多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物和制備方法及其應用的制作方法

專利名稱：多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物和制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生化制藥技術領域，尤其是涉及多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物和制備方法及其在制備治療慢性腎炎和腎衰竭疾病藥物中的應用。
背景技術：
腎衰竭是由各種原因引起的腎實質損害所導致的水、電解質紊亂，酸堿平衡失調及涉及多個器官功能紊亂的綜合征，治療較為困難，且醫療費昂貴。據有關資料統計，我國約有腎臟病人3000萬，慢性腎衰發生率約為總人口的萬分之五，其中死于尿毒癥者每年就有數萬人。近幾十年來，血液凈化技術的問世和不斷改進以及營養治療、抗生素等技術的發展，使腎衰病人的成活率有了突破性的提高，但在合并嚴重感染、多臟器功能障礙及衰竭時，死亡率仍高至50-75％以上，因此探索如何發展治療腎臟疾病的新療法和新藥物仍是當前面臨的嚴峻挑戰。
天然多糖是構成生命基礎的四大類物質之一，迄今為止，有300多種多糖的免疫調節作用已為人們所發現。基于對腎臟疾病機理的認識，人們發現用糖胺聚糖及其衍生物治療慢性腎臟疾病有顯著效果(Shestakova et al.Terapevticheskii Arkhiv.1997，69(6)34-37；Skrha et al.Diabetes Research and Clinical Practice.1997，38(1)25-31)。如Akima等以酸性粘多糖和具有抗凝血活性的葡聚糖硫酸酯用作治療間質腎炎、腎小球腎炎和狼瘡腎炎(日本專利08-301771；美國專利5981509)；Egidio等以粘多糖來源的2-氨基葡萄糖醛酸-2-脫氧葡聚糖硫酸酯治療糖尿病腎病，降低尿白蛋白效果尤佳(日本專利06-091713)；徐祖洪等公開了一種褐藻多糖硫酸酯新的制備方法和作為治療腎衰疾病藥品中的應用(中國專利95112292.4、98120283.7)；畢愛芳等申請了用褐藻多糖硫酸酯作為治療腎小球疾病的藥品專利(中國專利98110201.8)。本發明人研究發現真菌來源多糖經硫酸酯化修飾后具有顯著的降血肌酐、血尿素氮和尿蛋白等治療慢性腎炎和腎衰竭的功能(中國專利，申請號200410013931.1)。
氨基酸對腎功能的保護是多方面的，雖然機理上尚存在許多爭議。L-鳥氨酸、L-精氨酸是尿素循環中重要的代謝中間物，促進血氨轉變成尿素。L-精氨酸是NO的前體物質，NO是舒血管因子，可以顯著改善腎臟微循環，提高腎小球濾過率，保護腎臟組織減輕缺血、缺氧的損傷。尿素循環中L-鳥氨酸接受2個氨基轉化為L-精氨酸。很久以前人們已發現L-鳥氨酸和L-精氨酸有保護人體減輕銨鹽的毒性作用，并嘗試用L-鳥氨酸、L-精氨酸治療高血氨病人(Bimbaum et al.Arch Biochem Biophys.1956，64(2)319；342；Harper et al.Proc Soc ExpBiol Med.1956，92(3)560；Fahey et al.Am J Med.1957，23(6)860；Michel et al.Presse Med.1971，79(19)867)。Schramm認為在大鼠缺血性急性腎功能衰竭中，L-精氨酸能改善其腎功能，其主要機制可能和來源于L-精氨酸的NO有關(Schramm et al.Ren Fail，1994，16(5)555)。Reckelhoff等實驗表明L-精氨酸能防止與老齡有關的腎小球損傷和GFR的減少(Reckelhoffetal.Am J Physiol，1997，272(6 Pt 2)R1768)。McGivan實驗表明，L-鳥氨酸被L-鳥氨酸轉氨酶分解的速度和L-鳥氨酸進入線粒體參與尿素循環的速度幾乎是一樣的(McGivan et al.Biochemistry Journal 162147-156(1977))，補充L-鳥氨酸有助于加速尿素循環。
甘氨酸能夠保護多種細胞，減輕由缺氧、過氧化和多種毒物造成的損傷。甘氨酸對于缺氧誘導的腎近曲小管損傷是一種非常有效的保護因子。大劑量的甘氨酸對順鉑引起的腎毒性能產生明顯的保護和修復作用(Li et al.J Pharm Pharmacol，1995，47(3)223)。Schneider發現甘氨酸抑制環孢菌素A誘導的大鼠腎小球濾過率的下降，阻止血肌酐、尿素氮和堿性磷酸酶的升高，改善近曲小管的膨脹和壞死以及吞噬細胞的浸潤(美國專利6096785)。
其它氨基酸如L-丙氨酸能對體外的兔近曲小管的缺氧性損傷起保護作用，L-絲氨酸也有類似的保護作用。L-賴氨酸能保護溶血引起的腎功能減退，主要是因為帶有正電荷的L-賴氨酸能抑制對血紅蛋白的重吸收(秦杰.國外醫學泌尿系統分冊，2003，23(4)374)。
