專利名稱：能通過免疫防治Ⅰ型糖尿病的重組蛋白和重組基因的制作方法
技術領域：
在醫學領域中，可以用疫苗來預防自身免疫性疾病，本發明是一種重組蛋白，能用于預防和治療I型糖尿病的發生。
背景技術：
I型糖尿病，或稱胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，是一種具家族遺傳性的自身免疫性疾病，患者以青少年居多。主要表現為胰島β細胞的大部分被破壞和胰島素的絕對缺乏。目前尚無有效的治療方法，患者需終生依靠胰島素，十分痛苦。1992年后，我國一些地區根據WHO diamond Project計劃，在統一方法和標準下，對15歲以下兒童IDDM的發病率進行了調查，據收集到的已發表的11個地區的資料中，1988年到1995年期間我國兒童IDDM的年發病率在0.19/10萬～1.26/10萬，多數地區年發病率在0.5/10萬～0.9/10萬。自20世紀80年代起，兒童IDDM的發病在我國有不斷增高的趨勢。
一般情況下，自身免疫性疾病可通過免疫注射疾病相關的自身抗原來治療。目前已經從IDDM病人血清中檢測出許多自身抗體，其中重要的有胰島細胞抗體(islet cell antibody，ICA)，胰島素抗體(insulin antibody，IA)，抗熱休克蛋白60((heat shock protein 60，HSP60)抗體，抗谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)抗體等。由此進一步驗證引起疾病的自身抗原有胰島細胞表面抗原-512(ICA-512)，胰島素，HSP60，GAD，此外可能存在的還有胰島素受體，羧肽酶H，外周蛋白。當存在多種可能的抗原時，確定其中的優勢抗原尤為重要。熱休克蛋白(HSP)是所有的細胞，包括原核細胞和真核細胞在受到溫度的突然增高和其他理化因素的刺激產生應激反應后而形成的一種高度保守蛋白，具有很強的免疫原性，與多種自身免疫性疾病相關，其中與IDDM相關的為HSP60家族。HSP60是IDDM中極其重要的一個抗原，迄今為止，未見有報道稱由HSP60引發IDDM，倒是有許多文獻表明，用此種抗原免疫機體能使其在下一次遇到該抗原時對其產生耐受性，阻止自身免疫性疾病的發生。有人把人工合成的多肽固定在聚乙烯材料上，來進行HSP60的線性抗體表位掃描，發現糖尿病兒童組的血清中特異性針對P277的抗體水平顯著高于健康兒童組。
P277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特異性多肽，是在IDDM中發揮作用的特異片段，序列為VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文獻報道了一次隨機的，雙盲的二期臨床實驗，實驗結果表明，P277能挽救機體內未受損的胰島β細胞的功能(即使機體已表現出明顯的臨床癥狀)，使其能繼續釋放內源性的胰島素。至于P277的作用機理，可以通過一種抗原能調控機體對其它抗原反映的現象(亦稱“旁路抑制”理論)來解釋，即一種抗原在炎癥部位激活抑制炎癥因子的Th2型細胞因子可關閉Th1細胞對附近抗原的反應，這也是目前對此較為成熟與合理的解釋。在鼠和人中，與胰島β細胞決定簇作用的主要為CD4+T細胞，而CD4+T細胞按其分泌的細胞因子不同又分為Th1細胞和Th2細胞。Th1細胞主要分泌IL2和IFN-γ，前者能有效刺激T細胞增值，后者為炎癥因子，能引起阻止發炎并誘導B細胞產生IgG2α抗體。而且由于77％的Th1細胞具有細胞毒作用，它可以溶解呈遞自身移植抗原的β細胞，從而使抗體生成降低，降低體液免疫。Th2細胞分泌IL-2和IL-10，能降低Th1效應。IL-4促進β細胞產生IgG1抗體，抑制Th1產生前炎癥因子。IL-10通過影響抗原呈遞細胞和巨噬細胞釋放前炎癥因子而抑制Th1活性。至于p277為什么能誘導這種變化，現在認為關鍵在于P277本身的抗原特性，結構等，因為T細胞表型的分化受不同抗原刺激產生不同的結果。因此可考慮用此作為免疫疫苗來預防和治療I型糖尿病。疫苗的方法可以克服傳統的口服或注射胰島素及器官移植等方法的諸多缺點，更重要的是它能挽救未損傷的β細胞，使其繼續釋放內源性的胰島素。
然而，P277作為只具有20幾個氨基酸的多肽，免疫原性很弱，這在一定程度上限制了其作用的發揮。通常，多肽疫苗需要加入佐劑，才能激發機體產生足夠強的免疫應答。許多常用的佐劑，如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等僅能用于動物，不能用于人體；人體可用的佐劑目前僅有鋁佐劑，而這種佐劑常常對多肽疫苗不能起到強化免疫原性的作用。
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的熱休克蛋白65(MT-HSP65)具有“在位”佐劑的功能，可以非特異性刺激T細胞或作用于巨噬細胞，起到呈遞特異性抗原的作用。
發明內容
