抑制子宮頸癌的融合蛋白的制作方法

專利名稱：抑制子宮頸癌的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種融合蛋白，尤指一種用于抑制子宮頸癌的融合蛋白。
背景技術(shù)：
在臺灣，子宮頸癌發(fā)生率一向高居?jì)D女癌癥首位。一般子宮頸上皮變異或是早期子宮頸癌發(fā)生時(shí)，幾乎沒有任何癥狀，雖然早期治療愈后效果良好，但預(yù)防勝于治療，因此相關(guān)學(xué)者皆以找尋能有效預(yù)防子宮頸癌的方法為目的。
目前已證實(shí)人類乳突病毒(human papillomavirus，HPV)與子宮頸癌的形成息息相關(guān)，是子宮頸癌最主要的致病因子。HPV的某些亞型(如16、18型)的DNA序列已在75％～100％的子宮頸癌病例的癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但其致癌機(jī)制尚未完全清楚。近來發(fā)現(xiàn)HPV的16、18和31高危險(xiǎn)亞型的早期病毒基因產(chǎn)物E6和E7蛋白，極易與Rb和p53基因的產(chǎn)物結(jié)合并中和其抑制細(xì)胞生長的功能，這現(xiàn)象說明了HPV在致癌時(shí)不是單獨(dú)作用的，同時(shí)也需要環(huán)境因素的協(xié)同；且E7蛋白在子宮頸癌細(xì)胞和癌組織細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表現(xiàn)，并在維持轉(zhuǎn)化組織惡性表型的過程中扮演著重要的角色。
腫瘤免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔。參加細(xì)胞免疫的反應(yīng)細(xì)胞主要有細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)、自然殺手細(xì)胞(NK)和巨噬細(xì)胞。CTL被細(xì)胞介白素2(IL-2)啟動后，藉由可被T細(xì)胞識別，位于抗原呈現(xiàn)狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞上的組織兼容性復(fù)合體(majorhistocompatibility compolex，MHC)第一型分子的出現(xiàn)，而釋放某些溶解酶，將腫瘤細(xì)胞殺滅，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。CTL的保護(hù)作用在對抗如HPV導(dǎo)致的腫瘤時(shí)特別明顯，因此，如能通過增加HPV抗原與MHCI型分子的復(fù)合體出現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞的途徑來誘發(fā)屬于具備HPV抗原特異性的CTL如CD8+T細(xì)胞的增殖，則有可能直接針對抑制腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行免疫預(yù)防或治療。
已有研究證實(shí)子宮頸癌可通過施打疫苗來事先預(yù)防，而由于與形成子宮頸癌息息相關(guān)的HPV病毒結(jié)構(gòu)中，E7蛋白常被發(fā)現(xiàn)于癌癥病灶組織或是癌化前損傷的組織，因此具有做為疫苗發(fā)展標(biāo)的的潛力；此外，目前發(fā)展中的DNA疫苗雖然具有長效特性，但是其高成本，高危險(xiǎn)性(病毒本身容易被誘發(fā)突變)的考量仍是限制其發(fā)展的主因；然而，在應(yīng)用E7蛋白做為子宮頸癌的基因治療時(shí)，常由于HPV病毒E7蛋白的弱抗原特性，而無法誘發(fā)良好的免疫反應(yīng)，進(jìn)而無法發(fā)生所預(yù)期的預(yù)防或治療的功效。
