專利名稱：胡蘆巴種子提取物，其提取方法，及治療糖尿病及其并發癥用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及胡蘆巴種子提取物，提取方法，含有它們的藥物組合物及其作為治療糖尿病和并發癥，尤其作為降血糖和降血脂產品中的用途。
背景技術：
胡蘆巴種子是一種傳統的中藥材，具有溫腎、祛寒、止痛之功效。已有報道從胡蘆巴中分離到甾體皂甙、黃酮、生物堿等多種成分(尚明英，中草藥，1998，29(10)655；藥學學報，2001，36(11)837；中國中藥雜志，2002，27(4)277；徐學民，中草藥，2003，34(8)678；I.P.Varshney，Indian J.Chem.，1978，16B1134；M.Yoshikawa，Chem.Pharm.Bull.，1997，45(1)81-87)。有關胡蘆巴種子具有降血糖活性在國內外較早已有研究報道(G.Ribes，Proceedingsof the Society for Experimental Biology and Medicine，1986，182159-166；M.A.Riyad，Planta Med.，1988，54286；R.D.Sharma，Nutrition Res.，1996，16(8)1331；L.Ali，Planta Med.，1995，61358；朱鎮海，四川中醫，2000，18(11)20；陳軼玉，鎮江醫學院學報，2001，11(2)163)，但其中有效部位和有效成分報道很少，尚未明確。G.Ribes發現種皮中纖維是降血糖活性成分。L.Ali發現種子中可溶性半乳甘露聚糖有降血糖作用。文獻報道胡蘆巴種子降低膽固醇活性，其中活性成分是皂苷類化合物(G.Valette，Atherosclerosis，1984，50105；R.D.Sharma，Nutrition Reports International，1986，33(4)669；Pierre R.P.，Steroids，1995，60674)。
發明內容
本發明人經研究現已發現，不含纖維素或半乳甘露聚糖等多糖成分的胡蘆巴種子提取物，該提取物具有較強降血糖和降血脂作用，能刺激胰島素分泌，該結果未見相同研究報道。
本發明一方面涉及一種胡蘆巴種子提取物，其特征在于不含纖維素及半乳甘露聚糖。
本發明還涉及胡蘆巴種子提取物的制備方法，其包括將生藥胡蘆巴種子干燥粉碎，常溫、常壓下，用有機溶劑、含水有機溶劑或水浸提獲得胡蘆巴種子提取浸膏；浸膏再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇連續萃取，萃取液減壓濃縮，分別獲得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物，只保留正丁醇提取物。
本發明還涉及用于治療糖尿病及其并發癥以及降低血脂的產品，其包括胡蘆巴種子提取物及對人體無害的載體，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
本發明進一步涉及胡蘆巴種子提取物在制備用于治療糖尿病及其并發癥以及降血脂的產品中用途，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
進一步講，在本發明制備方法中，生藥胡蘆巴種子粉末與浸泡用有機溶劑、含水有機溶劑或水的重量體積比一般為1∶5-15(千克/升)。浸泡時間一般大于24小時，浸泡溫度一般0℃-60℃。所用有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇、丙酮。
萃取，提取物浸膏萃取分為三步，第一步采用低極性溶劑萃取，包括石油醚、四氯化碳、環己烷和苯，優選用石油醚。第二步采用中極性溶劑包括乙酸乙酯，氯仿、乙醚，優選用乙酸乙酯。第三步采用較大極性溶劑正丁醇。
胡蘆巴種子提取物浸膏重量與萃取溶劑體積比1∶5～15(克/毫升)。先用石油醚室溫萃取2次，石油醚萃取液減壓濃縮，獲得石油醚部位。萃取殘渣用乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，獲得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯萃取殘渣再用正丁醇萃取2次，正丁醇萃取液減壓濃縮，獲得正丁醇部位或正丁醇提取物。