本發明的目的是提供一種不需添加佐劑，能通過粘膜免疫防治I型糖尿病的重組蛋白。
本發明的另一目的是提供編碼該重組蛋白的基因。
本發明的再一目的是提供生產該該重組蛋白的方法。
本發明的還有一個目的是該重組蛋白的用途及其給藥途徑。
在本發明的第一方面，提供了一種能通過免疫防治人I型糖尿病的重組蛋白，這種重組蛋白不需要添加佐劑，而且能通過粘膜免疫。這種重組蛋白是將結核分枝桿菌的HSP65(MT-HSP65)和P277多肽形成融合蛋白HSP65-P277。MT-HSP65具有“在位”佐劑的功能，將抗原表位多肽P277與HSP65融合表達，能強化P277的免疫原性，不需添加佐劑就能激發機體產生強烈免疫應答，可以通過粘膜給藥來防治人的I型糖尿病。利用鼻粘膜給藥進行粘膜免疫簡便易行，藥物經鼻粘膜部豐富毛細血管吸收后直接進入體循環，使藥物不良反應的發生機率大為降低，體液免疫是粘膜免疫效應的主要過程，即產生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，sIgA的多聚體結構能增強其對抗原的親和力，而且sIgA表面特殊的糖成分或糖鏈有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。通過鼻粘膜給藥還可免受胃腸道中酶的破壞和肝臟對藥物的首過清除效應，有利于提高生物利用度和血藥濃度，可極大地減少藥物用量。同時IgG，IgM和IgE等免疫球蛋白在粘膜反應中也起著不可忽視的重要作用。除了鼻粘膜給藥，該重組蛋白還可以考慮口服這種給藥途徑。
本發明的第二方面，是提供編碼該重組蛋白的基因，現有的基因重組蛋白疫苗相對價格高，接種也必須到醫院，目前要讓所有的人都接受顯然十分困難。如把此重組基因片斷HSP65-P277導入動物體內，就可以獲得大量表達這種重組蛋白的轉基因動物，并能通過該動物分泌的奶，產的蛋或其他組織提取獲得此種重組蛋白，不但產量高、易提純，而且表達的蛋白經過充分的修飾加工，具有穩定的生物活性，一只轉基因的動物就相當于建一座大型制藥廠，大大降低現有的生產成本。或只要食用這種轉基因動物的乳汁或雞蛋等就可獲得I型糖尿病的保護。如把該基因整合到某些植物的基因組中，用植物表達作為疫苗的重組蛋白不須純化，可直接口服，在運輸中不須冷凍保存轉基因植物，價廉易行。如把HSP65-P277的基因轉入到番茄，香蕉中，就可以吃個番茄或香蕉就可防治I型糖尿病，這就使我們有了更多的選擇，不用去醫院，無需注射，只要在家吃個幾個番茄或服用幾粒這種番茄加工制成的藥物膠囊，就可以在體內產生抗I型糖尿病的抗體，常吃可使體內持續抗體維持在一個較高水平，增強了對I型糖尿病的抵抗。
在本發明的第三方面，是提供生產該抗人I型糖尿病重組蛋白的方法，其技術路線詳述如下1.P277基因的設計與獲得P277是人HSP60上的一段437VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED460，該序列是HSP60對IDDM發揮作用的特異片段。我們將442和447位的C(半胱氨酸)用V(纈氨酸)來置換，以增強肽段的穩定性，兩者具有相同的免疫特性。根據多肽P277氨基酸序列，選擇原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設計兩條寡核苷酸鏈，分別作為上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸內切酶BamHI的酶切位點，下游引物5’端加上終止密碼子和限制性核酸內切酶HindIII的酶切位點，兩條引物互補序列為20個堿基，通過聚合酶鏈式反應(PCR)法獲得P277多肽基因的核苷酸序列。
2.HSP65基因的設計與獲得在不改變HSP65氨基酸序列的前提下，選用原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設計兩條寡核苷酸鏈，從市售的卡介苗提取的DNA中通過PCR法獲得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了NcoI的識別位點，3’端添加了NheI和BglII的識別位點。
3.pED-P277重組基因工程菌的構建P277基因經BamHI、HindIII切割插入經BamHI、HindIII切割的pED質粒載體中，組成融合表達的重組質粒pED-P277，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
4.pED-HSP65-P277重組基因工程菌的構建HSP65基因經NcoI、BglII切割插入經NcoI、BamHI切割的pED-P277中，組成融合表達的重組質粒pED-HSP65-P277，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
