豬白細胞介素－4、6融合基因抗病制劑的制作方法

專利名稱：豬白細胞介素－4、6融合基因抗病制劑的制作方法
技術領域：
1.生物技術 2.分子免疫學具體包括豬白細胞介素-4和6基因的克隆、融合及其真核表達質粒的構建、殼聚糖納米顆粒對藏豬白細胞介素-4、6融合基因真核表達質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的應用技術。
背景技術：
增強動物抗感染免疫應答能力，提高疫苗保護率是人類防治傳染性疾病最可靠的簡便途徑。由于傳統的藥物治療和常規疫苗接種不能充分保障現代畜牧業的健康高效發展，動物免疫抑制和疫苗免疫應答及保護水平下降已嚴重制約對傳染性疾病的防治。我國當前畜牧業動物傳染病的發病率為15％-25％、死亡率高達8％-12％，由此造成的直接經濟損失每年達400多億元。因此，研制和應用新型高效動物免疫調節劑，增強動物的抗感染能力對控制動物的傳染性疾病具有非常重要的社會和經濟意義。
近年來，隨著生物學技術和免疫學技術的發展，細胞因子的研究取得了令人矚目的成就。利用基因工程技術發展某些新型的細胞因子融合蛋白，已成為其中重要的研究方向。融合基因是指將兩個或多個基因的編碼區首尾相連，置于同一套調控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等)控制之下，構成的嵌合基因。融合基因的表達產物為融合蛋白。融合蛋白可以優化蛋白性能，甚至產生新功能。融合蛋白可以有多種融合方式，分別在免疫反應的各個階段發揮作用。由于細胞因子的作用具有多向性、網絡性的特點，它們不僅可以單獨發揮生物學活性，而且不同的細胞因子之間還有相互協調和相互制約的作用。兩種細胞因子融合成一種新的蛋白，兩者可以取長補短，也可兼兩者之長，發揮其雙因子抗癌和增強免疫的綜合效應，或使其某些活性顯著提高，出現雙因子簡單合用所不具備的生物學效應。所以細胞因子融合蛋白不僅保留了融合前各因子的功能，而且還可能產生更強、更新的生物學效應。
白細胞介素4(IL-4)具有多種生物學功能可以作用于T細胞、B細胞、胸腺細胞、肥大細胞、巨噬細胞等多種靶細胞，激活的B細胞產生的抗體主要是IgG和IgE，是機體體液免疫的重要調節因子，也在粘膜免疫中也發揮著重要作用。IL-4可以刺激肥大細胞和B細胞的增殖，促進嗜酸性的富集和浸潤。IL-4還是CD4+Th幼稚前體細胞分化發育成Th2細胞的重要信號。
白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是迄今發現的功能最為廣泛的細胞因子之一，能夠刺激B細胞的分化和IgG的產生，亦能刺激外周T細胞(peripheral T cell)和胸腺T細胞(thymic T cell)成熟分化為細胞毒型T細胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)，能夠抑制人成纖維細胞及羊膜細胞的多種病毒，抗成纖維細胞有絲分裂，誘導特異性干擾素-激活基因，刺激由SPA-Cowan-I型激活的正常B細胞分泌IgM和IgG，誘導EB病毒轉化的B細胞分泌IgM和IgG，刺激肝細胞，誘導急性期蛋白的表達，在機體免疫應答、骨髓造血、自身免疫和機體防御等方面均起到重要作用。IL-6可由各種淋巴細胞和非淋巴細胞受各種刺激所分泌，成纖維細胞、單核細胞、某些T細胞系等都可以產生IL-6。
殼聚糖是天然生物多糖甲殼質的脫乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被體內多種酶類降解、降解產物安全無毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨特的聚陽離子特性，已有的研究結果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來，在基因轉染表達研究領域已出現了基于殼聚糖的納米顆粒系統。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復合物用于基因運載和轉染表達時，能有效攜帶目的基因進入靶細胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質，其釋放率主要決定于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質釋放明顯延長。初步研究結果發現基于殼聚糖的顆粒系統在生物醫學方面具有廣闊的應用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應用中顯示了廣闊的前景，本發明在克隆豬IL-4、IL-6基因的基礎上，構建了IL-6和IL-4融合基因的真核表達質粒(VPIL-46)及豬IL-4、IL-6基因真核表達質粒(VPIL-4、VPIL-6)，深入研究其對實驗動物和本動物免疫調節活性和在疫苗免疫應答中的作用，為研制新型的高效分子免疫佐劑，提高豬的免疫應答能力，增強其抗感染力奠定了堅實的基礎。
