專利名稱：短肽修飾的聚賴氨酸－聚乳酸共聚物納米粒及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于納米技術領域。具體涉及短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒及其制備方法和在醫藥中的用途。
背景技術：
1990年Weidner采用內皮細胞表面標記物顯示乳腺癌新生血管，發現腫瘤血管密度(MVD)與腫瘤侵襲性、淋巴結轉移、病人預后是相關的.此后MVD與腫瘤侵襲轉移的關系在許多腫瘤被證實。抗血管形成的干預治療還處于臨床試驗階段。1989年第一個進入臨床試驗的抗新生血管藥物干擾素(αIFNα)，迄今已有13種該藥物正在進行II-III期的臨床試驗。Agniostatin和Endostatin是最強的血管形成抑制劑，分別在1994年和1997年由Falkman實驗室報道。1999年美國FDA已批準Endostatin進入I期臨床試驗。但藥物的使用需長期甚至終身服用，這會給患者帶來不便和經濟負擔，探索一勞永逸的方法也是血管形成研究的方向。
近年來國內外對細胞識別和粘附的分子機制研究取得了很大的進展，其中對含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)序列在細胞識別和粘附方面的報道引人注目.RGD是細胞膜整合蛋白十幾種受體和細胞外基質如膠原、血管細胞粘附分子等配體識別與結合的氨基酸最小序列.在一定條件下，人工合成的RGD序列的可溶性小分子多肽能夠競爭性地與細胞表面的整合蛋白結合，將細胞外信息傳入細胞內，引起細胞一系列的生理變化.國際上已有很多學者做過大量的實驗，研究RGD序列肽抑制惡性腫瘤的血管新生而抑制其生長與轉移，證實RGD序列肽具有直接殺傷腫瘤細胞和誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
有研究者將RDG類多肽直接用于腫瘤的治療。雖然含有RGD序列多肽可為各種整合蛋白所識別，但是RGD序列肽在體內不穩定，這些多肽在體內迅速被分解與清除，需要多次注射大劑量才能抑制癌細胞轉移，這成為該類多肽作為實用性抗腫瘤細胞轉移藥物的一個不利因素。加大劑量雖可提高血藥濃度，但在血中未被磷酸化的藥物可迅速尿排，不但不能提高療效，反而產生腎毒性，而被RGD序列封閉的腫瘤細胞并沒有被殺滅，仍能夠在體內存活相當長時間，仍可以導致腫瘤的轉移。
也有研究者制備了其聚乙二醇、甲殼素的結合物，希望通過延長其體內作用時間來增強其抗癌細胞轉移效果。但是這些結合物為線性分子結構，在體內極易降解，一旦RGD序列肽脫落，仍可以導致腫瘤的轉移。
脂質體作為一種藥物載體得到了比較廣泛的研究，包含有PEG類脂衍生物的空間穩定脂質體可以在循環系統中存在足夠長的時間并發揮療效.表面結合了RGD序列肽序列的脂質體可以將藥物靶向釋放到病變組織中，顯著降低對其它組織的毒性并提高了療效.脂質體最容易制備，卻也最難達到質控要求。雖然不少文獻上仍用脂質體，但因體內靶向性差，在體內應用，除腫瘤瘤內注射外，其前景仍存在問題。此外，在質控上也有一定困難。
復旦大學醫學院肝癌研究所進行了IFNaIb治療棵植性肝癌等的實驗研究，結果令人滿意。但是全身系統給藥，對腫瘤抑制作用減弱、并有副反應。
研究表明生物活性短肽RGD能有效抑制腫瘤血管的生長，從而抑制腫瘤細胞的轉移。目前人們已注意了其臨床上治療腫瘤轉移的應用價值。繼續尋找抑制粘連作用強、持續時間長、能用于臨床的RGD類多肽是今后的研究方向。
發明目的本發明所要解決的技術問題在于選擇合適的載體，使生物活性短肽能有效地抑制腫瘤血管的生長。
本發明提供了一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，該納米粒包括藥物和短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物質作載體材料。