腎衰病人由于限制蛋白飲食，體內必須/半必須氨基酸血濃度很低，正常的、必要的蛋白質合成受阻，氮代謝平衡被打破。因此以一個合理的比例給腎衰病人補充一定量的必須氨基酸，既是滿足營養支持和平衡的需要，又有保護病變腎臟的功能。早些時候的發明給氨氮排泄障礙的病人補充一定量的包括L-精氨酸、L-組氨酸在內的必須/半必須氨基酸以糾正體內蛋白質的缺乏(美國專利2457820；3764703)。后來的發明將去氨氮的必須/半必須氨基酸的α-酮酸、α-羥基酸類似物和無法獲得這些類似物的必須/半必須氨基酸混合補充給病人，即補充了必要的氨基酸，又促進了氨氮轉換，減輕腎臟尿素排泄的負擔(美國專利4100160；4100161；4100293；4228099)。但這些專利產品均存在口感差、反胃以及某些氨基酸或α-酮酸、α-羥基酸類似物溶解度低的缺點。Walser將L-精氨酸和L-鳥氨酸與人體必須的支鏈氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸)的α-酮酸類似物組合形成復合鹽用于治療以高血氨為特征的肝病、腎衰和腦病，產品口感得到改善(美國專利4320146)。國內謝立平等發明了含有8種L-氨基酸的復合制劑具有明顯的對抗順鉑和缺血導致的急性腎功能障礙作用(中國專利1439364A)。

發明內容
1、發明目的本發明的目的在于提供一類多糖硫酸酯氨基酸鹽復合藥物和制備方法及其在治療慢性腎炎和腎衰竭制藥領域中的應用。將多糖硫酸酯與氨基酸復合的目的在于融合它們各自的免疫調節活性和治療慢性腎炎、腎衰竭的藥理活性，從而產生正向協同作用，使多糖硫酸酯氨基酸鹽對腎病患者腎功能的保護作用強于多糖硫酸酯和天然氨基酸的獨自藥效。
2、技術方案一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物，其特征在于它是由多糖硫酸酯聚陰離子載體與氨基酸成鹽形成的復合物，其組分重量百分比為多糖硫酸酯占該復合物10％-95％，氨基酸占該復合物5％-90％。
上述的多糖硫酸酯包括天然多糖硫酸酯和人工半合成多糖硫酸酯。硫酸根占多糖硫酸酯的重量百分比為2％-60％。
上述多糖硫酸酯中的多糖包括動物多糖、植物多糖和/或微生物多糖。微生物多糖優選為真菌多糖，最優選為茯苓多糖、豬苓多糖和裂褶菌多糖動物多糖優選為糖胺聚糖；植物多糖優選為海藻多糖。
上述成鹽氨基酸種類包括全部天然氨基酸，優選為L-鳥氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物加入相應的輔料可制備成片劑、丸劑、膠囊劑和針劑。
一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物的制備方法，其特征在于多糖硫酸酯和氨基酸的結合包括在溶液中以分子離子的形式化學合成和/或采用物理方式進行機械混合制備的兩種制備方法。其化學合成制備方法步驟如下(1)植物多糖的提取采用熱水抽提法，動物多糖、微生物多糖的提取采用酶解和堿提相結合的方法。提取物經脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；(2)多糖硫酸酯的制備采用氯磺酸-吡啶法。反應產物經堿中和、脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；
(3)多糖硫酸酯氨基酸鹽制備步驟如下a.多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽配成5％-20％溶液，緩慢攪拌加入氫型酸性樹脂，離子交換去除多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽中的金屬離子，反應過程中監測溶液pH值，當pH至0.5-2時過濾分離出樹脂；b.將氨基酸配成1％-70％的溶液；c.向酸性樹脂處理好的多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入氨基酸溶液，成鹽反應過程中監測溶液pH值，當pH至3-8時停止加入氨基酸溶液；d.活性碳脫色，真空濃縮和干燥，機械粉碎，即得多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物。
上述藥物的制備方法，在步驟(2)中所述的多糖硫酸酯，其分子量在0.2萬-80.0萬之間，優選0.5萬-30.0萬；上述藥物的制備方法，在步驟(3)中b和c所述的氨基酸，包括一種和/或多種，多糖硫酸酯和一種氨基酸形成多糖硫酸酯單氨基酸鹽，多糖硫酸酯和多種氨基酸形成多糖硫酸酯混合氨基酸鹽。
一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物在制備治療慢性腎炎和腎衰竭疾病藥物中的應用。該藥物經藥效學試驗結果表明，多糖硫酸酯氨基酸鹽進入體內后，在血液和組織液中以多糖硫酸酯和氨基酸游離的形式存在，各自發揮它們的腎功能保護和免疫調節作用，從而產生正向協同作用，使多糖硫酸酯氨基酸鹽對腎病患者腎功能的保護。作用強于多糖硫酸酯和天然氨基酸的獨自藥效。
