一種滿山紅提取物及其提取方法

專利名稱：一種滿山紅提取物及其提取方法
技術領域：
本發明涉及一種滿山紅提取物及其提取方法，特別涉及滿山紅中提取的一種黃酮類物質及這類黃酮類物質的提取方法。
背景技術：
滿山紅為杜鵑花科植物興安杜鵑的干燥葉(Rhododendron dauricum L)，又稱達子香、映山紅、迎山紅等。是一味藥理作用非常廣泛的天然藥物，中藥滿山紅具有止咳、祛痰、平喘的作用，用于治療急、慢性支氣管炎，哮喘。其有效成份為黃酮類物質。在目前上市的滿山紅產品中，有以滿山紅生藥或粗提取物入藥的制劑，如“滿山紅油滴丸”，“消咳喘糖漿”。以滿山紅入藥的復方制劑有“芩暴紅膠囊”(主要成分滿山紅、黃芩、暴馬子)。
一味中藥通常是由多類成份組成的，比如糖類、氨基酸類、蛋白類、香豆素類、黃酮類、鞣質類、生物堿類、萜類和甾體類等等。常規的提取方法(如用水煎或乙醇提取)，可將其大部分提取出來，但是其真正有活性的物質不一定是所有的成分類別，而常常僅僅是其中的一小類成分起效。因此得到一種盡可能將無效成分去除，而將有效成分盡可能保留的高純度提取物，是中藥現代研究的重點與難點。對其有效成分進一步精制純化是傳統中藥實現現代化的必然趨勢，而國內外已經公開的文獻及專利中未見有高純度滿山紅提取物的報道。
如前所述滿山紅中的有效成份為黃酮類物質。黃酮類物質，化學結構上屬于黃酮類、黃烷醇類、黃烷類、二氫黃酮醇類、花色素類、雙苯吡酮類、異黃酮類、查爾酮類、二氫查爾酮類，橙酮類、高異黃酮類的化合物的單倍體或多聚體化合物及它們與單糖或寡糖形成的苷或其他形式的衍生物的一種或幾種的組合。目前對黃酮類物質往往僅以“總黃酮含量”這一較上位的概念對其性質進行表征。對深層次的，諸如黃酮類物質中究竟是哪些有效成份起作用、這些有效份的含量等不曾認識，不作確切表征。總黃酮含量的測定，通常是采用其中含有的一種主要成份作為代表，采用一種通用的檢測方法將提取物中某一大類成分全部按代表成分的分子量計算；因此測得的總黃酮含量是一種相對值，它受選取代表化合物的分子量、檢測方法等的影響。因此，僅以“總黃酮含量”對黃酮類物質進行表征，難以反映出不同黃酮類物質(如，從不同植物中提取的黃酮類物質或以不同方法從同一種植物中提取的黃酮類物質)的真實特點，不同的黃酮類物質(即使總黃酮含量相同或相近)其包含的具體黃酮類化合物有很大不同，其所反應的藥理、藥性有巨大的差異。提取方法不同，即使是同一種植物，所得的黃酮類物質也不同。因此，以一種完全不同于現有技術的提取方法從某一植物中提取得到的黃酮類物質，從深層次的諸如黃酮類物質的具體構成、含量或者其物理化學參數的角度看，就是一種新物質，不能因為其屬于“黃酮類物質”大類而否認其為新物質。
現有技術已經鑒定出的存在于滿山紅植物中的黃酮類化合物有金絲桃苷、異金絲桃苷、杜鵑素、8-去甲杜鵑素、槲皮素、扁蓄苷、山奈酚、楊梅酮、棉花皮素、黃杉素等。每一種新的提取方法得到的提取物(黃酮類物質)由于包含不同的黃酮類化合物、不同的含量，其藥理、藥性存在很大差異，都是一種新的物質。
已經公開的與滿山紅提取物有關的中國專利主要涉及滿山紅生藥或粗提物在藥物方面的應用，包括以下專利“慢支含片及其制備方法”(CN1265907A)，“滿山紅注射液及其制備方法”(CN1265906A)，“滿山紅油氣霧劑及其制備方法”(CN1097301A)，“芩暴紅止咳膠囊及其制備方法”(CN1165014A)等。上述技術涉及的是滿山紅生藥或粗提物，其含量均小于10％(w/w)，與本發明提取物的特征不同。
目前滿山紅總黃酮提取物制備方法主要還是水煎法、水煎后醇沉法、醇提法、醇提水沉法等，其出膏率較高(一般在20％以上，最低也在15％以上)，特別是分離柱所用材料選用不當，難以將滿山紅提取物中的糖類、鞣質類、氨基酸類、及部分無效黃酮類成分除去，進一步增加了出膏率；這些提取物常具有吸濕性大、服用量大和藥效不明顯的缺點，因此現有提取方法得到的提取物大都為粗提取物；這里出膏率是指單位干燥藥材質量(如100g藥材)制備獲得的最終干燥提取物的質量(如3g)。出膏率越小，表明提取物精制程度越高；但是只有出膏率還不行，因為如果制備的提取物不含活性成分，則出膏率越小，有可能藥理活性會越小。

發明內容
