專利名稱：小腸上皮細胞孔道調控基因及制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體地說是小腸上皮細胞孔道調控基因PCAG(自命名)及制備和應用。
背景技術：
一個世紀以來，生命科學界一直認為小腸上皮是緊密排列不可改變和調控的天然的、絕對的屏障，(intercellular tight junction，TJ)，因而，胰島素，生長激素、干擾素、白細胞介素、紅血球生成素等大分子蛋白、多肽類生物藥物都以注射的藥物劑型生產和使用，給病人帶來諸多痛苦及不便。
近十年來，在細菌病理學上，相關配合學科的綜合研究，獲得若干有重大意義的突破。近年來對若干與人有直接關系的微生物基因組(如大腸桿菌)的全基因測序完成，改變及完善了科學家對細菌一宿主間相互作用的觀念。分子細菌學研究從分子水平向縱深發(fā)展 導致細菌一宿主細胞相互作用方面獲得若干新的進展，最重要的是通過細胞骨架和細胞間隙信號傳遞可實現對小腸壁通透性的改變和調控的這一重大發(fā)現。
過去幾十年的生物研究發(fā)現，人體伴隨發(fā)育學、生理學、病理學方面的體況不同，小腸上皮屏障(intestinal epithelial barrier，.IEB)是可以發(fā)生動力學改變的，而且TJ隨IEB環(huán)境的變化改變很快。1991年已由美國馬里蘭大學發(fā)現的ZOT(Zonula Occludens Toxin)基因及其表達蛋白，已證實可以可逆性的打開小腸上皮細胞孔道20至40分鐘左右，從而實現大分子藥物的口服吸收。但由于該功能蛋白發(fā)現有輕度致腹瀉副作用，至今未被醫(yī)藥業(yè)采用。
糖尿病已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題?，F今全世界糖尿病患者總數約為1.35億，我國糖尿病患者現有4000萬，以一個糖尿病人為例中等維持劑量用胰島素如每天30μ，每一月就需付出259.50元。自我皮肉注射起碼每天一次，皮肉注射給病人帶來痛苦，相當一層病人表示，只要能維持正常血糖水平，如能以口服取代注射，則患者免受長期皮肉注射所帶來的痛苦。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目是提供一種通過對人體功能基因PCAG的發(fā)現，實現基因PCAG在蛋白、多肽類藥物從注射給藥到口服給藥的新型制藥工藝上的應用，以及該基因的制備方法。
本發(fā)明以美國馬里蘭大學Alessio教授等提出的調控小腸壁通透性理論為研究思路，在他們用了不同來源的功能蛋白進行的動物體內外小腸壁通透性試驗，發(fā)現ZOT/PCAG等是一類同功異源性功能蛋白的基礎上，從蛋白功能轉到其基因結構及篩選，進行了大量的深入研究，我們發(fā)現除Alessio等從霍亂弧菌源分離的ZOT基因外，在人體腸道大腸桿菌系統(tǒng)及T4噬菌體系統(tǒng)內也有一個此類異源性同功能蛋白及其基因存在。并制備了人體腸道大腸桿菌基因組的COSMID(柯斯質粒)一全基因庫，使用此類調控小腸壁通透性類蛋白(ZOT)的抗體血清從蛋白水平，及從蛋白信息合成DNA探針的基因水平，定位及篩選出完整小腸壁通透性調控功能基因，本人命名其為PCAG基因，實現了將大分子蛋白、多肽藥物由注射改成口服給藥技術的關鍵突破。
1.小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG DNA核苷酸順序如下atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatggacgcctggcgggcagcgtgcctgcaaaatccgcaaggtattctctgctgcgcccgtggcggtcagcgctcacatattgtgcaaagctggttgcatgcagcggggattgattatccgctggtggaaggcggttataaggcactgcgccagaccgcgattcaggcgactattgaactggcacaaaaaccgatagtgctgattggcggttgtaccggcagcggtaaaacgctgttagtgcagcaacagccgaacggtgttgatctggaagggttggcgcgtcatcgcggttcggcgtttggtcgcacgttacaaccacaacttagccaggcgagttttgaaaacctgctggctgccgaaatgctaaaaaccgacgcccgtcagaatttgcgcctgtgggtgctggaagacgaaagccggatg
atcggttcgaatcacctgccggaatgcctgcgcgagcgaatgactcaggcggcgattgcggtggtagaagatccgtttgagatccgtcttgagcgcctgaacgaagagtatttcttgcgtatgcatcatgattttacccacgcgtacggcgacgaacagggctggcaggagtattgcgaatacctgcatcacggactttcggcgattaagcgtcggctggggctacagcgctataacgaactggctgcaaggctggatgcagcactgacaacgcaactcaccaccggcagcaccgacggtcatctggcctggctggtgccgttacttgaagaatattacgacccgatgtatcgctatcagcttgagaaaaaagcggaaaaagttgtctttcgcggtgagtgggcggaagtggcggaatgggttaaggcgcggtaa以上所述的小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG的制備方法包括1)使用大腸桿菌Escherichia