5.工程菌發酵及重組HSP65-P277融合蛋白的獲得以液體LB為基礎培養基，玉米漿培養基為發酵培養基，發酵參數如下溫度37℃，pH6.8-7.2。發酵后離心收集工程菌，經溶菌酶和DNA水解酶作用，離心取上清獲得可溶性蛋白，硫酸銨分級沉淀，35％-45％硫酸銨分級沉淀中含有目的融合蛋白且雜蛋白較少，沉淀重新溶解脫鹽后經陰離子交換柱層析純化，用SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，可以判斷純化的HSP65-P277的純度。
在本發明的第四方面是該重組蛋白的用途，如上所述，此種重組蛋白能用于防治人I型糖尿病的發生。我們選用國際上通用的I型糖尿病的動物模型NOD(non-obese diabetic mouse，NOD)小鼠，隨機分成六組，每組十只，分別是空白對照組，HSP65腹腔注射組，HSP65-P277腹腔注射組，HSP65鼻腔粘膜免疫組，HSP65-P277鼻腔粘膜免疫組，卵清蛋白滴鼻對照組。分別于4周齡，7周齡，10周齡3次免疫，每月測小鼠體內血糖水平及相應的抗體滴度。結果顯示，通過兩種給藥途徑HSP65和HSP65-P277都可以不同程度的抑制NOD小鼠糖尿病的發生，這可能由于HSP高度保守，MT-HSP65和人的HSP60中含有相似的抗原表位，當以可溶性的方式注射免疫或粘膜免疫時都可以誘導機體產生免疫耐受，從而起到降低針對胰島β細胞的免疫損傷來防治糖尿病的發生。這樣一來MT-HSP65不僅具有“在位”佐劑的功能，同時本身還具有抗I型糖尿病的作用，將它與P277組成重組蛋白，明顯優于單獨使用P277，更有利于防治I型糖尿病的發生。我們通過初步藥效學實驗表明了此重組蛋白HSP65-P277對I型糖尿病的發生有明顯的降低作用，同時我們也證明了此重組蛋白可以通過粘膜免疫。
圖1重組蛋白HSP65-P277的全基因序列(1707bp)及氨基酸序列(569aa)圖2重組質粒pED-P277和pED-HSP65-P277結構圖。
圖3 PED-HSP65-P277 C端部分基因測序結果。
圖4 SDS-PAGE電泳顯示HSP65-P277的融合表達。1.標準分子量蛋白；2.大腸桿菌BL21細胞全蛋白；3.載荷pED質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；4.載荷pED-HSP65-P277質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導前)；5.載荷pED-HSP65-P277質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；6.載荷pET28a-HSP65質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)。
圖5 SDS-PAGE電泳顯示pED-HSP65-P277重組基因工程菌乳糖誘導后5小時菌體裂解后上清不同飽和濃度的硫酸銨分級沉淀。1.標準分子量蛋白；2.菌體裂解上清30％飽和度的硫酸銨沉淀；3.菌體裂解上清40％飽和度的硫酸銨沉淀；4.菌體裂解上清45％飽和度的硫酸銨沉淀。
圖6 SDS-PAGE電泳顯示HSP65-P277蛋白的純化.1.標準分子量蛋白；2.乳糖誘導5小時后載荷pED-HSP65-P277質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；3.分離的HSP65-P277；6.分離的HSP65。
圖7 ELISA測定結果顯示融合蛋白HSP65-P277腹腔注射和粘膜免疫都能誘發小鼠產生抗P277的抗體。圖例■HSP65-P277腹腔注射組；□HSP65-P277鼻粘膜免疫組圖8 Western blot檢測結果顯示HSP65-P277能誘發NOD小鼠產生抗P277抗體。A蛋白轉膜后用麗春紅染色顯示相應的蛋白條帶；B雜交后顯色結果。1.標準分子量蛋白；2.氧化態rhVEGF-P277；3.還原態rhVEGF-P277；4.氧化態rhVEGF；5.還原態rhVEGF。
圖9各組小鼠免疫后不同月齡血清中血糖的含量。結果顯示HSP65-P277粘膜免疫和腹腔注射可以顯著降低NOD小鼠血糖含量，HSP65兩種免疫途徑的NOD小鼠的血糖也有不同程度的降低。圖例 HSP65腹腔注射組； HSP65-P277腹腔注射組； HSP65-P277鼻粘膜免疫組； 對照組；-x-HSP65鼻粘膜免疫組； 卵清蛋白滴鼻對照組圖10 各組小鼠不同時期糖尿病發生率，結果顯示HSP65-P277腹腔注射效果最好，至8月齡時NOD鼠尚無糖尿病的發生，HSP65-P277粘膜免疫的小鼠亦能顯著降低糖尿病的發生；HSP65對NOD小鼠糖尿病的發生也有一定的預防作用。圖例 對照組；■卵清蛋白滴鼻對照組； HSP65腹腔注射組；□HSP65-P277腹腔注射組(發病率為一直為0，圖中未顯示出圖形)； HSP65-P277鼻粘膜免疫組；□HSP65鼻粘膜免疫組具體實施方式
材料(1)菌株與質粒宿主菌E.coli BL21(Escherichia coli BL21)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關的實驗室一般都有保存。
