專利名稱：氨基生物蝶呤衍生物及其藥學上的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及到設計與合成具有控制體內一氧化氮自由基(簡寫為NO)過多產生的氨基生物蝶呤衍生物，尤其是具有抑制誘導型一氧化氮合成酶(簡寫為iNOS)作用的氨基生物蝶呤衍生物，用以制備具有預防和治療體內一氧化氮水平升高而產生的各種疾病的藥物。
背景技術：
NO是一種低分子量疏水性的具有高度反應活性的自由基，NO分子可以自由穿過細胞膜，作用于細胞內的靶分子，理論上講NO存在于細胞和組織內任何部位，故能在體內調控多種細胞功能，產生廣泛的生物效應。作為化學介質NO能調節心血管系統具有維持血管平滑肌緊張度，抑制血小板聚集和黏附，調節血管平滑肌細胞的增生，介導巨噬細胞對低密度脂蛋白的氧化修飾等功能。作為神經遞質或神經調質，NO參與信息傳遞包括在中樞神經系統中參與記憶的形成、進行神經與血管之間的協調、參與一些行為調節、維持與強化痛覺；作用于植物神經參與前列腺素介導的交感神經活化作用；在外周神經系統具有特殊的神經信使功能，包括調節胃腸道功能、調節呼吸功能、調節生殖泌尿功能、介導某些神經元性血管舒張作用、抑制嗜鉻細胞釋放兒茶酚胺和作為胰島素分泌過程的重要調質。NO作為病理生理性信使介導炎癥過程和免疫反應的作用已被確立，一方面，NO和O2-，形成超氧負離子ONOO-，產生強大的細胞毒性；另一方面，NO上調使巨噬細胞釋放活性氧中間體和炎癥性細胞因子，對機體起到炎癥介導過程，又起到對細胞生長分化調節作用。NO在炎癥和免疫反應中起著關鍵的損傷和保護雙重作用。
NO水平升高而引起的疾病和病癥主要包括病理性血壓下降，例如敗血癥或出血性休克；用細胞毒素進行腫瘤的化學治療、化學物質或藥物以及慢性肝炎引發的多種肝損傷(即化學性，病毒性和免疫性肝損傷)，肝硬化或肝萎縮，和肝功能衰退；也包括進行性炎癥，如類風濕性關節炎和潰瘍性結腸炎，以及胰島素依賴型糖尿病和器官移植排斥反應等。
另外，下列一些疾病也與誘導產生的NO水平升高有關，在心血管循環方面，如心肌梗塞損傷、病毒性感染引起的心肌炎；在神經和中樞神經方面，如病毒性神經退化(變性)疾病，以及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛等。總之，過量NO產生與許多疾病有關，尤其iNOS的激活產生過多的NO是重要的致病因素，因此，研制iNOS選擇抑制劑是十分必要的。
鑒于NO的廣泛的病理生理功能，其調控劑的研究已成為當代生物醫學和藥學研究的熱點與前沿。內源性的NO的來源是一氧化氮合成酶(NO Synthase，簡寫為NOS)，以L-精氨酸(L_Arginine，簡寫為L-Arg)和分子氧為底物，催化L-Arg中的兩個等價胍基氮之一，經氧化反應生成的，同時生成L-瓜氨酸(L-Citrulline，簡寫為L-Cit)。
至今三種結構獨特的NOS異構酶已被分離、克隆和確定(參見FoerstermannU，Gath I，et al，Biochem Pharmacol，1995，501321-1332)，根據這三種NOS亞型來源于細胞或組織的不同和其表達方式而分別給與不同的命名，如集中于血管內皮細胞中的亞型稱為內皮型NOS(endothelial NOS，eNOS或NOS-III)，存在神經組織中的稱為神經元型NOS(neuronal NOS，nNOS或NOS-I)，這兩種異構酶在細胞處于生理狀態下即有表達，一般來說，它們是通過機體對Ca2+水平的控制而維持在低水平的持續表達狀態，在NO保持在低濃度下發揮生理功能，故常又將eNO和nNOS合稱為結構型NOS(Constitutive NOS，cNOS)。第三種異構酶即所謂的誘導型NOS(inducible NOS，iNOS或NOS-II)，它在巨噬細胞和許多暴露在細胞素下的細胞中表達，并且在對細胞毒素物質產生的早期免疫應答反應方面起到關鍵作用。一般認為iNOS在生理作用下不表達，不依賴于體內的Ca2+水平和調鈣蛋白，重要的是它通過誘導后被合成，如敗血性休克，感染性、免疫性疾病，以及細胞因子，內毒素等許多因素均誘導iNOS大量合成。一旦NO大量的生成，就會產生廣泛的損害。
初期的NOS抑制劑主要是內源性底物L-Arg的類似物，即結構修飾了的L-Arg。在生物化學水平上NOS的一些輔因子已經鑒明，它們有還原性尼克酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FDA)、黃素單核苷酸(FMN)、血紅素和四氫生物蝶呤(BH4)。故除以上L-Arg型的NOS抑制劑外，NOS上其它的結合位置也可以作為藥理學上的靶點，如考慮干擾NOS還原酶區黃素輔酶的結合位點，有人開發了二亞苯基碘鎓(DPI)(參見Griffith OW，Gross SS，InMethods in Nitric Oxide ResearchFeelisch M，Stamler JS，ed；JohnWiley & Sons；New York，1996，p187-208。)和一喹啉類化合物(Fujisawa PharmCo Ltd.，WO 970225，1977)；針對NOS氧化酶區，Griffith和Gross合成出不同類型的吲哚和咪唑作為配體結合到血紅素輔基上，來達到抑制NOS的目的。但是上面介紹的NOS抑制劑都缺乏相當明顯的對iNOS異構酶的抑制選擇性。
