專利名稱：MG7－Ag模擬表位構建胃癌特異性多表位基因疫苗的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學技術領域，涉及利用噬菌體隨機肽庫所篩選出的MG7-Ag模擬表位構建胃癌特異性多表位基因疫苗的方法。
背景技術：
胃癌是嚴重威脅我國人民健康的惡性腫瘤，目前胃癌的治療手段主要有手術切除和化療，但均不能有效解決腫瘤轉移、復發等問題。免疫治療是腫瘤治療的新方法，對機體正常細胞的副作用小，主要包括用外源性抗體治療、用細胞因子調節免疫以及主動免疫治療，用疫苗對患者的免疫系統產生特異性刺激。目前尚無有效的疫苗用于胃癌的主動免疫治療。胃癌MG7抗原是本研究所在八十年代發現的特異性較高的腫瘤標志物，抗原分析表明其抗原決定簇位于糖鏈上。由于糖抗原免疫原性弱，純化、制備困難，且不易誘導T細胞免疫反應。用分子模擬多肽替代糖抗原進行免疫治療是解決問題的方法之一，并在動物模型中取得很好的效果。申請人的研究所用噬菌體隨機肽庫技術篩選得到了MG7抗原的模擬肽表位，抗體競爭結合抑制實驗證明模擬肽表位可以有效地模擬天然抗原，計算機輔助分析顯示模擬表位可與HLA分子結合，這為胃癌疫苗的研究奠定了基礎。
DNA疫苗制備便捷、能誘發針對結構復雜的天然蛋白的免疫反應，并可同時引起體液免疫反應和細胞免疫反應，不涉及活性載體(如病毒)和復雜的生化技術。由于這些特點，DNA疫苗一直引起研究者的興趣。重組DNA技術已非常成熟，因此在質粒DNA疫苗的操作方面沒有大的技術障礙。臨床實驗也證明人體對質粒耐受良好。但在人體肌注免疫時，應用需要1mg～5mg質粒才能引起免疫反應，給商品化生產及應用帶來困難。因此，如何增強DNA疫苗的效率備受關注。
1.佐劑的應用細胞因子作為免疫佐劑增強DNA疫苗的效果，近年已有廣泛研究。巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是應用最廣的細胞因子之一，其他的細胞因子和趨化因子還有INF-γ，IL-2，IL-4，IL-12，IL-18，MIG，IP-10，RANTES，MCP-3等。應用此類佐劑時，可以用重組的細胞因子蛋白或與DNA疫苗進行共轉染。某些趨化因子除了有增強免疫反應的作用外，還具有抑制血管生成的作用，如MIG、IP-10和RANTES，在體內還可通過抑制腫瘤血管生成而起一定的抑瘤作用。佐劑是細胞因子除了共轉染輔助分子CD154和CD80也可以增強疫苗的效果。
熱休克蛋白(HSP)與腫瘤免疫的關系是近年研究熱點之一。HSP可通過多種途徑增強腫瘤特異性免疫HSP具有蛋白伴侶功能，參與蛋白質的裝配轉運和降解；APC細胞表面存在HSP受體，納摩水平的HSP肽復合物足以誘導很強的免疫反應，免疫后小鼠的CD8+T細胞能特異地識別腫瘤細胞(Proc Natl AcadSci USA 1995；9211993-7)，從而降低免疫劑量；HSP本身具有免疫刺激劑的作用，可增加多種細胞因子的分泌(Fundamental Immunology，4th 1999.1237-1270)。
HSP肽復合物腫瘤疫苗在動物實驗中已取得良好療效，例如，從gp70-抗原陽性的B16黑色素瘤中提取的HSP70可保護小鼠免受gp70-抗原陽性的CT26結腸癌細胞的攻擊(Biochem.Soc.Trans.25 1997，p.268S)。又如，從甲基膽蒽誘導的肉瘤MC57S中純化的HSP70可誘導對腫瘤的免疫反應，現在HSP肽復合物的免疫治療已進入II期臨床試驗，I期臨床試驗結果表明HSP肽復合物可使50％病人CD8+T細胞增加，部分病人NK細胞亦有增加趨勢(Cancer Res.591999，2718-2723)。HSP融合蛋白也能誘導特異的抗融和蛋白的CTL反應。例如，用HSP70與人乳頭瘤病毒16型的E7抗原融合后的DNA疫苗，E7特異性CD8+T細胞數目增加至少30倍，其免疫效果和抗瘤性明顯增強且不依賴于Th細胞。
2.表位組建方式加強免疫效果的策略。