本發明針對目前無法得到確切表征的高純度提取物，因而滿山紅都以生藥或粗提取物入藥的問題，提供一種確切表征的、在醫藥上有突出作用的滿山紅(高純度)提取物。
本發明還針對現有滿山紅提取物的提取方法出膏率高、所得提取物都為粗提物的問題，提供一種高純度滿山紅提取物的提取方法。
本發明是采用如下技術方案實現的一種滿山紅提取物，(1)以金絲桃苷作為代表成分對該提取物進行測定，提取物中總黃酮含量30％——90％；(2)提取物中，金絲桃苷化合物的含量6.3％——42％；(3)提取物中，杜鵑素化合物的含量0.4％——8％；(4)提取物中，槲皮素化合物的含量0.7％——7％。
本發明所述的滿山紅提取物是以全新的提取方法首次從滿山紅中提取出來的一種新物質，以總黃酮含量、金絲桃苷化合物、杜鵑素化合物和槲皮素化合物的含量對其進行確切的表征。目前，以上述表征方式進行表征的黃酮類物質未見相關文獻的報道。
采用滿山紅中含量較高而且分子量居中的黃酮類化合物——金絲桃苷——作為代表成分(分子量為466)，采用公知的三氯化鋁(AlCl3)和乙酸鉀(KAc)作為黃酮通用顯色劑，在紫外可見分光光度儀上的400-420nm處進行測定，這樣避免了因為含量測定方法不統一造成的對提取物定義的分歧。由于中藥材提取物受中藥材產地、采收季節變化和提取方法的不同而有一定的變化，在對滿山紅提取物進行多次測定后，本發明滿山紅總黃酮提取物中總黃酮含量為30％——90％。上述含量測定方法可將不同母核(苷元)的黃酮測定出來。
本發明的總黃酮提取物可以進一步采用常規植物化學方法純化，例如各種色譜柱層析(減壓柱層析，葡聚糖凝膠，反相柱層析，制備性高效液相等)，這些方法對于本領域內技術人員來說是不言自明的。因此本發明提取物定義了四個指標，不論其它單體化合物含量如何，只要是從植物滿山紅中提取，并且四項指標在上述范圍內，則該提取物在本發明的保護范圍內。
上述含量測定方法可將不同母核(苷元)的黃酮測定出來。進一步研究表明，金絲桃苷、杜鵑素和槲皮素具有滿山紅典型的藥理特征。
本發明所表征的滿山紅提取物是首次從滿山紅中提取出來的一種新物質，不僅精制程度高，而且保留了大部分滿山紅的藥理活性，具有止咳、平喘、祛痰的作用等。而且服用量遠小于滿山紅粗體物，其藥理、藥性與滿山紅粗提物相比有顯著區別，具有現代中藥“劑量小、毒性小、副作用小、”“高效、速效、長效”的特點，滿足了醫藥領域長期以來對高效、高純度滿山紅提取物的需求。因此本發明提供的滿山紅提取物在醫藥領域具有極高的利用價值，能夠用于治療和預防急、慢性支氣管炎、哮喘等疾病。
本發明所述的滿山紅提取物是一種高純度的提取物，并且具有顯著的藥理活性；采用合適指標定義了提取物的特征。中藥先進制劑之所以難以開發，難以做到服用方便、攜帶方便，其關鍵就是服量過大，難以制備成先進制劑。本發明的高純度的滿山紅提取物在此方面有著廣泛的用途，具有很好的藥物開發前景，為提取物的進一步開發奠定了基礎。本發明的提取物具有顯著的止咳、平喘、祛痰等作用，一方面有望給患這些疾病的患者提供一種新的治療選擇，另一方面對于更加有效的利用滿山紅植物資源，拓寬滿山紅植物的應用也具有重要意義。
本發明滿山紅提取物藥效學檢測(1)滿山紅總黃酮的提取物止咳作用實驗實驗方法昆明種小白鼠，分為對照組、提取物組和粗提物組，提取物組和粗提物組灌胃給藥(給藥3天，每天1次)，于最后一次給藥后1h，將三組小鼠分別置于倒置的500ml燒杯中，內放一棉球，用1ml注射器吸取氨水(25％～28％)0.2ml，注入棉球，迅速倒置燒杯。觀察記錄小鼠的咳嗽潛伏期和2min內的咳嗽次數。
實驗結果(1)與空白對照組相比，提取物給藥組的咳嗽潛伏期明顯延長，2min內的咳嗽次數明顯降低。
(2)與粗提物組相比，提取物給藥組的服用量顯著減少且止咳效果好于粗提物組。
組別 劑量動物數潛伏期(s) 咳嗽次數(次/2min)空白對照組- 1018.60±5.7126.13±3.91提取物67mg/kg1035.48±7.8614.78±5.07粗提物600mg/kg 1021.36±9.9622.50±10.47(2)滿山紅總黃酮的提取物祛痰作用實驗實驗方法昆明種小白鼠，灌胃給藥(給藥3天，每天1次)，于最后一次給藥后0.5h，由腹腔注射0.25％酚紅液0.5ml，注射后30min脫頸椎處死，仰位固定于手術板上，剪開頸正中皮膚，分離氣管，于喉頭下將頭磨平的7號針頭插入氣管內約3mm，用線結扎固定后，用1cm注射器吸取5％NaHCO30.5ml，通過針頭來回灌洗呼吸道3次(每次不作停留)，將灌洗液注入5ml容量瓶中，重復3次，用5％NaHCO3定容，在546nm處測其紫外吸光度值，依標準曲線計算其濃度值。