卡介苗由上海生物制品公司生產，該制品中含有牛結核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
質粒pED由本實驗室構建并保存。
質粒pET28a-HSP65由本實驗室構建并保存，HSP65蛋白也由本實驗室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細菌基因組、質粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產品；PCR回收試盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為華舜生物工程公司產品。
(3)培養基LB培養基，配方見參考文獻Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術的經典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(5)Cellouse-DEAE DE-52為Whatman公司產品。
(6)辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產品。
(7)3、3`、5、5`-四甲基聯苯胺(TMB)、二氨基聯苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(Sigma)公司產品。
(8)96孔酶標板為美國康寧(Corning)公司產品。
(9)硝酸纖維素膜為美國Millipore公司產品。
(10)測定血清中血糖濃度的儀器為Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物學操作方法質粒提取、聚合酶鏈反應、限制性核酸內切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉化大腸桿菌在基因工程研究領域，這些都是常規操作方法，參見Sambrook J，Fristsh E F，ManiatisT.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進行。
實施例1 HSP65-P277多肽基因的設計、合成和克隆根據MT-HSP65基因和P277多肽基因的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，在計算機的輔助下設計出4條寡核苷酸片段。首先通過PCR法合成P277多肽基因，將該基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名為pED-P277。再以pET28a-HSP65質粒為模板，通過PCR的方法獲得MT-HSP65基因，將該基因替換pED-P277中的L-ansB-C基因，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名為PED-HSP65-P277。具體方法如下4條寡核苷酸P15’GCTGGATCCAGTTCTGGGTGGTGGCGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTGG 3’P25’GTCAAGCTTAATCTTCGTTAGCCGGGGTCAGGGAGTCCAGAGCCGGGATAACGCGC 3’P35’TTG ACC ATG GCC AAG ACA ATT GCG TAC 3’P45’TAA AAG ATC TGC GCT AGC GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’通過PCR獲得P277多肽基因將寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板，94℃，30秒，58℃，30sec，72℃，30sec，共30個循環；72℃，10min。將擴增獲得的PCR產物經試劑盒純化后用限制性核酸內切酶BamH1和HindIII消化，與用相同限制性內切酶消化的pED質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含連有P277多肽基因的重組質粒pED-P277。
通過PCR獲得HSP65多肽基因以P3為上游引物，P4為下游引物，pET28a-HSP65質粒為模板，經94℃變性5min，然后以94℃變性1min、62℃復性1min、72℃延伸2min共進行35個循環后，再72℃延伸10min。將擴增獲得的PCR產物經PCR純化試劑盒純化后用限制性核酸內切酶NcoI和BglII消化，與用NcoI和BamH I消化的pED-P277質粒連接，其中BglII和BamH I為同尾酶，連接產物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含HSP65-P277融合蛋白基因的重組質粒pED-HSP65-P277，其質粒圖譜見圖2。