隨著多種B、T、Th細胞表位在體外研究中的確定，產生了以表位為基礎的DNA疫苗。這類疫苗對靶抗原的選擇更精確，使免疫效果更有針對性，但抗原表位的結構小型，過于簡單，可能造成抗原性減弱。為了克服這類問題，除了應用包括以上所述的各類佐劑對疫苗加以修飾外，多表位聯合組建基因疫苗是近幾年來研究的一個重要方向。串聯后抗原的加長和復雜結構有利于其穩定性(Mol Immunol 1999；36，103-12)。還有研究表明，單一表位以同源串聯可誘導增強Th1反應，從而促進細胞介導的免疫反應(Infection andImmunity，July 2000，3867-3872)。
研究認為，多個表位串聯后，可誘導機體對各個表位產生特異性免疫反應。Ling-ling等人構建了針對不同病原體的多表位聯合疫苗(包括5種病毒和1種細菌)，動物實驗結果表明，機體產生了針對各個表位的免疫反應。在MHC多態性使疫苗的應用范圍縮小，因為不同人群的MHC分子可能識別不同的抗原表位。多表位聯合疫苗可幫助克服這一問題。此外，在病毒變異的情況下，多表位聯合疫苗可使疫苗更有效。例如，Roshni等人構建了針對人類T細胞淋巴病毒1型的多價CTL表位串聯的疫苗，結果證明其效果優于單個表位疫苗的免疫效果。在DNA疫苗中聯合應用CTL表位、B細胞表位和Th細胞表位可增強免疫效能。因為可以誘導機體同時產生CTL反應和體液免疫反應，而Th細胞表位可激活Th細胞分泌細胞因子，進而更有效的活化CTL細胞和B細胞、提高APC呈遞抗原的能力。在研制腫瘤DNA疫苗時，多表位聯合疫苗允許機體對多個關鍵的腫瘤相關抗原產生特異性免疫反應，從而增進其抑制腫瘤的效能。例如，由于人乳頭瘤病毒(HPV)的E6和E7抗原對于宮頸癌的發生及其惡性表型的保持都必不可少，Markwin等人研制了聯合人乳頭瘤病毒HPV的E6和E7抗原的基因疫苗，并包括CTL、Th和B細胞表位。疫苗使所有受試小鼠在腫瘤攻擊實驗中受到保護，并在融合泛素后效果加強(J.Immunol，2001，1665366-5373)。
在構建多表位基因疫苗時，無論是單一表位的同源串聯還是異源串聯，相鄰的表位或相鄰的嵌合佐劑都可能對疫苗的免疫效果產生影響。其他影響因素還包括表位的插入順序、插入位點以及表位重復次數等。Mireille等人在構建乳腺癌亞單位疫苗時，發現將融合的源于破傷風毒素的T細胞表位在重復4次后，疫苗誘發的CTL反應大大提高。
各個表位的側翼序列對表位的抗原性也有重要影響，關系到細胞內蛋白酶對抗原肽的處理、表位的釋放、抗原肽與MHC分子的結合、表位的呈遞等。此外，表位之間添加間隔序列(linker/spacer)對于增強抗原呈遞、避免各個抗原之間可能造成的干擾有重要作用(J Gene Virol，1999，802343)。有研究表明，對于同樣序列的多表位聯合疫苗，添加了spacer的疫苗比沒有spacer的疫苗誘導的免疫效果高出50％(J.Immunol，2001，1665366-5373)。Brian等人在研制針對HIV的多表位聯合疫苗時發現，GPGPG序列作為spacer可以避免4個Th細胞表位之間的相互干擾，進一步提高疫苗的免疫效果(J.Immunol，2002，1685499-5506)。Brian D.Livingston等研究認為K、R、Q、N、G、S、A、T可在單個插入后誘導較好的CTL反應。Shintaro Yagi等認為，在表位間插入L、V、等疏水氨基酸或多聚甘氨酸可避免多表位聯合所造成的非特異性結合。
GGGS是噬菌體呈現肽與噬菌體小膜蛋白pIII之間的連接短臂，用以避免呈現肽與噬菌體自身蛋白互干擾。根據申請人的實驗室的研究，利用GGGS作為spacer可起到避免兩個表位之間相互干擾，保持親本蛋白各自活性的作用，也避免了改變臨近氨基酸以盡量保持篩選出的模擬表位的性質。
還有研究表明，單一表位以同源串聯可誘導增強Th1反應，而Th1型的CD4+T細胞主要分泌IL-2，IL-12和IFNγ，誘導細胞免疫。申請人采用HSP70基因為疫苗佐劑，與表位融合可增強疫苗的免疫效能；并利用GGGS作為spacer(間隔序列)，避免抗原表位與MHC分子非特異結合，促進抗原呈遞的作用在利用其作為并利于蛋白酶水解釋放表位的要求。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用MG7-Ag模擬表位構建胃癌特異性多表位基因疫苗的方法，并且獲得具有抗瘤效應的基因疫苗，其效果優于單表位的基因疫苗。
