專利名稱：犬靜脈注射免疫球蛋白、其制備方法以及犬靜脈注射免疫球蛋白制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種犬靜脈注射免疫球蛋白、其制備方法以及犬靜脈注射免疫球蛋白制劑。
背景技術：
寵物在人們日常生活中的地位越來越重要，寵物保健已經成為一個工要的課題。犬用血液制品是從犬血漿中分離提取得生物制品，又稱血漿衍生物。這類制品用于犬病的治療或被動免疫。
上述生物制品之一即為免疫球蛋白(Ig)，它是機體免疫系統的重要組成部分，在防御感染和免疫調節中發揮著極為重要的作用。
從使用途徑上講，免疫球蛋白和免疫球蛋白制劑一般分為肌肉注射免疫球蛋白(IMIG)和靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)兩類，現已有發明人對犬用免疫球蛋白進行研究與制備，如專利申請00123292.4，但是，由于技術上的原因，其只能研制出口服或肌肉注射的免疫球蛋白(IMIG)，在使用上具有很大的局限性，主要表現在(1)用量過小，即使多部位注射，總用量也只有20毫升；(2)注射部位會有嚴重的疼痛反應；(3)進入循環前會有部分Ig被酶降解，并且起效較慢。靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)的作用機理是被動免疫，主要用來預防和治療病毒性、細菌性感染，以及各種免疫缺乏癥和免疫低下癥等，主要體現在抗體補充和免疫調節，包括靶細胞阻斷作用、免疫調理作用、結合活化的補體成分、改變免疫復合物的結構和可溶性、改善IgG的新陳代謝率、增加末梢血中自然殺傷細胞的數量并增強其功能、中和自身免疫性抗體以及調節多種細胞因子的表達等。
目前，尚沒有對犬用靜脈注射用免疫球蛋白的研究和應用的文獻報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種犬靜脈注射免疫球蛋白。
本發明的另一目的在于提供犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法。
本發明還以目的在于提供一種犬靜脈注射免疫球蛋白制劑。
首先，本發明提供的一種犬靜脈注射免疫球蛋白，是由來自健康犬的血漿或血清，經低溫乙醇法或利凡諾結合低溫乙醇法分離、制備得到的pH值上述犬靜脈注射免疫球蛋白中，所述血漿或血清來自多種犬病，包括細小病毒病、犬瘟熱、犬傳染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血漿或血清。
上述犬靜脈注射免疫球蛋白中，所述低溫乙醇法包含以下步驟1).將血漿或血清融化，逐漸降溫至0℃，控制pH7.0～7.4，加入預冷乙醇至終濃度8％(g/100ml)，離心去除雜蛋白；2).多次對上清液進行處理，調整pH4.5～6.0，逐漸加入乙醇至終濃度15％～20％，靜置過夜后，離心保留沉淀；3)、上述沉淀加入0℃無熱源水10倍量，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸調整pH4.5～5.0，攪拌3小時，靜置過夜。
4)、上述溶解液用連續離心機離心，乙-3板過濾上清，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸調pH4.8～5.3，加入乙醇至15％～20％，攪拌1小時，靜置過夜。
5)、離心分離雜蛋白后的上清液調至pH6.5～7.0，加入乙醇至22～26％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白；6).將步驟5)得到的免疫球蛋白在pH3.5～5.0進行后處理，并超濾、除菌、分裝得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白。
上述犬靜脈注射免疫球蛋白中，所述利凡諾結合低溫乙醇法包含以下步驟1).將融化后血漿和血清調至pH8.0～9.0，加入2％(g/100ml)利凡諾，去除白蛋白沉淀，取上清液；2).將上清液用活性炭吸附后過濾，在0℃、pH6.5～7.0條件下，加入乙醇至22～26％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白；3).將步驟2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4進行后處理，并超濾、除菌、分裝得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％(g/100ml)的免疫球蛋白注射液。