生物蝶呤(Biopterin，BP)四氫生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin，BH4)BH4是被第一個發現的，已經被鑒定的最重要的NOS輔酶之一，經iNOS和BH4共結晶的X光衍射結構分析，可以看到在iNOS的氧化酶區有一個帶有血紅素、L-Arg、Phe470、Ser112和Trp457等氨基酸所形成供嵌入BH4的iNOS的蝶啶結合區，在這里BH4分子中的N-3、O4、N-5、C6側鏈和血紅素上的丙酸基、Arg375、Phe470、Ser112等由親水或/和親脂的相互作用(參見Crane BR.et al，Science，1998，2972121-2126)，BH4的輔助作用主要是在iNOS發生催化作用的第一步，即L-Arg轉變為Nω-羥基-L-Arg(NHA)時，向血紅素的丙酰基提供一個電子和BH4的3，4-酰胺上的一個氫質子(參見Crane BR，et al，Biochemistry，2000，394608-4621)。
雖然目前對BH4催化NOS的機制還沒有完全研究清楚，但是有關研究已表明NOS以二聚體的形式才能發揮作用，而BH4對iNOS二聚體組裝及穩定性起關鍵作用(Alderton WK，Cooper CE，Knowles RG，et al.Nitric Oxide SynthaseStruture，Function and Inhibition[J]，Biochem J，2001，357593-615)；BH4能催化促進各種NOS達到最大催化活性，哺乳動物生物體內BH4生成越多，NOS的催化活性越高(參見Gross SS，Levi RJ，Biol Chem，1992，26725722)；細胞因子，內毒素等也能誘導BH4的大量生成，其原因是在生物體內有從頭合成和補救合成兩條途徑來合成BH4，而BH4的從頭合成的關鍵酶GTP環水解酶和iNOS一樣，其表達也受內毒素或細胞因子誘導，從而會增加細胞中的BH4的產生和水平的提高。有關BH4的研究還表明BH4是芳香氨基酸羥化酶的輔因子，而這些氨基酸羥化的產物是人體合成神經遞質的原料，直接抑制體內BH4的生物合成必然會引起嚴重的副反應。然而，BH4對NOS的催化機理同催化芳香氨基酸羥化酶的機理是不同的(Thny B，Auerbach G，Blau N；Tetrahydrobiopterin biosynthesis，regeneration and functions，Biochem.J.2000，3471-16.)在蝶啶化合物中，蝶呤類化合物(4-羰基化合物)和大多數4-氨(胺)基化合物都是芳香氨基酸羥化酶的輔因子(Kappock TJ，Caradonna JP，Pterin-Dependent Amino Acid Hydroxylase，Chem.Rev.1996，96，2650-2756)，故氨基生物蝶呤類NOS抑制劑不會對芳香氨基酸羥化酶產生不良影響。另外研究表明，BH4對iNOS的催化活性遠強于對另外兩種NOS催化活性(Gibraeil HD，Dittrich P，Saleh S，et al.Inhibition ofendotoxin-induced vascular hyporeactivity by 4-amino-tetrahydrobiopterin.British J.of Pharmacology，2000，1311757-1765)。因此，BH4與其iNOS的結合區可作為理想的選擇性藥理干預靶點，基于此思想，我們設計合成了一系列的氨基生物蝶呤類衍生物，結構式用分子式(I)表示。這些氨基生物蝶呤類衍生物可和BH4競爭地結合到iNOS中的BH4結合區，從而改變iNOS結構或電學性質，達到抑制iNOS活性的目的。經過生物活性測試的結果表明，氨基生物蝶呤類衍生物具有抑制iNOS活性的作用，可用于處理iNOS體內過量表達導致NO升高而引發的疾病。
發明內容
本發明要解決的技術問題就是設計與合成具有控制體內一氧化氮自由基(簡寫為NO)過多產生的氨基生物蝶呤衍生物，尤其是具有抑制誘導型一氧化氮合成酶(簡寫為iNOS)作用的氨基生物蝶呤衍生物，用以制備具有預防和治療體內一氧化氮水平升高而產生的各種疾病的藥物。
以BH4為靶點，合成較好的iNOS的抑制劑必須滿足以下條件(1)抑制劑應是BP類似物，這樣才有可能適應iNOS中的BH4結合區結構上的需求；(2)所合成的BH4衍生物可以是非還原型的BP類似物，并且在BP的4-位和6-位的1，2-二羥基丙基上有較多的修飾基團的變化，其作用和BH4競爭地與iNOS結合。根據這兩點，本發明提供了一般通式為(I)的氨基生物蝶呤類衍生物能成為iNOS抑制劑。
下述通式(I)表示氨基生物蝶呤衍生物或其藥學上可接受的鹽或其水合物 R1和R2相同或不同，各自獨立的表示有取代基、無取代基的C1-C6直鏈、支鏈烷基或芳基；芐基；R1、R2、R3和R4不同時為H；R1為H或甲基時，R2代表有取代基的或無取代基的三元～六元環烷基；-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5與R6相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪環單或二取代氨基。