一般而言，腫瘤的特異性抗原必須在宿主體內(nèi)經(jīng)過處理后與MHC-I型分子結(jié)合，才能被呈現(xiàn)到細(xì)胞表面以啟動CD8+T淋巴細(xì)胞。有研究顯示子宮頸癌組織中含有HPV16 E7基因，但缺乏能夠呈現(xiàn)出E7基因編碼抗原特定的MHC-I型分子的特定復(fù)合體于抗原呈現(xiàn)細(xì)胞表面，使得HPV16 E7蛋白在宿主體內(nèi)不被呈現(xiàn)而逃過宿主的免疫監(jiān)視。此外，一般做為疫苗的蛋白質(zhì)在進(jìn)入生體中時(shí)，多會被細(xì)胞認(rèn)為是外源抗原，而在還沒發(fā)揮作用的前即分解，而減低了蛋白質(zhì)疫苗的效果，因此必須發(fā)展一種傳輸系統(tǒng)可以有效的將蛋白質(zhì)抗原完整送達(dá)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，同時(shí)又能誘發(fā)生體產(chǎn)生有效性細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可針對特定癌癥誘發(fā)細(xì)胞免疫效果的融合蛋白，尤其是不易誘發(fā)免疫反應(yīng)的弱抗原病毒，本發(fā)明可由有效傳輸系統(tǒng)以及激發(fā)細(xì)胞免疫的過程達(dá)到抑制癌化細(xì)胞增殖的目的，而降低癌化程度甚至達(dá)到預(yù)防癌癥的功效。
本發(fā)明融合蛋白可于接受融合蛋白的生體細(xì)胞中誘生CTL及抗體的保護(hù)作用，進(jìn)而促使被感染的細(xì)胞由于抗原的呈現(xiàn)而被殲滅；本發(fā)明亦提供一種含有抑制子宮頸癌融合蛋白的醫(yī)藥組合物，以期于細(xì)胞發(fā)生癌變的前抑制癌化細(xì)胞增殖，達(dá)到抑制癌癥發(fā)生的目的。
本發(fā)明提供的抑制子宮頸癌的融合蛋白，T細(xì)胞疫苗或含該融合蛋白的醫(yī)藥組合物，包括一段人類乳突狀病毒16型(human papillomavirus，HPV，type 16)的E7蛋白勝太片段；一段具有移位功能的勝太片段；以及一段具羧基終端部分的勝太片段。
于本發(fā)明融合蛋白中，其中人類乳突狀病毒16型的E7蛋白勝太片段的核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1；適用的移位勝太片段可選自常用的任何一種具移位功能的勝太片段，較佳是來自假單胞菌屬外毒素(pseudomonasaeruginosa exotoxin A)的一部分；而羧基終端部分的勝太片段亦可選自常用的任何一種具羧基終端的序列，較佳來自假單胞菌屬外毒素的一部分，且，該羧基終端部分的勝太片段包括KDEL的胺基酸序列，其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.2。
本發(fā)明較佳的融合蛋白胺基酸序列為SEQ.ID.NO.3。
本發(fā)明還提供一種與E7勝太結(jié)合的抗體組成物，其中該E7勝太序列為SEQ.ID.NO.1；利用本發(fā)明抗體組成物，可偵測生體內(nèi)E7勝太片段的出現(xiàn)，并以抗原抗體方式鍵結(jié)的。
本發(fā)明利用細(xì)菌性毒素的特性，使帶有蛋白質(zhì)的細(xì)菌毒素與標(biāo)的細(xì)胞(抗原呈現(xiàn)細(xì)胞)的細(xì)胞膜表面接受器接合，使蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，并發(fā)揮細(xì)菌毒素自然的位移特性，再將蛋白質(zhì)帶至細(xì)胞質(zhì)；此時(shí)，位于細(xì)胞質(zhì)的外源蛋白質(zhì)可被產(chǎn)制成小勝太，并接著與組織兼容性復(fù)合體II或I型分子(MhcII or MhcI)進(jìn)行結(jié)合，而被呈現(xiàn)于抗原呈現(xiàn)細(xì)胞的外部，與MhcII或I結(jié)合者再由CD4+T或CD8+T細(xì)胞辨識，而誘發(fā)一連串的免疫反應(yīng)，使本發(fā)明融合蛋白達(dá)到免疫提升的功效。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可包括根據(jù)技藝中已知的技術(shù)使用適合的佐劑；分散劑或保濕劑(如Tween80)以及懸浮劑調(diào)配無菌注射劑，例如，無菌注射水溶液或含油性懸浮液。無菌注射制劑亦可用于無毒性注射的稀釋劑或溶劑中的無菌注射液或懸浮液，例如，于1，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的載體與溶劑中，有甘露醇、水、Ringer溶液、與等張氯化鈉溶液。此外，常用的使用滅菌、固定油類作為溶劑或懸浮介質(zhì)(例如合成的單酸或二酸甘油酯類)。脂肪酸(例如油酸與其甘油酯衍生物)，以及天然醫(yī)藥上可接受的油類(例如橄欖油或蓖麻油，尤其是其多氧乙基化的型態(tài))，可使用于可注射制劑。此等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其它一般使用的界面活性劑例如Tweens或Spans或其它類似的乳化劑或生體可用率增強(qiáng)劑(一般用于制造醫(yī)藥上可接受的固體、液體、或其它劑量形式)亦可用于調(diào)配的目的。