經動物實驗表明，多糖硫酸酯氨基酸鹽使腎衰動物腎臟系數顯著下降；明顯提高腎衰動物的終尿量、尿肌酐的排放量，提高血清總蛋白、白蛋白水平，使其接近正常水平；降低血清肌酐、血清尿素氮水平，減少尿蛋白的排放。病理切片顯示，和模型對照組相比，實驗組動物的腎泌尿功能組織的萎縮、腎小體數量的減少、腎小球體積的增大、腎小球囊腔的擴大、細胞間質的增生等現象得到明顯改善，腫脹、變性、壞死的近曲小管數量減少，遠曲小管擴張程度明顯減輕，腎組織內的棕黑色結晶沉積顯著減少。
3、有益效果本發明與現有技術相比，有以下優點
(1)本產品生產工藝簡單，工藝條件溫和，對設備無特殊要求；產品原材料來源豐富，動物多糖來源于大型哺乳動物和海洋動物，植物多糖取自天然中藥寶庫和海洋資源，真菌多糖原材料——食用菌在我國的年產量占世界總產量的60％以上，2002年產量為876萬噸。生產過程無固體廢料，溶劑可回收套用。因此本發明產品成本低廉，適應低收入腎臟病患者藥物治療的需求。
(2)本產品制備采用樹脂離子交換技術去除多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽中的金屬離子，消除以往多糖硫酸酯產品中金屬離子對腎臟病人造成的不利影響。
(3)本產品水溶性好，易于藥物在體內吸收，有利于制備成各種藥物劑型。
(4)將多糖硫酸酯與氨基酸復合成鹽融合了它們的免疫調節活性和治療慢性腎炎和腎衰竭的藥理活性，并產生正向協同作用，多糖硫酸酯氨基酸鹽對腎功能的保護作用強于多糖硫酸酯或天然氨基酸獨自藥效。
通過上述藥效實驗結果證明多糖硫酸酯氨基酸鹽治療慢性腎炎和腎衰竭疾病的療效是顯著的，茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽對腎功能的保護作用強于茯苓多糖硫酸酯。急性毒理實驗的結果也表明本發明藥物的毒副作用小。
四、具體實施方案結合以下實施例進一步說明多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物、制備方法及對慢性腎炎和腎衰竭疾病的治療作用。
實施例1 多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物的組成(一)茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽L-精氨酸占成品重量百分比為38.4％，茯苓多糖硫酸酯占61.6％。其中茯苓多糖硫酸酯分子量分布范圍為0.6萬-20.0萬，硫酸根含量為48.6％。
(二)海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽海藻多糖硫酸酯占產品重量的百分比為47.6％，混合氨基酸為52.4％。其中海藻多糖硫酸酯硫酸根含量為45.0％，分子量分布范圍為0.5萬-15.0萬；混合氨基酸中，L-鳥氨酸占海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽的重量比為23.8％，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸各占9.5％。
(三)硫酸軟骨素混合氨基酸鹽硫酸軟骨素占產品的重量百分比為57.4％，混合氨基酸占42.6％。其中硫酸軟骨素硫酸根含量為23％，分子量分布范圍為0.5萬-3.0萬；混合氨基酸中，L-賴氨酸、L-鳥氨酸和甘氨酸分別占硫酸軟骨素混合氨基酸鹽的重量比分別為17.8％、16.0％和8.9％。
實施例2 茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽的化學合成制備，其制備步驟如下1、茯苓多糖的提取(1)100g茯苓干粉置于5倍量的1mol/LNaOH稀堿溶液中室溫下浸泡4小時；(2)抽濾分離出粘稠的液體，殘渣用3倍量堿液再提取一次，合并兩次的提取液；(3)提取液以10％的醋酸液中和至pH6，加入3倍量的95％乙醇，于4℃放置過夜，離心分離出沉淀，流水透析兩天；(4)依次用蒸餾水、無水乙醇洗滌后，真空干燥，得63.7g白色粉末。
2、茯苓多糖硫酸酯的制備(1)1000ml平底燒瓶中加入吡啶240ml，冷卻至4℃并攪拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸40ml，制備磺化試劑；(2)向磺化試劑中加入12g茯苓多糖，于75-80℃下劇烈攪拌反應1小時；(3)4N NaOH調pH6，減壓蒸餾去除水和吡啶，一直到蒸干為止；(4)反應瓶中加500ml熱水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脫色；(5)3倍量的95％乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯，無水乙醇洗滌，真空干燥，得淺黃色粉末38.5g；(6)改良的BaSO4濁度法檢測所得產品硫酸根含量，結果為48.6％；硝酸銀法檢測NaCl含量小于0.15％；(7)經醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍染色，以已知分子量范圍的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸為對照品，檢測到所得產品分子量分布范圍為0.6萬-20.0萬。