濃縮及萃取液減壓濃縮的溫度一般等于或低于60℃。
本發明的胡蘆巴種子提取物中的正丁醇部位，主要含有黃酮、三萜皂苷和甾體皂苷。如含小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖甙，三糖的齊墩果烷型三萜皂苷(大豆皂苷I)，大豆皂苷I甲酯，胡蘆巴甾體皂苷等成分。
本發明所述產品包括口服使用和非腸道使用的產品，如口服液，片劑，顆粒劑，膠囊或注射劑。本發明所述產品也可理解功能性食品或保健品。進一步講，本發明中對人體無害載體是指制藥或食品領域允許使用的已知載體。
進一步講，本發明中胡蘆巴種子提取物可理解為胡蘆巴種子的正丁醇提取物。
具體實施例方式
實施例1胡蘆巴種子2kg，粉碎，過篩(20目)，加入95％醫用乙醇16L室溫浸泡72小時，不斷攪拌。四層紗布過濾，殘渣繼續用95％乙醇8L浸泡48小時，過濾。合并濾液，離心，上清液45℃減壓濃縮得到乙醇浸膏155.6克，得率為7.8％。胡蘆巴種子醇提浸膏500g，加100ml水研磨成乳濁液，用5000ml石油醚萃取三次，收集醚層溶液減壓濃縮，得到石油醚部位。殘留液用乙酸乙酯2000ml萃取三次，萃取液減壓濃縮，得到乙酸乙酯部位。殘留液再用3000ml正丁醇萃取三次，萃取液減壓濃縮，得到正丁醇部位或正丁醇提取物69.17克，得率為1.8％。
胡蘆巴95％乙醇提取殘渣1kg用蒸餾水8L室溫浸泡72h，不斷攪拌。浸泡液過濾，殘渣用蒸餾水4L再繼續浸泡24h，過濾，合并濾液，減壓濃縮，55℃烘干得水提浸膏177.4g，得率為17.7％.
實施例2將實施例得到的胡蘆巴種子的正丁醇部位少許，溶于甲醇中，進行薄層層析。
層析板G254硅膠板，展開劑條件(1)乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3(2)乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2∶1顯色條件熒光，λ＝254，365。
碘熏法方法(1)Rf值0.55(λ365，I2) 方法(2)Rf值0.83(λ365)0.47(I2)0.79(I2)0.43(λ254，I2)0.58(λ254，I2)0.39(I2)0.37(I2)0.20(I2)0.28(λ254，I2)0.09(λ254，I2)0.20(λ365，I2)0.06(I2)0.09(I2)采用鹽酸-鎂粉檢驗方法鑒別出正丁醇部位呈陽性，表明含有黃酮類化合物；醋酐-濃硫酸反應呈陽性，表明含皂苷類化合物；氯仿-濃硫酸反應呈陽性，表明含萜類和甾體類化合物；α-萘酚濃硫酸反應呈陽性，表明含還原糖苷類化合物。
濃硫酸-苯酚法檢驗水提物中多糖，呈陽性反應。
實施例3將實施例1得到的胡蘆巴種子提取物的正丁醇部位經D101大孔樹脂柱層析，分別以水，30％，50％，70％，95％乙醇洗脫，50％乙醇部分經硅膠色譜柱分離，氯仿-甲醇-水梯度洗脫，得到一個黃酮類化合物為小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖甙，特征為黃色針晶，熔點246-248℃，IR(KBr)cm-13378，1655，1598，1491。1H-NMR(DMSO)δ12.96，9.40，3.88，6.46，6.87，7.08，7.36，5.05，3.24，-3.73。13C-NMR(DMSO)δ182.1，56.4，100.1，60.6-77.4。
30％乙醇部分經硅膠色譜柱分離，氯仿-甲醇-水梯度洗脫，得到3個三萜皂苷和1個甾體皂苷。三萜皂苷為2個三糖的齊墩果烷型三萜皂苷(大豆皂苷I)和1個大豆皂苷I甲酯。其中一個三萜皂苷特征為白色粉末，熔點228-231℃，IR(KBr)cm-13410，1625，1355-1392。1H-NMR(C5D5N)δ0.69，0.95，1.00，1.22，1.29，1.39，1.75，2.40，3.23，4.23，3.74，6.25。13C-NMR(DMSO)δ122.3，144.8，172.3，105.3，102.3，101.7。另一三萜皂苷特征白色粉末，熔點280-282℃，初步鑒定為三糖齊墩果烷型三萜皂苷。