本發明另一目的是提供了一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，該方法為將一定量的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)修飾的PL-PL高分子材料加到一定體積的二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷(DCM)/丙酮的混合有機溶劑中構成有機相，取適量藥物加入有機相中，將其勻化后形成初乳，將初乳加到一定量的乳化劑和一定體積的去離子水所構成的水相中，再次乳化，將所得乳液攪拌蒸發有機溶劑1～5小時，使有機溶劑揮發完全，即得短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物(GD-PL-PL)納米粒的分散體系，在膠體溶液中加入或不加入適量的支架劑，常規凍干保存。
本發明納米粒載體材料用一系列不同分子量和不同L-lactic Acid與-L-lysine比例以及不同RGD含量的材料，其分子量為4.0×103～6.0×104；L-lacticAcid與-L-lysine比例為100∶1-50∶50；RGD含量為0～50％。其有機溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷和丙酮(AC)的混合液，DCM和AC的體積比為60～100/0～40。
本發明水分散介質為右旋糖苷40或右旋糖苷70或普朗尼克F68，其濃度為0.1～5％。其勻化方式包括超聲乳化，高壓乳勻方式。支架劑包括葡萄糖、乳糖或甘露糖等，其含量為0.1～5％。
本發明又一目的是提供了短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物在制備納米級藥物中的應用。
本發明提供的短肽(RGD)修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物(Poly(L-lacticAcid-co-L-lysine)。該高分子材料是優良的藥物載體，利用這種材料包裹藥物，在機械攪拌或高壓乳勻機作用下制備緩釋納米粒，粒徑在10～1000nm以下可控，表面光滑，均勻度好，顆粒規則無粘連，再分散性好，載藥量和包封率高，可用于制備靜脈或肌肉注射或口服給藥的緩釋納米粒，作為癌細胞靶向給藥。
本發明所述的藥物為有機藥物、水溶性藥物或水不溶性藥物抗癌藥，如抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環胞苷)、直接影響和破壞DNA結構及其功能的藥物(如氮芥、環磷酰胺、氮甲、順鉑、絲裂霉素、喜樹堿)、抑制蛋白質合成的藥(如阿霉素、L-門冬酰胺酶、柔紅霉素、光輝霉素)、影響微管蛋白質組裝和紡錘絲形成的藥物(長春堿、依托泊苷)。
圖1RGD-PL-PL緩釋納米粒粒徑分布圖。
圖2RGD-PL-PL緩釋納米粒透射電鏡(JEM-100SX透射電子顯微鏡，日本電子公司)圖。
具體實施例方式下面再以實施例對本發明加以進一步的說明，但是不能限制本發明的內容。
實施例1精確稱取RGD-PL-PL 500mg，加到丙酮中構成有機相。將氟尿嘧啶或米托蒽醌(DHAQ)25mg溶于雙蒸水中形成水相。將氟尿嘧啶或DHAQ溶液加入有機相中其勻化后形成初乳。稱取普朗尼克F68加入雙蒸水中使其充分溶解，調節使其濃度為3％，構成外水相。內水相與外水相的體積比為1∶4～1∶8。將初乳加到外水相中，高壓乳勻機乳化，將所得乳液磁力攪拌蒸發有機溶劑4～5小時，使丙酮揮發完全，即得RGD-PL-PL納米粒的分散體系。加入3％的甘露糖作為支架劑，常規凍干保存。
實施例2精確稱取RGD-PL-PL50mg，加到二氯甲烷(DCM)和丙酮的混合有機溶劑中(DCM和AC的體積比為60～100/1～40)構成有機相。將氟尿嘧啶或米托蒽醌(DHAQ)2mg溶于雙蒸水中形成水相。將氟尿嘧啶或DHAQ溶液加入有機相中其勻化后形成初乳。稱取右旋糖苷70加入雙蒸水中使其充分溶解，調節使其濃度為1％，構成外水相。將初乳加到外水相中，超聲乳化30s，將所得乳液放入燒杯中，磁力攪拌蒸發有機溶劑3小時，使二氯甲烷和丙酮揮發完全，即得RGD-PL-PL納米粒的分散體系。加入3％的甘露糖作為支架劑，常規凍干保存。
實施例3精確稱取RGD-PL-PL100mg，加到丙酮中構成有機相。將米托蒽醌(DHAQ)5mg溶于雙蒸水中形成水相。將DHAQ溶液加入有機相中其勻化后形成初乳。稱取右旋糖苷40加入雙蒸水中使其充分溶解，調節使其濃度為1％，構成外水相。將初乳加到外水相中，高壓乳勻機乳化，將所得乳液磁力攪拌蒸發有機溶劑1～5小時，使丙酮揮發完全，即得RGD-PL-PL納米粒的分散體系。加入3％的乳糖作為支架劑，常規凍干保存。