本發明制備了殼聚糖納米顆粒分子，首次以其包裝豬白細胞介素-4、6融合基因真核表達質粒(VPIL46)，發現對動物免疫機能和免疫保護有顯著的增強作用，可作為高效安全、活性持久和效應廣譜的新型動物免疫抗病劑。

發明內容
本發明解決的技術問題具體包括豬白細胞介素-4、6基因的融合及其真核表達質粒的構建、殼聚糖納米顆粒對豬白細胞介素-4、6融合基因真核質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的應用技術。主要包括下列步驟1、豬白細胞介素-4、6基因的克隆、融合應用淋巴細胞分離技術，分離了豬外周血液淋巴細胞進行體外培養，在Con A的刺激下培養24-72h后，提取培養的淋巴細胞總RNA，應用RT-PCR擴增出豬淋巴細胞白細胞介素-4、6基因的cDNA，克隆到pMD18-T載體上，并進行了序列分析；將所獲的序列在GenBank和EMBL數據庫中進行同源比較，證明成功克隆到豬白細胞介素-4和6的cDNA。
設計融合基因引物，分別擴增豬IL4和IL6基因，連接入相應的pMD18-T載體，雙酶切后，先將PIL6連接到同樣雙酶切的pGEX4T-1質粒上，再將從載體雙酶切獲得的PIL4片段與重組的pGPIL6連接，轉化感受態細胞，篩選陽性轉化子，酶切鑒定獲得融合的pGPIL6/4重組質粒。
2、豬白細胞介素-4、6融合基因的真核表達與活性檢測將豬白細胞介素-4、6融合基因亞克隆到真核分泌型表達載體VR1020上，命名為VPIL46；豬淋巴母細胞增殖實驗證明VPIL46在轉染Cos7細胞株后，成功表達出有生物活性的IL-46，能刺激豬淋巴母細胞顯著增殖；此結果表明已成功構建了能正確表達PIL-46的真核表達質粒，其表達產物具有正常的生物學活性，為研究其體內基因轉染表達的免疫調節奠定了基礎。
3、殼聚糖納米顆粒的制備和分子包裝將pH5.5的殼聚糖溶液和VPIL46質粒(含適當濃度三聚磷酸鹽)溶液分別50℃水浴恒溫25min，均勻混合質粒溶液和殼聚糖溶液，即得VPIL46質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。取少量質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer 3000HS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位，結果發現本法獲得的顆粒直徑平均為50-65nm，顆粒的zeta電位達到+27.2mV；凝膠電泳阻滯實驗發現殼聚糖納米顆粒分子(CNP)包裝的VPIL46均未移出電泳點樣孔，表明所制備的CNP成功完成了VPIL46的分子包裝。
4、豬白細胞介素-4、6融合基因抗感染DNA制劑的應用本研究首次將豬白細胞介素-4、6融合基因用殼聚糖納米顆粒包裝后通過口服接種的簡便方式免疫BALB/c小鼠，檢測了殼聚糖包裝豬白細胞介素-4、6融合基因對小鼠的體液免疫和細胞免疫水平的影響情況，并對巴氏桿菌、沙門氏菌和鏈球菌疫苗等常規疫苗在豬白細胞介素-4、6融合基因分子免疫佐劑協同作用下細胞免疫和體液免疫應答的變化，進行了較為系統的分析；小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測體液免疫應答(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)、細胞免疫反應(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的動態變化；并在小鼠免疫35天后，以鏈球菌、巴氏桿菌口服感染實驗小鼠，觀察發病情況；49天時對所有存活的小鼠進行解剖，觀察各種器官組織的病變情況，檢測免疫保護效應。
結果顯示豬白細胞介素-4、6融合基因納米顆粒能顯著提高小鼠的非特異和特異性免度應答水平，增強小鼠對強毒病原感染的免疫抵抗力和保護率；以殼聚糖納米顆粒作為免疫基因包裝分子，具有減少質粒用量、增強體液免疫和細胞免疫的優點。