實驗結果(1)與空白對照組相比，提取物給藥組動物的呼吸道酚紅濃度顯著升高。
(2)與粗提物組相比，提取物給藥組的服用量顯著減少且祛痰效果優于粗提物組。
組別 劑量 動物數酚紅濃度(μg/ml)空白對照組-101.794±0.270提取物 67mg/kg102.863±0.607粗提物 600mg/kg 102.142±0.312(3)滿山紅總黃酮的提取物平喘作用實驗實驗方法豚鼠，灌胃給藥(給藥7天，每天1次)，于最后一次給藥后1h，依給藥前后順序分別測試豚鼠引喘潛伏期，超過360秒者，記為360秒，記錄發生抽搐的動物數，比較用藥前后變化。
實驗結果(1)與空白對照組相比，提取物給藥組動物的引喘潛伏期顯著延長。
(2)與粗提物組相比，提取物給藥組的服用量顯著減少且平喘效果優于粗提物組。
組別 劑量 動物數 引喘潛伏期(s)空白對照組-866.50±7.73提取物11.5mg/kg880.50±8.50粗提物300mg/kg 870.24±7.78滿山紅提取物的提取方法，包括滿山紅上柱液的制備、上柱液上分離柱分離、對分離柱的洗脫、洗脫液濃縮、干燥；分離柱采用聚酰胺樹脂，上柱液通過聚酰胺樹脂吸附后，先用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌，洗脫液棄取；再用重量濃度為40～90％的溶劑洗脫，至洗脫液與三氯化鋁無黃酮反應，洗脫液備用，其中洗脫所用的溶劑為低級的醇、酮、酯(如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯)的一種或幾種以任意比例組合的水溶液。本發明優選了聚酰胺樹脂作為分離柱材料，可將滿山紅上柱液中的糖類、鞣質類、氨基酸類、及部分無效黃酮類成分等成分除去(即聚酰胺樹脂不吸附這些物質)，而保留有效成分及部分有效黃酮類物質(保留的這部分是當前所未充分認識的)。因此，本發明所述的提取方法使提取物的出膏率得到降低(3％以下)(濃縮率得到提高)。洗脫液的選取及濃度，直接影響最終提取物所含組份和含量，即決定提取方法是否能得到前述表征的提取物；本發明所用的洗脫液及濃度以及聚酰胺樹脂柱的確定是在大量的實驗基礎上得出的，與現有的提取方法相比具有突出的實質性特點，并帶來顯著進步(體現在降低了出膏率，得到了本發明所要求保護的高純度的提取物)。
滿山紅上柱液在靜置后通常含有大量的膠體物質、懸浮的小顆粒不溶物等，這些物質會嚴重堵塞樹脂柱，影響樹脂柱的壽命；其次滿山紅上柱液中含有大量強吸附性物質，聚酰胺對此類物質的吸附力較大，應提前除去，否則也會影響樹脂柱的壽命。為此，本發明在上柱液上柱前，在上柱液中加入澄清劑來進行澄清、純化處理，澄清劑是甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑的其中一種溶液或甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑中的任兩種以1-2∶1-2比例制成的溶液，甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑單獨或兩種組合的用量占滿山紅用量的0.6％-2.4％(g/g)。澄清劑用量少達不到澄清、純化的目的，澄清劑用量過多會造成所需有效成份的損失。
由于上柱液的復雜性，一種澄清劑常常不能達到較好的澄清效果，多需要聯合使用；但采用其中任何一種也可將上柱液澄清，只是效果稍有不同，影響不大。因此本發明在于可采用澄清劑對滿山紅上柱液進行上柱前處理。本發明中的蛋白類澄清劑是指明膠。本發明中的甲殼素類澄清劑是指甲殼素，或以甲殼素為原料的各種衍生物(如脫乙酰甲殼素，也稱殼聚糖)制成的澄清劑。ZTC澄清劑是市場上公開出售的現有產品，其包括A組份和B組份。
本發明采用的聚酰胺樹脂可以是各種粒度范圍的樹脂，也可以是各種顆粒形狀的樹脂如粉末狀、顆粒狀和球狀樹脂。