上述犬靜脈注射免疫球蛋白中，所述后處理為在pH3.0～5.4的免疫球蛋白溶液中加入保護劑，所述保護劑為5～15％(g/100ml)的麥芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖的鹽水中的一種或兩種的組合。
本發明同時提供一種犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟1).去除白蛋白將健康犬的血漿或血清在pH4.8～5.1時，加入乙醇至15～20％，去除雜蛋白；或用利凡諾法，將融化后血漿和血清調至pH8.0～9.0，加入2％利凡諾，去除白蛋白；2).提取免疫球蛋白將去除雜蛋白或白蛋白后的溶液在0℃、pH6.5～7.0條件下，加入乙醇至22～26％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白；3).制備免疫球蛋白注射液將步驟2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4進行后處理，并超濾、除菌、分裝得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白注射液。
上述犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法中，步驟3)的后處理為在pH3.0～5.4的免疫球蛋白溶液中加入保護劑，所述保護劑為5～15％的麥芽糖、5～10％葡萄糖或5～10％葡萄糖的鹽水中的一種或兩種的組合。
上述犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法中，步驟1)中健康犬的血漿或血清取自多種犬病，包括細小病毒病、犬瘟熱、犬傳染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血漿或血清。
本發明還提供犬靜脈注射免疫球蛋白制劑，由來自健康犬的血漿或血清，經低溫乙醇法或利凡諾結合低溫乙醇法分離、制備得到的pH值在3.0～5.4，純度不低于95％的可用于犬靜脈注射的免疫球蛋白制備成蛋白含量為1～10％的免疫球蛋白注射液。
上述犬靜脈注射免疫球蛋白制劑，還包括生物體可接受的保護劑，所述保護劑為5～15％的麥芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖的鹽水中的一種或兩種的組合。
本發明提供的犬靜脈注射免疫球蛋白，其保持有完整的天然生物分子結構，具有體內免疫球蛋白G(IgG)的全部生理活性，免疫球蛋白IgG，IgG亞類構成比與正常犬血漿相似。
本發明提供的犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法，工藝簡單，成本低，回收率高，制備的成品純度好，純度超過96％，且性能穩定。
本發明提供的犬靜脈注射免疫球蛋白制劑，不含任何防腐劑，生物適應性好。
圖1是本發明方法得到的免疫球蛋白分子量鑒定圖。
具體實施例方式
為更清楚地公開，以下從幾方面敘述本發明。
本發明提供的犬靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)，是將犬的血漿或血清，用現代生物技術分離提取，經病毒滅活并加入適量穩定劑制成的犬用靜脈注射生物制劑。其中，血漿和血清可為多種犬病(如細小病毒病、犬瘟熱、犬傳染性肝炎、狂犬病、犬副流感等)的疫苗免疫大量健康犬后獲得的混合血漿，此時，對犬的免疫、取血漿過程，與其它常規做法相同；病毒滅活的方法和步驟可以采用常規的方法；現代生物分離技術，在本發明中是指從血漿中分離提取免疫球蛋白的方法，可以為低溫乙醇法或利凡諾結合低溫乙醇法，提取時的總體要求為1、原料新鮮分離的液體血漿、血清、輕度溶血或脂肪血漿、去除其他血漿蛋白的組分等均可用于制備。
2、原料要求所用之血漿或血清，應盡可能保持無菌，否則應及時投料制造或低溫冰凍保存。低溫冰凍保存血漿最長保存期不應超過2年。
3、操作場所工作室應符合GMP工藝流程要求。冷庫及各種生產用具必須專用，嚴禁與其他異種蛋白質混用。工作室的建筑應便于清潔、消毒、防霉。在制造過程中為防止制品污染熱原質，應采取各種有效措施，如降低操作室溫度，注意無菌操作等。各種直接接觸制品的用具，用后應立即洗凈，用前須經除熱原質或滅菌處理。
4、制備用水及化學藥品生產用水應符合飲用水標準，直接用于制品的水應符合注射用水標準。所用各種化學藥品應符合《中國獸藥典》、《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》、《中國生物制品主要原材料試行標準》等規定，未納入標準者應不低于化學純。
