轉錄活性試驗的制作方法

專利名稱：轉錄活性試驗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于測定可以調節基因轉錄的化合物的生物活性的新方法，和基于此的一種用于測定化合物的相對生物活性的方法，以及一種鑒定可調節基因轉錄的化合物的方法。本發明的方法對于鑒定那些可以用于疾病治療的化合物尤為有用，其中所述疾病取決于患病的細胞和組織中的基因轉錄調節。
背景技術：
可調節細胞增殖或病毒防御等細胞功能的化合物的生物活性的通常測定方法為在體外或在基于細胞的結合試驗中測定這些因子和/或化合物與其天然或重組受體的結合活性的增減。這些用于評價化合物生物活性的方法的缺點在于結合親和力并不必然地與化合物的生物活性相關。
對于化合物生物活性更為直接且由此更為可靠的測定可以通過一些廣為人知的試驗例如細胞增殖、細胞存活、或細胞遷移試驗來實現。然而，這些試驗比較繁瑣，尤其對于較大規模的篩選而言。在很多情況下，調節這些細胞活性的化合物也調節基因的轉錄。因而，這樣的化合物的生物活性可以通過測定基因轉錄的調節來確定，這通常通過報告基因試驗來進行，此試驗需要制備可表達適宜報告基因構建體的重組細胞。或者，這樣的化合物的生物活性可以由測定(例如通過Northern雜交分析或定量PCR)適當的靶基因的表達來確定，但此法的效率不高。
本發明的問題是要提供一種可靠、易行的方法來測定轉錄活性調節劑的生物活性，該法沒有結合試驗的缺點，而又比通常采用的活性試驗更高效。

發明內容
出人意料的，發現化合物的生物活性能夠通過一種基于測定在這種化合物誘導下的總體轉錄基因應答(general transcriptional gene response)的新方法而更為可靠地確定，此法包括對轉錄活性受所述化合物調節的基因的信號強度進行定量。
本發明提供一種用于測定可調節基因轉錄的化合物的生物活性的新方法，包括以下步驟a)使化合物與宿主接觸；b)測定宿主的總體轉錄基因應答；c)對所述化合物誘導的總體轉錄基因應答進行定量。優選的，上述化合物的生物活性由步驟c)中定量的信號強度的歸一化平均差(normalized average difference)之和給出。本發明的一個更為優選的實施方案中，總體轉錄基因應答通過DNA陣列技術測定。在一個更加優選的實施方案中，陣列技術是寡核苷酸陣列技術。優選地，DNA或寡核苷酸陣列是高密度的DNA或寡核苷酸陣列。這些陣列以及用這些陣列分析DNA或RNA的方法在已有的文獻例如EP0834575，EP0834576，WO96/31622，US5837832或WO98/30883中有所描述。WO97/10365提供了用高密度寡核苷酸陣列對大量基因的表達水平進行監測的方法。在一個最優選的實施方案中寡核苷酸陣列是基因芯片(GeneChip)陣列。
這里用到的“總體轉錄基因應答”一詞是指化合物的生物活性，由該化合物在有反應的宿主中所調節的基因的信號強度的歸一化平均差之和來表示。總體轉錄基因應答的確定是通過將來自處理過的宿主的標記cDNA與DNA或更優選地寡核苷酸陣列雜交而進行的。然后測量陣列的原始數據，例如，用共聚焦激光掃描儀(Hewlett Packard，美國)進行(此例子并不是為了對本發明加以限制)，并用通常已知的方法對象素水平加以分析。各個基因的表達水平都相對于與錯配的寡核苷酸的雜交計算為歸一化平均差強度，用任意單位(AD)表示。用四個標準篩選差異表達的基因(1)處理過的細胞的強度值至少比未處理細胞的強度值高兩倍。(2)處理過的細胞的強度值應大于或等于至少50個任意單元(AD)。(3)未經處理的細胞的強度值應小于50AD。(4)標準差必須顯著低于平均差的絕對變化，且基因的計算的置信水平設定在大于97％(p值＜0.03)。然后，受化合物誘導的宿主的總體轉錄基因應答通過信號強度的歸一化平均差之和(任意單位之和，∑AD)來定量。
下文中描述的非限制性實施證明用這種新方法獲得的結果與生物活性之間的相關性比結合試驗更為可靠，此外此方法還具有高效的優點。這些例子還表明，用本發明的方法測定總體轉錄基因應答比測定單個基因或選定的少數基因的轉錄表達水平更為可靠。
本發明方法中所用的宿主可以是所有非人類生物體，包括但并不僅限于轉基因或基因敲除動物；來自任何物種的特定種類的組織，其中包括但并不僅限于肝臟、心臟、腎臟或原代細胞分離物，例如血細胞或從組織分離到的原代細胞或細胞系。本發明中用于測定化合物的生物活性的宿主必須對目的化合物有反應。此處所用“有反應”一詞指宿主在響應化合物時能夠表現出增強或降低的基因轉錄水平。作為一個非限制的例子，黑色素瘤細胞系ME15(WO02/18633中的CNCM I-2546)可被用于通過本發明的方法檢測PEG-IFN或PEG-IFN同種型的生物活性。
相對于通常所用的活性分析試驗或測定基因轉錄的方法例如報告基因試驗或Northern雜交，本發明的主要優勢在于本方法無需制備任何經報告基因構建物轉染的細胞系，它還可以對大量受到轉錄水平調節的基因進行方便且有效的分析，因此使得活性分析更高效和可信。另外，如圖4所示，結合活性并不總是與生物活性相關聯，基于測定總體轉錄基因應答而確定的化合物的轉錄活性卻總是與生物活性相關。因此，本發明的方法對于化合物生物活性的測定比結合試驗更準確。
在一個實施方案中，前面所述方法中的化合物是修飾的化合物，更優選為修飾的蛋白，甚至更優選是聚乙二醇化蛋白(pegylated protein)，或最優選是聚乙二醇化蛋白的特定的分離的同種型。優選地，該聚乙二醇化蛋白是促紅細胞生成素(EPO)或干擾素(IFN)。
這里所用到的“PEG-IFN”一詞包括從任何天然物質(例如白細胞、成纖維細胞和淋巴細胞)或其衍生物(如細胞系)來源的IFN-α，或通過DNA重組技術得到的IFN-α。對IFN-α特別是在大腸桿菌(E.coli)中的克隆以及直接表達的細節在許多文獻中已有描述。重組IFN-α的制備是公知的，例如，可參見Goeddel等人(1980)Nature284，316-320和(1981)，Nature290，20-26，以及歐洲專利號32134，43980和211148。IFNα有許多種類，例如IFNαI，IFNα2；還有它們的亞類，包括但并不僅限于IFNα2A，IFNα2B，IFNα2C和IFNαII(又名IFNαII或ω-IFN)。“IFNα”一詞還包括從Amgen可購得的共有IFNα(consensus IFNα)或天然的和/或重組的IFNα的混合物。優選地使用IFNα2A。IFNα2A的制備在歐洲專利號43980和211148中有記載。
IFN-α可以與取代或未取代的聚(亞烷基)二醇例如聚乙二醇等聚合物綴合，形成PEG-IFN-α綴合物。綴合可以通過多種本領域公知的連接體來實現，特別是例如在歐洲專利申請公開號0510356，0593868和0809996中公開的連接體。
聚合物，優選聚乙二醇的分子量可以在300至70,000道爾頓的范圍；并且可以是一個或多個，優選一到三個聚合物與IFN-α相綴合。優選的PEG-IFN-α綴合物具有下式 其中R和R’是甲基，X是NH，n和n’分別為或同時為420或520。
在上文中描述的方法的另一個優選實施方案中，被轉錄調節的基因是從Seq ID No.1至29的一組基因中選出的一個或多個基因，這些基因也在表3中列出。
本發明的方法適用于分析在任何類型宿主中調節基因轉錄的任何化合物。對基因轉錄的調節包括上調或下調基因轉錄。
上述的方法可以作為測定修飾后化合物的相對生物活性的方法的基礎，相對生物活性測定包括用上述方法對修飾后的化合物以及對應的未修飾化合物的生物活性進行測定，其中，修飾化合物的相對轉錄活性通過計算修飾化合物與未修飾的化合物的生物活性之比得出。優選的，修飾化合物是經化學或酶學方法修飾的化合物。更優選的，修飾化合物是聚乙二醇化蛋白。因此，本方法提供了一種可以用于比較修飾化合物與其對應的未修飾化合物的生物活性的簡單試驗。在一個優選的實施方案中，本發明可以從化合物的同種型的混合物中，最優選從聚乙二醇化蛋白質中分離出生物活性最高的同種型。
生物活性可以通過本發明的方法測定的化合物包括所有能夠調節基因轉錄的化合物。它們可以是蛋白質、多肽、核酸、聚合物或小分子。許多蛋白質、多肽、核酸、聚合物或小分子可以直接地作為轉錄因子來調節基因轉錄，或者間接地通過誘導最終能上調或下調基因轉錄的信號級聯或者通過干擾別的能夠調節基因轉錄的化合物來調節基因轉錄。下列能夠用本發明的方法測定其生物活性的化合物只是能用上本發明方法的各類化合物，包括蛋白質和多肽的非限定性例子。
在這些非限制的例子中，有可以誘導作為轉錄因子的核激素受體的激素例如視黃酸(A.Rowe視黃酸X受體，Int.J.Biochem.Cell Biol.，29(1997)，275-278；CK.Glass通過甲狀腺激素和視黃酸受體調節基因表達的一些新手段，J.Endorinol，150(1996)，349-357)。本發明的方法可以用于測定這些激素和它們的核激素受體的生物活性，此方法還可以用于鑒定能夠干擾這些核激素受體的轉錄活性的化合物。因此，本發明可以用于例如鑒定和分析核激素受體如RXR或LXR的抑制物。