權利要求
1.一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，其特征在于該納米粒包括作為活性成份的藥物和由精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰序列短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物的作載體材料。
2.根據權利要求1所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，其特征在于其中所述的藥物為有機藥物、水溶性藥物和水不溶性抗癌藥物。
3.根據權利要求1所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，其特在于其中所述的載體材料用賴氨酸、乳酸和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物，分子量為4.0×103～6.0×104；賴氨酸/乳酸為100～50∶0～50；短肽含量為0.001～50％；納米粒徑在10～1000nm。
4.一種如權利要求1所述的短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于該方法為一定量的由精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰短肽修飾的聚賴氨酸與聚乳酸高分子材料加到乙酸乙酯、二氯甲烷、或二氯甲烷和丙酮的混合有機溶劑中構成有機相，取適量藥物加入有機相中，將其勻化后形成初乳，初乳加到一定量的乳化劑和一定體積的去離子水所構成的水相中，再次乳化，所得乳液蒸發有機溶劑1～5小時，使其揮發完全，即得短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的水分散體系，在膠體溶液中加入或不加入支架劑，常規凍干保存；其中聚賴氨酸與聚乳酸比例為100∶1-100；所述短含量為0.001～50％；有機溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液，體積比為60～100∶1～40；所述的水分散介質濃度為0.1～5％(W/V)；其支架劑含量為0.1～5％(W/V)。
5.根據權利要求4所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于勻化方式包括超聲乳化或高壓乳勻。
6.根據權利要求4所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于其中所述的支架劑是包括葡萄糖、乳糖或甘露糖。
7.根據權利要求4所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于其中所述的分散介質為右旋糖苷40或右旋糖苷70或普朗尼克F68。
8.根據權利要求5所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于其中所述的高壓乳勻方式初乳超聲的強度為10～300W，每次超聲5～10秒，共超聲1～5次，復乳超聲的強度為30～600W，每次超聲5～10秒，共超聲1～6次。
9.一種如權利要求1所述的短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米材料的用途，其特征在于是制備藥物緩釋納米粒的材料。
全文摘要
本發明屬于納米技術領域。本發明公開了一種短肽修飾的聚賴氨酸－聚乳酸共聚物納米粒，該納米粒包括藥物和由精氨酰－甘氨酰－天冬氨酰序列短肽、修飾的聚賴氨酸－聚乳酸共聚物納米粒載體組成。本發明的納米載體材料可用于有機藥物、水溶性藥物或水不溶性抗癌藥物。本發明制備方法簡便，適于大規模生產，特別適應于制備靶向給藥的抗腫瘤藥。
文檔編號A61P35/00GK1634591SQ20041006806
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月11日 優先權日2004年11月11日
發明者段友容, 王慶瑞, 陳雪英, 何春菊 申請人:東華大學