用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌，主要是除去過量的樣品溶液、不吸附的糖類、氨基酸類、吸附力較弱的苷類和一些小分子酚性物質等，將洗脫液棄取；然后可直接使用重量濃度為40～90％的溶劑洗脫，直至洗脫液與三氯化鋁無黃酮反應；洗脫液濃縮，并將濃縮液進行干燥，可得總黃酮提取物；用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌過度會將所需的有效成份洗掉，洗滌不足不能將不吸附的糖類、氨基酸類、吸附力較弱的苷類和一些小分子酚性物質等充分洗掉，將會影響出膏率。本發明為進一步優化提取方法，用1-5倍樹脂柱體積的水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌。
本發明中的水可以是不加任何物質的純水，也可以是加入適當的改性劑如，少量的酸、堿或鹽，這些都是本領域內的公知共用的方法；本發明中重量濃度為5％-25％的溶劑是指，以水為溶劑的低級的醇、酮、酯等的一種或幾種的組合，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯；也可以加入適當的改性劑如，少量的酸、堿或鹽；本發明中重量濃度為40％-90％的溶劑是指，以水為溶劑的低級的醇、酮、酯等的一種或幾種的組合，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯；也可以加入適當的改性劑如，少量的酸、堿或鹽。本發明優選水為除雜溶劑，50％-85％的乙醇為洗脫劑。
本發明中經純化后的洗脫液采用濃縮、干燥技術后，即可得到高純度的提取物。其中濃縮可采用減壓濃縮、薄膜濃縮等方法；干燥可采用常壓烘干、減壓干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等技術。這些方法均是本領域內的公知公用的方法。
本發明的上柱液制備，采用本領域內公知公用的方法，可用含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮，乙酸乙酯、正丁醇、正己烷或類似物之一種或幾種任意比例的混合物作溶劑，或由這些溶劑與酸、堿配成的酸性或堿性溶劑進行提取，可以經過加熱回流、滲漉、超聲提取、微波提取或高壓提取等方法提取。本發明優選25-85％乙醇回流提取。
以本發明所述的提取方法可得到本發明所述的滿山紅提取物。采用聚酰胺樹脂作為分離手段，可除去大量雜質，因而使有效成分富集、出膏率低，同時完成了除雜和濃縮兩道工序，與傳統方法相比，這種方法的生產周期縮短，產品穩定性增強，而且可除去藥材中的有毒成份和污染的有害金屬或重金屬元素。本發明所述的提取方法優選澄清劑進行上柱液前處理，可明顯延長分離柱的壽命。


圖1為實施例1金絲桃苷HPLC圖譜；圖2為實施例1杜鵑素HPLC圖譜；圖3為實施例1槲皮素HPLC圖譜；圖4為實施例2金絲桃苷HPLC圖譜；圖5為實施例2杜鵑素HPLC圖譜；圖6為實施例2槲皮素HPLC圖譜；圖7為實施例3金絲桃苷HPLC圖譜；圖8為實施例3杜鵑素HPLC圖譜；圖9為實施例3槲皮素HPLC圖譜；具體實施方式
下列具體實施例是對本發明進行更加詳細描述，但不對本發明的范圍構成任何限制。
實施例1.滿山紅提取物的制備1.提取取滿山紅原藥材(干燥莖葉300g)，粉碎，在85℃-100℃的溫度下，以3000ml的40％乙醇水溶液回流提取3次(3000ml×3)，每次1hr，合并提取液，室溫下靜置過夜、過濾，去沉淀，濾液減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)，至總體積1800ml，濃縮液加1％明膠水溶液540ml(相當于5.4克明膠，可制成其它低濃度的明膠水溶液，只要使明膠充分溶解即可)，攪拌，室溫靜置4-8hr，抽濾，棄去殘渣，上清夜過處理好的聚酰胺樹脂柱(柱體積約400ml，流速400ml/hr)，以聚酰胺薄層噴以三氯化鋁95％乙醇溶液顯色，以確證樹脂柱是否吸附飽和；隨后依次以1200ml水，1500ml的50％乙醇水溶液洗脫，洗脫流速約400ml/hr。收集50％乙醇水溶液并減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，75℃烤箱干燥24-72hr，得棕色至黃棕色粉末，滿山紅提取物約為6.0g(含水量≤5％)。