3、茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽的化學合成制備步驟為(1)100g茯苓多糖硫酸酯溶于蒸餾水成10％溶液，緩慢攪拌加入JK00g氫型強酸樹脂，離子交換反應過程中檢測溶液pH值，當pH至1.3時停止樹脂的加入；(2)過濾分離出樹脂，少量蒸餾水洗滌樹脂2次，洗滌液合并入酸化的茯苓多糖硫酸酯溶液中；(3)用市售的50g L-精氨酸配成10％的溶液；
(4)向酸性茯苓多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入L-精氨酸溶液，成鹽反應過程中監測溶液pH值，當pH至7時停止加入L-精氨酸溶液，L-精氨酸實際用量為43g；(5)活性碳脫色、濃縮、干燥后得淺黃色粉末，重112g；(6)L-精氨酸占成品重量百分比為38.4％，茯苓多糖硫酸酯占61.6％。
實施例3 茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽的化學合成制備1、茯苓多糖和茯苓多糖硫酸酯的制備過程同實施例2；2、100g茯苓多糖硫酸酯去鈉離子的酸化過程同實施例2；3、將50g市售L-鳥氨酸配成20％的溶液；4、向酸性茯苓多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入L-鳥氨酸溶液，成鹽反應過程中監測溶液pH值，當pH至6.5時停止加入L-鳥氨酸溶液，L-鳥氨酸實際用量為44g；5、活性碳脫色、濃縮、干燥后得淺黃色粉末，重124g；6、L-鳥氨酸占成品重量百分比為35.5％，茯苓多糖硫酸酯占64.5％。
實施例4 海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽的物理方法制備，其制備步驟如下1、海藻多糖硫酸酯的制備(1)1000ml平底燒瓶中加入吡啶200ml，冷卻至4℃并攪拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸30ml，制備磺化試劑；(2)向磺化試劑中加入12g市售海藻酸鈉，于80-90℃下劇烈攪拌反應1.5小時；(3)4N NaOH調pH6，減壓蒸餾去除水和吡啶，一直到蒸干為止；(4)反應瓶中加500ml熱水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脫色；(5)3倍量的95％乙醇沉淀海藻多糖硫酸酯，無水乙醇洗滌，真空干燥，得淺黃色粉末30.7g；(6)改良的BaSO4濁度法檢測所得產品硫酸根含量，結果為45.0％；(7)經醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍染色，以已知分子量范圍的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸為對照品，檢測到所得產品分子量分布范圍為0.5萬-15.0萬。
2、海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽的物理方法制備(1)干燥的海藻多糖硫酸酯粉碎成粉末，稱取100g；
(2)分別稱取市售L-鳥氨酸50g，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸各20g，機械混勻成混合L-氨基酸粉末；(3)海藻多糖硫酸酯和混合L-氨基酸粉末混勻即為目的產品，海藻多糖硫酸酯占產品重量的百分比為47.6％，混合氨基酸為52.4％，其中L-鳥氨酸23.8％，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸分別為9.5％。
實施例5 硫酸軟骨素鳥氨酸、賴氨酸、甘氨酸混合氨基酸鹽的化學合成制備1、市售硫酸軟骨素通過BaS2O4濁度法測出硫酸根含量為23％，醋酸纖維素薄膜電泳法測得產品分子量分布范圍為0.5萬-3.0萬；2、100g市售硫酸軟骨素酸化過程同實施例3；3、30g市售L-賴氨酸、27g市售L-鳥氨酸和15g市售甘氨酸以1∶0.9∶0.5的比例配成25％等摩爾的混合氨基酸溶液；4、向酸化的硫酸軟骨素溶液中緩慢攪拌加入氨基酸混合溶液，至溶液pH6.8時停止。實際消耗L-賴氨酸26.3g，L-鳥氨酸23.7g，甘氨酸13.2g；5、活性碳脫色、濃縮、干燥后得白色粉末，重148g；6、硫酸軟骨素占產品的重量百分比為57.4％，混合氨基酸占42.6％。