大豆皂苷I甲酯特征為白色粉末，熔點247-249℃，IR(KBr)cm-13424，2926，1731，1619，1382，1050。1H-NMR(DMSO)δ0.75-1.14，3.67，4.74，4.95，5.16；13C-NMR(DMSO)δ169.2，144.1，121.5，103.7，100.2，100.0，51.7。甾體皂苷特征為無色針狀結晶，熔點173-175℃，IR(KBr)cm-13390，1627，1033。1H-NMR(DMSO)δ4.96，4.83，4.97，3.94，3.62，3.95，3.68，1.62，1.03，0.73，0.70；13C-NMR(DMSO)δ152.3，104.8，103.6，105.3，17.3，14.4，13.2，11.7。
實施例450只昆明小鼠隨機分為正常對照組(10只)和待造模組(40只)。待造模組小鼠禁食24小時后(不禁水)，尾靜脈快速注射四氧嘧啶生理鹽水溶液，劑量為60mg·kg-1。72h后尾尖取血測定小鼠血糖，血糖值＞20.0mmol·L-1的小鼠被選為糖尿病小鼠，分成模型組(10只)和實施例1正丁醇提取物組(今后簡稱組A)1g.kg-1組(10只)，水提物組1g.kg-1組(10只)，連續灌胃給藥20天，第7天測定血糖，第20天測定血糖。數據以X±SD表示，二組均數間差異用t檢驗。
表1胡蘆巴種子95％乙醇提取物降血糖實驗結果
注與模型組比較，*p＜0.05。
實施例5100只昆明小鼠隨機分為正常對照組(10只)和待造模組(90只)。待造模組小鼠禁食24小時后(不禁水)，尾靜脈快速注射四氧嘧啶生理鹽水溶液，劑量為60mg·kg-1。72h后尾尖取血測定小鼠血糖，血糖值＞20.0mmol·L-1的小鼠被選為糖尿病小鼠，分成模型組(10只)和石油醚部位(10只)，乙酸乙酯部位1g.kg-1組(10只)，實施例1的正丁醇部位(10只)。灌胃，劑量800mg/kg，連續給藥20天，第7天測定血糖，第21天測定血糖后，眼眶取血，處死，測定小鼠血清中甘油三脂和胰島素水平。數據以X±SD表示，二組均數間差異用t檢驗。實驗結果表明正丁醇部位具有顯著降血糖和降血脂作用，對糖尿病小鼠有促進胰島素分泌作用。
表2胡蘆巴種子正丁醇部位降血糖實驗結果
注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01.
表3胡蘆巴種子正丁醇部位降血脂和促進胰島素分泌實驗結果
注與模型組比較，*p＜0.05，***p＜0.001.
權利要求
1.一種胡蘆巴種子提取物，其特征在于不含纖維素及半乳甘露聚糖。
2.胡蘆巴種子提取物的制備方法，其包括將生藥胡蘆巴種子干燥粉碎，常溫、常壓下，用有機溶劑、含水有機溶劑或水浸提獲得胡蘆巴種子提取浸膏；浸膏再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇連續萃取，萃取液減壓濃縮，分別獲得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物，只保留正丁醇提取物。
3.用于治療糖尿病及其并發癥以及降低血脂的產品，其包括胡蘆巴種子提取物及對人體無害的載體，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
4.胡蘆巴種子提取物在制備用于治療糖尿病及其并發癥以及降血脂的產品中用途，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
5.權利要求1的胡蘆巴種子提取物，其中所述提取物為胡蘆巴種子的正丁醇提取物。
全文摘要
本發明涉及胡蘆巴種子提取物，提取方法，含有它們的藥物組合物及其作為治療糖尿病和并發癥，尤其作為降血糖和降血脂產品中的用途。
文檔編號A61P3/10GK1726952SQ200410071030
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月27日 優先權日2004年7月27日
發明者單俊杰, 趙毅民, 楊明, 楊靜, 任晉瑋 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所