實現上述發明目的的技術方案是采用單一表位以同源串聯形式，以HSP70為載體，GGGS為間隔序列，連續四次PCR，并以前一次PCR的產物作為下一次PCR的模版，將四個不同的模擬表位以及間隔序列連接起來；構建含有4個串聯不同的MG7-Ag模擬表位與HSP70的融合基因疫苗，其串聯表位的具體核苷酸以及氨基酸序列參見核苷酸和氨基酸序列。
其制備方法是首先構建多個MG7-Ag模擬表位與HSP70融合的基因疫苗，并利用Western blotting鑒定表明重組蛋白的表達保持了親本蛋白各自的活性，采用肌肉注射和靜脈注射兩種方式免疫接種BALB/c小鼠，每隔2周加強免疫一次，共免疫3次。分別于初次免疫后2、4、6周收集血清，進行細胞ELISA。第6周時取小鼠脾細胞，用酶聯免疫斑點法檢測分泌IFNγ的特異性CTL。第6周時用表達有MG7-Ag的小鼠艾氏腹水瘤細胞對靜脈接種的各組小鼠進行腫瘤攻擊實驗，25天后觀察小鼠成瘤情況。
本發明利用分子生物學技術，采用單一表位以同源串聯形式，將4個胃癌模擬表位的基因融合，多表位疫苗在串聯多個表位后，抗原的加長和復雜結構有利于其穩定性，更利于被APC識別并加工、呈遞；其次，由于各個MG7模擬抗原對原始碳水化合物表位的模擬能力不盡相同，多表位串聯疫苗中聯合使用多個模擬抗原，相對于單表位疫苗刺激機體免疫反應的能力可更完善。
本發明的方法構建的MG7-Ag模擬表位為基礎的多表位基因疫苗，將會在臨床的腫瘤免疫治療，胃癌特異性疫苗的研制方面打下良好的基礎。
圖1是4個串聯的MG7-Ag模擬表位以及spacer的核苷酸和氨基酸序列。
以下結合附圖對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
胃癌特異性疫苗是胃癌免疫治療的重要方向之一。本發明的方法是采用單一表位以同源串聯形式，以HSP70為載體，GGGS為間隔序列，連續四次PCR，并以前一次PCR的產物作為下一次PCR的模版，將四個不同的模擬表位以及間隔序列連接起來；構建含有4個串聯不同的MG7-Ag模擬表位與HSP70的融合基因疫苗。并利用細胞酶聯免疫檢測、酶聯免疫斑點法、腫瘤攻擊實驗等檢測了多表位基因疫苗的效能，證明該疫苗具有較好體內抗瘤效應。
1.技術方案及其路線1.1以MG7-Ag模擬表位為基礎的多表位基因疫苗的構建1.1.1串聯4個表位以pcDNA3.1(+)質粒的209-785bp序列為模版，用primer5.0軟件設計引物，通過多次PCR將多個胃癌MG7-Ag模擬表位融合基因與一段無關載體基因連接。小量膠回收試劑盒純化回收第四次PCR產物，電泳定量，與PMD18-T載體16℃連接過夜。連接產物轉化E coli DH5α感受態菌，經藍白篩選法篩選，隨機挑取12個白色菌落，質粒小量提取試劑盒提取質粒。EcoR I單酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳看有無約900bp片段釋放，鑒定后的重組質粒測序。
1.1.2多表位串聯真核表達載體的構建小量提取試劑盒測序正確的陽性克隆質粒，BamH I和EcoR I雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，小量膠回收試劑盒純化回收約900bp片段。BamH I和EcoRI雙酶切pcDNA3.1B，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，回收約5.3kb片段。大小片段摩爾比1∶3，T4連接酶連接，轉化E coli DH5α感受態細菌，氨芐抗性篩選，隨機挑取陽性菌落，提取質粒，BamH I和EcoR I雙酶切鑒定陽性克隆。HindIII單酶切，觀察有無約660bp的無關載體片段釋放。回收大片段，T4連接酶連接，轉化E coli DH5α感受態細菌，氨芐抗性篩選，隨機挑取陽性菌落，提取質粒，測序。