實施例6 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽急性毒性實驗1、實驗動物 昆明種小白鼠，體重20±2g；2、實驗樣品配制 取茯苓多糖硫酸酯及其L-精氨酸鹽、L-鳥氨酸鹽各6g完全溶解于40ml生理鹽水中，制成濃度為150mg/ml的溶液；3、毒性實驗 每種樣品取小白鼠20只，雌雄各半，每只小白鼠按體重計算一次性灌胃給藥0.04ml/g，相當于6000mg/kg，觀察10天。茯苓多糖硫酸酯及其L-精氨酸鹽、L-鳥氨酸鹽各自給藥后動物均健康生存，經解剖觀察肝、腎等臟器未發現異常。因此多糖硫酸酯及其L-精氨酸鹽、L-鳥氨酸鹽各自對小白鼠口服的最大耐受量在6000mg/kg以上，屬于低毒類物質(標準是LD50＞5000mg/kg)。
實施例7 茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物治療腎衰竭的藥效學實驗
1、腺嘌呤腎衰動物模型 SD雄性大鼠適應1周后，按體重隨機分為5組，每組14只，每天給予腺嘌呤250mg/kg體重，灌胃給藥，每天1次，連續21天。腺嘌呤配成25mg/ml的混懸液，灌胃容量10ml/kg鼠重。另有10只大鼠為正常對照組，不給予腺嘌呤。
2、動物分組 正常對照組，給于等量蒸餾水；模型對照組，給于等量蒸餾水；地塞米松組，0.1mg/kg；茯苓多糖硫酸酯組，500mg/kg；茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組，800mg/kg；茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組，800mg/kg。所有組均灌胃給藥。
3、采樣檢測 造模開始第5天給予藥物治療，每天1次，連續30天。所有動物造模之日稱體重，以后一周稱1次，共稱5次。治療結束時，代謝籠單喂收取12小時尿，期間禁食禁水，量取尿量，測尿總蛋白；蒸餾水稀釋10倍，測定尿肌酐；眼眶靜脈采血，離心取血清，測定肌肝，尿素氮，總蛋白和白蛋白。治療結束眼眶采血后，脫頸椎處死大鼠，剖腹取出腎臟，稱重后，置于10％甲醛溶液固定，HE染色，光鏡觀察。內容包括腎小球、近曲小管、腎髓質、腎間質結締組織及血管，每只動物計數腎皮質被膜下4個視野的腎小球數(×100)，并計算其均值。
4、結果4.1一般情況觀察 正常對照組大鼠被毛光澤，緊密貼身，活動敏捷，食量較多，飲水適量，體重逐步增加，大便呈顆粒狀，尾色淡紅。造模各組大鼠，1周后出現多飲多尿，食量減少，被毛干枯蓬松少光澤，活動減少，精神不振。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽各組與模型組和地塞米松組相比，大鼠活動較多，飲水、尿量多，體重減輕較少，灌胃時掙扎有力。地塞米松組較模型組體重下降快，活動、食量少。各組體重增重情況見表1。
表1 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌呤致腎衰大鼠體重增重的影響組別 第一周(g)第二周(g) 第三周(g)第四周(g)第五周(g)正常對照組268.73±16.32274.80±15.64 291.95±15.91309.13±15.73329.60±14.25269.45±15.86278.57±19.45288.40±22.76模型對照組268.62±18.64260.10±17.96△△ △△ △△246.33±12.40238.33±21.23250.55±21.20地塞米松組277.33±14.59267.04±15.95△△**△△*△△*270.96±19.12282.54±20.33茯苓多糖硫酸酯272.82±17.24261.81±19.26306.16±20.53*△ △273.55±16.79茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組 274.50±14.74268.73±16.58295.64±18.45*311.00±17.41**△315.77±27.25茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組 274.38±16.02260.38±20.73 273.38±26.28295.69±25.83*與模型對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01
4.2死亡情況 造模1周后有動物死亡，多數發生在造模后2-4周內。正常對照組無大鼠死亡，模型組有4只死亡(4/14)，地塞米松組有5只死亡(5/14)，茯苓多糖硫酸酯組有2只死亡(2/14)，茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組有3只死亡(3/14)，茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組有1只死亡(1/14)。