coli系統(tǒng)表達該基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核細胞系統(tǒng)表達該基因蛋白，即1)將致病性大腸桿菌E.coli.CT-58和非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1這幾種細菌表達的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉硝酸纖維素膜，用小腸壁通透性調控蛋白的抗體做免疫雜交后，出現幾種細菌都有一條清晰的陽性條帶，分離、純化這一條帶蛋白，胰蛋白酶處理，對小片段進行C端氨基酸測序，以此結果作為篩選大腸桿菌基因庫的核酸探針信息；2)用Cosmid作載體，構建非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655的全基因組基因庫，按以上小腸壁通透性調控蛋白信息合成脫氧核酸DNA探針，P32放射性同位素標記，從基因庫中釣出一個陽性克隆DNA測序結果，得到530bp長度的一個小腸壁通透性調控蛋白基因，其5’，3’兩端編碼的氨基酸順序，與探針來源的小腸壁通透性調控蛋白一個小片段的兩端實際測得氨基酸順序完全相同，由此得到了大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白基因，用此基因序列進一步與國際NCBI的基因核酸數據庫序列做BLAST(基因同源性檢測)，所得的基因片斷與E.coli.基因組上的6205-6702之間的序列完全一致，由此定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白完整基因PCAG。
3.小腸上皮細胞孔道調控基因PCAG的應用本發(fā)明從相對無害的非致病性K-12大腸桿菌屬，克隆了小腸上皮細胞孔道調控因子族中另一個同功異源、具有重大實用價值的新基因PCAG。是與ZOT不同來源的其他一個同功能異源蛋白。利用PCAG蛋白的調控小腸壁通透性功能而將大分子蛋白、多肽藥物由注射改成口服藥物，實現了將胰島素、免疫球蛋白、生長激素、干擾素、白細胞介素、紅血球生成素等蛋白多肽類藥物制成口服藥物的重大突破。
該腸壁通透性調控蛋白的具體應用方法將胰島素、免疫球蛋白、生長激素、干擾素、白細胞介素、紅血球生成素等蛋白多肽類藥物與PCAG基因表達的小腸上皮細胞孔道調控蛋白質混合制成口服藥(可制成耐胃酸膠囊)。將所述的蛋白多肽類藥物與小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG混合時，二者用量為蛋白多肽類藥物以產品注射計量作參考，腸壁通透性調控蛋白0.1～0.4nmol(納摩)/每公斤體重。以胰島素為例胰島素1.2～2.4 Humulin U(國際單位)，腸壁通透性調控蛋白0.1～0.4nmol(納摩)(按體重調節(jié))。
ZOT/PCAG類調控小腸壁通透性功能蛋白動物體內外試驗結果試驗動物新西蘭白兔、大鼠。
藥物1)胰島素(分子量5.7Kda)，2)免疫球蛋白(分子量140～160Kda)試驗方法體外Ussing Chambers腸壁通透性電生理測定系統(tǒng)。
體內兔食管插管給藥，頸靜脈插管抽血檢測。
實驗結果1)胰島素體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加72％。體內小腸(空腸、廻腸)壁吸收量增加10倍。
高血糖大鼠胰島素與腸壁通透性調控蛋白混合口服(服用量胰島素1.2～2.4 Humulin U，腸壁通透性調控蛋白0.1～0.4nmol，按體重調節(jié))，使血糖水平下降到胰島素注射后水平。
高血糖大鼠慢性毒性試驗胰島素與腸壁通透性調控蛋白混合口服(服用量與上同)，高血糖大鼠存活時間與胰島素注射組相似。
2)免疫球蛋白體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加52％。體內空腸壁吸收量增加2倍，廻腸壁吸收量增加6倍。
從該動物試驗結果可見，ZOT/PCAG類調控小腸壁通透性功能蛋白，可使胰島素及免疫球蛋白等大分子蛋白質藥物經腸道吸收，而不用注射。
本發(fā)明既可創(chuàng)造可觀的經濟價值，又給注射病人帶來福音，深受患者的喜愛，市場使用廣泛，全世界糖尿病患者預測有10％使用胰島素給藥口服液，每位患者每年醫(yī)藥費利潤預計100元，則每年創(chuàng)利10億元。
具體實施例方式