1.1.3 HSP70為載體蛋白的多表位串聯DNA疫苗的構建含有人HSP70編碼基因的質粒PC/P6由申請人的寧小萱博士贈與，其制備方法如下收集人血液，利用試劑盒提取人基因組DNA，用primier 5.0軟件設計針對人HSP70編碼區的引物，并在引物兩端添加酶切位點EcoR I和Xho I。以基因組DNA為模版，利用上述引物進行PCR反應。將所得PCR產物裝入商品化載體中測序，如測序結果正確，即得到含有人HSP70編碼基因的質粒PC/P6。
EcoR I、Xho I雙酶切PC/P6，回收約2kb的片段。EcoR I、Xho I雙酶切重組多表位串聯真核表達載體，回收大片段。大小片段摩爾比1∶3，T4連接酶連接，轉化E coli DH5α感受態細菌，氨芐抗性篩選，隨機挑取陽性菌落，提取質粒，HindIII和Xho I雙酶切鑒定。
1.1.4真核表達載體的轉染及Western blot鑒定將重組質粒pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP轉化的E.coli DH5α菌株及以空載體pcDNA3.1轉化的菌株，在LB培養基中于37℃培養18h，按照質粒提取說明分別提取pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP和pcDNA3.1的DNA，經紫外分光光度儀測定OD260定量。按照LipofactaminTM Reagent脂質體轉染說明轉染小鼠SP2/0細胞。轉染前一天，將細胞接種于6孔板，約2×105/孔，第二天細胞達到80％融合，DNA定量后取各0.50ug，LipofactaminTM10ul，加無血清培養基800ul。轉染5小時后加入含胎牛血清的1640培養液至正常水平。72小時后收集轉染的細胞，含蛋白酶抑制劑的三去污裂解，細胞總蛋白質用Bradford方法蛋白定量；30μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，體積分數為10％的凝膠)，半干法將電泳產物轉至硝酸纖維膜(0.22μm孔徑)；麗春紅染色，剪下相應蛋白電泳條帶，10％脫脂奶粉室溫封閉2h，加入鼠抗人HSP一抗或鼠抗人MG-7單抗，4℃過夜，TBS緩沖液洗膜三次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜三次，ECL顯影。
1.2基因疫苗免疫小鼠后的效果觀察1.2.1免疫小鼠大量提取質粒pcDNA3.1(+)/4MG-HSP70、pcDNA3.1(+)/MG-HSP70、pcDNA3.1(+)/HSP70及空載體pcDNA3.1(+)，PEG8000純化，備用。50只BALB/c小鼠，，雌性，4周齡，體重15-20g，隨機分為5組，每組10只，采用肌肉注射，具體分組如下第1組pcDNA3.1B/4MG-HSP70(多表位串聯疫苗組)第2組pcDNA3.1(+)/GC-HSP70(單表位疫苗免疫組)第3組pcDNA3.1(+)/HSP70(HSP對照組)第4組pcDNA3.1(+)(空載體對照組組)第5組生理鹽水組具體方法為質粒接種前24h用0.25％布比卡因100μl預處理，具體操作如下75％酒精消毒接種部位，滅菌的100μl微量注射器以45°進針，刺入小鼠股四頭肌，進針后一邊緩慢注射藥物一邊不斷小角度改變針頭方向，使經處理的肌纖維面積盡可能增大，損傷盡可能小。布比卡因處理后24h，在同一預處理部位接種質粒，質粒用量為100μg/只，每隔2周加強免疫一次，共免疫3次，每次接種前24h均用0.25％布比卡因預處理。
1.2.2體液免疫反應的檢測分別于初次免疫后2、4、6周收集免疫血清，進行體液免疫檢測。免疫血清的收集方法如下從小鼠尾靜脈取血，收集于0.5ml離心管中，靜置5min后，3000rpm離心3min，收集上層血清，-20℃保存備用。細胞ELISA檢測時，收集處于對數生長期的人胃癌KATOIII細胞，置于50ml離心管，1000rpm離心5min，PBS(PH 7.4)洗滌3次。顯微鏡下進行細胞計數，調整細胞濃度，鋪于96孔細胞培養板(每孔細胞密度為3×105)，1500rpm離心15min，棄上清，充分干燥后，每孔加入50μl PBS配制的0.25％戊二醛中固定15分鐘，棄固定液，PBS洗滌5min×3次，用PBS溶液配制的10％脫脂奶粉封閉過夜，洗滌后每孔加入1∶200稀釋的小鼠免疫血清50μl，以抗MG7-Ag抗體為陽性對照，37℃孵育1h，PBST溶液洗滌5min×4次，每孔加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)50μl，37℃孵育1h，PBST震蕩洗滌5min×3次，然后用TMB顯色10min，終止液終止反應，立即在酶聯免疫檢測儀上測定A450波長下的OD值。實驗結果進行統計學分析。