2.含量檢測(1)金絲桃苷的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動相甲醇∶0.5％磷酸水溶液(用三乙胺調PH為3)(45∶55)；流速0.8ml/min；檢測波長355nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖1示，其中保留時間(min)為12-13的為金絲桃苷。滿山紅提取物(實例1)的金絲桃苷含量為16.6％。
(2)杜鵑素的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)，流動相甲醇∶水(60∶40)，流速1ml/min；檢測波長296nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖2示，其中保留時間(min)為16-17的為杜鵑素。滿山紅提取物(實例1)的杜鵑素含量為1.1％。
(3)槲皮素的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)，流動相甲醇∶水∶冰醋酸(50∶50∶2)，流速1ml/min；檢測波長370nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖3示，其中保留時間(min)為10-11的為槲皮素。滿山紅提取物(實例1)的槲皮素含量為3.8％。
(4)總黃酮的含量測定對照品溶液制備精密稱取金絲桃苷對照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，置100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶液適量使溶解，并稀至刻度，搖勻。得每1ml中含無水金絲桃苷60μg的溶液。
供試品溶液制備精密稱取干燥本品(實施例1)適量，置于100ml量瓶中，加入60％乙醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，備用。
測定方法取對照品梯度濃度溶液及供試品溶液，置10ml容量瓶中，經AlCl3和KAc顯色，60％乙醇定容后，按分光光度法(中國藥典2000版附錄IVA)，在418nm處測定吸光度，總黃酮物質含量為48.0％。
實施例2.滿山紅提取物的制備1.提取取產地、采收季節不同于實例1的滿山紅原藥材(干燥莖葉300g)，粉碎，在85℃-100℃的溫度下，以3000ml的60％乙醇水溶液回流提取3次(3000ml×3)，每次1hr，合并提取液，室溫下靜置過夜、過濾，去沉淀，濾液減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)，至總體積1800ml，濃縮液加1％殼聚糖溶液270ml，攪拌，再加入1％明膠水溶液270ml，攪拌，室溫靜置4-8hr，抽濾，棄去殘渣，上清夜過處理好的聚酰胺樹脂柱(柱體積約400ml，流速400ml/hr)，以聚酰胺薄層噴以三氯化鋁95％乙醇溶液顯色，以確證樹脂柱是否吸附飽和；隨后依次以1500ml10％乙醇，1500ml的60％丙酮水溶液洗脫，洗脫流速約400ml/hr。收集60％丙酮水溶液并減壓濃縮(40℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，75℃烤箱干燥24-72hr，得棕色至黃棕色粉末，滿山紅提取物約為4.8g(含水量≤5％)。
2.含量檢測(1)金絲桃苷的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動相甲醇∶0.5％磷酸水溶液(用三乙胺調PH為3)(45∶55)；流速0.8ml/min；檢測波長355nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖4所示，其中保留時間(min)為12-13的為金絲桃苷。滿山紅提取物(實例2)的金絲桃苷含量為20.8％。