在應用中發現，殼聚糖包裝豬白細胞介素4、6融合基因質粒口服接種的方式能有效提高免疫小鼠對常規疫苗的免疫應答水平，其原因可能是殼聚糖納米顆粒包裹質粒DNA后，有效地防止了體液核酸酶對DNA的降解和VRIL46被體內其它組織蛋白的吸附，同時又促進VRIL46進入細胞，使質粒DNA緩慢釋放，將目的基因DNA轉運到靶細胞中，發揮基因轉錄表達，分泌更多的細胞因子，增強對免疫應答的上調效應，提高體液和細胞免疫水平。這在將來的實際應用上有較大的價值，意味著較少的質粒用CNP包裹后也可刺激較強的免疫反應，減少質粒用量，降低成本。這些結果表明殼聚糖納米顆粒包裹豬白細胞介素4、6融合基因接種可提高機體特異性和非特異性的細胞免疫和體液免疫水平，增強特異免疫應答及免疫保護力和非特異防御抗病力，可望作為豬的新型高效抗感染免疫調節劑，具有潛在的廣泛應用前景。


圖1殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-46質粒透射電鏡圖(x50000)圖2殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖3FPIL-6，FPIL-4 cDNA的PCR擴增電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1PCR product of pMD18-T/P3+P4 Lane2PCR product of IL-4geneLane3PCR product of IL-6gene Lane4PCR product of pMD18-T/P1+P2Lane MDL2000marker圖4IL-4連pMD18-T重組子酶切鑒定電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1pMDT18-IL4質粒LaneMDL2000markerLane2pMDT18-IL4/PmaCI Lane3pMDT18-IL4/SalI+XhoI圖5IL-6連pMD18-T重組子酶切鑒定電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1pMDT18-IL6質粒 LaneMDL2000markerLane2pMDT18-IL6/PstILane3pMDT18-IL6/BamHI+SalI圖6PIL-4cDNA片段413bp核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列圖7PIL-6cDNA片段核苷酸序列及推測的氨基酸序列圖8FpIL-6cDNA，FpIL-4cDNA片段酶切回收檢測電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1FpUIL-4cDNA片段酶切回收 LaneMDL2000markerLane2FpUIL-6cDNA片段酶切回收圖9IL-6插入PGEX4T-1的酶切電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1pGIL-6/BamHI+SalI LaneMDL2000Lane2pGIL-6/BamHILane3pGIL-6/SalILane4pGIL-6/XhoI Lane5pGIL-6質粒圖10IL-4插入pGEX-IL6的酶切電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1pGEX-IL6/IL4/PstI LaneMDL2000MarkerLane2pGEX-IL6/IL4/BaMHI+XhoI Lane3pGEX-IL6/IL4/SalI+XhoILane4pGEX-IL6/IL4/BamHI+SalI圖11pGEX-IL6/IL4質粒PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1pGEX-4T-1質粒PCR/P1+P4 LaneMDL2000MarkerLane2pGEX-IL6/IL4質粒PCR/P3+P4 Lane3pGEX-IL6/IL4質粒PCR/P1+P2Lane4pGEX-IL6/IL4質粒PCR/P1+P4圖12重組質粒原核表達的RT-PCR電泳分析Lane1RT-PCR of pGFPIL-6/IL-4，4h LaneMDL2000Lane2RT-PGR of pGEX4T-1.4h圖13重組質粒原核表達產物SDS-PAGE(11％)Lane1.3Expression