口服投藥用的組合物可為任何口服上可接受的劑量形式，包含但不限于膠囊、錠、乳劑、及水性懸浮液、分散劑、與溶液。在口服用途的錠劑的例中，一般使用的載體包含乳醣及玉米淀粉。一般亦常添加潤滑劑，例如，硬脂酸鎂。對于以膠囊形式口服投藥而言，可使用的稀釋劑包含乳糖及玉米淀粉。當(dāng)口服投藥水性分散劑或乳劑時(shí)，可使活性成份與乳化劑或懸浮劑組合懸浮或分散于油相中。若需要，可添加特定的甜味劑、風(fēng)味劑、或著色劑。鼻腔噴劑或吸入劑組合物可依據(jù)醫(yī)藥配方的技藝中習(xí)知的技術(shù)制備，及可制成生理食鹽水，使用苯甲醇或其它適合的防腐劑、增加生體可用率的吸收促進(jìn)劑、氟碳化合物、及/或其它技藝中已知的溶解劑或分散劑。含吲哚化合物的組合物亦可以直腸投藥的栓劑形式投藥。
醫(yī)藥組合物中的載體必須為″可接受″，意為與配方中的活性成份相容(及較佳地是能使配方安定)及對接受治療的病患無害。其它載體的實(shí)例包含膠態(tài)二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉、及D&C黃色10號。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例二質(zhì)體構(gòu)筑的流程圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例二的腫瘤生長試驗(yàn)結(jié)果圖。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例六的E7專一性CD8+T細(xì)胞前驅(qū)物的誘發(fā)結(jié)果圖。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例七的E7專一性抗體的檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一、E7核苷酸以及KDEL序的列合成自美國國立生物技術(shù)數(shù)據(jù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中找到HPV16 E7蛋白序列(NC_001526，SEQ.ID.NO.3)，共98個(gè)胺基酸。
利用臺灣專利申請案號92126644所公開的方法，使HPV16E7蛋白可由大腸桿菌系統(tǒng)大量表現(xiàn)出來；改質(zhì)的重點(diǎn)主要在將野生病毒株的核苷酸片段，以在不影響其原本表現(xiàn)出的胺基酸，而又能有效的在大腸桿菌宿主系統(tǒng)中表現(xiàn)的狀況下，進(jìn)行單一核苷酸的改質(zhì)，改質(zhì)后核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1。
本實(shí)施例合成的核苷酸片段，分別利用共8對引子，以聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)進(jìn)行核苷酸片段的合成，所有引子對的序列請見表1，表中有底線的序列表示將與特定的片段發(fā)生互補(bǔ)。
首先利用無DNA模板的聚合方式，只利用F1以及R1引子進(jìn)行核苷酸片段，其中在此二引子的3’端部分各有15個(gè)堿基是設(shè)計(jì)為彼此互補(bǔ)的結(jié)合，再經(jīng)由聚合酵素的讀寫及補(bǔ)足成為一條雙股的DNA模板聚合產(chǎn)物；完成第一次PCR后，取1μl的聚合產(chǎn)物作為第二次PCR的模板DNA，同時(shí)加入F1以及R2引子各4μl，連同所需的dNTPs、反應(yīng)試劑以及Pfu聚合酶等，開始進(jìn)行第二次PCR；接著依照相同方式共進(jìn)行8次的PCR，合成出改質(zhì)后的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)。