除了能夠激活核激素受體的激素之外，本發明的方法還可以用于測定其它能激活信號級聯從而引起基因轉錄調節的激素的生物活性。這些激素包括，但不限于，已知可以調節基因轉錄的激素如促紅細胞生成素(Epo)(Z.Z.Chong等人造血因子促紅細胞生成素通過新的信號轉導級聯促進神經保護，J.Cereb.Blood Flow Metab.，22(2002)，503-514；D.M.Wojchowski和T.C.He促紅細胞生成素受體系統中的信號轉導，Stem.Cells，11(1993)，381-392；J.L.Spivak促紅細胞生成素的作用機制，Int.J.Cell Cloning，4(1986)，139-166；以及L.Mulcahy促紅細胞生成素的受體Semin.Oncol.28(2001)，19-23)。
已知細胞因子和生長因子可以誘導能導致基因轉錄調節的信號級聯。因此，作為一個非限制的例子，本發明的方法也可以用于鑒定細胞因子和生長因子的激動劑或拮抗劑，并測定其生物活性。這些細胞因子和生長因子包括，但不僅限于干擾素、腫瘤壞死因子、血管內皮細胞生長因子(T.Hanada和A.Yoshimura細胞因子信號通路的調節及炎癥，CytokineGrowth Factor Rev.，13(2002)，413-421；和Y. Sato等人兩類血管內皮細胞生長因子(VEGF)受體Flt-1和KDR在信號轉導中的性質，Ann.N Y.Acad.Sci.，902(2000)，201-207)。
除此以外，本發明的方法可以用于測定修飾或突變的蛋白或多肽的生物活性。修飾可以通過化學方法或酶促反應實現。此應用的一個非限制的例子是測定不同同種型的聚乙二醇化干擾素的生物活性，結果示于本申請的附圖中。因此本發明可用于測定修飾化合物的相對生物活性，包括用上述方法測定修飾的化合物和相應的未修飾化合物的生物活性，其中修飾蛋白的相對轉錄活性通過計算修飾化合物與未修飾化合物的生物活性之比來得到。優選的修飾化合物是經化學方法或酶促反應修飾的化合物。最為優選的修飾化合物是聚乙二醇化蛋白質。
本發明的方法還可以用于鑒定和表征酶的調節劑，其中，作為下游事件，此酶能夠引起基因轉錄的調節。這種酶有，例如(但不限于此)磷酸二酯酶(PDE)，優選PDE4，最優選為PDE4D同工酶。優選PDE4D同工酶從PDE4D1，PDE4D2，PDE4D3，PDE4D4，PDE4D5，PDE4D6，PDE4D7和PDE4D8組成的組中挑出。PDE可以降解能夠調節基因轉錄的第二信使——環AMP(G.S.McKnight環AMP第二信使系統，Curr.Opin.CellBiol.，3(1991)213-7)，并且，已發現PDE的強抑制劑可以調節基因轉錄(B.Wagner等人7-芐基氨基-6-氯-2-哌嗪并-4-吡咯烷蝶啶，cAMP-特異性磷酸二酯酶的強抑制劑，增強人的腫瘤細胞中核蛋白與CRE共有序列的結合，Biochemcial Pharmacology，63(2002)659-668；Y.Nishio等人Cilostazol，一種cAMP磷酸二酯酶抑制劑，在血管內皮細胞中減弱腫瘤壞死因子α引起的單核細胞趨化蛋白-1的產生，Hormone & MetabolicResearch，29(1997)491-495)。因此，本發明的方法可以用于篩選此類酶的調節劑。
在可被鑒定和分析的化合物中還包括功能抗體。功能抗體是指能夠抑制或刺激其所結合的蛋白質的功能的一類抗體。已開發出抗多種靶蛋白的此類抗體，有一些抗體還具有治療價值。這其中，例如(但不限于)有抗-Her2/ErbB2抗體，又名赫賽汀(herceptin)抗體。此抗體正被成功的用于治療乳腺癌。它們通過抑制人表皮生長因子受體Her2/ErbB2(該受體在包括乳腺癌的多種癌癥中起關鍵作用)的活化來發揮作用。如同其它許多生長因子受體一樣，當配體與Her2結合時，Her2能介導包括基因轉錄調節在內的信號轉導。已證明赫賽汀(herceptin)可以在表達Her2/ErbB2的細胞中調節基因的轉錄(A.H.Talukder等人抗人表皮生長因子受體2抗體赫賽汀(herceptin)抑制自分泌活動因子(AMF)表達，并增強AMF抑制劑的抗腫瘤效果，Clin.Cancer Res.8(2002)，3285-3289；以及R.Mandler等人合成策略中的修飾提高格爾德霉素-赫賽汀(herceptin)免疫綴合物的產率和效力，Bioconjugate Chemistry，13(2002)，786-791)。目前，存在8種不同的赫賽汀(herceptin)抗體，并且還可能生產出更多的種類。通常地，就功能性抗體而言，本發明的方法可以用于確定哪種抗體具有最高的生物活性且最適合于治療用途。因此，本發明的方法同樣適用于測定抗體的生物活性，例如用于鑒定抑制性或激活性抗體。在優選的實施方案中，抗體是有治療用途的抗體。更為優選的實施方案中，抗體是赫賽汀(herceptin)抗體。
對于鑒定和分析通過抑制或激活另一化合物(例如激素、細胞因子、生長因子、酶等)的生物活性而間接起作用的化合物，本發明提供了一種可以鑒定間接調節基因轉錄的化合物的方法，該法包括用上文所述方法測定已知可以調節基因轉錄的第一化合物在有或沒有第二化合物存在的情況下的生物活性，若第一化合物在存在所述第二化合物時測得的生物活性明顯不同于第一化合物在不存在第二化合物時測得的活性，則鑒定出可間接調節基因轉錄的化合物。
本發明提供經上述方法鑒定到的可調節基因轉錄的化合物。同時也提供上述方法在鑒定可調節基因轉錄的化合物中的用途。本發明還提供包含用于實施上述方法的成分的試劑盒。優選的，所述成分包括DNA陣列，更為優選的是寡核苷酸陣列。
進一步的，提供藥物組合物，其包含經上述方法鑒定的化合物和可藥用載體(carrier)。任何常規的載體材料均可以使用。載體材料可以是適于腸的、經皮的或胃腸外施用的有機物或無機物。適宜的載體包括水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚(亞烷基)二醇、凡士林等等。此外，藥物制劑可以包含其它藥學活性劑。額外的添加劑例如調味劑、穩定劑、乳化劑、緩沖液等可以按照藥物化合物的公認慣例被添加進去。
另外，本發明提供一種用于制備藥物組合物的方法，此法包括如下步驟用本發明的方法鑒定化合物，對鑒定到的化合物進行修飾，然后與可藥用載體或稀釋劑一起配制所得化合物。
本發明還提供將按照上述方法鑒定到的化合物或該化合物的可藥用鹽用于制備治療疾病，特別是病毒性疾病或癌癥的藥物。
這里所用“可藥用”一詞是指在合理的醫學判定范圍內，化合物、材料、組合物和/或劑型適用于與人和動物的組織接觸而不會引起過度的毒性、刺激性、過敏反應或別的問題或并發癥，并相稱地具有合理的藥效/風險比。
這里所提到的“可藥用鹽”指鑒定到的活性劑的衍生物，其中將親本活性劑修飾成為其酸或堿式鹽。可藥用鹽包括但不僅限于如堿性殘基如胺的無機酸或有機酸鹽；酸性殘基如羧酸的堿金屬鹽或有機鹽；等等。可藥用鹽包括親本化合物的常規無毒性鹽或季銨鹽，例如由無毒性的無機酸或有機酸形成的鹽。例如，這樣的常規無毒性鹽包括從無機酸衍生的鹽，無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有機酸制備的鹽，有機酸有例如醋酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、水楊酸、磺胺酸、2-乙酰氧基安息香酸、反丁烯二酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸等。
本申請還要求保護上面提到的，尤其是參照上面例子所提到的方法、化合物、試劑盒及用途。
上面已經對本發明做了一般性的描述，而通過特定的實施例，結合下面的附圖可以更好地理解本發明，這里包括的實施例除非特別地指明僅是用于舉例說明目的而并非為了加以限制。
附圖簡述

圖1180μg PEG-IFN的分析性IEC-HPLC。用分析性強陽離子交換柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，粒徑10μm，柱直徑7.5mm，柱高7.5cm)分離位置異構體。
圖2(A)9種位置異構體和PEG-IFN的抗病毒比活性圖中所示為位置異構體的抗病毒比活性[U/μg]。該抗病毒活性在受到水泡性口炎病毒感染的MDBK細胞中測定。
(B)位置異構體和PEG-IFN的抗增殖比活性圖中顯示100U/ml各種位置異構體和PEG-IFN對ME15細胞增殖的單位抑制作用[OD490nm/μg]。
結果是三次獨立試驗的平均值。給出PEG-IFN的抗病毒比活性和抗增殖比活性(虛線所示)用于比較。
圖3
對黑色素瘤細胞系(ME15)增殖的時間依賴性抑制。ME15細胞系在不同濃度(500，125，和15U/ml)的IFN，PEG-IFN和異構體的存在下培養5天。每24小時對細胞增殖進行一次測量。五天后對照細胞的密度設為100％作為參照。數據來自三次獨立的重復培養試驗。
圖4動力學解離常數與PEG-IFN和具有高(K134)、中(K131，K164)、低(K121)抗病毒比活性的各異構體的抗病毒活性的相關性。
圖5(A)各個異構體的抗病毒比活性、抗增殖比活性和單位轉錄應答的相關性。PEG-IFN的值設為100％作為參照。虛線所示為PEG-IFN的生物學活性和轉錄活性。對于每個異構體，相對mRNA豐度(AD)之和由所有可誘導基因的總和表示。
(B)對100U/ml IFN，PEG-IFN和各異構體引起的不同總體轉錄基因應答的AD的分級群聚(hierarchical clustering)。IFN和各聚乙二醇化異構體的孵育時間是48小時；所用細胞系是IFN敏感的黑色素瘤細胞系(ME15)。數據分析的條件在文中描述。基因差異表達譜的數據記錄于表3中。