products of pGFPIL-6/IL-4 not induced by IPTGLane2Expression products of pGFPIL-6/IL-4 induced by IPTG in DH5αLane4Expression products of pGFPIL-6/IL-4 induced by IPTG in BL21Lane5Expression products of pGPIL-6 induced by IPTGLane6Expression products of pGPIL-6 not induced by IPTG
Lane7Expression products of pGEX-4T-1 induced by IPTGLane8Expression products of pGEX-4T-1 not induced by IPTG圖14重組VTPIL-4質粒的菌落PCR篩選1陰性菌落； 2、3陽性菌落； MDL2,000圖15PIL-4在VR1020插入方向酶切電泳圖譜1pVTPIL-4/BglII和PmacI雙酶切正向重組子2pVTPIL-4/BamHI Mφ1743pVTPIL-4/BglII和PmacI雙酶切反向重組子圖16重組VPIL-6質粒的菌落PCR篩選1λDNA/EcoRI+HindIII；2、3陽性菌落圖17PIL-6在VR1020插入方向酶切電泳圖譜1Mark3、6pVPIL-6/PstI，正向重組子；2、4、5、7、8、9pVPIL-6/PstI，反向重組子圖18a非特異免疫組小鼠血清IgG含量圖18b非特異免疫組小鼠血清IgM含量圖18c非特異免疫組小鼠血清IgA含量圖19a非特異免疫組小鼠血清IL-2含量圖19b非特異免疫組小鼠血清IL-4含量圖19c非特異免疫組小鼠血清IL-6含量圖20a非特異免疫組小鼠白細胞數量變化圖20b非特異性免疫組小鼠單核細胞數量變化圖20c非特異免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖20d非特異免疫組小鼠中性粒細胞數量變化圖21a疫苗免疫組小鼠血清IgG含量圖21b疫苗免疫組小鼠血清IgA含量圖21c疫苗免疫組小鼠血清IgM含量圖22a疫苗免疫組小鼠血清巴氏桿菌特異性抗體含量圖22b疫苗免疫組小鼠血清鏈球菌特異性抗體含量圖22c疫苗免疫組小鼠血清沙門氏菌特異性抗體含量圖23a疫苗免疫組小鼠血清IL-2含量圖23b疫苗免疫組小鼠血清IL-4含量圖23c疫苗免疫組小鼠血清IL-6含量圖24a疫苗免疫組小鼠白細胞數量變化圖24b疫苗免疫組小鼠單核細胞數量變化圖24c疫苗免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖24d疫苗免疫組小鼠中性粒細胞數量變化
具體實施例方式
1.豬白細胞介素-4基因的克隆及序列分析從豬前腔靜脈無菌采血，應用淋巴細胞分離技術，分離了豬外周血液淋巴細胞進行體外培養，在Con A的刺激下培養36h后，提取培養的淋巴細胞總RNA，提取藏豬總RNA，設計一對豬IL-4基因cDNA擴增引物。引物序列如下引物1CGG GAT CCC TAT TCA TGG GTC TCA CCT C引物2CGG GAT CCT CAG CTT CAA CAC TTT以總RNA為模板，在50μl反應體系中加10×RT-PCR反應緩沖液5μl，25mM MgCl210μl，l0mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)lμl，AMV RNase XL(5units/uL)lμl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)lμl，5′和3′引物各20uM，總RNAl~2μl，補水至50μl。RT-PCR循環參數為50℃，30min；94℃，2min，然后進行30個PCR循環(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s)后繼續在72℃延伸l0min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉化感受態細胞，篩選和鑒定含重組質粒的菌落，小規模提取質粒DNA，酶切及電泳觀察質粒DNA，進行序列測定。