R3和R4相同或不同，各自獨立的表示H、C1-C6直鏈或支鏈烷基；各種取代的酰基R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9為C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10為相同或不同的C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其藥學上可接受的鹽、水合物，其中較好的是R1和R2相同，為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、芐基；R1代表H時，R2為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、環丁基、環己基、芐基、-CH2CH2OH。
R3和R4相同或不同，各自獨立的表示H、C1-C6直鏈或支鏈烷基；各種取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9為C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10為相同或不同的C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；或者NR1R2代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪環胺基。
氨基生物蝶呤衍生物I或其藥學上可接受的鹽、水合物，其中更為合適的是R1和R2相同，為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、芐基；R1代表H時，R2為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、環丁基、環己基、芐基、-CH2CH2OH；R3、R4代表H、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基。
以上所述的烷基、烷氧基、和胺基中的烷基可以是直鏈的烷基，或是有側鏈的烷基，或是環狀烷基。在分子式中如果出現立體異構體，則本發明中的化合物包括這些全部的互變異構體和立體異構體。
由前述通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其藥學上可接受的鹽、水合物在制備抑制誘導性一氧化氮合酶藥物中的應用。
前述通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其藥學上可接受的鹽、水合物在制備抑制誘導性一氧化氮合酶藥物中的較具體的應用是制備在敗血性和(或)出血性休克，或用細胞毒素進行腫瘤化學治療，肝硬化或肝萎縮和(或)肝功能衰退時所引起的血壓下降或(和)止血障礙藥物。更進一步的應用，是制備預防和治療炎癥疾病藥物；是制備預防和治療異體器官和組織移植的排斥反應藥物以及胰島素依賴型糖尿病藥物；是制備預防和治療細胞毒素進行腫瘤的化學治療、化學物質或藥物以及慢性肝炎引發的多種肝損傷、肝功能衰退以及預防和治療心肌梗塞損傷、病毒性心肌炎藥物。所述的應用還包括，是制備預防和治療病毒性神經退化、變化疾病及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛藥物。
藥物組合物，其中含有治療有效量的通式(I)氨基生物蝶呤衍生物或其藥學上可接受的鹽或其水合物，并含有常規藥用載體。
本發明所用的通式I表示的化合物可以它們的中性形式，也可以和無機酸或者有機酸加成形成相應的鹽使用，對藥物中所能用的酸包括有如鹽酸、溴化氫、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸等。通式II表示的化合物可和多摩爾的酸加成形成鹽，這些多摩爾的酸可以是單一的也可以是組合的，這主要根據需要用相應的溶劑或稀釋劑的情況來決定。這些鹽也可以它們的水合物形式存在。這些加成的鹽可通過陰離子交換而去除。
本發明所涉及的氨基生物蝶呤衍生物和它們相應的鹽類可和適合輔料(包括相應的醫藥上準許應用的賦形劑、粘合劑、緩釋劑、穩定劑、香料、調味劑和色素等)做成片劑或膠囊口服，也可做成相應的針劑用于臨床。
對本發明中的通式I氨基生物蝶呤衍生物抑制iNOS活性的測定，根據已知的測定方法(參見鐘慈聲，孫安陽 主編一氧化氮的生物醫學，上海上海醫科大學出版社，1997，p.361-363，381-385)進行。
本發明通式I所表示的化合物是本發明首次合成的新化合物，均經過各種分析方法進行了結構鑒定，包括1H-NMR、MS、和元素分析。所有氨基生物蝶呤衍生物都是按照或者參照已發表的Viscontini方法進行合成(參見Schircks B，Bieri JH，Viscontoni M；Helv Chim Acta，1985，681639-1643)。
通式I化合物的合成有以下步驟(1)中間體2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)的合成
式中NR1R2＝N(C2H5)2；HNCH(CH3)2；N(CH2CH2)2NCH3；HN(CH2)5；HNCH(CH2)2；HNCH(CH2)5；HNCH2CH2CH2CH3；N(CH2CH2CH2CH3)2；HNCH2CH2OH；HNCH2C(CH3)3等(與權力要求1中一致)。