圖6PEG-IFN介導的干擾素應答的3D結構模型。按照抗病毒比活性和抗增殖比活性將PEG-IFN位置異構體分為4組。人干擾素α-2a的高分辨率結構由NMR光譜測得(Klaus等人由雜核NMR光譜測得的溶液中的人干擾素α-2a的高分辨率三維結構，J.Mol.Biol.274(1997)；661-675)。干擾素α-2a的聚乙醇化位點以紅色顯示。
實施例
IFN的抗病毒和抗增殖作用干擾素α-2a(IFN)在介導抗病毒和抗增殖應答以及調節免疫應答中起著重要的作用(G.R.Stark細胞如何應答干擾素，Annu.Rev.Biochem.67(1998)，227-264)。IFN的這些生物活性使其作為病原抑制劑而具有重要作用，并可被用于治療病毒感染和某些癌癥(S.Zeuzem等人慢性丙型肝炎患者中聚乙二醇化干擾素α-2a，New England Journal of Medicine 343(2000)，1666-1172)。自1986年以來，重組的人IFN(ROFERON-A)已經成為治療患病毒性疾病和腫瘤的病人的一種重要治療劑(S.Zeuzem等人聚乙二醇化干擾素α-2a(40kDa)單一用藥一種治療慢性丙型肝炎的新藥劑，Expert Opinion on Investigational Drugs 10(2001)，2201-2213)。
IFN在臨床治療中的成功應用部份地受到其在血清中的短半衰期(4-6小時)的限制。IFN在靜脈或皮下給藥后的3-8小時達到峰濃度，每次給藥后血清中的濃度會發生大幅度的波動。24小時后，體內留有的外源IFN的量微乎其微，因而一周三次的治療方案不可能保持抗病毒活性所需的濃度(J.M.Harris等人聚乙二醇化一種用于改變藥物動力學的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551；P.Bailon等人強效持久形式的干擾素的合理設計一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。
IFN的施用頻率視疾病而定。例如，標準IFN治療性使用由3百萬國際單位的IFN每周皮下給藥三次并最多施用48周組成(J.M.Harris等人聚乙二醇化一種用于改變藥物動力學的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551)，而有的腫瘤適應癥則需要每日給藥(P.Bailon等人強效持久形式的干擾素的合理設計一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。為了提高IFN的藥物動力學和藥效學特性，將之與聚乙二醇(PEG)綴合。
幾年以來，就PEG的大小和PEG的種類對體內和體外的生物活性的影響進行了研究。研究的結果證明PEG的特性與生物活性有著重要的關聯。例如，對于掩蓋和保護IFN免于蛋白水解而言，支鏈的PEG部分比直鏈PEG結合更為有效，且支鏈的PEG部分還可以增強蛋白質的吸收和改善蛋白質的分布特性。另一效果是增加PEG部分的分子量可以降低治療分子的清除率，由此造成與病毒的持久接觸(J.M.Harris等人聚乙二醇化一種用于改變藥物動力學的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551)。基于這些認識以及聚乙二醇化手段的最新進展，已開發出一種持久的支鏈單聚乙二醇化IFN(P.Bailon等人強效持久形式的干擾素的合理設計一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。
一種通過酰氨鍵連接上40kDa支鏈PEG的干擾素α-2a(PEG-IFN)表現出持久的吸收和減低的腎清除率，其在整個每周一次給藥的方案中導致強的抗病毒壓力(M.C.Perry和B.Jarvis綜述聚乙二醇化干擾素α-2a(40kD)用于治療慢性丙型肝炎，Drugs 15(2001)，2263-2288；以及M.W.Lamb和E.N.Martin聚乙二醇化干擾素(40kDa)α-2a的基于體重給藥相對固定給藥，The Annals of Pharmacotherapy 36(2002)，933-938)。對此PEG-IFN混合物的表征顯示出有9種在賴氨酸上單聚乙二醇化的位置異構體K31，K49，K70，K80，K112，K121，K131，K134和K164。在抗病毒試驗中，所有的位置異構體均能引起MDBK細胞對病毒的抵抗。
實施例1PEG-IFN的制備PEG-IFN由Hoffmann-La Roche公司生產。聚乙二醇化的干擾素α-2a如下制備用活化的支鏈聚乙二醇衍生物(分子量40000Da)與干擾素分子表面的賴氨酸ε-氨基基團綴合(Bailon，P.等人強效持久形式的干擾素的合理設計一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202；EP809996)。按照下文所述分離和分析PEG-IFN的異構體。其它所有試劑和化學品均為能獲得的最高純度。
PEG-IFN的組成是單聚乙二醇化的IFN分子的混合物。每一個分子中僅一個賴氨酸通過結合PEG部分而被化學修飾，從而形成幾種物質的混合物。因為存在11個賴氨酸和一個游離的N末端氨基基團，預期有12種單聚乙二醇化的分子，但僅能發現9種賴氨酸修飾的分子(K31，K49，K70，K83，K112，K121，K131，K134和K164)。
實施例2純化和表征PEG-IFN位置異構體我們開發了一種制備性兩步層析方法用于有效的分離這些種類的異構體。制備的位置異構體的純度可以用分析性離子交換方法檢驗，例子參見圖1中的洗脫曲線。分離是基于這些異構體的局部電荷差異進行的，而這種差異是由于蛋白質部份上聚乙二醇化位置的不同而造成的。
層析圖中基線吸收朝向末尾的下降意味著沒有別的種類的單聚乙二醇化IFN在更高的滯留時間被洗脫下來。通過兩步分離純化得到9種位置異構體，之后的性質分析顯示聚乙二醇化位點均在賴氨酸上K31，K49，K70，K83，K112，K121，K131，K134和K164。
實施例3位置異構體的分離使用兩步分離純化的方案制備PEG-干擾素α2a單聚乙二醇化同種型。
a)第一步是在一個制備性低壓液相色譜柱上進行位置異構體的分離，柱基質是弱陽離子交換基質(TOSOH-BIOSEP，Toyopearl CM-650S，樹脂批號82A，其離子交換容量為123mEq/ml，柱直徑為16mm，柱長120cm)。以0.7mL/min流速使用具有遞增醋酸鈉濃度的線性pH梯度(25mM，pH4.0至75mM，pH7.8)。檢測波長為280nm。通過這個層析步驟，能夠得到1、2、5、6類型的異構體以及3，4，4a，7和8類型異構體的混合物，參見表1。
b)這些級分進一步地用第二個制備步驟加以分離和純化。使用的制備性柱子的基質和上文提及的分析性強陽離子交換柱的基質相同，只是增加了柱的大小(30mm內徑，70mm長)，另外，使用更高的流速和延長的運行時間。就此分析方法，該柱先用3.4mM的醋酸鈉，10％乙醇和1％二甘醇，pH值調節為4.4的溶液(緩沖液A)預平衡。將PEG-IFN樣品上樣后，柱子用緩沖液A洗，之后用遞增線性梯度至10mM磷酸氫二鉀、10％乙醇和1％二甘醇，pH值6.6(緩沖液B)的溶液洗。流速為1.0mL/min，檢測波長為218nm。
基于PEG-IFNα2a的蛋白質部分在280nm處的光吸收，用光譜法測定PEG-IFNα2a異構體的蛋白濃度。
180μg的PEG-IFNα2a的分析性洗脫曲線示于圖1。此法的結果是分出8個洗脫峰，其中2個為基線分離，6個是部分的分離。基線吸收朝向層析圖末端方向的下降意味著沒有別的單聚乙二醇化IFN種類在更高的滯留時間被洗脫下來。
此外，仔細觀測IEC的層析圖可以發現在峰2和峰3之間有另外一個接近檢測界限的峰，這說明還有另外的位置異構體存在，這些異構體對于PEG-IFNα2a混合物的比活性應該也有貢獻。由于干擾素α-2a分子顯示出12個可聚乙二醇化的位點(11個賴氨酸以及N-末端)，故預期還有其它種類的異構體。然而，鑒于這些種類的低豐度，它們沒有被分離出來，性質未能得到檢測。
由優化的IEC操作下得到的異構體樣品在分離后直接分析(t＝0)和儲存于5℃下2周后進行分析。就光譜測定法得到的蛋白含量而言，沒有發現來自IEC各峰的蛋白有明顯的差別；也沒在單聚乙二醇化位點、低-PEG-IFNα2a的含量、團聚體的量和生物測定活性方面發現變化。考慮到各個異構體的相對豐度(由IEC法測得)以及比活性(由抗病毒試驗測定)，用于異構體分離的PEG-IFNα2a混合物的生物學比活力幾乎全部得以回收(回收率近93％)。考慮到IEC級分中有其它位置異構體的污染，故用分析性IE-HPLC檢測各個異構體的純度。峰2，3，4，4a，5和7的純度大于98％，峰1和8純度為93％，峰6的純度為88％。
表1通過比較異構體與標準參照的Lys-C消化譜鑒定的PEG-肽。
在分離出的各種PEG-IFN中鑒定到的PEG位點峰 肽圖譜中缺少的峰PEG-IFNPEG位點 Mr(DA) 序列峰1K31A，E 24-49峰2K134I，I’ 134-164峰3K131C122-131a峰4K121B，C 113-131峰4a K164b134-164a，b峰5K70D，F 50-83峰6K83D，H 71-112峰7K49E，F 32-70峰8K112B，H 84-121a132-133太小而未檢測a bRP-HPLC.