2.豬白細胞介素-6基因的克隆及序列分析應用淋巴細胞分離技術，分離了豬外周血液淋巴細胞進行體外培養，在Con A的刺激下培養36h后，提取培養的淋巴細胞總RNA，提取藏豬總RNA，設計一對豬IL-6基因cDNA擴增引物。引物序列如下引物1CGG GAT CCA CCA GGA ACG AAA GAG AG引物2CGG GAT CCA GGT TTC TGA CCA GAG GAG以總RNA為模板，在50μl反應體系中加l0×RT-PCR反應緩沖液5μl，25mM MgCl210μl，l0mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)lμl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，5′和3′引物各20uM，總RNA1~2μl，補水至50μl。RT-PCR循環參數為50℃，30min；94℃，2min，然后進行30個PCR循環(94℃變性60s，58℃退火30s；72℃延伸60s)后繼續在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉化感受態細胞，篩選和鑒定含重組質粒的菌落，小規模提取質粒DNA，酶切及電泳觀察質粒DNA，進行序列測定。
3.融合基因引物的設計與合成根據分別編碼IL-4和IL-6成熟肽的cDNA堿基序列，設計并人工合成了四條引物P15’CGGGATCCACC AGG AAC GAA AGA GAG 3’P2 5’TTGTCGACCATTATCCGAATGGCCCT 3’P35’ATGTCGAC GGC TCC TCT ACT GGTCTCACCTCCCAACTG 3’P45’CGCTCGAGTCAACACTTTGAGTATT 3’4.融合基因的構建應用PCR技術對豬的IL-6和IL-4基因分別加以改造。去除IL-6的終止密碼子，并在兩端引入BamHI和SalI酶切位點，去除IL-4的起始密碼子，并在兩端引入SalI和XhoI酶切位點，同時在二者之間加上Gly-Ser-Ser-Thr柔性連接肽序列，克隆PCR產物，將其克隆到pMD18-T載體中，酶切篩選鑒定重組質粒。
5.豬IL-4/IL-6融合基因原核表達質粒的構建及表達活性分析將豬白介素-4與pMD18-T重組的質粒(pUPIL-4)；豬白介素-6與pUC18重組的質粒(pUPIL-6)酶切，電泳回收IL-4、IL-6DNA片段。將元和表達載體pGEX4T-1進行BamHI，SalI酶切，同回收來的pUFPIL-6cDNA片段進行連接，篩選重組質粒，選取正確的重組子，命名為pG-FPIL6。將pGEX4T-1-IL6酶切，與回收的酶切過的pUFPIL-4cDNA片段進行連接，篩選重組質粒。
將已構建的IL-6/IL-4融合蛋白表達載體質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，用2×YTA培養基培養，以IPTG誘導融合蛋白表達，并作RT-PCR及SDS-PAGE分析表達情況；融合蛋白的表達產物以包涵體形式存在，將包涵體經過變性，稀釋、透析復性處理后用MTT法測定重組蛋白刺激豬淋巴母細胞增殖反應活性。
6.豬IL-4/IL-6融合基因真核表達質粒的構建將獲得的豬IL-4\IL-6融合基因原核表達質粒進行酶切，切下的豬IL-4\IL-6融合基因與酶切處理去磷酸化的真核表達載體VR1020連接，轉化，篩選重組真核表達質粒。
7.豬IL-4基因真核表達質粒的構建將克隆測序得到的豬IL-4基因片段與酶切、脫磷酸化的VR1020質粒連接，轉化DH5α感受態細胞，菌落PCR鑒定轉化子，進一步酶切篩選插入方向正確的重組表達質粒。
8.豬IL-6基因真核表達質粒的構建將克隆測序得到的豬IL-6基因片段與酶切、脫磷酸化的VR1020質粒連接，轉化DH5α感受態細胞，菌落PCR鑒定轉化子，進一步酶切篩選插入方向正確的重組表達質粒。
9.免疫用質粒DNA的大量制備按亞精胺沉淀方法制備質粒，溶解于滅菌生理鹽水，用紫外分光光度計測其濃度。
10.納米顆粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)將VPIL-46質粒、VPIL-4質粒、VPIL-6質粒溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數與DNA的磷酸酯基摩爾數比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復合物微粒。即是VPIL-46質粒、VPIL-4質粒、VPIL-6質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