首先將對氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶結合生成2，6-二氨基-4-氯-5-對氯苯偶氮嘧啶，接著用取代胺取代氯，所得的化合物用鋅粉在酸性條件下還原偶氮基得化合物2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(嘧啶衍生物的合成方法參考Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121。)(2)中間體2，3，4-三乙酰氧基-5-脫氧阿拉伯苯腙(B)的合成 出于簡化制備操作的目的，采用了“一鍋煮”的方法首先，將L-鼠李糖與乙硫醇在低溫下縮合成縮硫醛，以有機酸(甲酸，乙酸等)為介質用雙氧水氧化分子中的硫原子，形成二乙磺酰基L-鼠李糖，此化合物在pH＝9～10的水溶液中脫去一分子的CH2(SO2CH2CH3)2生成5-脫氧阿拉伯糖④。將5-脫氧阿拉伯糖與苯肼反應后再經過乙酰化即得(B)。
表 設計合成的氨基生物蝶呤衍生物編號和對應結構 (3)目的化合物的合成
將前面制得的中間體(A)和(B)同醋酸鈉，保險粉在醇水溶液中縮合后，經用I2的醇溶液進行芳構化，得產品11，12，進一步皂化水解得產品1-10。因部分中間體易于被氧化，所以反應過程中必要的步驟需在氮氣保護下進行。
具體實施例方式
1.合成中間體(A)按照文獻(Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121)方法制備。
中間體(B)的制備(主要參見專利EP A1 0153095和文獻Schircks B，Bieri JHand Viscontoni M；Helv Chim Acta，1985，681639-1643.)L-鼠李糖二乙基縮硫醛②取L-鼠李糖一水合物40克加入到40mL 37％的濃鹽酸中，0℃下快速攪拌中再加入60mL乙硫醇，約15分鐘后有大量固體生成，產物略帶粉色。繼續攪拌15分鐘后加入50mL水攪拌，過濾水洗，五氧化二磷真空干燥，得白色固體②39克，m.p183-184℃，收率66.8％。
1，1-二乙磺酰基-L-鼠李糖③取L-鼠李糖二乙基縮硫醛②2.7克(0.01mol)溶于10mL乙酸中冷卻到0℃，控溫在0℃以下滴加5.1克30％H2O2(0.08mol)，加畢維持溫度1小時后升到室溫下反應48小時。反應完畢減壓蒸去乙酸和過量的雙氧水，得無色或淺黃色粘稠液③，用于下一步。
5-脫氧-L-阿拉伯糖④將上一步制得的產品③溶于20mL水中，用濃氨水調pH＝9.5，于室溫下攪拌24小時，有白色固體[脫下來的CH2(SO2CH2CH3)2]生成，過濾，用20mL氯仿萃取12小時，將水層減壓蒸去水得黃色油狀物，即產品④，產率為65％(以②計算)。
5-脫氧-L-阿拉伯糖苯腙⑤將上步制得的產品④(0.0075mol)溶于20mL甲醇中。取苯肼0.89克(0.00825mol)加入到④的甲醇液中，再加入一滴冰醋酸，氮氣保護下于室溫攪拌反應2小時。真空濃縮蒸干后得橙紅色粘稠液。將此粘稠液用乙醚洗兩次(10mL/次)得橙色固化物，將此固體物溶于50mL乙酸乙酯中，用水洗兩次(50mL/次)，乙酸乙酯液用無水硫酸鈉干燥后，蒸干得橙色固體⑤1.91克(含有溶劑乙酸乙酯，到此總收率按②算為45％～50％)。
2，3，4-三乙酰氧基-5-脫氧-L-阿拉伯糖苯腙(B)將上步制得的產品1.91克⑤溶于10mL吡啶中，0℃以下滴加10mL乙酸酐，加畢氮氣保護下保溫攪拌30分鐘后，升至室溫反應5小時，減壓濃縮后，低溫下溶于50mL甲醇中得產品(B)的甲醇溶液，備用。
2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(1)的“一鍋法”制備第一步縮合配制1.97克(0.024mol)NaAc，1.0克NaS2O4的40mL水溶液和1.67克(0.006mol)2，6-二氨基-4-二乙基胺基嘧啶鹽酸鹽，1.0克NaS2O4的60毫升水溶液，并先后加入上步制得的2，3，4-三乙酰氧基-5-脫氧-L-阿拉伯糖苯腙(按0.005mol計)甲醇液中，攪拌，在氮氣保護下于35-40℃反應36小時。
第二步芳構化方法1室溫下滴加I2/MeOH溶液，如淀粉碘化鉀試紙檢測碘過量，室溫下反應3小時后，加入少量NaS2O4除去過量的碘，減壓蒸干，再加入50mL甲醇溶解，濾去不溶物，減壓蒸干后200～300目硅膠后柱層析(氯仿∶甲醇＝20∶1)。收集含產品部分。
方法2室溫下攪拌并通入氧氣24-48小時，芳構化完全后減壓蒸干，再加入50mL甲醇溶解，濾去不溶物，減壓蒸干后200～300目硅膠后柱層析(氯仿∶甲醇＝20∶1)。收集含產品部分。
第三步分離將芳構化所得的產品經硅膠(100～200目)柱層析(氯仿∶甲醇＝40∶1，20∶1)，得淡黃色固體，丙酮重結晶得淡黃色固體2-氨基-4-二乙基氨基-6-〔(1S，2R)-二乙酰氧基〕蝶啶(11)0.15克，總產率4.0％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p165-167℃。ESI-MS377.4[M+H]+，753.5[2M+1]+(C17H24N6O4，Mr＝376.4)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.18(d，J＝6.54Hz，3H，3’-CH3)；1.19(bm，3H，N4-CH2CH3)；1.28(bm，3H，N4-CH2CH3)；1.97(s，3H，CH3-(OAc-2’))；2.28(s，3H，CH3-(OAc-1’))；3.83(bm，2H，N4-CH2CH3)；4.15～4.33(bm，2H，N4-CH2CH3)；5.33(m，1H，CH-2’)；5.96(d，J＝4.33Hz，1H，CH-1’)；8.86(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC17H24N6O4·H2O(394.4)C51.77，H6.65，N21.30；FoundC52.21，H6.65，N20.75。