各級分通過本文中所述方法來鑒定其性質。
實施例4通過質譜肽作圖法分析各級分質譜用MALDI-TOF MS儀(PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR，使用“延遲引出”(delayed extraction))記錄。各個IEC(離子交換層析)級分通過透析脫鹽，用0.02M 1，4-二硫代-DL-蘇糖醇(DTT)還原，并用0.2M 4-乙烯基吡啶烷基化。然后用內切蛋白酶Lys-C(Wako Biochemicals)消化蛋白質，反應溶液是0.25M Tris(三(羥甲基)-氨基乙烷)，pH8.5，酶與蛋白的比例約為1∶30。在37℃下反應過夜。
20mg/mlα-氰基-4-羥基桂皮酸和12mg/ml硝酸纖維素在40/60(v/v)的丙酮/異丙醇中的溶液作為基質(薄層施用)。首先，將0.5μL基質鋪于靶上并讓其干燥。然后，加入1.0μL樣品。光譜在線性陽離子化模式下獲得，其中加速電壓為20,000V，柵極電壓為95％。每一個光譜至少收集可覆蓋整個點的190次激光發射。Des-Arg1-緩激肽和牛胰島素用來作為內部校準。
實施例5高效液相色譜(RP-HPLC)肽作圖肽通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)肽作圖法來表征。IEC的級分用上面MALDI-TOF MS肽作圖中的方法還原、烷基化、以及用內切蛋白酶Lys-C消化。消化的異構體在Waters Alliance HPLC系統中進行分析，所用為Vydac RP-C18分析柱(5μm，2.1×250mm)和填充同樣材料的前置柱。用水中的1％至95％的乙腈梯度進行洗脫，時間為105分鐘，流速0.2mL/min。兩種溶劑均含有0.1％(v/v)TFA。每個消化樣品注射100μL，監測波長為215nm。
實施例6未消化蛋白的MALDI-TOF譜18mg/ml的反式-3-吲哚基丙烯酸在70/30(v/v)的乙腈/0.1％三氟乙酸中的溶液與等體積的樣品溶液預混合。然后將1.0μL混合物施于靶表面。通常在線性陽離子化模式下平均進行150-200次激光發射。加速電壓設為25,000V，柵極電壓至90％。牛血清M+和M2+用作外部校準。
實施例7SE-HPLC(大小排阻HPLC)SE-HPLC在配有TosoHaas TSK gel G 4000 SWXL柱(7.8×300mm)的Waters Alliance 2690 HPLC系統下進行。蛋白質用含有0.02MNaH2PO4，0.15M NaCl，1％(v/v)二甘醇以及10％(v/v)乙醇(pH6.8)的流動相洗脫，洗脫流速為0.4mL/min，用210nm的波長監測。注射量為每種異構體20μg。
大小排阻HPLC以及SDS-PAGE用于測定不同的IEC級分中的低-PEG-IFNα2a和團聚體的量。參照物含有2.3％團聚體和2.2％低聚物。
峰1，4，4a，5，6和8含有小于0.7％的低聚乙二醇化IFNα2a，而峰2，3，和7中低聚乙二醇化IFNα2a的百分比低于測量的底限(＜0.2％)。對于團聚體，觀察到不同趨勢。所有峰中團聚體的量均低于0.9％。
實施例8SDS-PAGESDS-PAGE使用16％的Tris-甘氨酸凝膠(1.5mm，10孔)在非還原和還原條件下進行。分子量分布在2.5到200kDa的Novex Mark 12分子量標準被用作參照，用牛血清白蛋白(BSA)(2ng)作為靈敏度標準。大約所有樣品各約1μg和0.5μg標準物加到膠上。電泳條件是在125V，6W下120分鐘。用Novex的SilverXpress銀染試劑盒對蛋白進行固定和染色。
對于IEC級分1-8，在非還原條件下記錄的膠顯示出與參照標準PEG-IFNα2a相類似的模式。在還原條件下，與標準相比而言，凝膠顯示出在大約90kDa的次要條帶的強度有所增強。對于峰6，7和8，在6到10kDa之間有蛋白質片斷。兩條帶一起相當于被剪切物質的約1％。在異構體1，5，6，7，8的泳道中，可見大于100kDa的額外的條帶，這些條帶在標準物中也有出現。這些條帶可以推定為低聚體。因而，SDS-PAGE證實了SE-HPLC分析的結果。
總之，RP-HPLC和SDS-PAGE試驗顯示IEC組分的純度可以被認為與PEG-IFNα2a參照標準相當。
由9個IEC-級分得來的各種PEG-IFNα2a的結構基于上述方法的結果使用上述策略得以鑒定。
實施例9體外抗病毒保護活性分離到的異構體的抗病毒活性通過水泡性口炎病毒(VSV)在Madin-Darby牛腎細胞(MDBK)上的致細胞病變效應的減弱來測定。細胞系在含有10％胎牛血清的MEM培養基中培養。為了測定有效濃度，異構體和PEG-IFN稀釋至終濃度為10ng/ml(試驗起始濃度)。這里有效濃度(EC50)定義為使得50％細胞抵抗VSV所需的濃度。在所有測定中，細胞培養物在加入PEG-IFN異構體后4小時經VSV攻擊。在37℃下生長18小時后，細胞用結晶紫crystal violet_染色，以確定完好的細胞的數量。
測定EC50值以確定9個位置異構體的抗病毒活性。在本試驗中測定PEG-IFN作為參照。
圖2A顯示的是異構體的比活性(U/μg，灰色柱)。在這個試驗中，各個位置異構體均有活性，只是水平不同。異構體K31和K134有比PEG-IFN高的活性，分別相當于PEG-IFN活性的170％和125％。K164的活性等于混合物的活性，而K49，K70，K83，K112，K121和K131的活性則較低。
實施例10抗增殖活性試驗在此試驗中，使用人的轉移性黑色素瘤細胞系(ME15)的原代細胞培養物。此細胞系于2000年8月17日依據布達佩斯條約保藏在巴黎的國立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur)，保藏號為CNCM I-2546。細胞系在添加有10％FCS，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，10mM非必需氨基酸和HEPES緩沖液(均購自英國Gibco Life Sciences)的RPMI培養基中培養。當細胞匯合時。用胰蛋白酶消化以進行細胞傳代。以平底96孔板中每孔約5000-6000個細胞為細胞增殖試驗的起點，試驗分別在有或沒有各個濃度的IFN，PEG-IFN和異構體的情況下進行5天。之后用細胞著色試劑盒(Promega，Madison，USA)進行活細胞計數，計數是基于四氮唑鹽MTS裂解為甲月替(formazan)后的比色測定進行的。按照廠商推薦加入MTS反應溶液，37℃反應4小時之后在分光光度計上測定490nm處的光吸收值。
用IFN-敏感的黑色素瘤細胞系(ME15)和商業試驗來測定異構體的抗增殖比活性。位置異構體和作為參照的PEG-IFN的使用濃度為100U/ml(圖2B)。試驗所用的異構體的生物學單位(U)由本文中前述的抗病毒試驗來定義和確定，以PEG-IFN為標準參照。
在本試驗中，所有的異構體均有活性，其中異構體K31和K134相對于PEG-IFN的活性分別為159％和115％。異構體K164顯示與PEG-IFN相同的活性；其余所有異構體的活性均低于參照物。
此結果中的活性排序與抗病毒試驗中的活性排序基本上相同，這表明上述活性來源于一個共同的引發機制或信號事件。
對于在以上二試驗中9種位置異構體具有不同比活性的一種解釋是它們的蛋白穩定性有所不同。為了證實此點，我們在ME15細胞系中進行了一個時間過程試驗來測試不同的濃度下的一些異構體。我們選擇了活力最高的異構體K31和K134，以及活力最低的異構體K121，用IFN以及PEG-IFN作為參照(參見圖3)。不同濃度(500，125和15U/ml)的IFN，PEG-IFN和位置異構體被用來處理ME15細胞，作用時間為5天。每24小時計算細胞的數量。
我們又發現了與上述抗增殖活性驚人的相關性K134活性最高，K31和PEG-IFN次之。和我們預想的一樣，活性最低的是K121和IFN。
可以觀察到，對增殖的抑制隨著濃度的降低而降低。有趣的是，5天之后，PEG-IFN在500U/ml使用濃度時的抗增殖活性與使用濃度為125U/ml的異構體K134的抗增殖活性一致，而5天后，IFN和K121在使用濃度至少125U/ml時表現出較低或沒有抗增殖活性。
通過三個獨立的生物試驗，我們在PEG部分的分子內結合位點和生物活性之間建立了聯系。總體而言，異構體K31和K134比商購混合物表現出一貫的較高的比活性，而其余7個異構體相對于商購混合物(等于K164)有相近似的比活性。活性范圍在170％到20％之間，說明不同的位置異構體之間蛋白的比活性的差異是顯著的。
實施例11從大腸桿菌表達和純化重組干擾素受體2的胞外結構域。
干擾素受體2的胞外結構域(IFNR2-EC)被克隆進pET15b-載體(美國Invitrogen)，N末端帶有His-Tag_。用此載體構建體在E.coli中表達IFNR2-EC。目的蛋白在細胞中以包函體的形式沉淀。在完全培養基中發酵后將E.coli沉淀并重懸于含50mM Tris，10％蔗糖，0.02％疊氮化鈉，10mM氯化鎂以及無EDTA的蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中。在FrenchPress中勻漿并于13000rpm離心后，將包函體溶解于8M的尿素。第一個層析步驟是鎳螯和層析，用大于10個柱體積的0-500mM咪唑進行線性梯度洗脫。合并的IFNR2峰在8M尿素中透析以去除咪唑。透析之后用含有150mM pH8.0 Tris/HCl的8M尿素稀釋樣品至A280吸收值為0.1，然后將之儲存在室溫下直到Ellman試驗結果顯陰性。氧化的IFNR2-EC對50mM Tris pH8.4透析以使之重新折疊。pH8.4的50mM Tris溶液也是第二步層析的起始緩沖液。第二步層析用陰離子交換樹脂(HiTrap Q HP，5×5ml，Amersham Biosciences)，用0-500mM NaCl梯度進行。
所有的純化步驟都用還原和非還原SDS-PAGE加以分析。蛋白質的純度由使用Superdex_75和200 HR(PC 3.2/30，Amersham Biosciences)的分析性大小排阻層析進行監測。此層析方法同樣用于測定結合活性和能力(數據未顯示)。
實施例12用光學生物傳感器系統表征IFN以及PEG-IFN異構體與IFNR2-EC的相互作用。
IFNR2-EC的固定用生物素標記來實現。生物素化蛋白質被錨定在鏈親和素傳感器表面(SA Sensor，BIAcore)。
生物素化是通過將蛋白質的儲存溶液(10mM醋酸，pH7.5)用Hepes(10mM，pH＝8.4)稀釋至最終蛋白濃度為0.23mg/ml(8.65μM)進行的。8.65mM溶在DMSO中的生物素氨基己酸-正-羥基琥珀酰亞胺酯(Fluka)被加入溶液中使得生物素化試劑的終濃度為86.5μM。混合物反應1小時后對10mM Hepes緩沖液(pH8.4，含150mM NaCl)透析過夜以去除低分子量的反應產物。此溶液用于固定步驟中。固定是通過將生物素化蛋白質溶液與SA傳感器表面相接觸來進行的。固定化的蛋白質的量通過接觸時間來控制。對于結合試驗，固定4000RU，相當于固定大約4ng/mm2蛋白質。