4.3對大鼠腎臟系數的影響 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌呤致腎衰大鼠腎臟系數的影響見表2。
表2 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌嶺致腎衰大鼠腎臟系數的影響組別體重(g) 雙腎重(g) 腎系數(g/100g)正常對照組 329.60±14.252.19±0.19 0.67±0.05模型對照組 288.40±22.76△△9.64±2.78△△ 3.37±1.06△△地塞米松組 250.55±21.20△△*8.16±1.51△△**3.24±0.58△△茯苓多糖硫酸酯 306.16±20.53*7.93±1.64△△*2.58±0.47△△*茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組311.0±17.41**9.25±1.33△△ 2.98±0.42△△茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組315.77±27.25*8.19±1.94△△ 2.58±0.50△△*與模型對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01造模后大鼠腎臟重量顯著增加。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽治療后，腎臟系數較模型對照組有明顯下降，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽效果優于地塞米松。
4.4對血液肌酐、尿素氮、總蛋白和白蛋白的影響 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌呤致腎衰大鼠腎功能的影響見表3。
表3 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌呤致腎衰大鼠腎功能的影響組別Scr(μmol/L) Bun(mmol/L)TP(g/L)ALB(g/L)正常對照組 41.50±7.148.77±1.61 88.69±5.6238.49±3.02模型對照組 78.40±23.14△△ 35.18±4.05△△75.13±4.34△△28.69±3.12△△地塞米松組 135.22±14.75△△**31.24±5.81△△76.46±4.49△△31.44±3.53△△茯苓多糖硫酸酯 132.42±18.73△△**29.66±5.13△△*85.17±5.62**34.59±2.92*茯苓多糖硫酸酯精氨129.64±22.77**△△ 26.62±6.68△△*86.09±5.54**38.74±2.56**酸鹽組茯苓多糖硫酸酯鳥氨113.08±26.41△△**21.89±4.88△△**85.02±6.59**36.79±3.11**酸鹽組與模型對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01
動物造模后，模型對照組與正常對照組相比，血清肌酐(Scr)、尿素氮(Bun)有極為顯著的升高(P＜0.001)，而總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)則表現為明顯的降低(P＜0.01)。經茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽治療后，血清Scr和Bun水平有明顯的降低，其中血肌酐下降更為顯著。茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽降血肌酐和血尿素氮的能力強于茯苓多糖硫酸酯，茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽強于茯苓多糖精氨酸鹽。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽各組明顯升高血清總蛋白和白蛋白，和正常對照組差別已不顯著，且升高的幅度大于地塞米松。
4.5對尿量、尿肌酐和尿蛋白的影響 影響結果見表4。