1.2.3細胞免疫反應的檢測1.2.3.1收集免疫后小鼠脾淋巴細胞初次免疫后第6周將免疫小鼠摘眼球放血處死，75％酒精浸泡5min，右側臥位固定于12cm滅菌平皿上置超凈臺內，消毒眼科剪剪開皮膚，暴露腹膜，換另一眼科剪剪開腹膜，摘取小鼠脾臟，去除脂肪組織和結締組織，剪碎，用無血清培養基沖洗后置于200目不銹鋼網上，用無菌注射器針芯輕輕研磨脾臟，并用無血清培養基沖洗。收集脾細胞懸液，Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離小鼠的淋巴細胞。具體操作為，在離心管中加入適量淋巴細胞分離液，將等體積脾細胞懸液用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，保持清楚界面，離心2000rmp×20分鐘。離心后管內分為三層，在上、中層界面處有一白色云霧層狹窄帶，用彎頭滴管插到云霧層，仔細吸取細胞。細胞用PBS洗三遍，去除Ficoll，再用含20％胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞沉淀，臺盼藍染色排除法計數活細胞數目。將細胞移入96孔細胞培養板，調整細胞密度為1×106/孔，加入含20％胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養。
移入含有10％胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養，并加入人工合成MG7-Ag模擬表位多肽至終濃度為50μg/ml。
1.2.3.2 ELISPOT檢測在室溫下，PVDF板每孔用70％乙醇100μl孵育10分鐘，倒掉乙醇，每孔用100μl PBS洗3次。捕獲抗體(IFNγ特異性單抗)1∶100稀釋于PBS，每孔加入稀釋后抗體100μl，于4℃孵育過夜。孵育后用PBS洗一次，去除未結合的抗體。每孔加入2％牛奶100μl，室溫孵育2小時。倒去牛奶后用PBS洗板一次。每孔加入體外預刺激后的脾細胞100μl(細胞數5×104)，于37℃CO2孵箱孵育15小時～20小時。倒去細胞懸液，每孔加入PBST100μl，4℃放置10分鐘，再用PBST洗板3次。檢測抗體(生物素化二抗)1∶100稀釋于含1％BSA的PBS，每孔加入稀釋后抗體100μl，于37℃CO2孵箱孵育1～1.5小時。倒去液體，PBST洗板3次。親和素—堿性磷酸酶復合物1∶100稀釋于含有1％BSA的PBS中，每孔加入100μl，于37℃CO2孵箱孵育1小時。倒去液體，PBST洗板3次，在吸水紙上輕拍板子，去除殘留的液體。每孔加入BCIP/NBT緩沖液100μl，反應在室溫下避光進行5分鐘～20分鐘，期間注意觀察斑點的形成。用無菌水洗板3次，晾干后計數出現的斑點，并做統計學分析。
1.3腫瘤攻擊實驗免疫6周后，用艾氏腹水瘤細胞對采用靜脈免疫的各組小鼠(不包括生理鹽水組)進行攻擊實驗。收集艾氏腹水瘤細胞，以1×107/100μl/只接種于各組小鼠皮下，每組接種4只。腫瘤攻擊25天后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出瘤體，稱重，比較各組小鼠成瘤情況。
攻擊實驗證實，該疫苗能誘導小鼠產生抗MG7-Ag特異性抗體以及一定數量的特異性CTL分泌IFNγ，腫瘤攻擊后，疫苗免疫組小鼠成瘤體積明顯小于對照組，多表位疫苗免疫組優于單表位疫苗組和其他對照組。