結合試驗以Hepes緩沖液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)為運作緩沖液。干擾素溶液通過用運作緩沖液稀釋干擾素貯液來制備。所有結合試驗的流速設定為5μl/min。干擾素溶液與固定的IFNR2-EC接觸5分鐘的時段。
結合數據的計算基于形成1/1復合物的簡單動力學模型，將時間依賴的反應曲線進行數學擬合來確定解離常數值(KD)。Kon和koff值通過此擬合而得到。KD為koff/Kon之比。
當用無標記的固相探測例如表面等離子體共振(surface plasmonresonance，SPR)來研究蛋白質的相互作用時，需要固定相互作用的化合物中的一個。
我們使用兩個不同的偶聯策略來將IFN或IFNR2-EC固定于傳感器表面。IFN經由自由氨基基團被固定到羧化葡聚糖傳感器表面，IFNR2-EC被生物素標記并錨定在鏈親和素傳感器表面。分別用此兩種傳感器和對應的IFN來進行IFNR2-EC結合試驗。獲得速率常數和結合親合力的一致值。結果顯示結合親合力與使用的固定手段和所固定的蛋白無關(數據未顯示)。這些預試驗對于增加異構體測定的準確性以及驗證1/1復合體形成的簡單動力學模型是必要的。
為了測定親合力和動力學常數，我們選擇了可以涵蓋整個生物學比活性范圍的五種異構體(K31，K121，K131，K134和K164)，參見圖2A，B。為了增加動力學和平衡參數的意義，我們用了不同的異構體濃度在固定的IFNR2-EC上進行結合研究。用IFN和PEG-IFN作為參照。基于1/1復合物形成的動力學模型的結合曲線擬合結果示于表2。
表2野生型IFN；PEG-IFN以及幾種位置異構體的相互作用的動力學常數
konkoffKDkin[105M-1×s-1] [10-2s-1][nM]IFN 12.5 1.14 9.12PEG-IFN 0.27 2.3851K31n.d. n.d. n.d.(＞1mM)K1340.87 3.96 455K1310.96 2.8289K1210.83 2.33 279K1640.652 2.19 335表中顯示了測得的親和力和動力學數據。對于動力學常數的計算是基于形成1/1的復合物的動力學模型進行的。IFNR2-EC由生物素標記。生物素化的蛋白質被錨定在鏈親和素傳感器的表面(SA Sensor，Biacor)。結合試驗在作為運作緩沖液的Hepes緩沖液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)中進行。
所獲得的KD-值顯示IFN的聚乙二醇化導致其與INFR2-EC的親和力降低。親和力的降低值由聚乙二醇化的位點而定。親和力的變化通常由結合常數(Kon)的變化引起。例如，異構體K134使親和力改變了大約15倍。其kon減少了10倍以上，而其Koff僅增加大約4倍。
對于異構體K31，因為其蛋白質濃度太低，故只可能得出KD的估算值。
將抗病毒比活性或抗增殖比活性數據與IFNR2-EC親和力研究相結合，發現一種有趣的聯系，參見圖4。它顯示，對于一個給定的異構體，IFNR2-EC親和力越高(KD越低)，其生物學比活性越低。此關系與主要用于尋找具有低KD和高生物活性的配體的通常藥物篩選原則正相反。
實施例13異構體相對于IFN的轉錄應答可用于同時測量數千個基因的表達水平的DNA微陣列提供了一個全面的架構以確定位置異構體如何在基因組水平上影響細胞的新陳代謝和調節。
為了評價聚乙二醇化位點對于IFN轉錄活性的影響，我們用寡核苷酸陣列技術測量了IFN誘導的黑色素瘤細胞系ME15的基因表達模式。
ME15細胞在100U/ml的IFN，PEG-IFN或PEG-IFN異構體存在的條件下孵育48小時。經過48小時后培養的細胞用刮除的方法收獲，并用RNA-BeeTM提取細胞的總RNA。從每個樣品中10μg的細胞總RNA被逆轉錄(Invitrogen，U.S.)，標記(Ambion，U.S.)，并利用商購的試劑盒按生產廠商的說明進行加工。堿性條件下加熱片斷化以及之后U95Av2 GeneChip陣列與cDNA的雜交依照microchip(Affymetrix，U.S.).的生產商提供的標準程序進行。進行寡核苷酸陣列分析的另外一個方法實例在文獻中有記載——Fambrough等人生長因子受體活化的多樣信號通路可以誘導在很大范圍上重疊而非獨立的多組基因，Cell 97(1999)，727-741。
陣列的原始數據用共聚焦激光掃描儀(Hewlett Packard，U.S.)測定，并用GeneChip v3.1軟件(Affymetrix，U.S.)分析像素水平。各個基因的表達水平相對于與錯配寡核苷酸的雜交計算為熒光強度的歸一化平均差，用任意單位(AD)表示。樣品的每個分析均用來自三個不同的細胞板的標記cDNA重復進行三次。
判定一個基因在用IFN，PEG-IFN或PEG-IFN異構體處理后相對于未處理細胞是否有差異表達的四項標準為(1)處理后的細胞的強度值至少比未處理的細胞高兩倍。(2)處理后的細胞的強度值應至少大于或等于50AD。(3)未處理的細胞的強度值應低于50 AD。(4)標準差必須顯著低于平均差的絕對變化值，計算的基因的置信水平設為大于97％(p值＜0.03)。
在這些試驗中，我們所用的細胞系(ME15)和抗增殖試驗中用到的相同。我們用100U/ml的各個異構體或IFN和PEG-IFN處理細胞48小時。IFN用來作為參照。經過這樣的處理之后從ME-15細胞中提取總RNA。用于制備cDNA以及隨后進行雜交和U95Av2 GeneChip陣列掃描的方法見上文所述。加工前經瓊脂糖凝膠電泳對總RNA樣品進行肉眼觀察，沒有在樣品中發現任何降解跡象。對于每個異構體、IFN和PEG-IFN的生物重復次數(n＝3)使得可以為數據分析應用統計學算法，以解決實驗差異問題。數據分析集中于那些在未處理細胞中低于50 AD而在處理細胞中上調至少兩倍以致AD值至少為50AD的基因。
標準差必須顯著低于平均差的絕對變化值，基因的計算置信水平設為大于97％(p值＜0.03)。
運用這些標準，觀察到29個上調的基因的表達譜。在這個表達模式下，相對于IFN，13種已知參與抗增殖和抗病毒通路的IFN所誘導的基因受到很大程度的上調(表3)。分級群聚(圖5B)顯示所有的異構體都有轉錄活性，但強度有所不同。
針對每個異構體和IFN，測定所誘導基因的AD值之和(∑AD)，轉錄、抗病毒、抗增殖活性均以IFN為參照進行比較。圖5A顯示，當異構體具有增加的生物活性(與PEG-IFN相比較根據異構體的抗病毒和抗增殖活性來確定)，其也具有增加的轉錄活性；而生物活性較低的異構體顯示較低的轉錄活性，因此，與生物活性相對于結合試驗的關系有所不同，生物活性與轉錄活性之間有著正相關性。
除了異構體對于總體轉錄基因應答的影響，還發現單個基因的不同的上調。例如，干擾素誘導的核磷蛋白基因在K49和K31接觸下的表達高于在K134或K131接觸下的表達。K49和K31異構體比K134或K131具有較低的總體轉錄基因應答。此發現突出了為了確定目的化合物的轉錄活性，有必要用本發明的方法分析總體轉錄基因應答而不是測量某個或一小部分選定的基因的轉錄表達水平。
另外，針對轉錄特異的副作用也分析了微陣列芯片的數據，這些副作用可以指示出任何異構體對于細胞的生存或代謝的不良影響。這些分析的標準與上述的相同，唯一的區別在于各個異構體的數據是交叉比較的。本分析的結果顯示所有異構體均無特異副作用。
表3取決于聚乙二醇化位點由IFN調節的基因


為了鑒定出受誘導的基因，ME15細胞系在沒有(未處理細胞)或有100U/ml IFN或PEG-IFN樣品存在的條件下被培養48小時。各個基因的表達水平相對于與錯配寡核苷酸的雜交計算為熒光強度的歸一化平均差，以任意單位來表示。樣品的每個研究用來自三個不同的細胞板的標記cDNA重復進行三次測量。對于基因在IFN或PEG-IFN樣品處理后相對于未處理細胞是否差異表達的判斷準則是處理細胞的平均值比未處理細胞的平均值至少高出兩倍，而處理細胞的平均值應至少大于或等于50單位。且未處理的細胞的平均值應小于50單位。另外，標準差必須顯著低于平均差的絕對變化值，基因的計算置信水平設為大于97％(p值＜0.03)。運用這些標準，發現了29個受到調節的基因。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>轉錄活性試驗<130>21574<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>597<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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<221>BST-2<222>(1)..(996)<223>GenBank accession No.D28137<400>2gtggaattca tggcatctac ttcgtatgac tattgcagag tgcccatgga agacggggat 60aagcgctgta agcttctgct ggggatagga attctggtgc tcctgatcat cgtgattctg120ggggtgccct tgattatctt caccatcaag gccaacagcg aggcctgccg ggacggcctt180
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<221>干擾素誘導的肽(6-16)基因<222>(1)..(6803)<223>GenBank accession No.U22970<400>3agatctatca tgatggccac atgaacacag gcttcactgg tcttaccata tgcccatgac 60ccagaagcag ccagcctgag agaacaatgg aacaaagtga cttaatttcc aaagttctgg120gggtttataa acagcatatg gtatgtcaca tgactactgt gggattggaa aaagatcatg180taaatagagc actttgcaca gaccctggca tgcagcaagt gctcaataaa tgataggtgt240tgtttactaa ttggactgaa tggtgaaagg cctgtgtgcc ccagggggag ctggtgatca300ggcttcacta agcccagtat ggccgtggct ctcatctcag tgtgacatgc tttgaatacc360cttagcggct ccaaaagtcc tcagcttgaa gtgcattttt ctgccagcag gcagcacaca420aatgttccgc tgggcggagc tgggagagag gggaaaatga aactctgcag agtgcaggag480ctgggagaga ggggaaaatg aaactgcaga gtgcagaaat agaaactccg acagggattg540gctgcctagg gtgagacgtg ggaggatcca caagtgatga taaaaagcca gccttcagcc600