實施例1由下述方法獲得小腸上皮細胞孔道調控基因PCAG1.將致病性大腸桿菌E.coli.CT-58-和非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1這幾種細菌表達的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉硝酸纖維素膜，用小腸壁通透性調控蛋白的抗體做免疫雜交后，出現幾種細菌都有一條清晰的陽性條帶，分離、純化這一蛋白組分，蛋白酶處理，對小片段進行C端氨基酸測序，以此結果作為篩選大腸桿菌基因庫的探針信息；2.用Cosmid(柯斯質粒)作載體，構建非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655的全基因組基因庫，按以上小腸壁通透性調控蛋白的氨基酸排列結構信息，合成脫氧核酸DNA探針，P32放射性同位素標記，從基因庫中釣出一個陽性克隆DNA測序結果，得到530bp長度的一個小腸壁通透性調控蛋白基因，其5’，3’兩端編碼的氨基酸順序，與探針來源的小腸壁通透性調控蛋白一個小片段的兩端實際測得氨基酸順序完全相同，由此得到了大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白基因，用此基因序列進一步與國際NCBI的核酸數據庫序列做BLAST(基因同源性檢測)，所得的基因片斷與E.coli.基因組上的6205-6702之間的序列完全一致，由此定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白完整基因，該基因命名為PCAG。其基因結構如下PCAG基因全部核苷酸順序atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatg
gacgcctggcgggcagcgtgcctgcaaaatccgcaaggtattctctgctgcgcccgtggcggtcagcgctcacatattgtgcaaagctggttgcatgcagcggggattgattatccgctggtggaaggcggttataaggcactgcgccagaccgcgattcaggcgactattgaactggcacaaaaaccgatagtgctgattggcggttgtaccggcagcggtaaaacgctgttagtgcagcaacagccgaacggtgttgatctggaagggttggcgcgtcatcgcggttcggcgtttggtcgcacgttacaaccacaacttagccaggcgagttttgaaaacctgctggctgccgaaatgctaaaaaccgacgcccgtcagaatttgcgcctgtgggtgctggaagacgaaagccggatgatcggttcgaatcacctgccggaatgcctgcgcgagcgaatgactcaggcggcgattgcggtggtagaagatccgtttgagatccgtcttgagcgcctgaacgaagagtatttcttgcgtatgcatcatgattttacccacgcgtacggcgacgaacagggctggcaggagtattgcgaatacctgcatcacggactttcggcgattaagcgtcggctggggctacagcgctataacgaactggctgcaaggctggatgcagcactgacaacgcaactcaccaccggcagcaccgacggtcatctggcctggctggtgccgttacttgaagaatattacgacccgatgtatcgctatcagcttgagaaaaaagcggaaaaagttgtctttcgcggtgagtgggcggaagtggcggaatgggttaaggcgcggtaa實施例2在試驗動物的應用ZOT/PCAG類調控小腸壁通透性功能蛋白動物體內外作用測試試驗動物新西蘭白兔、大鼠。
藥物1)胰島素(分子量5.7Kda)，2)免疫球蛋白(分子量140～160Kda)試驗方法體外Ussing Chambers腸壁通透性電生理測定系統(tǒng)。
體內兔食管插管給藥，頸靜脈插管抽血檢測。
實驗結果1)胰島素體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加72％。體內小腸(空腸、廻腸)壁吸收量增加10倍。
高血糖大鼠胰島素與腸壁通透性調控蛋白混合口服(服用量胰島素1.2-2.4 Humulin U(國際單位)，腸壁通透性調控蛋白0.1-0.4nmol納摩，按體重調節(jié))，使血糖水平下降到胰島素注射后水平。
高血糖大鼠慢性毒性試驗胰島素與腸壁通透性調控蛋白混合口服，服用量胰島素1.2～2.4 Humulin U，腸壁通透性調控蛋白0.1～0.4nmol(按體重調節(jié))，高血糖大鼠存活時間與胰島素注射組相似。
2)免疫球蛋白體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加52％，體內空腸壁吸收量增加2倍，廻腸壁吸收量增加6倍。
從該動物試驗結果可見，ZOT/PCAG類調控小腸壁通透性功能蛋白，可使胰島素及免疫球蛋白等大分子蛋白質藥物經腸道吸收，而不用注射。
權利要求
1.一種小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG，其特征在于PCAG基因DNA核苷酸順序如下atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatggacgcctggcgggcagcgtgcctgcaaaatccgcaaggtattctctgctgcgcccgtggcggtcagcgctcacatattgtgcaaagctggttgcatgcagcggggattgattatccgctggtggaaggcggttataaggcactgcgccagaccgcgattcaggcgactattgaactggcacaaaaaccgatagtgctgattggcggttgtaccggcagcggtaaaacgctgttagtgcagcaacagccgaacggtgttgatctggaagggttggcgcgtcatcgcggttcggcgtttggtcgcacgttacaaccacaacttagccaggcgagttttgaaaacctgctggctgccgaaatgctaaaaaccgacgcccgtcagaatttgcgcctgtgggtgctggaagacgaaagccggatgatcggttcgaatcacctgccggaatgcctgcgcgagcgaatgactcaggcggcgattgcggtggtagaagatccgtttgagatccgtcttgagcgcctgaacgaagagtatttcttgcgtatgcatcatgattttacccacgcgtacggcgacgaacagggctggcaggagtattgcgaatacctgcatcacggactttcggcgattaagcgtcggctggggctacagcgctataacgaactggctgcaaggctggatgcagcactgacaacgcaactcaccaccggcagcaccgacggtcatctggcctggctggtgccgttacttgaagaatattacgacccgatgtatcgctatcagcttgagaaaaaagcggaaaaagttgtctttcgcggtgagtgggcggaagtggcggaatgggttaaggcgcggtaa
2.如權利要求1所述的小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG的制備方法，其特征在于具體方法包括1)使用大腸桿菌Escherichia coli系統(tǒng)表達該基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核細胞系統(tǒng)表達該基因蛋白，即1)將致病性大腸桿菌E.coli.CT-58和非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1這幾種細菌表達的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉硝酸纖維素膜，用小腸壁通透性調控蛋白的抗體做免疫雜交后，出現幾種細菌都有一條清晰的陽性條帶，分離、純化這一條帶蛋白，胰蛋白酶處理，對小片段進行C端氨基酸測序，以此結果作為篩選大腸桿菌基因庫的核酸探針信息；2)用Cosmid作載體，構建非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655的全基因組基因庫，按以上小腸壁通透性調控蛋白信息合成脫氧核酸DNA探針，P32放射性同位素標記，從基因庫中釣出一個陽性克隆DNA測序結果，得到530bp長度的一個小腸壁通透性調控蛋白基因，其5’，3’兩端編碼的氨基酸順序，與探針來源的小腸壁通透性調控蛋白一個小片段的兩端實際測得氨基酸順序完全相同，由此得到了大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白基因，用此基因序列進一步與國際NCBI的基因核酸數據庫序列做BLAST(基因同源性檢測)，所得的基因片斷與E.coli.基因組上的6205-6702之間的序列完全一致，由此定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白完整基因PCAG。
3.如權利要求1、2所述的小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG的應用，其特征在于將胰島素、免疫球蛋白、生長激素、干擾素、白細胞介素、紅血球生成素等蛋白多肽類藥物與PCAG基因表達的小腸上皮細胞孔道調控蛋白質混合制成口服藥。
4.根據權利要求3所述的小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG的應用，其特征在于將所述的蛋白多肽類藥物與小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG混合時，二者用量為蛋白多肽類藥物以產品注射計量作參考，腸壁通透性調控蛋白0.1～0.4nmol(納摩)/每公斤體重。
全文摘要
本發(fā)明是一種小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG及制備和應用。小腸上皮細胞孔道調控蛋白的基因PCAG的制備方法是1)使用大腸桿菌Escherichia coli系統(tǒng)表達該基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核細胞系統(tǒng)表達該基因蛋白。定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調控蛋白完整基因PCAG。本發(fā)明既可創(chuàng)造可觀的經濟價值，又給注射病人帶來福音，深受患者的喜愛，市場使用廣泛，全世界糖尿病患者預測有10％使用胰島素給藥口服液，每位患者每年醫(yī)藥費利潤預計100元，則每年創(chuàng)利10億元。
文檔編號A61K38/16GK1680551SQ20041004078
公開日2005年10月12日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權日2004年10月8日
發(fā)明者任兆鈞 申請人:任兆鈞, 廣州銘俊基因技術開發(fā)有限公司