2.技術效果本發明的方法采用篩選出的MG7-Ag模擬表位，用GGGS為spacer，以HSP70為疫苗佐劑，構建了胃癌特異性的多表位基因疫苗。該疫苗是一種含有串聯的胃癌特異性模擬表位的DNA疫苗，經細胞酶聯免疫檢測，酶聯免疫斑點法檢測，以及腫瘤攻擊實驗證實，該疫苗能誘導小鼠產生抗MG7-Ag特異性抗體以及一定數量的特異性CTL分泌IFNγ，腫瘤攻擊后，疫苗免疫組小鼠成瘤體積明顯小于對照組，多表位疫苗免疫組優于單表位疫苗組和其他對照組。說明該疫苗能對動物產生針對胃癌的特異性保護作用，且多表位串聯疫苗的效果優于單表位疫苗。該疫苗在胃癌的免疫治療研究，胃癌特異性疫苗的研制方面將具有巨大的潛在價值。
根據申請人進行的資料檢索，本發明的方法采用篩選的MG7-Ag模擬表位，以GGGS為spacer構建4個胃癌模擬表位串聯的基因疫苗，目前尚無文獻報道，因此本發明具有惟一性和自主的知識產權。
3.最佳實施方式研制胃癌特異性多表位蛋白疫苗將發明中構建的多表位基因疫苗的序列插入原核表達載體，進行原核表達，并利用His標簽進行純化。將純化得到的蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠，通過檢測免疫后小鼠的體液免疫反應和細胞免疫反應，評價多表位蛋白疫苗的免疫效能。同時用帶有MG7-Ag的腫瘤細胞制備荷瘤小鼠，用純化后的蛋白注射小鼠后，觀察腫瘤生長及小鼠一般狀態，評價多表位蛋白疫苗對腫瘤的治療效果。
核苷酸和氨基酸序列K P H V H T K G G G SAAA CCA CAT CTA CAT ACA AAA GGA GGA GGA AGTK P H L H F H G G G SAAA CCA CAT CTT CAT TTT CAT GGA GGA GGA AGTK P H S H L H G G G SAAA CCA CAT AGT CAT CTT CAT GGA GGA GGA AGTS W A P V Y A R A NAGT TGG GCT CCA GTT TAT GCT AGA GCT AAT
權利要求
1.一種MG7-Ag模擬表位構建胃癌特異性多表位基因疫苗的方法，其特征在于，采用單一表位以同源串聯形式，以HSP70為載體，GGGS為間隔序列，連續四次PCR，并以前一次PCR的產物作為下一次PCR的模版，將四個不同的模擬表位以及間隔序列連接起來；構建含有4個串聯不同的MG7-Ag模擬表位與HSP70的融合基因疫苗，其串聯表位的具體核苷酸以及氨基酸序列如下KPHVHTKGGGSAAA CCA CAT CTA CAT ACA AAA GGA GGA GGA AGTKPHLHFHGGGSAAA CCA CAT CTT CAT TTT CAT GGA GGA GGA AGTKPHSHLHGGGSAAA CCA CAT AGT CAT CTT CAT GGA GGA GGA AGTSWAPVYARANAGT TGG GCT CCA GTT TAT GCT AGA GCT AAT。
2.如權利要求1所述的MG7-Ag模擬表位構建胃癌特異性多表位基因疫苗的方法，其特征在于，其構建含有4個串聯不同的MG7-Ag模擬表位與HSP70的融合基因疫苗包括以下步驟1)4個串聯不同的MG7-Ag模擬表位以pcDNA3.1(+)質粒的209-785bp序列為模版，用primer5.0軟件設計引物，通過多次PCR將多個胃癌MG7-Ag模擬表位融合基因與一段無關載體基因連接；小量膠回收試劑盒純化回收第四次PCR產物，電泳定量，與PMD18-T載體16℃連接過夜，連接產物轉化E co1i DH5α感受態菌，經藍白篩選法篩選，隨機挑取12個白色菌落，質粒小量提取試劑盒提取質粒；EcoR I單酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳看有無約900bp片段釋放，鑒定后的重組質粒測序；2)多表位串聯真核表達載體的構建小量提取試劑盒測序正確的陽性克隆質粒，BamH I和EcoR I雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，小量膠回收試劑盒純化回收約900bp片段；BamH