ggagaaccgt ttactcgctg ctgtgcccat ctatcagcag gctccgggct gaagattgct 660tctcttctct cctccaaggt aaactcagga gcttatgaag tgtgggcatt caagctgcca 720ccctctgcca ggctgcctgt ctgcctgtaa atctcatgtt ctgagagcca ggaggcccct 780tctcctggga ggcagcactc ctgggtccct tttagtgctc tgggctggga cttgtctaag 840aggatgggtt ggagattttt agggagatgg gatgcaaaac cccaagtggc atgagaccca 900gcttacaggt gcaatatcag cgatctgtgg ccttaacact gtcacctctt ggagccttaa 960ttacttcctc tgtaaaagga aagttaagtt gcctttgctg ctcaaaggac tggagtattt1020tagaatcccc tttattatag gatccaatgt gacagtgagt tcatctttaa ggatagatga1080agccatctgg agtggttgtt aaaaatgtgg gcttggtggc caggcgtggt ggttcacgcc1140tgtaatccca gcactttggg aggccgagac ccacggatca cgaggtcagg agatcgagac1200catcctggct aacacagtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaaaa attagccggg1260cttggtggtg ggcgcctgta gtctcagcta ctcgggaggc tgaggcaggc aggagaatgg1320catgaacctg ggaggtggag cttgcagtga gatgagattg cgccactgca ctccagcctg1380ggcgacagag aaagactcca tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgtggg cttgggtatt1440agccaattgt gggtttaaac cctgactttg ccatgacctg gctaggcagc cttgggaata1500ttacttaacc tctctgagct tcagtttcct tatctataac atgtggttga taacaatggt1560acctacttcg tggtgttgtt ataggtacaa gtggactgcg tgccataaag tgctaagtac1620tcaatacatg agaggagttt cttgtttttc tttttaactt aagaaaatag cattgatctg1680acaaagatca tattagaggt gagtctgagg gcatatgcat tttccagttt tgtggtataa1740aggaaagagc ataggttcat gaattctgac tgtcttgaat gtgtacccat gttgcacaat1800ttgctgtgtg acctttatcc cttgtgatat tgtaaaatat attttttcat cccccagttc1860ctggcataca actcctaaaa tccttggaat cttcaaagtg ataaatatct tttgagtgat1920aactgtctaa taagttgact gatggctggc atttcctctg gggaggggag aggggctgaa1980ggttaagctg attaccaatg ggcagtgatt taatcagtca tgcctatgta atgaagcctc2040cataaaaaca caaaaggaca gggtttgaca agcttccaga tagccgaata caggaggtct2100ccagtgggtg gtgcttctgg agaggaatgg aaactccatg ccctttctcc cataccttgc2160cctatgcatc tcttcatctg gagcatttgt aatatccata aggaaccagt aaatgtagct2220gggtatggtg gctgatgcct gtaatctcag cactttggga ggctgaggca ggcagattgc2280gtgagttcag gagttcaaga tcagcctggg caacatggtg aaaccccatc tcaaaaaaaa2340aaaaaaaaat tagttgggcg tggtggtgca tacctgtagt cccagctatc tggaggctga2400ggtgggagga tcacttgagc ctgggaggcg aaggtctcag tgagctgaga tggggccact2460
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<221>干擾素誘導的17-kDa/15-kDa蛋白質<222>(1)..(634)<223>GenBank accession No.M13755<400>4cggctgagag gcagcgaact catctttgcc agtacaggag cttgtgccgt ggcccacagc 60ccacagccca cagccatggg ctgggacctg acggtgaaga tgctggcggg caacgaattc120caggtgtccc tgagcagctc catgtcggtg tcagagctga aggcgcagat cacccagaag180attggcgtgc acgccttcca gcagcgtctg gctgtccacc cgagcggtgt ggcgctgcag240gacagggtcc cccttgccag ccagggcctg ggccctggca gcacggtcct gctggtggtg300gacaaatgcg acgaacctct gagcatcctg gtgaggaata acaagggccg cagcagcacc360tacgaggtcc ggctgacgca gaccgtggcc cacctgaagc agcaagtgag cgggctggag420ggtgtgcagg acgacctgtt ctggctgacc ttcgagggga agcccctgga ggaccagctc480ccgctggggg agtacggcct caagcccctg agcaccgtgt tcatgaatct gcgcctgcgg540ggaggcggca cagagcctgg cgggcggagc taagggcctc caccagcatc cgagcaggat600caagggccgg aaataaaggc tgttgtaaga gaat634<210>5<211>2058
<212>DNA<213>人<220>
<221>成骨細胞中表達的mRNA<222>(1)..(2058)<223>GenBank accession No.AB000115<400>5gcacgaggaa gccacagatc tcttaagaac tttctgtctc caaaccgtgg ctgctcgata 60aatcagacag aacagttaat cctcaattta agcctgatct aacccctaga aacagatata 120gaacaatgga agtgacaaca agattgacat ggaatgatga aaatcatctg cgcaactgct 180tggaaatgtt tctttgagtc ttctctataa gtctagtgtt catggaggta gcattgaaga 240tatggttgaa agatgcagcc gtcagggatg tactataaca atggcttaca ttgattacaa 300tatgattgta gcctttatgc ttggaaatta tattaattta cgtgaaagtt ctacagagcc 360aaatgattcc ctatggtttt cacttcaaaa gaaaaatgac accactgaaa tagaaacttt 420actcttaaat acagcaccaa aaattattga tgagcaactg gtgtgtcgtt tatcgaaaac 480ggatattttc attatatgtc gagataataa aatttatcta gataaaatga taacaagaaa 540cttgaaacta aggttttatg gccaccgtca gtatttggaa tgtgaagttt ttcgagttga 600aggaattaag gataacctag acgacataaa gaggataatt aaagccagag agcacagaaa 660taggcttcta gcagacatca gagactatag gccctatgca gacttggttt cagaaattcg 720tattcttttg gtgggtccag ttgggtctgg aaagtccagt tttttcaatt cagtcaagtc 780tatttttcat ggccatgtga ctggccaagc cgtagtgggg tctgatacca ccagcataac 840cgagcggtat aggatatatt ctgttaaaga tggaaaaaat ggaaaatctc tgccatttat 900gttgtgtgac actatggggc tagatggggc agaaggagca ggactgtgca tggatgacat 960tccccacatc ttaaaaggtt gtatgccaga cagatatcag tttaattccc gtaaaccaat1020tacacctgag cattctactt ttatcacctc tccatctctg aaggacagga ttcactgtgt1080ggcttatgtc ttagacatca actctattga caatctctac tctaaaatgt tggcaaaagt1140gaagcaagtt cacaaagaag tattaaactg tggtatagca tatgtggcct tgcttactaa1200agtggatgat tgcagtgagg ttcttcaaga caacttttta aacatgagta gatctatgac1260ttctcaaagc cgggtcatga atgtccataa aatgctaggc attcctattt ccaatatttt1320gatggttgga aattatgctt cagatttgga actggacccc atgaaggata ttctcatcct1380ctctgcactg aggcagatgc tgcgggctgc agatgatttt ttagaagatt tgcctcttga1440ggaaactggt gcaattgaga gagcgttaca gccctgcatt tgagataagt tgccttgatt1500ctgacatttg gcccagcctg tactggtgtg ccgcaatgag agtcaatctc tattgacagc1560