第四步水解方法1將含產品11部分，溶于20mL甲醇和20mL濃氨水的混合液中于50℃下反應3-5小時，反應完畢減壓蒸干，用30mL水溶解，用濃鹽酸調pH＝1，濾去不溶物，用稀NaOH/H2O調pH＝8減壓蒸干，硅膠(200～300目)柱層析(氯仿∶甲醇＝20∶1～10∶1)。得黃色固體，用甲醇-丙酮重結晶得淡黃色粉末狀產品2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(1)，m.p154-156℃。
方法2將含產品11部分，溶于40mL濃氨水中于50℃下反應1-3小時，反應完畢減壓蒸去氨氣，濾去不溶物，處理后硅膠(200～300目)柱層析(氯仿∶甲醇＝10∶1)。得淡黃色固體，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色固體粉末2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(1)0.5克(0.00152mol)，m.p154-156℃。總收率為15.3％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)；ESI-MS293.2[M+H]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(AV-300，D6-DMSO)δ1.05(d，J＝6.31Hz，3H，CH3-3’)；1.24[t，6H，N4-(CH2CH3)2]；3.98-3.88[bm，4H，N4-(CH2CH3)2]；3.94(m，1H，CH-2’)；4.38(d，J＝5.48Hz，1H，CH-1’)；8.86(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC13H20N6O2·HCl(358.81)C，43.51，H，5.90 N，23.41；FoundC，43.23 H，5.71 N，22.822-氨基-4-異丙基氨基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(2)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色固體粉末(2)0.13克，總產率4.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p185-189℃；ESI-MS279.1[M+H]+，301.1[M+Na]+(C12H18N6O2，M＝278.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.13(d，J＝6.30Hz，3H，CH3-3’)；1.25[d，J＝6.6Hz，6H，N4-CH(CH3)2]；4.43-4.35[m，2H，CH-1’，N4-CH(CH3)2]；3.94(m，1H，CH-2’)；4.39(d，1H，CH-1’)；8.68(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC12H18N6O2·HCl(314.70)C，45.84 H，6.09 N，26.71；FoundC，45.33 H，6.51 N，26.532-氨基-4-(4-甲基)哌嗪胺基-6〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(3)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體0.15克，產率4.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p189-192℃；ESI-MS320.1[M+H]+，342.2[M+Na]+(C14H21N7O2，M＝319.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.08(d，J＝6.27Hz，3H，CH3-3’)；2.27(s，3H，NCH3)；2.54～2.49[m，4H，(-CH2)2NCH3]；3.90(bs，1H，CH-2’)；4.37(bs，1H，CH-1’)；4.30[bs，4H，N4(CH2-)2]；4.61(bs，1H，OH-2’)；5.50(bd，1H，OH-1’)；6.62(bs，2H，N2H2)；8.70(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC14H21N7O2·0.5HCl·0.5CH3OH(353.62)C49.25，H6.70，N27.73；FoundC49.52，H6.70，N27.45.