表4 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌呤致腎衰大鼠尿量、尿肌酐和尿蛋白的影響組別尿量(ml) 尿肌酐(μmol/L) 尿蛋白(mg/L)正常對照組 6.02±1.72 3103.00±746.98 970.00±294.58模型對照組 13.08±2.72△△ 1178.20±388.68△△ 2080.00±500.67△△地塞米松組 14.53±2.61△△ 1730.00±336.64△△*1244.44±335.82**茯苓多糖硫酸酯 16.73±3.83△△*1847.72±352.81△△**1162.92±431.54**茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組21.48±3.94△△**2079.09±408.64△△**1136.36±385.42**茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組18.50±3.08△△**1992.31±495.10△△**1253.85±411.53**與模型對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01動物造模后，尿量大量增多(P＜0.01)，實驗后期，模型組和地塞米松組尿量開始減少，而茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽各組繼續維持高尿量狀態。造模各組經尿排泄的肌酐顯著減少，尿蛋白的排出顯著增加，模型對照組與正常對照組相比，差異極為顯著(P＜0.01)。經茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽治療后，尿肌酐排出顯著增多，尿蛋白排出則明顯減少，尿蛋白和正常對照組相比沒有差異。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽效果優于地塞米松，茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽優于茯苓多糖硫酸酯。
4.6腎臟的病理學檢查 病理切片顯示，和模型對照組相比，各治療組動物腎泌尿功能組織的萎縮、腎小體數量的減少、腎小球體積的增大、腎小球囊腔的擴大、細胞間質的增生等現象得到明顯改善，腫脹、變性、壞死的近曲小管數量減少，遠曲小管擴張程度明顯減輕，腎組織內的棕黑色結晶沉積顯著減少。總體按腎臟病變程度排序模型對照組＞地塞米松組＞茯苓多糖硫酸酯組＞茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽組＞正常對照組。正常對照組每視野腎小球平均為17.8個，模型對照組每視野腎小球平均為6.5個，地塞米松組每視野腎小球平均為6.9個，茯苓多糖硫酸酯組每視野腎小球平均為10.6個，茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組每視野腎小球平均為13.6個，茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組每視野腎小球平均為12.7個。
總之，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對腺嘌呤致腎衰大鼠有很好的腎功能保護作用，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽的保護作用強于地塞米松，且無地塞米松顯著降低實驗動物體重的副作用，茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽的保護作用強于茯苓多糖硫酸酯。
實施例8 多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物的試用實例1、李××，女，60歲，干部。高血壓，高血糖，慢性腎炎。血肌酐1100，血尿素氮28，沒有做血透。服用茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽，每天二次，每次服用2000mg，持續服藥一個月。服藥后療效明顯，起效迅速，體質增強，食欲增加，睡眠質量提高，精神好轉，血肌酐和血尿素氮下降速度快，不反彈。血肌酐下降到850，血尿素氮下降到22。
2、蔡××，男，36歲，企業經理，遺傳性高血壓。后肺部感染誘發急性腎衰，血肌酐1700，血尿素氮38，后即進行腎透析，每周2次。透析一年后服用茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽，開始每天4000mg分二次服用，持續三個月。服藥后療效明顯，食欲增加，精神好轉，血肌酐和血尿素氮下降速度快。血透前檢查血肌酐下降到1200，血尿素氮下降到25。
3、江××，女，52歲，公司職員。糖尿病腎衰早期，嘔吐，惡心。血肌酐1000，血尿素氮25，沒有做血透。服用海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽，每天二次，每次服用2000mg，持續服藥一個月。服藥后療效明顯，起效迅速，血肌酐下降到600，血尿素氮下降到18，惡心癥狀消失。