實施例2 HSP65-P277基因在大腸桿菌中的表達將重組質粒pED-HSP65-P277轉化大腸桿菌BL21。從生長有不同轉化子平板上挑取單菌落接種含有50ug/ml卡那霉素LB液體培養基，于37℃恒溫振蕩培養過夜，按1％比例轉接種入新鮮的玉米漿液體培養基(50ug/ml卡那霉素)中，37℃培養4小時后，加入終濃度為0.5mmol/L的α-乳糖誘導大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，繼續培養從而表達融合蛋白HSP65-P277。誘導后每隔1小時取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經薄層掃描顯示已經實現了HSP65-P277多肽基因的融合表達。融合蛋白在誘導后5小時達到穩定的最大表達量，融合蛋白占細菌總蛋白的40％左右，結果見圖6。
實施例3重組蛋白HSP65-P277的分離純化誘導表達后的工程菌經離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體裂解液(pH8.0，50mM磷酸鹽緩沖液，0.02％溶菌酶)中，37℃攪拌30分鐘，加入DNase將DNA消化至溶液不粘稠為止，離心回收上清，用硫酸銨分級沉淀，目的蛋白主要在35％-45％硫酸銨沉淀中，見圖5。將沉淀的融合蛋白重新溶解在pH7.4磷酸鹽緩沖液中，透析脫鹽，離心后取上清進行陰離子交換柱層析，DEAE纖維素DE-52柱(2×60cm)，用PBS/NaCl梯度洗脫，分部收集進行SDS-PAGE電泳檢測，HSP65-P277在120-150mmolNaCl處的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度，見圖6。
實施例4 HSP65-P277重組蛋白的免疫原性研究選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機分成6組分別為PBS腹腔注射對照組、HSP65腹腔注射實驗組、HSP65-P277腹腔注射實驗組、HSP65鼻腔粘膜免疫實驗組、HSP65-P277鼻腔粘膜免疫實驗組和卵清蛋白鼻腔粘膜免疫對照組，每組各10只。分別腹腔注射或鼻腔粘膜免疫對應的蛋白50ug/只(PBS對照組50ulPBS/只)，HSP65、HSP65-P277和卵清蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑。以后每隔3周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。每次免疫后3周內眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清冷凍保存。
用純化的重組人血管內皮生長因子121和p277的融合蛋白(rhVEGF-p277)4℃過夜包被96孔ELISA酶標板，每孔100ul含50ug融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋50倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時。用PBST(含0.1％Tween-20)和自來水間隔洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標記)，每孔100μl，37℃作用1小時。PBST和自來水間隔洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3`、5、5`-四甲基聯苯胺(TMB)溶液于37℃顯色30分鐘后，加入50μl 2MH2SO4終止反應，并于450nm波長下，測定各孔吸光度值。結果見圖6。結果表明，HSP65-P277腹腔免疫和鼻腔粘膜免疫都能誘發小鼠產生特異的抗P277抗體。
實施例5抗P277特異抗體的Western檢測將純化后的rhVEGF、還原態rhVEGF-P277和氧化態rhVEGF-P277用15％SDS-PAGE電泳后，于30V電壓電泳過夜轉移到硝酸纖維素膜上，然后以5％BSA溶液室溫封閉2小時。實施例5和例6中所得抗血清稀釋20倍后，與硝酸纖維素膜上的抗原于37℃作用1小時后，以pH7.5TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀釋400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根過氧化物酶標記)二抗，于37℃作用1小時，再以以pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色。具體操作方法參考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring HarborLaboratory Press，1989，pp.888-898。NOD小鼠血清Western blot法檢測結果見圖8。氧化態rhVEGF-P277(泳道2)由于其鏈間二硫鍵的作用，部分蛋白質形成二聚體，在PAGE膠上表現為分子量分別為17kD和34kD的雙條帶，還原態rhVEGF-P277(泳道1)為單體，在膠上表現為分子量為16kD的單條帶。由于NOD小鼠血清中有抗P277抗體的存在，因此可以分別和膜上16kD和32kD的rhVEGF-P277蛋白帶雜交，但不和rhVEGF雜交(泳道4和5)，證實了HSP65-P277實驗組能誘發NOD小鼠產生特異的抗P277的抗體。