I和EcoRI雙酶切pcDNA3.1B，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，回收約5.3kb片段；大小片段摩爾比1∶3，T4連接酶連接，轉化E coli DH5α感受態細菌，氨芐抗性篩選，隨機挑取陽性菌落，提取質粒，BamH I和EcoR I雙酶切鑒定陽性克隆；HindIII單酶切，觀察有無約660bp的無關載體片段釋放；回收大片段，T4連接酶連接，轉化E coli DH5α感受態細菌，氨芐抗性篩選，隨機挑取陽性菌落，提取質粒，測序；3)HSP70為載體蛋白的多表位串聯DNA疫苗的構建EcoR I、Xho I雙酶切HSP70的質粒PC/P6，回收約2kb的片段，EcoR I、Xho I雙酶切重組多表位串聯真核表達載體，回收大片段；大小片段摩爾比1∶3，T4連接酶連接，轉化E oli DH5α感受態細菌，氨芐抗性篩選，隨機挑取陽性菌落，提取質粒，HindIII和Xho I雙酶切鑒定；4)真核表達載體的轉染及Western blot鑒定將重組質粒pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP轉化的E.coli DH5α菌株及以空載體pcDNA3.1轉化的菌株，在LB培養基中于37℃培養18h，按照質粒提取說明分別提取pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP和pcDNA3.1的DNA，經紫外分光光度儀測定OD260定量；按照LipofactaminTM Reagent脂質體轉染說明轉染小鼠SP2/0細胞；轉染前一天，將細胞接種于6孔板，約2×105/孔，第二天細胞達到80％融合，DNA定量后取各0.50ug，LipofactaminTM10ul，加無血清培養基800ul，轉染5小時后加入含胎牛血清的1640培養液至正常水平；72小時后收集轉染的細胞，含蛋白酶抑制劑的三去污裂解，細胞總蛋白質用Bradford方法蛋白定量；30μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳，半于法將電泳產物轉至0.22μm孔徑的硝酸纖維膜；麗春紅染色，剪下相應蛋白電泳條帶，10％脫脂奶粉室溫封閉2h，加入鼠抗人HSP-抗或鼠抗人MG-7單抗，4℃過夜，TBS緩沖液洗膜三次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜三次，ECL顯影；經此鑒定后即可得到胃癌特異性多表位基因疫苗。
3.如權利要求2所述MG7-Ag模擬表位構建胃癌特異性多表位基因疫苗構建方法，其特征在于，所述質粒PC/P6的制備方法是收集人血液，利用試劑盒提取人基因組DNA，用primier 5.0軟件設計針對人HSP70編碼區的引物，并在引物兩端添加酶切位點EcoR I和Xho I；以基因組DNA為模版，利用上述引物進行PCR反應，將所得PCR產物裝入商品化載體中測序，測序結果正確，即得到含有人HSP70編碼基因的質粒PC/P6。
全文摘要
本發明公開了以胃癌MG7－Ag模擬表位為基礎構建的多表位DNA疫苗及其方法。本發明利用HSP70為載體，GGGS為間隔序列，構建含有4個串聯不同的MG7－Ag模擬表位與HSP70的融合基因疫苗。經Western blotting鑒定表明融合基因在小鼠骨髓瘤SP2/0細胞中成功表達，并保持了親本蛋白各自的活性。質粒免疫接種后，融合基因疫苗可誘導小鼠產生抗MG7－Ag特異性抗體以及一定數量的特異性CTL分泌IFNγ，多表位疫苗免疫組優于單表位疫苗組和其他對照組。腫瘤攻擊后，疫苗免疫組小鼠成瘤體積明顯小于對照組。這一基因疫苗在胃癌的免疫治療研究，胃癌特異性疫苗的研制方面將具有巨大的潛在價值。
文檔編號A61K48/00GK1616109SQ20041007312
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月29日 優先權日2004年9月29日
發明者吳開春, 陳瑜, 寧小萱, 丁杰, 樊代明 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學