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<221>轉錄因子ISGF-3<222>(1)..(2607)<223>GenBank accession No.M97936<400>6attaaacctc tcgccgagcc cctccgcaga ctctgcgccg gaaagtttca tttgctgtat 60gccatcctcg agagctgtct aggttaacgt tcgcactctg tgtatataac ctcgacagtc120ttggcaccta acgtgctgtg cgtagctgct cctttggttg aatccccagg cccttgttgg180ggcacaaggt ggcaggatgt ctcagtggta cgaacttcag cagcttgact caaaattcct240ggagcaggtt caccagcttt atgatgacag ttttcccatg gaaatcagac agtacctggc300acagtggtta gaaaagcaag actgggagca cgctgccaat gatgtttcat ttgccaccat360ccgttttcat gacctcctgt cacagctgga tgatcaatat agtcgctttt ctttggagaa420taacttcttg ctacagcata acataaggaa aagcaagcgt aatcttcagg ataattttca480ggaagaccca atccagatgt ctatgatcat ttacagctgt ctgaaggaag aaaggaaaat540tctggaaaac gcccagagat ttaatcaggc tcagtcgggg aatattcaga gcacagtgat600gttagacaaa cagaaagagc ttgacagtaa agtcagaaat gtgaaggaca aggttatgtg660tatagagcat gaaatcaaga gcctggaaga tttacaagat gaatatgact tcaaatgcaa720aaccttgcag aacagagaac acgagaccaa tggtgtggca aagagtgatc agaaacaaga780acagctgtta ctcaagaaga tgtatttaat gcttgacaat aagagaaagg aagtagttca840caaaataata gagttgctga atgtcactga acttacccag aatgccctga ttaatgatga900
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<221>ISGF3-γ<222>(1)..(1584)<223>GenBank accession No.M87503<400>7gatcagaggg cgatcagctg gacagcaact caggatggca tcaggcaggg cacgctgcac 60ccgaaaactc cggaactggg tggtggagca agtggagagt gggcagtttc ccggagtgtg 120ctgggatgat acagctaaga ccatgttccg gattccctgg aaacatgcag gcaagcagga 180cttccgggag gaccaggatg ctgccttctt caaggcctgg gcaatattta agggaaagta 240taaggagggg gacacaggag gtccagctgt ctggaagact cgcctgcgct gtgcactcaa 300caagagttct gaatttaagg aggttcctga gaggggccgc atggatgttg ctgagcccta 360caaggtgtat cagttgctgc caccaggaat cgtctctggc cagccaggga ctcagaaagt 420accatcaaag cgacagcaca gttctgtgtc ctctgagagg aaggaggaag aggatgccat 480gcagaactgc acactcagtc cctctgtgct ccaggactcc ctcaataatg aggaggaggg 540ggccagtggg ggagcagtcc attcagacat tgggagcagc agcagcagca gcagccctga 600gccacaggaa gttacagaca caactgaggc cccctttcaa ggggatcaga ggtccctgga 660gtttctgctt cctccagagc cagactactc actgctgctc accttcatct acaacgggcg 720cgtggtgggc gaggcccagg tgcaaagcct ggattgccgc cttgtggctg agccctcagg 780ctctgagagc agcatggagc aggtgctgtt ccccaagcct ggcccactgg agcccacgca 840gcgcctgctg agccagcttg agaggggcat cctagtggcc agcaaccccc gaggcctctt 900cgtgcagcgc ctttgcccca tccccatctc ctggaatgca ccccaggctc cacctgggcc 960aggcccgcat ctgctgccca gcaacgagtg cgtggagctc ttcagaaccg cctacttctg1020cagagacttg gtcaggtact ttcagggcct gggcccccca ccgaagttcc aggtaacact1080gaatttctgg gaagagagcc atggctccag ccatactcca cagaatctta tcacagtgaa1140gatggagcag gcctttgccc gatacttgct ggagcagact ccagagcagc aggcagccat1200tctgtccctg gtgtagagcc tgggggaccc atcttccacc tcacctcttt gttcttcctg1260tctcctttga agtagactca ttcttcacac gattgacctg tcctctttgt gataattctc1320agtagttgtc cgtgataatc gtgtcctgaa aatcctcgca cacactggct ggtggagaac1380tcaaggctaa ttttttatcc tttttttttt tttatttttg agatatacgc cctctttcat1440ctgtaaggga ctaggaaatt ccaaatggtg tgaacccagg gggcctttcc ctcttccctg1500acctcccaac tctaaagcca agcactttat atttttctct tagatattca ctaaggactt1560aaaataaaat ttttttgaaa gagg 1584
<210>8<211>483<212>DNA<213>人<220>
<221>丙型肝炎相關的微管聚集體<222>(1)..(483)<223>GenBank accession No.D28915<400>8cctctggttg cctttcctga gataatccac taagaatatt ttgtgtttct tttctcaggg 60aatctaaggg aggaaattat caactgtgca caaggaaaaa aatagatatg tgaaaggttc120acgtaaattt cctcacatca cagaagatta aaattcagaa aggagaaaac acagaccaaa180gagaagtatc taagaccaaa gggatgtgtt ttattaatgt ctaggatgaa gaaatgcata240gaacattgta gtacttgtaa ataactagaa ataacatgat ttagtcataa ttgtgaaaaa300taataataat ttttcttgga tttatgttct gtatctgtga aaaaataaat ttcttataaa360actcgggtct aacttgagag tgtgtgtgat tttggaaaaa ttatgatttg tcagcatctt420ctgatattca ctgctttcat cttaattttg ccttctgatt ttatttctaa agtatgtgat480ttt 483<210>9<211>1642<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導的56Kd蛋白質_(IFIT-1)<222>(1)..(1642)<223>GenBank accession No.M24594<400>9ccagatctca gaggagcctg gctaagcaaa accctgcaga acggctgcct aatttacagc 60aaccatgagt acaaatggtg atgatcatca ggtcaaggat agtctggagc aattgagatg120tcactttaca tgggagttat ccattgatga cgatgaaatg cctgatttag aaaacagagt180cttggatcag attgaattcc tagacaccaa atacagtgtg ggaatacaca acctactagc240ctatgtgaaa cacctgaaag gccagaatga ggaagccctg aagagcttaa aagaagctga300aaacttaatg caggaagaac atgacaacca agcaaatgtg aggagtctgg tgacctgggg360caactttgcc tggatgtatt accacatggg cagactggca gaagcccaga cttacctgga420caaggtggag aacatttgca agaagctttc aaatcccttc cgctatagaa tggagtgtcc480