實施例5 HSP65-P277重組蛋白的藥效學研究選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機分成6組分別為PBS腹腔注射對照組、HSP65腹腔注射實驗組、HSP65-P277腹腔注射實驗組、HSP65鼻腔粘膜免疫實驗組、HSP65-P277鼻腔粘膜免疫實驗組和卵清蛋白鼻腔粘膜免疫對照組，每組各10只。分別腹腔注射或鼻腔粘膜免疫對應的蛋白50ug/只(PBS對照組50ulPBS/只)，HSP65、HSP65-P277和卵清蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑。以后每隔3周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。每次免疫后3周內眥取血一次，以后每月取血一次。血量為0.5-0.8ml，離心，取血清5小時內用全自動生化分析儀測定血糖含量。結果見圖9。結果顯示HSP65-P277粘膜免疫和腹腔注射可以顯著降低NOD小鼠血糖含量，HSP65兩種免疫途徑的NOD小鼠的血糖也有不同程度的降低。以血糖濃度≥11.1mmol/l判為糖尿病。結果見圖10。結果表明重組蛋白HSP65-P277腹腔注射效果最好，至8月齡時NOD鼠尚無糖尿病的發生，粘膜免疫亦可以顯著降低NOD小鼠糖尿病的發生。HSP65對NOD小鼠糖尿病的發生也有一定的預防作用。
權利要求
1.一種免佐劑具有預防人I型糖尿病作用的重組蛋白，將源于牛結核分枝桿菌(Mycobacterium bovine)的熱休克蛋白HSP65的基因和人HSP60的一個抗原表位P277基因連接，置于T7強啟動子的下游，可獲得高效表達的重組蛋白HSP65-P277。其特征在于不需添加佐劑，也不需要與載體化學偶聯，通過注射和粘膜免疫都能激發機體產生抗I型糖尿病的免疫應答。
2.按照權利要求1所述的重組蛋白，其特征在于其中含有人HSP60中在I型糖尿病人的優勢抗原表位P277，其氨基酸序列是PVLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。
3.按照權利要求1所述的重組蛋白，其特征在于牛結核分枝桿菌(Mycobacterium bovine)的熱休克蛋白HSP65與多肽P277融合表達，融合蛋白作為疫苗在不額外添加佐劑的情況下激發機體產生強烈的免疫應答。
4.一種免佐劑抗人I型糖尿病蛋白疫苗的制備方法，包括用化學合成法和PCR法合成人P277、和HSP65的編碼序列DNA，將這些DNA分步插入表達載體，在大腸桿菌中表達出可溶性的融合蛋白；經硫酸銨分級沉淀純化；再經陰離子交換樹脂DEAE纖維素純化，得到抗人I型糖尿病重組蛋白。
5.根據權利要求4所述免佐劑抗人I型糖尿病蛋白疫苗，其特征在于免疫動物能誘發機體產生特異的抗P277抗體。
6.根據權利要求1所述的重組蛋白通過注射免疫和粘膜免疫方式能預防和治療I型糖尿病。
7.根據權利要求1和2所述的重組蛋白和重組基因的特性，該重組基因能用于轉基因動物、轉基因植物和重組微生物。
8.根據權利要求4所述免佐劑抗人I型糖尿病的融合蛋白，其特征在于可與藥物載體組合制成藥物組合物。
9.根據權利要求4所述免佐劑抗人I型糖尿病的融合蛋白，其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發明提供一種能用于預防和治療I型糖尿病的重組蛋白及其重組基因。將源于分枝桿菌(Mycobacterium bovine)的熱休克蛋白HSP65基因與人HSP60的一段抗原表位P277連接，產生的重組蛋白可不需添加佐劑直接用于免疫。該重組蛋白通過注射途徑和粘膜免疫途徑都能刺激機體產生針對P277的抗體，顯著降低NOD小鼠糖尿病的發生，能起到防治I型糖尿病的作用。同時本發明提供的重組基因也可用于轉基因動物或植物和重組微生物，使它們作為生產該重組蛋白的工廠或制作口服疫苗。
文檔編號A61P3/00GK1663613SQ200410065968
公開日2005年9月7日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者劉景晶, 朱愛華, 金亮, 曹榮月, 吳潔 申請人:中國藥科大學