在本發明技術方案和以下實施例中，如無特殊說明，所提及物質濃度如免疫球蛋白濃度、乙醇濃度和葡萄糖、麥芽糖、葡萄糖鹽水濃度等均以％表示，意為g/100ml，即每100毫升溶液中所含溶質的重量克。
實施例一采用低溫乙醇法提取犬靜脈注射免疫球蛋白所述低溫乙醇法包含以下步驟1).融漿及添加乙醇將符合原料要求的血漿20萬毫升在37℃條件下快速融化，并在無菌環境下置入反應罐；在攪拌狀態下逐漸降溫至0℃，用pH為4.0的醋酸緩沖液調pH至7.2；邊攪拌邊加入預冷為-15℃--20℃的53.3％乙醇至乙醇體積終濃度為8％(加乙醇要緩慢，以10萬毫升血漿計，每分鐘加400-500ml，2-3小時加完)，溫度維持在-2℃--3℃，加完后繼續攪拌1小時，靜置2小時。
2).去除雜蛋白使用連續離心機離心，離心機出液口溫度-2℃～-3℃，上清液用pH為4.0的醋酸緩沖液調pH為5.8，用95％的低溫乙醇緩慢加至終體積濃度為19％，溫度保持在-5℃～-6℃，加完后攪拌2小時，-5℃靜置過夜；第二次離心，保留沉淀。
上述沉淀加入0℃無熱源水10倍量，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸調整pH4.8，攪拌3小時，靜置過夜；溶解液用連續離心機離心，乙-3板過濾上清，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸調pH5.1，加入乙醇至17％，攪拌1小時，靜置過夜。
3)、分離免疫球蛋白離心去除雜蛋白后的上清液，調整pH6.9，加入乙醇至25％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白。
4).超濾濃縮將步驟3)得到的免疫球蛋白在pH4.0進行后處理，并超濾濃縮得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白。
實施例二采用利凡諾結合低溫乙醇法提取犬靜脈注射免疫球蛋白1)融漿及調pH將符合原料要求的血漿20萬毫升在37℃條件下快速融化，并在無菌環境下置入反應罐；在攪拌狀態下緩慢加入濃度為1％的Na2CO3，調pH至8.5±0.1。
2).去除白蛋白取犬血漿加入反應罐，在攪拌狀態下，向反應罐中加入與血漿等體積的2％利凡諾，加完后停止攪拌，靜置2小時，取上清加入2％活性炭，攪拌30分鐘，靜置1小時，過乙-3板，收集濾液過夜。
3).沉淀免疫球蛋白將步驟2)的濾液降溫至0℃，加入25％的NaCl溶液至終濃度1％、0.5mol/L乙酸緩沖液調pH至6.9，加入95％乙醇至終濃度25％，攪拌1小時，靜置過夜后，溶液連續離心，沉淀即為犬免疫球蛋白。
4).超濾濃縮將步驟3)得到的免疫球蛋白在pH4.0進行后處理，并超濾濃縮得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白。
實施例三制備犬靜脈注射免疫球蛋白制劑-麥芽糖注射液在實施例一或實施例二的基礎上，繼續下面步驟在實施例三步驟4)中，將溶液濃縮，加入麥芽糖至10％，然后除菌分裝，得到蛋白含量為5％的添加麥芽糖保護劑的犬靜脈注射免疫球蛋白注射液。
用同樣的方法，改變麥芽糖的添加量，使得麥芽糖的含量在5％至10％之間的任意期望濃度變化，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之間，麥芽糖濃度在5％至10％的犬靜脈注射免疫球蛋白注射液。
實施例四制備犬靜脈注射免疫球蛋白制劑-葡萄糖注射液和實施例三同樣的方法，用葡萄糖代替麥芽糖作保護劑，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之間，葡萄糖濃度在5％至10％的犬靜脈注射免疫球蛋白注射液。
實施例五制備犬靜脈注射免疫球蛋白制劑-葡萄糖鹽水注射液和實施例三同樣的方法，用葡萄糖鹽水代替麥芽糖作保護劑，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之間，葡萄糖鹽水濃度在5％至10％的犬靜脈注射免疫球蛋白注射液。
實施例六制備犬靜脈注射免疫球蛋白制劑-麥芽糖葡萄糖注射液和實施例三同樣的方法，合用麥芽糖和葡萄糖作保護劑，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之間，麥芽糖濃度在5％至10％、葡萄糖濃度在5％至10％的犬靜脈注射免疫球蛋白注射液。
實施例七制備犬靜脈注射免疫球蛋白制劑-麥芽糖葡萄糖鹽水注射液和實施例三同樣的方法，合用麥芽糖和葡萄糖鹽水作保護劑，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之間，麥芽糖濃度在5％至10％、葡萄糖濃度在5％至10％鹽水的犬靜脈注射免疫球蛋白注射液。