11.納米顆粒的形態、粒徑及Zeta電位測定取少量質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米顆粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
E)醇酸樹脂/三聚氰胺烤漆Alftalat AC 451 70％/Maprenal MF800

用二甲苯調節到25秒，閃蒸20分鐘烘干140℃下30分鐘2K清漆丙烯酸/異氰酸酯Macrynal SM 510/Desmodur N 3390

透明清漆硬化劑溶液2∶1擦去測試的結果
15.免疫動物外周血免疫細胞數量的動態變化常規法計白細胞總數；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
16.實驗動物免疫保護檢測免疫35天后，以巴氏桿菌強毒菌(C-44-8株)和豬鏈球菌2型口服攻毒實驗小鼠，每只小鼠口服兩種菌液各0.4ml進行攻毒(濃度分別為3×104/ml和3×109/ml)，觀察小鼠的保護情況；49天時用常規方法對所有未死亡動物進行觀察解剖，記錄器官組織的病交情況。
17.數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
實驗結果3.1豬白細胞介素-4和6基因克隆及序列分析應用RT-PCR擴增出豬淋巴細胞白細胞介素-4、6基因的cDNA(圖3)，回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉化感受態細胞，篩選和鑒定含重組質粒的菌落，小規模提取質粒DNA，酶切及電泳觀察質粒DNA(圖4、5)，確定重組質粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一樣后，進行序列測定，序列測定結果(圖6、7)。用M13通用引物對含有目的基因片斷的pMPIL-4、pMPIL-6質粒進行正反向測序，通過重疊序列的拼接，得到了完整的PIL-4、PIL-6基因的cDNA序列，并用DNA tools 5.1對其編碼氨基酸進行了分析，PIL-4 cDNA長度為423個堿基，開放閱讀框為402個堿基，編碼134個氨基酸，分子量為15.0kD；PIL-6基因的cDNA序列長度為675個堿基，開放閱讀框為645個堿基，編碼215個氨基酸，分子量為24.0kD。
3.3豬IL-4/IL-6融合基因原核表達質粒的構建及表達活性分析將克隆到pMD18-T載體上的PIL-6cDNA片段酶切回收(結果見圖8)，與酶切處理的pGEX4T-1載體連接轉化，酶切和PCR鑒定得到含PIL-6cDNA片段的重組質粒pGIL6(結果見圖9)。進一步將pGPIL6酶切與回收的PIL-4cDNA片段連接，用SalI，XhoI酶切和PCR鑒定，得到含PIL-6cDNA和PIL-4cDNA片段的重組質粒，命名為pG PIL-6/IL-4(結果見圖10、11)。
將pG PIL-6/IL-4誘導培養，以誘導pGEX4T-1空載轉化子作為對照。在加入IPTG 4小時后取樣，分別提取重組子總RNA和空載表達蛋白總RNA。RT-PCR結果(見圖12)顯示，重組子經誘導后出現了1119bp的特異性條帶，而pGEX4T-1空載轉化子經誘導沒有此特異帶出現，說明經過誘導，IL-6/IL-4融合基因已得到了轉錄。
以經四小時誘導的pGEX4T-1，pGPIL6及pGPIL-6/IL-4和未被誘導的pGEX4T-1，pG-FPIL6及pGPIL-6/IL-4的細菌總蛋白進行電泳分析。經IPTG誘導的pGEX4T-1在E.coliDH5α中的表達樣品在26KDa處出現GST蛋白帶，而未經IPTG誘導的pGEX4T-1沒有26KDa帶；經IPTG誘導的pGPIL6表達樣品在46KDa處明顯出現新的蛋白帶，為26KD的GST帶和20KD的IL-6蛋白共同構成的融合蛋白；經IPTG誘導的pGPIL-6/IL-4表達樣品在64KDa處明顯出現新的蛋白帶。在BL21宿主菌內，配合用2×YTA培養基誘導表達的融合蛋白量遠大于在DH5α宿主菌，用LB培養基誘導表達的量。其表達量可占總蛋白量的30％，此帶正是由26KD的GST和38KD的IL-6加IL-4蛋白共同構成的融合蛋白，而26KD處的GST帶消失。表達融合蛋白SDS-PAGE圖譜見圖13。