(2)杜鵑素的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)，流動相甲醇∶水(60∶40)，流速1ml/min；檢測波長296nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖5示，其中保留時間(min)為16-17的為杜鵑素。滿山紅提取物(實例2)的杜鵑素含量為2.4％。
(3)槲皮素的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)，流動相甲醇∶水∶冰醋酸(50∶50∶2)，流速1ml/min；檢測波長370nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖6示，其中保留時間(min)為10-11的為槲皮素。滿山紅提取物(實例2)的槲皮素含量為4.75％。
(4)總黃酮的含量測定對照品溶液制備精密稱取金絲桃苷對照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，置100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶液適量使溶解，并稀至刻度，搖勻。得每1ml中含無水金絲桃苷60μg的溶液。
供試品溶液制備精密稱取干燥本品(實施例2)適量，置于100ml量瓶中，加入60％乙醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，備用。
測定方法取對照品梯度濃度溶液及供試品溶液，置10ml容量瓶中，經AlCl3和KAc顯色，60％乙醇定容后，按分光光度法(中國藥典2000版附錄IVA)，在418nm處測定吸光度，總黃酮物質含量為60.5％。
實施例3.滿山紅提取物的制備1.提取取產地、采收季節不同于實例1、2的滿山紅原藥材(干燥莖葉300g)，粉碎，在85℃-100℃的溫度下，以3000ml的60％乙醇水溶液回流提取3次(3000ml×3)，每次1hr，合并提取液，室溫下靜置過夜、過濾，去沉淀，濾液減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)，至總體積1800ml，濃縮液加1％ZTC1型澄清劑B組份216ml，攪拌，再加入1％ZTC型澄清劑A組份108ml，攪拌，室溫靜置4-8hr，抽濾，棄去殘渣，上清夜過處理好的聚酰胺樹脂柱(柱體積約400ml，流速400ml/hr)，以聚酰胺薄層噴以三氯化鋁95％乙醇溶液顯色，以確證樹脂柱是否吸附飽和；隨后依次以900ml15％乙醇，1500ml的70％甲醇水溶液洗脫，洗脫流速約400ml/hr。收集70％甲醇水溶液并減壓濃縮(45℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，75℃烤箱干燥24-72hr，得棕色至黃棕色粉末，滿山紅提取物約為3.6g(含水量≤5％)。
2.含量檢測(1)金絲桃苷的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動相甲醇∶0.5％磷酸水溶液(用三乙胺調PH為3)(45∶55)；流速0.8ml/min；檢測波長355nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖7示，其中保留時間(min)為12-13的為金絲桃苷。滿山紅提取物(實例3)的金絲桃苷含量為32.7％。
(2)杜鵑素的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)，流動相甲醇∶水(60∶40)，流速1ml/min；檢測波長296nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖8示，其中保留時間(min)為16-17的為杜鵑素。滿山紅提取物(實例3)的杜鵑素含量為5.83％。