2-氨基-4-吡嗪氨基-6-〔(1S，2R)-二乙酰氧基〕蝶啶(12)方法參見(11)的制備，將芳香化所得的產品經硅膠(100～200目)柱層析(氯仿∶甲醇＝40∶1～20∶1)，得淡黃色粉末固體，丙酮重結晶得產品(12_1)0.15克，產率3.9％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p170-172℃；ESI-MS389.1[M+H]+，411.1[M+Na]+(C18H24N6O4，M＝388.1)；1H-NMR(BrukerAV-300，D6-DMSO)δ1.17(d，J＝6.60Hz，3H，CH3-3’)，1.64[bm，6H，N4(CH2)2(CH2)3]；4.20[bs，4H，N4(CH2)2(CH2)3]，1.95[s，3H，CH3-(OAc-2’)]；2.12[s，3H，CH3-(OAc-1’)]；5.31[m，1H，CH-2’]；5.81[d，J＝4.5Hz，1H，CH-1’]；6.72(b，0.3H，N2H2)；8.65(s，1H，CH-7)Anal Calcd forC18H24N6O4·H2O(406.44)C，53.19 H，6.45 N，20.68；FoundC，53.46 H，6.28 N，21.212-氨基-4-吡嗪胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(4)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體0.52克，產率16.4％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p160-161℃；
ESI-MS305.1[M+H]+，327.1[M+Na]+(C14H20N7O2，M＝304.1)；1H-NMR(BrukerAV-300，D6-DMSO)δ1.06(d，J＝6.30Hz，3H，CH3-3’)；1.68[s，6H，N4(CH2-)2(-CH2)3]；3.91(m，1H，CH-2’)；4.41(d，J＝4.50Hz，1H，CH-1’)；4.31[bs，4H，N4(CH2-)2]；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.65(d，1H，OH-1’)；7.0-7.4(bs，2H，N2H2)；8.72(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC14H20N7O2·2HCl(377.46)C，44.55 H，5.87 N，22.26；FoundC，43.69 H，5.84 N，21.912-氨基-4-環己基胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(5)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體產品0.27克，產率8.5％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p120-125℃；ESI-MS319.1[M+H]+(C15H22N6O2，M＝318.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.14(d，J＝6.18Hz，3H，CH3-3’)；1.17-2.07[m，10H，N4-CH(-CH2-)5]；3.81(m，1H，CH-2’)；4.45(m，1H，CH-1’)；4.13(m，1H，N4-CH)；4.69(s，1H，OH-2’)；5.54(d，1H，OH-1’)；7.0-7.7(bs，2H，N2H2)；8.54(bd，1H，N4H)；8.75(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC15H22N6O2·2.5HCl·0.5C2H5OH(432.56)C，44.43 H，6.39N，19.42；FoundC，44.16 H，5.62 N，19.232-氨基-4-環丙胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(6)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體產品0.35克，產率12.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p198-200℃(分解)；ESI-MS277.1[M+H]+(C12H16N6O2，M＝276.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.13(d，J＝6.22Hz，3H，CH3-3’)；0.73-0.82[m，4H，N4-CH(-CH2)2]；3.04(m，1H，N4-CH)；3.78(m，1H，CH-2’)；4.41(d，J＝6.47Hz，1H，CH-1’)；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.43(bs，1H，OH-1’)；6.84(bs，2H，N2H2)；8.29(bs，1H，N4H)；8.71(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC12H16N6O2·0.5HCl·CH3OH(326.57)C，47.81 H，6.32 N，25.73；FoundC，47.87 H，5.85 