對上述得到的IVIG進行性能測試1、放置試驗液體制劑分裝后，在20～35℃的條件下放置至少30天，逐瓶檢查，外觀為略有粘稠、黃色或綠色至棕色澄明液體，不含有任何異物，也無混濁和沉淀現象。
2、熱穩定性試驗取液體制劑檢品，放入57±0.5℃水浴保溫4小時后，無凝膠形成或絮狀物出現。
3、化學檢定按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》、《生物制品化學檢定規程》等進行3.1pH值1％的免疫球蛋白注射液在20±2℃測定，其pH值為6.4～7.4；5％和10％的制品用生理鹽水稀釋成1％蛋白質濃度，在20±2℃測定，pH值為6.4～7.4。
3.2蛋白質含量及總量用鎢酸沉淀法測定，蛋白質含量不低于標示量的95％，每瓶蛋白質總量不低于出品規格的標示量。
3.3純度不同規格的制品，免疫球蛋白含量不低于蛋白質總量的95％。
3.4糖含量若制品中加糖(葡萄糖、麥芽糖等)，其含量應不高于50g/L。
3.5分子大小分布IgG單體及二聚體含量之和不低于90.0％。
4、鑒別試驗采用免疫雙擴散法。僅與抗犬的血清產生沉淀線，與抗人、抗馬、抗牛的血清不產生沉淀線。
5、無菌試驗按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》進行。
結果符合標準。
6、安全試驗6.1豚鼠試驗用體重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射檢品5ml，注射后半小時內動物沒有明顯的異常反應，觀察7天，動物均健存，每只體重增加者判為合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠復試一次，判定標準同前。
結果符合標準。
6.2小白鼠試驗用體重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射檢品0.5ml，半小時內動物沒有明顯的異常反應，繼續觀察7天，動物均健存，每只體重增加者判為合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠復試一次，判定標準同前。
結果符合標準。
7、熱原質試驗按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》、《生物制品化學檢定規程》等進行。注射劑量按家兔體重注射0.6g/kg。
結果符合標準。
上述得到的犬靜脈注射免疫球蛋白和犬靜脈注射免疫球蛋白制劑，可應用在預防和治療病毒性、細菌性感染，以及各種免疫缺乏癥和免疫低下癥等。
本發明提供的犬靜脈注射免疫球蛋白和犬靜脈注射免疫球蛋白制劑為無色澄明液體，其使用方法靜脈輸注。若需要大劑量輸注時，可將數瓶制品連續輸注(必須在4小時內使用)。必要時可用5％的葡萄糖注射液稀釋本品后再進行靜脈滴注。
輸注劑量5公斤以下犬，5毫升/日，連用2~3日；5~10公斤犬，10毫升/日，連用2~3日；10公斤以上犬，10~20毫升/日，連用2~3日。病情嚴重時，可酌情加倍。
輸注速度首次使用，開始30分鐘內輸注速度為0.02~0.03毫升/公斤體重/分鐘，若未見不良反應，可增加到0.04~0.08毫升/公斤體重/分鐘。
舉例13公斤的犬，首注30分鐘的速度為3～5滴/分鐘；30分鐘后速度為8～15滴/分鐘。
舉例210公斤的犬，首注速度為8～15滴；30分鐘后速度為16～25滴/分鐘。
保存及有效期保存于2～8℃暗處，謹防凍結；有效期3年。
權利要求
1.一種犬靜脈注射免疫球蛋白，是由來自健康犬的血漿或血清，經低溫乙醇法或利凡諾結合低溫乙醇法分離、制備得到的pH值在3.0～5.4，純度不低于95％的可用于犬靜脈注射的免疫球蛋白。
2.如權利要求1所述的犬靜脈注射免疫球蛋白，其特征在于所述血漿或血清來自多種犬病，包括細小病毒病、犬瘟熱、犬傳染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血漿或血清。
3.如權利要求1或2所述的犬靜脈注射免疫球蛋白，其特征在于所述低溫乙醇法包含以下步驟1).將血漿或血清融化，逐漸降溫至0℃，控制pH7.0～7.4，加入預冷乙醇至終濃度8％(g/100ml)，離心去除雜蛋白；2).多次對上清液進行處理，調整pH4.5～6.0，逐漸加入乙醇至終濃度15％～20％，靜置過夜后，離心保留沉淀；3)、上述沉淀加入0℃無熱源水10倍量，0.5mol/LNa2HPO4和0.5mol/L醋酸調整pH4.5～5.0，攪拌3小時，靜置過夜。4)、上述溶解液用連續離心機離心，乙-3板過濾上清，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸調pH4.8～5.3，加入乙醇至15％～20％，攪拌1小時，靜置過夜。5)、離心分離雜蛋白后的上清液調至pH6.5～7.0，加入乙醇至22～26％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白；6).將步驟5)得到的免疫球蛋白在pH3.5～5.0進行后處理，并超濾、除菌、分裝得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白。