4、周××，男，46歲，出租車司機。患尿毒癥，口腔有嚴重的氨臭味，皮膚騷癢，惡心，頭暈，血肌酐1500，血尿素氮35，每周血透2次。服用硫酸軟骨素混合氨基酸鹽，每天二次，每次服用2500mg，持續服藥一個月。服藥后療效明顯，血透減少為每周一次，血肌酐下降到950，血尿素氮下降到26，皮膚騷癢、頭暈癥狀減輕。
權利要求
1.一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物，其特征在于它是由多糖硫酸酯聚陰離子載體與氨基酸成鹽形成的復合物，其組分重量百分比為多糖硫酸酯占該復合物10％-95％，氨基酸占該復合物5％-90％。
2.根據權利要求1所述的藥物，其特征在于上述的多糖硫酸酯包括天然多糖硫酸酯和人工半合成多糖硫酸酯，硫酸根占多糖硫酸酯的重量百分比為2％-60％。
3.根據權利要求1或2所述的藥物，其特征在于上述多糖硫酸酯中的多糖包括動物多糖、植物多糖和/或微生物多糖。
4.根據權利要求3所述的藥物，其特征在于所述的微生物多糖優選為真菌多糖，最優選茯苓多糖、豬苓多糖和裂褶菌多糖；動物多糖優選為糖胺聚糖；植物多糖優選為海藻多糖。
5.根據權利要求1所述的藥物，其特征在于成鹽氨基酸種類包括全部天然氨基酸，優選為L-鳥氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
6.根據權利要求1所述的藥物，其特征在于該藥物加入相應的輔料，可制備成片劑、丸劑、膠囊劑和針劑。
7.一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物的制備方法，其特征在于多糖硫酸酯和氨基酸的結合包括在溶液中以分子離子的形式化學合成和/或采用物理方式進行機械混合兩種制備方法，其化學制備方法步驟如下(1)植物多糖的提取采用熱水抽提法，動物多糖、微生物多糖的提取采用酶解和堿提相結合的方法，提取物經脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；(2)多糖硫酸酯的制備采用氯磺酸-吡啶法，反應產物經堿中和、脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；(3)多糖硫酸酯氨基酸鹽制備步驟如下a.多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽配成5％-20％溶液，緩慢攪拌加入氫型酸性樹脂，離子交換去除多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽中的金屬離子，反應過程中監測溶液pH值，當pH至0.5-2時過濾分離出樹脂；b.將氨基酸配成1％-70％的溶液；c.向酸性樹脂處理好的多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入氨基酸溶液，成鹽反應過程中監測溶液pH值，當pH至3-8時停止加入氨基酸溶液；d.活性碳脫色，真空濃縮和干燥，機械粉碎，即得多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物。
8.根據權利要求7所述藥物的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的多糖硫酸酯，其分子量在0.2萬-80.0萬之間，優選0.5萬-30萬。
9.根據權利要求7所述藥物的制備方法，其特征在于步驟(3)中b和c所述的氨基酸，包括一種和/或多種，多糖硫酸酯和一種氨基酸形成多糖硫酸酯單氨基酸鹽，多糖硫酸酯和多種氨基酸形成多糖硫酸酯混合氨基酸鹽。
10.一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物在制備治療慢性腎炎和腎衰竭疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一類多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物及其制備方法，該藥物是由多糖硫酸酯聚陰離子載體與氨基酸成鹽形成的復合物，其中多糖硫酸酯占該復合物的重量比為10％－95％，氨基酸占5％－90％。該類藥物的制備方法，其步驟為(1)多糖的提取；(2)多糖硫酸酯的制備；(3)多糖硫酸酯氨基酸鹽的制備。該藥物由于將多糖硫酸酯與氨基酸復合成鹽，有助于去除多糖硫酸酯制備過程中產生的金屬離子，并融合了它們的免疫調節活性和治療慢性腎炎和腎衰竭的藥理活性，從而產生正向協同作用，使多糖硫酸酯氨基酸鹽對腎病患者腎功能的保護作用強于多糖硫酸酯和天然氨基酸的獨自藥效。此類藥物水溶性好，療效顯著且低毒無副作用，是治療慢性腎炎和腎衰竭疾病的良好藥物。
文檔編號A61K9/20GK1634126SQ20041006476
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月27日 優先權日2004年9月27日
發明者焦慶才, 陳群, 李緒亮, 劉茜 申請人:南京大學