(3)槲皮素的測定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)，流動相甲醇∶水∶冰醋酸(50∶50∶2)，流速1ml/min；檢測波長370nm；進樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖9示，其中保留時間(min)為10-11的為槲皮素。滿山紅提取物(實例3)的槲皮素含量為6.33％。
(4)總黃酮的含量測定對照品溶液制備精密稱取金絲桃苷對照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，置100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶液適量使溶解，并稀至刻度，搖勻。得每1ml中含無水金絲桃苷60μg的溶液。
供試品溶液制備精密稱取干燥本品(實施例3)適量，置于100ml量瓶中，加入60％乙醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，備用。
測定方法取對照品梯度濃度溶液及供試品溶液，置10ml容量瓶中，經AlCl3和KAc顯色，60％乙醇定容后，按分光光度法(中國藥典2000版附錄IVA)，在418nm處測定吸光度，總黃酮物質含量為79.6％。
權利要求
1.一種滿山紅提取物，其特征為(1)以金絲桃苷作為代表成分對該提取物進行測定，提取物中總黃酮含量30％——90％；(2)提取物中，金絲桃苷化合物的含量6.3％——42％；(3)提取物中，杜鵑素化合物的含量0.4％——8％；(4)提取物中，槲皮素化合物的含量0.7％——7％。
2.一種如權利要求1所述的滿山紅提取物的提取方法，包括滿山紅上柱液的制備、上柱液上分離柱分離、對分離柱的洗脫、洗脫液濃縮、干燥；其特征為分離柱采用聚酰胺樹脂；上柱液通過聚酰胺樹脂吸附后，先用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌，洗脫液棄取；再用重量濃度為40～90％的溶劑洗脫，至洗脫液與三氯化鋁無黃酮反應，洗脫液備用，其中洗脫所用的溶劑為低級的醇、酮、酯的一種或幾種以任意比例組合的水溶液。
3.如權利要求2所述的提取方法，其特征為用1-5倍樹脂柱體積的水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌。
4.如權利要求2或3所述的提取方法，其特征為優選水為除雜溶劑，50％-85％的乙醇為洗脫劑。
5.如權利要求2或3所述的提取方法，其特征為在上柱液上柱前，在上柱液中加入澄清劑來進行澄清、純化處理，澄清劑是甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑的其中一種溶液或甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑中的任兩種以1-2∶1-2比例制成的溶液，甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑單獨或兩種組合的用量占滿山紅用量的0.6％-2.4％(g/g)。
全文摘要
本發明為一種滿山紅提取物及其提取方法。滿山紅提取物，(1)以金絲桃苷作為代表成分對該提取物進行測定，提取物中總黃酮含量30％－90％；(2)提取物中，金絲桃苷化合物的含量6.3％－42％；(3)提取物中，杜鵑素化合物的含量0.4％－8％；(4)提取物中，槲皮素化合物的含量0.7％－7％。提取方法采用聚酰胺樹脂分離柱，并用澄清劑對上柱液進行澄清、純化。本發明所表征的滿山紅提取物是首次從滿山紅中提取出來的一種新物質，不僅精制程度高，而且保留了大部分滿山紅的藥理活性，而且服用量遠小于滿山紅粗體物，其藥理、藥性與滿山紅粗提物相比有顯著區別。提取方法采用聚酰胺樹脂作為分離手段，可除去大量雜質，因而使有效成分富集、出膏率低。
文檔編號A61P11/00GK1634324SQ200410064550
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月18日 優先權日2004年11月18日
發明者李青山, 張振杰, 韓玲革, 李曉妮 申請人:李青山