以同樣的方式聚合出一段作為訊息勝太的KDEL序列，其引子序列如表1中K3F與K3R；合成出的KDEL核苷酸序列為SEQ.ID.NO.2。
表1、引子對序列表


實(shí)施例二、載體構(gòu)筑將實(shí)施例一中完成聚合反應(yīng)后所獲得的E7產(chǎn)物，利用5％聚丙烯醯氨(polyacrylamide)瓊酯膠體進(jìn)行分離，并以產(chǎn)物分子量為依據(jù)純化萃取出標(biāo)的產(chǎn)物；取pET或pPE(ΔIII)載體(J.R.Chen，C.W.Liao，S，J.T.Mao，and C.N.Weng，Vet.Microbiol.80(2001)347-357)，利用限制酶同時(shí)處理二載體以及純化后E7片段，再同樣以5％聚丙烯醯氨瓊酯膠體進(jìn)行分離純化，取0.3kb含有E7序列的片段，利用T4ligase將E7片段與載體建構(gòu)為一段長度為7.84kb，含綠膿桿菌外毒素A不含酵素毒性部位的PE(ΔIII)基因，以及含E7基因的融合蛋白PE(ΔIII)-E7的質(zhì)體pPE(ΔIII)-E7，以及一段長度為3.83kb，含E7及pET23a的pE7質(zhì)體。
由K3-FK3-R引子所制得的PCR DNA以利用限制酶切割及純化后后，接合至pET23a的Sal1-Xho1位置可以獲得一段長度為3.78kb，含n’-KDELRDELKDEL多生polypeptide基因的pKDEL3質(zhì)體。
以同樣方式，以限制酶Sal1及Pst1在pKDEL3質(zhì)體中將一段長度為1.47kb含KDEL序列切出后接合至以限制酶Xho11及Pst1切割的6.5kb的PE(ΔIII)-E7質(zhì)體DNA上，完成一8.0kb大小含有融合蛋白PE(ΔIII)-E7-KDEL3基因的質(zhì)體pPE(DIII)-E7-K3。上述質(zhì)體構(gòu)筑流程圖請參見圖1。
將上述完成構(gòu)筑的質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)入大腸桿菌JM108菌株中保存。
實(shí)施例三、蛋白質(zhì)純化將上述完成構(gòu)筑的質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)入大腸桿菌BL21(DE3)pLys菌株中，接著將大腸桿菌培養(yǎng)于含有200μg/ml抗生素ampicillin的200ml LB培養(yǎng)液中，直到菌液濃度OD550達(dá)到0.3；接著加入1mM IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside，Promege，USA)，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，將所生長出的細(xì)胞進(jìn)行離心收集；以冷凍解凍反復(fù)操作的方式使帶有目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)略松，此時(shí)加入溶解液10ml(含有0.3mg/ml溶菌酶，1mM的PMSF以及0.06mg/ml的DNaseI)，置于室溫下20分鐘，接著再加入1ml 10％TritonX-100，置于室溫下10分鐘，的后以12000xg離心10分鐘收集蛋白質(zhì)；再分別以與1M與2M的urea進(jìn)行清洗；最后，將所收集到的蛋白質(zhì)包涵體(Inclusion body)溶于8ml的8M urea中。
接著再以市售的pET His-Tag純化系統(tǒng)(Novagen，USA)，依照實(shí)驗(yàn)說明書進(jìn)行如下的實(shí)驗(yàn)將溶于8M urea中的蛋白質(zhì)包涵體倒入已先以4mlNTA-Ni2+配裝完成的瓊酯樹脂管柱中；再將黏接于管柱中的蛋白質(zhì)以不同pH(8.0、7.0、6.5、6.0、5.4以及3.5)的緩沖液(含6M urea、0.3m NaCl、20mM磷酸鹽緩沖液以及20mM Tris-HCl)沖下收集的；最后以SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)純度并定量；此蛋白質(zhì)的胺基酸序列為SEQ.ID.NO.4。