N，25.982-氨基-4-正丁基胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(7)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體產品0.15克，產率5.1％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p178-187℃(分解)；ESI-MS293.2[M+H]+，315.2[M+Na]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.25Hz，3H，CH3-3’)；0.93(t，J＝7.44Hz，3H，N4-CH2CH2CH2CH3)；1.35(m，J＝7.32Hz，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；1.61(m，J＝7.41Hz，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；3.48(m，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；3.86(m，1H，CH-2’)；4.40(d，1H，CH-1’)；4.63(d，J＝5.39Hz，1H，OH-2’)；5.42(s，1H，OH-1’)；6.62(bs，2H，N2H2)；8.14(bs，1H，N4H)；8.70(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC13H20N6O2·0.5H2O(301.35)C51.77，H7.03，N27.89；FoundC51.85，H7.17，N27.30。
2-氨基-4-二正丁基胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(8)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體產品0.31克，產率8.6％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p178-185℃(分解)；ESI-MS349.1[M+H]+，371.2[M+Na]+(C13H20N6O2M＝348.1)；1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.07(d，J＝6.28Hz，3H，CH3-3’)；0.95[t，J＝7.37Hz，6H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；1.37[m，J＝7.37Hz，4H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；1.70[m，J＝7.37Hz，4H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；3.75-4.25[bm，5H，N4(CH2-)2，CH-2’]；3.86(m，1H，CH-2’)；4.43(d，J＝5.35Hz，1H，CH-1’)；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.58(bs，1H，OH-1’)；6.83(bs，2H，N2H2)；8.72(s，1H，CH-7)；Anal Calcd forC17H28N6O2·1.75H2O(348.45)C，53.74 H，8.36 N，22.12；FoundC，54.12 H，8.36 N，21.632-氨基-4-(2-羥基乙基)胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶(9)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體產品0.23克，產率8.2％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p215-218℃(分解)。
ESI-MS281.0[M+H]+，303.1[M+Na]+(C11H16N6O3，M＝280)1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.24Hz，3H，CH3-3’)；3.65-3.58[m，4H，N4-CH2CH2OH]；3.89(m，1H，CH-2’)；4.47(d，1H，CH-1’)；4.72(bs，1H，OH-2’)；4.91[bs，1H，N4CH2CH2OH]；5.63(bd，1H，OH-1’)；7.25-7.75(bs，2H，N2H2)；8.81(s，1H，N4H)；8.79(s，1H，CH-7)；Anal Calcd forC11H16N6O3·HCl(316.64)C，41.69 H，5.41 N，26.54；FoundC，41.81 H，5.63 N，26.72
2-氨基-4-異丁氨基胺基-6-〔(1S，2R)-二羥基丙基〕蝶啶鹽酸鹽(10)方法同于(1)的制備，用甲醇-丙酮重結晶，得黃色粉末固體產品0.39克，產率12.0％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②計算)，m.p275-280℃(分解)；ESI-MS293.2[M+H]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.24Hz，3H，CH3-3’)；0.93[d，6H，N4CH(CH3)2]；2.08(m，1H，N4CH2CH)；3.39-3.44(m，2H，N4CH2-)；3.92(m，1H，CH-2’)；4.54(d，J＝5.79Hz，1H，CH-1’)；4.79(bs，1H，OH-2’)；5.77(bs，1H，OH-1’)；7.89(bs，1H，N2H)；8.73(bs，1H，N2H)；8.85(s，1H，CH-7)；9.71(t，1H，N4H·HCl)；13.09(bs，1H，N4H·HCl)；Anal Calcd forC13H20N6O2·HCl·1.5H2O(355.2)C43.92，H6.81，N23.65；FoundC43.80，H6.73，N23.84。
表 設計合成目標化合物的編號和對應結構 2.誘導型一氧化氮合成酶抑制劑活性的研究
2.1樣品與試劑氨基生物蝶呤衍生物本發明中合成的14個化合物，其中13個進行了iNOS的抑制活性研究，化合物121沒有進行活性測試。活性測定是以水作溶劑進行的，將藥品配制成DMSO溶液，按需要量取一定量的用水進行稀釋，或加入到測定溶液中。
誘導型一氧化氮合成酶Rcombinnation from E.Col是Cayman Chenical公司產品。
四氫生物蝶呤(Tetrohtdro-L-biopterin)二鹽酸鹽，純度＞99％，由CaymanChenical公司提供。
一氧化氮合成酶試劑盒由南京建成生物工程研究所提供提供，批號20040511。