4.如權利要求1或2所述的犬靜脈注射免疫球蛋白，其特征在于所述利凡諾結合低溫乙醇法包含以下步驟1).將融化后血漿和血清調至pH8.0～9.0，加入2％(g/100ml)利凡諾，去除白蛋白沉淀，取上清液；2).將上清液用活性炭吸附后過濾，在0℃、pH6.5～7.0條件下，加入乙醇至22～26％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白；3).將步驟2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4進行后處理，并超濾、除菌、分裝得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％(g/100ml)的免疫球蛋白注射液。
5.如權利要求3或4所述的犬靜脈注射免疫球蛋白，其特征在于所述15％(g/100ml)的麥芽糖、5～10％葡萄糖和3～10％葡萄糖鹽水中的一種或兩種的組合。
6.一種犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟1).去除白蛋白將健康犬的血漿或血清在pH4.8～5.1時，加入乙醇至15～20％，去除雜蛋白；或用利凡諾法，將融化后血漿和血清調至pH 8.0～9.0，加入2％利凡諾，去除白蛋白；2).提取免疫球蛋白將去除雜蛋白或白蛋白后的溶液在0℃、pH6.5～7.0條件下，加入乙醇至22～26％，靜置過夜得到免疫球蛋白懸浮液，離心沉淀得到免疫球蛋白；3).制備免疫球蛋白注射液將步驟2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4進行后處理，并超濾、除菌、分裝得到可靜脈注射的蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白注射液。
7.如權利要求6所述的犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法，其特征在于步驟3)的后處理為在pH3.0～5.4的免疫球蛋白溶液中加入保護劑，所述保護劑為5～15％的麥芽糖、5～10％葡萄糖和5～10％葡萄糖鹽水中的一種或兩種的組合。
8.如權利要求6或7所述的犬靜脈注射免疫球蛋白的制備方法，其特征在于步驟1)中健康犬的血漿或血清取自多種犬病，包括細小病毒病、犬瘟熱、犬傳染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血漿或血清。
9.犬靜脈注射免疫球蛋白制劑，由來自健康犬的血漿或血清，經低溫乙醇法或利凡諾結合低溫乙醇法分離、制備得到的pH值在3.0～5.4，純度不低于95％的可用于犬靜脈注射的免疫球蛋白制備成免疫球蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白注射液。
10.根據權利要求9所述的犬靜脈注射免疫球蛋白制劑，其特征在于，還包括生物體可接受的保護劑，所述保護劑為5～15％的麥芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖的鹽水中的一種或兩種的組合。
全文摘要
本發明涉及犬靜脈注射免疫球蛋白、其制備方法及其制劑，是由來自健康犬的血漿或血清，經低溫乙醇法或利凡諾結合低溫乙醇法分離、制備得到的pH值在3.0～5.4，純度不低于95％的可用于犬靜脈注射的免疫球蛋白，以及用該免疫球蛋白配制成含5～15％麥芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖鹽水中的一種或兩種保護劑，同時蛋白含量為1～15％的免疫球蛋白注射液。
文檔編號A61P31/00GK1654072SQ20041003957
公開日2005年8月17日 申請日期2004年2月10日 優先權日2004年2月10日
發明者章金剛, 孫文種, 趙寶全, 王建國, 呂茂民, 熊景峰, 楊姝, 王曉菲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所