實(shí)施例四、腫瘤細(xì)胞株(TC-1)制備將HPV16-E6、E7及ras致癌基因用以癌化C57BL/6品系的小鼠的主要肺部上皮細(xì)胞，此癌化細(xì)胞株即為TC-1，利用公知方式來維持與生產(chǎn)TC-1細(xì)胞株。將此細(xì)胞株培養(yǎng)于RPMI1640中，同時(shí)添加10％(v/v)胎牛血清，50單位/ml的penicillin或是streptomycin，L-麩醯氨酸(L-Glutamine)2mM，丙酮酸鈉(sodium pyruvate)1mM，2mM非必須胺基酸以及0.4mg/ml G418，培養(yǎng)的條件為37℃，培養(yǎng)箱中維持5％的CO2。
欲使用腫瘤細(xì)胞株的當(dāng)天，以胰蛋白酶處理(trypsin)并收集培養(yǎng)的細(xì)胞，以1X HBSS緩沖液清洗細(xì)胞2次，最后再以1X HBSS稀釋細(xì)胞至欲使用的濃度。
實(shí)施例五、小鼠癌化模式的活體腫瘤試驗(yàn)將所欲進(jìn)行試驗(yàn)的蛋白質(zhì)樣品E7、PE(ΔIII)、PE(ΔIII)-E7、PE(ΔIII)-E7-KDEL3分別以1∶10的比例稀釋于磷酸鹽緩沖液中，使?jié)舛葹?.1mg/ml，先培養(yǎng)于37℃2小時(shí)，使用前再與10％ISA206佐劑(Sepec，F(xiàn)rance)以震蕩方式混合，形成四種不同的疫苗；分別取含有抗原量0.1mg的上述疫苗，同時(shí)進(jìn)行小鼠的免疫，并分別于2周后追加補(bǔ)強(qiáng)一次免疫；在最后一次免疫后一周，取5×104TC-1腫瘤細(xì)胞注射至免疫小鼠的右腿皮下位置以誘發(fā)腫瘤生長，同時(shí)注射一組未經(jīng)免疫的小鼠，以觀察腫瘤的自然生長情形。在誘發(fā)腫瘤生長實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的60天的后，每1至2周進(jìn)行腫瘤生長的目測與觸診。
結(jié)果如圖2所示，接受PE(ΔIII)-E7-KDEL3融合蛋白(■)免疫后的小鼠，在誘發(fā)腫瘤生長試驗(yàn)期間，參與該試驗(yàn)組的小鼠均無腫瘤發(fā)生100％，且持續(xù)觀察了60天皆為同樣現(xiàn)象；相反的，接受E7、PE(ΔIII)、PE(ΔIII)-E7等融合蛋白，以及未接受融合蛋白注射的小鼠組，在誘發(fā)腫瘤生長試驗(yàn)后，最長只有20天維持無腫瘤發(fā)生紀(jì)錄。由結(jié)果可以看出，含有PE(ΔIII)以及KDEL3序列與E7抗原片段的融合蛋白，在TC-1細(xì)胞株誘發(fā)小鼠癌化試驗(yàn)?zāi)Ｊ街锌梢杂行У陌l(fā)揮抑制腫瘤生長的免疫效果。
實(shí)施例六、細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)如上述疫苗免疫的小鼠試驗(yàn)，于一周后犧牲試驗(yàn)小鼠后取其脾臟巨噬細(xì)胞，屬于不同疫苗處理的脾臟巨噬細(xì)胞約含3.5×105的細(xì)胞液與含有一組織兼容復(fù)合體(MHC class I)抗原決定位的E7勝太(第46-57個(gè)胺基酸位置)1μg/ml，一起培養(yǎng)16小時(shí)，再利用CD8+細(xì)胞表面標(biāo)記(surface marker)與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞素IFN-γ的結(jié)合染色反應(yīng)以及流式細(xì)胞儀(FACScan)分析結(jié)果，來觀察各免疫組之間屬于E7專一性的CD8+T細(xì)胞前驅(qū)物的生成差異情形。CD8+細(xì)胞表面標(biāo)記(surface marker)與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞素IFN-γ的染色方法以及使用流式細(xì)胞儀(FACScan)的檢驗(yàn)方法請參見Cheng，et al.，HumGene Ther，13553-568，2002.