2.2.主要儀器HH-4電熱恒溫水浴箱常州國華電器有限公司。
BS110S分析天平北京塞多利天平有限公司。
52紫外光柵分光光度計上海分析儀器總廠。
2.3.藥物體外抑制誘導型一氧化氮百分率的測定試驗方法在一氧化氮試劑盒的1號試劑中不加入四氫生物喋呤(BH4)，按試劑盒方法分別在試管中加入試劑1、試劑2、試劑3、iNOS樣品、BH4、受試藥物后混勻，37攝氏度水浴下準確反應20分鐘，加入試劑4終止反應，再加入終止液后混勻，530nm處，1cm光徑，蒸餾水調零，比色測定吸光值。
測定BH4的飽和濃度按照試劑盒方法按步驟加入試劑，各個試管中分別加入不同濃度的BH4，測定各管吸光值，并計算其飽和濃度。
3.2.4.測定氨基生物蝶呤(ABP)及13個氨基生物蝶呤衍生物的iNOS活性抑制百分率根據文獻，配制藥物濃度為BH4飽和濃度的48倍，同樣按試劑盒的方法測定吸光值，并計算出抑制百分率。
抑制百分率＝(標準管吸光值-測定管吸光值)/(標準管吸光值-空白管吸光值)×100％3.2.5.氨基生物蝶呤衍生物IC50(半數抑制濃度)的測定根據前一次試驗BH4飽和濃度測定結果，以及藥物的抑制百分率達100％的藥物濃度，我們推薦以下幾個劑量，分別為32倍、24倍、18倍、13.5倍。實驗中每個試管中加入的誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的濃度是固定的。測得各管在530nm處的吸光度，用直線回歸的方法計算出各自的半數抑制濃度。
表 氨基生物蝶呤衍生物對iNOS的抑制效果
注(1)表中iNOS活性數據測定時的抑制劑濃度均為110μmmol/L、BH4的飽和濃度2.3μM。Vmax為沒有抑制劑時在的BH4飽和濃度作用下的iNOS活性(2)ND表示沒有進行測定。(3)ABP為4-氨基生物蝶呤。
從活性測定結果可以看出，設計合成的化合物多數具有iNOS抑制效果，而12號和4號化合物同屬類似結構，具有增加iNOS活性的作用，設計的化合物具有調節iNOS活性作用。
權利要求
1.下述通式(I)表示的化合物 R1和R2相同或不同，各自獨立的表示有取代基、無取代基的C1-C6直鏈、支鏈烷基或芳基；芐基；R1、R2、R3和R4不同時為H；R1為H或甲基時，R2代表有取代基的或無取代基的三元～六元環烷基；-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5與R6相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪環單或二取代氨基。R3和R4相同或不同，各自獨立的表示H、C1-C6直鏈或支鏈烷基；各種取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9為C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10為相同或不同的C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；
2.如權利要求1表示的化合物，其中R1和R2相同或不同，各自獨立的表示有取代基、無取代基的C1-C6直鏈、支鏈烷基或芳基；芐基；R1、R2、R3和R4不同時為H；R1為H或甲基時，R2代表有取代基的或無取代基的三元～六元環烷基；-(CH2)nOH，n＝1～6；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5與R6相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪環單或二取代氨基。R3和R4相同或不同，各自獨立的表示H、C1-C6直鏈或支鏈烷基；各種取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等，其中R9為C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基，(n＝0～6)；R10C6H4(CH2)nCH2-等，R10為相同或不同的C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基，(n＝0～5)；
3.權利要求1或2表示的化合物，其中R1和R2相同或不同，各自獨立的表示有取代基、無取代基的C1-C6直鏈、支鏈烷基或芳基；R3和R4相同，表示H、C1-C6直鏈或支鏈烷基；各種取代的酰基如R5CO-、R5C6H4(CH2)nCO-(n＝0～6)等，其中R5為C1-C6直鏈或支鏈烷基、烷氧基；
4.權利要求1-3任意一項的化合物在制備誘導性一氧化氮合成酶藥物中的應用。
5.權利要求1-3任意一項的化合物在制備在敗血性和(或)出血性休克，或用細胞毒素進行腫瘤化學治療和肝硬化或肝萎縮和(或)肝功能衰退時所引起的血壓下降或(和)止血障礙藥物中的應用。
6.權利要求1-3任意一項的化合物在制備預防和治療炎癥疾病藥物中的應用。
7.權利要求1-3任意一項的化合物在制備預防和治療異體器官和組織移植的排斥反應藥物以及胰島素依賴型糖尿病藥物中的應用。
8.權利要求1-3任意一項的化合物在制備預防和治療細胞毒素進行腫瘤的化學治療、化學物質或藥物以及慢性肝炎引發的多種肝損傷、肝功能衰退以及預防和治療心肌梗塞損傷、病毒性心肌炎藥物中的應用。
9.權利要求1-3任意一項的化合物在制備預防和治療病毒性神經退化、變化疾病及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛藥物中的應用。
10.一種藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1-3任意一項的化合物并含有常規藥用載體。
全文摘要
本發明設計并合成了一種具有控制體內一氧化氮自由基(簡寫為NO)過多產生的氨基生物蝶呤類衍生物，它具有通式(I)所述的化學結構。本發明具有選擇性抑制誘導型一氧化氮合成酶的作用，可用以制備具有預防和治療體內一氧化氮水平升高而產生的各種疾病的藥物。
文檔編號A61P29/00GK1583745SQ20041004487
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月26日 優先權日2004年5月26日
發明者姚其正, 姜力勛, 石靜波, 馮明聲, 郭平 申請人:中國藥科大學