回收融合蛋白包涵體，將包涵體經過變性，稀釋、透析復性處理后用MTT法測定重組蛋白刺激豬淋巴母細胞增殖反應活性。以包涵體經變性，復性回收的融合蛋白為樣品，以相同濃度的復性重組豬IL-6蛋白、IL-4蛋白和GST蛋白膠塊磨碎后的上清為對照，進行豬淋巴母細胞增殖刺激活性檢測，結果如表3。結果表明，回收的融合蛋白對豬淋巴母細胞有顯著的刺激增殖作用，且與相同濃度的重組豬IL-6和IL-4比較，經復性處理的融合蛋白促進豬淋巴母細胞增殖反應活性顯著增強(P＜0.05)。
表3回收融合蛋白對豬淋巴母細胞增殖刺激活性檢測結果

3.4豬IL-4/IL-6融合基因真核表達質粒的構建將pGPIL-6/IL-4重組質粒酶切，電泳回收PIL-4/IL-6融合基因片段，與酶切、脫磷酸化的VR1020載體連接，菌落PCR鑒定轉化子，進一步酶切篩選插入方向正確的重組表達質粒，命名為VPIL-46。
3.5豬IL-4基因真核表達質粒的構建將PIL-4片段與BamHI酶切、脫磷酸化的VR1020質粒DNA連接，轉化經菌落PCR鑒定，得到含有目的PIL-4片段的重組質粒的菌落，菌落PCR見圖14。PmacI和BagII雙酶切篩選出正確方向插入的重組表達質粒，命名為VPIL-4(圖15)。
3.6豬IL-6基因真核表達質粒的構建將PIL-6片段與酶切、脫磷酸化處理的VR1020質粒DNA連接，轉化經菌落PCR鑒定，得到含有目的PIL-6片段的重組質粒的菌落，菌落PCR見圖16。酶切篩選出正確方向插入的重組表達質粒，命名為VPIL-6(圖17)。
3.7納米顆粒的形態、粒徑及zeta電位透射電鏡觀察結果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(圖1)。納米顆粒度分析儀測定結果為平均粒徑為48nm；多分散度為0.285(圖2)；zeta電位為+25.8。
3.8殼聚糖納米顆粒包裝免疫基因質粒對小鼠非特異性免疫應答的影響從圖18、19、20可見以殼聚糖包裝VPIL-46質粒納米顆粒，殼聚糖包裝VPIL-4質粒聯合殼聚糖包裝VPIL-6質粒免疫小鼠時，免疫組小鼠血清中IgG、IgA、IgM含量和IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平較殼聚糖包裝VR1020空質粒對照組顯著升高(P＜0.05)；同時，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等免疫細胞數量也明顯增加，只是攻毒后小鼠中性粒細胞數量較對照組稍低。兩免疫組各指標變化無顯著差異(P＞0.05)。
3.9殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-46、VPIL-4、VPIL-6質粒對小鼠特異性免疫應答的影響從圖21、22、23、24可見在特異性免疫組中，殼聚糖包裝VPIL-46質粒納米顆粒與鏈球菌疫苗、巴氏桿菌疫苗、沙門氏菌疫苗聯合使用，可以明顯提高實驗小鼠血清中的IgG、IgA、IgM含量(P＜0.05)，對疫苗的特異性鏈球菌疫苗、巴氏桿菌疫苗、沙門氏菌抗體免疫應答也顯著加強(P＜0.05)；與對照組相比，IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平，免疫細胞數量等細胞免疫指標也明顯提高(P＜0.05)，只是攻毒后中性粒細胞數量較對照組稍高。殼聚糖包裝VPIL-4質粒及殼聚糖包裝VPIL-6質粒聯合疫苗免疫，同樣能明顯提高免疫小鼠的細胞免疫和體液免疫水平，增強疫苗免疫應答。
3.10強毒菌攻擊后的免疫保護結果攻毒2周后剖解實驗小鼠發現，實驗接種小鼠多數健康存活(詳見表4)，肝、脾、十二指腸、等消化道和呼吸道組織器官未出現明顯病變，而對照小鼠均發病，精神萎靡，被毛聳立；發現各處組織皮下、粘膜等處有以出血、肝脾腫大等為主的病變，死亡鼠的病變較發病鼠嚴重和明顯。
表4實驗小鼠巴氏桿菌強毒菌攻擊結果

這些結果顯示殼聚糖納米顆粒包裹VRIL46接種能顯著增強小鼠對鏈球菌和巴氏桿菌感染的免疫抵抗力，提高其免疫保護率。
