專利名稱：臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種物質在治療傷口瘢痕中的應用，更具體地說它是臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應用。
背景技術：
大量的醫學研究結果表明成纖維細胞的增殖和膠原合成具有正性調控效應，它們在瘢痕的形成中具有重要作用，正常的真皮成纖維細胞中某種生長因子及其受體為陰性或低表達，現已證實胎兒創傷的無疤痕愈合與轉移生長因子β(TGFβ)的缺乏直接有關。相反成年人的皮膚創傷后，愈合的纖維化瘢痕特性又與TGFβ的過量和I、III前膠原mRNA表達增強相關。增生性瘢痕成纖維母細胞在傷口愈合時，如果過分活化，分泌大量的TGF-β1，則會造成傷口中累積大量細胞間質，愈合后疤痕顯著。某些對TGF-β1具有拮抗作用藥物能抑制瘢痕疙瘩的形成使這類藥物成為治療瘢痕疙瘩的有效藥物。在創傷愈合及纖維化疾病中應用抗TGFβ的特殊療法可能成為減輕疤痕的形成的有效手段。但由于這類藥物往往又具有較強的毒付效應，因而，其臨床應用受到制約。新近有人用反義技術和RNA干擾技術等方法能有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的體外增殖，誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡，為應用基因藥物方法改善創傷愈合提供了實驗依據。但基因治療技術尚不能完全為醫學工作者認同和患者所接受。
發明內容
本發明的目的在于克服上述背景技術的不足之處而提供一種臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應用，它是一種經濟、簡便、無毒副作用的全新皮膚傷口無疤痕愈合和無功能障礙的應用技術。
本發明的目的是通過如下措施來達到的臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應用，它是在無菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤臍帶血血清，抗凝后放置-30℃冰箱內保存，所述臍帶血血清在用于傷口瘢痕治療中的應用。
本發明方法簡便、經濟、不抑制機體免疫功能，亦無TGF-b基因封閉所致的毒副作用。
圖1為血清作用下巨噬細胞TGF-beta I PT-PCR結果；圖2為血清作用下巨噬細胞TGF-betaR II PT-PCR結果；圖3為血清作用下巨噬細胞TGF-b受體II蛋白Western blot結果；圖4為本發明在體實驗的空白對照組和外周血清組實驗切口愈合后，在切口處取材切片，經HE染色后鏡下觀察到的組織學變化圖，可見組織中纖維母細胞和細胞外基質(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)明顯多于臍帶血清組(圖5)。
圖5為本發明在體實驗的臍帶血清組實驗切口愈合后，在切口處取材切片，經HE染色后鏡下觀察到的組織學變化圖，可見臍血處理組傷口愈合組織中纖維母細胞和細胞外基質(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)較空白對照組和外周血清組(圖4)明顯減少。
具體實施例方式
下面結合附圖和相關實驗對本發明作進一步說明。
1.離體實驗采用小鼠RAW264.7巨噬細胞株為TGF-beta及其受體表達模型，細胞常規培養后接種于6孔板，無血清培養基培養18小時后，按下列分組進行實驗空白對照、LPS(100ng/ml)、10％臍帶血清組。10％臍帶血清作用1小時后，加入LPS(100ng/ml)，4小時后，Trizol(Invitrogen)法提取細胞總RNA。經紫外分光光度法定量后，取4ugRNA進行逆轉錄反應。取1ulcDNA作為模板進行PCR，以actin為內參，觀察各組TGF-beta及其受體的基因表達情況(結果見圖1、圖2)。
從圖1可知正常RAW264.7巨噬細胞TGF-b mRNA呈強表達；LPS輕度抑制TGF-b mRNA表達；臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細胞TCF-b mRNA表達。
從圖2可知正常RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體IImRNA呈強表達；LPS對RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體IImRNA呈強表達幾無影響。臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細胞TGF-b受體II mRNA表達。
小鼠RAW264.7巨噬細胞株常規培養后接種于6cm培養皿，無血清培養基培養18小時后，按上述分組進行實驗。
24小時后提取細胞總蛋白，用于western blot檢測炎癥因子COX-2及TGF-beta受體II蛋白表達水平的檢測。(結果見圖3)
從圖3可知正常RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體II蛋白呈強表達；LPS對RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體II蛋白表達幾無影響。臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細胞TGF-b受體II蛋白的表達。
2.在體實驗選取雄性SD大鼠24只，隨機分為3組(每組8只)空白對照組、外周血清組及臍帶血清組。3％戊巴比妥(3mg/kg)肌肉注射麻醉，背部剪毛后，于無菌條件下，在背部正中作1cm長與脊柱平行的切口，深達筋膜。空白對照組切口內注入0.2ml生理鹽水；外周血清組切口內注入0.2ml健康孕婦外周血清；臍帶血清組切口內注入0.2ml臍帶血清。3-0絲線縫合切口，術后一周每日肌注2萬單位青霉素。4周后處死動物，肉眼觀察切口愈合情況及疤痕大小，切口處取材切片HE染色，鏡下觀察切口處組織學變化。(結果見圖4、圖5)從圖4-1、4-2可知臍血處理組傷口愈合組織中纖維母細胞和細胞外基質(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)較對照組明顯減少。
我們根據胎兒創傷的無疤痕愈合現象得到啟示，創造性研究出臍帶血減輕疤痕的形成的有效方法。體外實驗證實臍帶血能更加有效的抑制巨噬細胞TGFβ的表達，下調TGFβ受體；在體實驗證實傷口局部注射臍帶血能有效抑制I、III前膠原mRNA表達增強，減少瘢痕形成。從而為成年人的皮膚無疤痕愈合創造了一種全新方法。
本方法通過一次性傷口局部注射適量臍帶血血清可有效減少傷口疤痕形成，切口處取材切片，經HE染色證實傷口愈合組織中纖維母細胞和細胞外基質(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)較對照組明顯減少。離體實驗證實臍帶血清可有效減少巨噬細胞TGF-b及其受體基因表達，下調TGF-b受體II。我們認為臍帶血清可能主要通過抑制相關細胞TGF-b及其受體表達，進而抑制膠原纖維和新生血管生成，從而減少傷口疤痕形成。本方法較通過抑制免疫或封閉TGF-b基因等方法具有很大優勢方法簡便、經濟、不抑制機體免疫功能，亦無TGF-b基因封閉所致的毒副作用。
權利要求
1.臍帶血血清在制備用于治療傷口瘢痕藥物中的應用。
2.一種用于治療傷口瘢痕的藥物，其特征在于它是在無菌條件下采集的健康孕婦娩出的胎盤臍帶血血清。
3.制備權利要求2所述治療傷口瘢痕藥物的方法，包括以下步驟a.在無菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤的臍帶血血清；b.抗凝后放置-30℃保存備用。
全文摘要
臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應用，它是在無菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤臍帶血血清，抗凝后放置－30℃冰箱內保存，所述臍帶血血清可用于治療傷口瘢痕。它克服了現有藥物具有較強的毒副效應，因而，其臨床應用受到制約的不足；本發明方法簡便、經濟、不抑制機體免疫功能。為皮膚創傷無疤痕愈合創造了一種全新方法。
文檔編號A61P17/02GK1795872SQ200410061470
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優先權日2004年12月30日
發明者葉篤筠 申請人:華中科技大學