于本實(shí)施例中，首度確認(rèn)PE(ΔIII)-E7-KDEL3融合蛋白對于E7專一性免疫的誘發(fā)具有影響力。如圖3所示，在注射PE(ΔIII)-E7-KDEL3融合蛋白此組中，可發(fā)現(xiàn)IFN-γ所制造出具E7專一性的CD8+T細(xì)胞前驅(qū)物，比任何一組實(shí)驗(yàn)組來的高(空白組10.0±1.4，E7組14.0±2.1，PE(ΔIII)組12.0±2.1，PE(ΔIII)-E7組36.0±2.8，PE(III)-E7-KDEL3組564.0±28.0，p＜0.01，AVONA)。由結(jié)果可知PE(III)-E7-KDEL3組可誘發(fā)比E7組高于40倍的具E7專一性的CD8+T細(xì)胞前驅(qū)物。
實(shí)施例七、E7專一性抗體的檢測如實(shí)施例五的免疫動物方法，以0.1mg的E7、PE(ΔIII)、PE(ΔIII)-E7、PE(ΔIII)-E7-KDEL3融合蛋白進(jìn)行小鼠的免疫，并分別于1周與2周后追加補(bǔ)強(qiáng)一次疫苗；在最后一次免疫進(jìn)行后7天收集小鼠血清。
于96孔盤的各孔中覆上100μl的HPV16-E7(0.5μg/ml)融合蛋白，于4℃下培養(yǎng)隔夜；再以含20％胎牛血清的PBS阻覆于培養(yǎng)孔中；將小鼠血清以PBS進(jìn)行連續(xù)稀釋，接著加入培養(yǎng)孔中，于37℃中培養(yǎng)2小時(shí)；再以含有0.05％Tween 20的PBS清洗培養(yǎng)孔后，加入1∶2000的鍵結(jié)有過氧化酶的兔子抗老鼠IgG抗體(peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibody，Zymed，San Francisco，CA)于培養(yǎng)孔內(nèi)，再于室溫下培養(yǎng)1小時(shí)；的后沖洗培養(yǎng)盤，并加入1-Step Turbo TMB-ELISA(Pierce，Rockford，IL)使顏色展開，最后以1M的H2SO4終止反應(yīng)；利用ELISA判讀機(jī)于450nm的吸收光譜下進(jìn)行結(jié)果的判讀。
于本實(shí)施例中，進(jìn)一步以實(shí)驗(yàn)求得PE(ΔIII)-E7-KDEL3可提升抗E7抗體的力價(jià)。如圖4所示，免疫后的小鼠所生產(chǎn)出的抗E7的抗體，于血清中測得的數(shù)值，以1∶100稀釋倍數(shù)來看，空白組為0.629±0.093，E7組0.882±0.086，PE(ΔIII)組0.69±0.06，PE(ΔIII)-E7組0.93±0.06，而PE(ΔIII)-E7-KDEL3則高達(dá)3.593±0.54(p＜0.01，AVONA)，可明顯了解以PE(ΔIII)-KDEL/E7融合蛋白免疫小鼠，將可使小鼠產(chǎn)生高于其它組的抗E7抗體。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分顯示PE(III)-E7-KDEL3融合蛋白具有誘發(fā)E7專一性的免疫反應(yīng)，包括增加E7專一性CD8+T淋巴細(xì)胞以及E7專一性抗體。
所得數(shù)據(jù)皆以平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差值(Mean±SEM)表示。實(shí)驗(yàn)組之間的比較數(shù)據(jù)利用「社會科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包」(Statistical Package for SocialSciences，SPSS 9.0，SPSS Inc，Chicago，IL)進(jìn)行ANOVA變異數(shù)分析，如誤差機(jī)率低于0.05，則表示此數(shù)據(jù)具有顯著差異性。
上述實(shí)施例僅為了方便說明而舉例而已，本發(fā)明所主張的權(quán)利范圍自應(yīng)以申請專利范圍所述為準(zhǔn)，而非僅限于上述實(shí)施例。
序列表<110>生寶生物科技股份有限公司<120>抑制子宮頸癌的融合蛋白<130>P7547/0613<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>310<212>DNA<213>Human papillomavirus type 16<400>1ggaattcatg cacggtgaca ccccgaccct gcacgaatac atgctggacc tccagccgga60aaccaccgac ctgtactgct acgaacagct gaacgactcc tccgaagaag aagacgaaat120cgacggtccg gctggtcagg ctgaaccgga ccgtgctcac tacaacatcg ttaccttctg180ctgcaaatgc gactccaccc tgctgctgtg cgttcagtcc acccacgttg acatccgtac240cctggaagac ctgctgatgg gtaccctggg tatcgtttgc ccgatctgct cccagaaacc300gctcgagaaa 310<210>2<211>18<212>PRT<213>Pseudomonas sp.