豬白細胞介素4和6融合基因序列<110>四川大學<120>豬白細胞介素-4、6融合基因抗病制劑<160>1<210>1<211>831<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<400>1ATGAGAAGTG TGAAAACCAG CAAGGAGGTA CTGGCAGAAA ACAACCTGAA CCTTCCAAAA 60ATGGCAGAAA AAGACGGATG CTTCCAATCT GGGTTCAATC AGGAGACCTG CTTGATGAGA 120ATCACCACCG GTCTTGTGGA GTTTCAGATA TACCTGGACT ACCTCCAGAA AGAGTATGAG 180AGCAATAAGG GAAATGTCGA GGCTGTGCAG ATTAGTACCA AAGCACTGAT CCAGACCCTG 240AGGCAAAAGG GAAAGAATCC AGACAAAGCC ACCACCCCTA ACCCCACCAC AAATGCCGGC 300CTGCTGGATA AGCTGCAGTC ACAGAACGAG TGGATGAAGA ACACAAAGAT CATTCTCATC 360CTGCGCAGCC TTGAGGATTT CCTGCAGTTC AGCCTGAGGG CCATTCGGAT AATGGTCGAC 420GGCTCCTCTA CTGGTCTCAC CTCCCAACTG ATCCCAACCC TGGTCTGCTT ACTGGCATGT 480ACCAGCAACT TCGTCCACGG ACACAAGTGC GACATCACCT TACAAGAGAT CATCAAAACC 540TTGAACATTC TCACAGCGAG AGAGAACTCG TGCATGGAGC TGCCCGTGAC GGACGTCTTT 600GCTGCCCCAG AGAACACGAC GGAGAAGGAA ACCTTCTGCC GGGCCTCGAC TGTGCTTCGG 660CACATCTACA GACACCACAC GTGCATGAAG AGCCTCCTGA GCGGACTTGA CAGGAACCTG 720AGCAGCATGG CAAACATGAC CTGTTCTGTG CATGAAGCCA AGAAGAGCAC TTTGAAAGAC 780TTCTTGGAAA GGCTAAAGAC GATTATGAAG GAGAAATACT CAAAGTGTTG A 83權利要求
1.豬白細胞介素-4、6融合基因抗病制劑，其特點為包括豬白細胞介素-4、6融合基因真核表達質粒的構建和口服制劑應用于豬增強機體免疫應答及抗感染免疫力的應用技術。
2.根據權利要求1所述的豬白細胞介素-4、6融合基因抗病制劑的制備，其特征在于融合豬白細胞介素-4和6基因，構建融合基因的VR1020真核表達質粒。
3.根據權利要求1所述的融合豬白細胞介素-4、6基因抗病制劑的制備，其特征在于所述制劑的包裹材料是分子量為300000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，以離子交聯法制備質粒殼聚糖納米顆粒分子。
4.使用權利要求1的豬白細胞介素-4、6融合基因表達質粒作為新型動物抗病免疫調節劑的應用技術，其特征如下a)將制備的豬白細胞介素-4、6融合基因質粒殼聚糖納米顆粒分子用口服方式免疫動物，結果表明該制劑能有效提高實驗動物非特異性細胞和體液免疫水平，增強其非特異性免疫抗病力，可有效抵抗強毒病原的感染攻擊；b)用制備的豬白細胞介素-4、6融合基因抗病制劑聯合疫苗(豬沙門氏菌疫苗、鏈球菌疫苗及巴氏桿菌疫苗)共免疫實驗動物，結果表明豬白細胞介素-4、6融合基因抗病制劑可顯著促進動物對疫苗的細胞免疫和體液免疫應答反應，增強動物的特異性免疫保護力，提高其免疫保護水平。
全文摘要
本發明公開豬白細胞介素－4、6融合基因抗病制劑的制備和應用技術。先克隆豬白細胞介素基因4和6，再融合豬白細胞介素－4、6基因，構建融合基因的真核表達質粒(VPIL46)，用離子交聯法制備殼聚糖納米顆粒分子包裝質粒將質粒溶于三聚磷酸鹽溶液，與分子量300000、脫乙酰度9 5％以上的殼聚糖醋酸液，55℃水浴恒溫15min，按比例均勻混合質粒和殼聚糖溶液，得到殼聚糖納米顆粒包裝質粒液，粒徑48nmnm，Zeta電位為+25.8mv。將VPIL46質粒納米顆粒制劑以口服接種方式單獨或配合疫苗免疫實驗動物，可明顯提高動物特異和非特異的細胞和體液免疫水平，顯著增強試驗動物的抗感染免疫保護力，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VPIL46質粒作為動物抗病制劑的應用技術。
文檔編號A61K48/00GK1692945SQ20041004076
公開日2005年11月9日 申請日期2004年9月30日 優先權日2004年9月30日
發明者高榮, 武梅, 孟民杰, 李江凌, 王澤洲, 呂學斌, 李惠, 付滿良, 吳凱源, 楊毅, 沈翼 申請人:四川大學