<400>2Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Asp Glu Leu Arg Asp Glu Leu Lys Asp1 5 10 15Glu Leu
<210>3<211>297<212>DNA<213>Human papillomavirus type 16<300>
<308>NC_001526<309>2004-07-27<313>(1)..(297)<400>3atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact60gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt120ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag180tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 29權(quán)利要求
1.一種抑制子宮頸癌的融合蛋白，包括一段人類乳突狀病毒16型(human papillomavirus，HPV，type 16)的E7蛋白勝太片段；一段具有移位功能的勝太片段；以及一段具羧基終端部分的勝太片段。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其中該人類乳突狀病毒16型E7蛋白勝太片段的核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其中該移位勝太片段來自假單胞菌屬外毒素(pseudomonas exotoxin)的一部分。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其中該羧基終端部分的勝太片段來自假單胞菌屬外毒素的一部分。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，其中該羧基終端部分包括KDEL的胺基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，其中該羧基終端部分的胺基酸序列為SEQ.ID.NO.2。
7.一種包含抑制子宮頸癌融合蛋白的醫(yī)藥組合物，其中該融合蛋白包括一段人類乳突狀病毒16型(human papillomavirus，HPV，type 16)的E7蛋白勝太片段；一段具有移位功能的勝太片段；以及一段具羧基終端部分的勝太片段。
8.如權(quán)利要求7所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，其中該移位勝太片段來自假單胞菌屬外毒素(pseudomonas exotoxin)的一部分。
9.如權(quán)利要求7所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，其中該人類乳突狀病毒16型的E7蛋白勝太片段的核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1。
10.如權(quán)利要求7所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，其中該羧基終端部分的勝太片段來自假單胞菌屬外毒素的一部分。
11.如權(quán)利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，其中該羧基終端部分包括KDEL的胺基酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，其中該羧基終端部分的胺基酸序列為SEQ.ID.NO.2。
13.一種與E7勝太結(jié)合的抗體組成物，其中該E7勝太的核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種抑制子宮頸癌的融合蛋白，包括一段人類乳突狀病毒16型E7蛋白勝太片段；一段具有移位功能的勝太片段；以及一段具羧基終端部分的勝太片段；本發(fā)明還揭示一種與E7勝太結(jié)合的抗體組成物，其中該E7勝太序列為SEQ.ID.NO.1。
文檔編號A61K39/395GK1740200SQ20041006418
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者章修綱, 廖朝暐, 鄭文芳 申請人:生寶生物科技股份有限公司