agaaatagac tgtgaggaag gatgggcctt gctgaagtgt ggaggaaaga attatgaacg 540ggccaaggcc tgctttgaaa aggtgcttga agtggaccct gaaaaccctg aatccagcgc 600tgggtatgcg atctctgcct atcgcctgga tggctttaaa ttagccacaa aaaatcacaa 660gccattttct ttgcttcccc taaggcaggc tgtccgctta aatccagaca atggatatat 720taaggttctc cttgccctga agcttcagga tgaaggacag gaagctgaag gagaaaagta 780cattgaagaa gctctagcca acatgtcctc acagacctat gtctttcgat atgcagccaa 840gttttaccga agaaaaggct ctgtggataa agctcttgag ttattaaaaa aggccttgca 900ggaaacaccc acttctgtct tactgcatca ccagataggg ctttgctaca aggcacaaat 960gatccaaatc aaggaggcta caaaagggca gcctagaggg cagaacagag aaaagctaga1020caaaatgata agatcagcca tatttcattt tgaatctgca gtggaaaaaa agcccacatt1080tgaggtggct catctagacc tggcaagaat gtatatagaa gcaggcaatc acagaaaagc1140tgaagagaat tttcaaaaat tgttatgcat gaaaccagtg gtagaagaaa caatgcaaga1200catacatttc tactatggtc ggtttcagga atttcaaaag aaatctgacg tcaatgcaat1260tatccattat ttaaaagcta taaaaataga acaggcatca ttaacaaggg ataaaagtat1320caattctttg aagaaattgg ttttaaggaa acttcggaga aaggcattag atctggaaag1380cttgagcctc cttgggttcg tctataaatt ggaaggaaat atgaatgaag ccctggagta1440ctatgagcgg gccctgagac tggctgctga ctttgagaac tctgtgagac aaggtcctta1500ggcacccaga tatcagccac tttcacattt catttcattt tatgctaaca tttactaatc1560atcttttctg cttactgttt tcagaaacat tataattcac tgtaatgatg taattcttga1620ataataaatc tgacaaaata tt 1642<210>10<211>853<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導的蛋白質9-27<222>(1)..(853)<223>GenBank accession No.J04164<400>10ctagtcctga cttcacttct gatgaggaag cctctctcct tagccttcag cctttcctcc 60caccctgcca taagtaattt gatcctcaag aagttaaacc acacctcatt ggtccctggc120taattcacca atttacaaac agcaggaaat agaaacttaa gagaaataca cacttctgag180aaactgaaac gacaggggaa aggaggtctc actgagcacc gtcccagcat ccggacacca240
cagcggccct tcgctccacg cagaaaacca cacttctcaa accttcactc aacacttcct 300tccccaaagc cagaagatgc acaaggagga acatgaggtg gctgtgctgg gggcaccccc 360cagcaccatc cttccaaggt ccaccgtgat caacatccac agcgagacct ccgtgcccga 420ccatgtcgtc tggtccctgt tcaacaccct cttcttgaac tggtgctgtc tgggcttcat 480agcattcgcc tactccgtga agtctaggga caggaagatg gttggcgacg tgaccggggc 540ccaggcctat gcctccaccg ccaagtgcct gaacatctgg gccctgattc tgggcatcct 600catgaccatt ggattcatcc tgtcactggt attcggctct gtgacagtct accatattat 660gttacagata atacaggaaa aacggggtta ctagtagccg cccatagcct gcaacctttg 720cactccactg tgcaatgctg gccctgcacg ctggggctgt tgcccctgcc cccttggtcc 780tgcccctaga tacagcagtt tatacccaca cacctgtcta cagtgtcatt caataaagtg 840cacgtgcttg tga853<210>11<211>1377<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導的2-5A合成酶<222>(1)..(1377)<223>X04371<400>11aacgaaacca acagcagtcc aagctcagtc agcagaagag ataaaagcaa acaggtctgg 60gaggcagttc tgttgccact ctctctcctg tcaatgatgg atctcagaaa taccccagcc120aaatctctgg acaagttcat tgaagactat ctcttgccag acacgtgttt ccgcatgcaa180atcaaccatg ccattgacat catctgtggg ttcctgaagg aaaggtgctt ccgaggtagc240tcctaccctg tgtgtgtgtc caaggtggta aagggtggct cctcaggcaa gggcaccacc300ctcagaggcc gatctgacgc tgacctggtt gtcttcctca gtcctctcac cacttttcag360gatcagttaa atcgccgggg agagttcatc caggaaatta ggagacagct ggaagcctgt420caaagagaga gagcattttc cgtgaagttt gaggtccagg ctccacgctg gggcaacccc480cgtgcgctca gcttcgtact gagttcgctc cagctcgggg agggggtgga gttcgatgtg540ctgcctgcct ttgatgccct gggtcagttg actggcagct ataaacctaa cccccaaatc600tatgtcaagc tcatcgagga gtgcaccgac ctgcagaaag agggcgagtt ctccacctgc660ttcacagaac tacagagaga cttcctgaag cagcgcccca ccaagctcaa gagcctcatc720cgcctagtca agcactggta ccaaaattgt aagaagaagc ttgggaagct gccacctcag780
tatgccctgg agctcctgac ggtctatgct tgggagcgag ggagcatgaa aacacatttc 840aacacagccc agggatttcg gacggtcttg gaattagtca taaactacca gcaactctgc 900atctactgga caaagtatta tgactttaaa aaccccatta ttgaaaagta cctgagaagg 960cagctcacga aacccacgcc tgtgatcctg gacccggcgg accctacagg aaacttgggt1020ggtggagacc caaagcgttg gaggcagctg gcacaagagg ctgaggcctg gctgaattac1080ccatgcttta agaattggga tgggtcccca gtgagctcct ggattctgct ggtgagacct1140cctgcttcct ccctgccatt catccctgcc cctctccatg aagcttgaga catatagctg1200gagaccattc tttccaaaga acttacctct tgccaaaggc catttatatt catatagtga1260caggctgtgc tccatatttt acagtcattt tggtcacaat cgagggtttc tggaattttc1320acatcccttg tccagaattc attcccctaa gagtaataat aaataatctc taacacc 1377<210>12<211>5503<212>DNA<213>人<220>
<221>Wilms腫瘤基因<222>(1)..(5503)<223>GenBank accession No.X69950<220>
<221>misc_feature<222>(2041)..(2041)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2083)..(2083)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2186)..(2186)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2187)..(2187)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2488)..(2488)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3386)..(3386)
<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3718)..(3718)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3720)..(3720)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3938)..(3938)<223>不明確的核苷酸<400>12ggtgcgctca ggactggaag caactctcag ttcatcaatt tcatgggcct acgtatctgc 60tctggccacg gcctggcctc catccccact gtggcattaa tgcagaacaa attgagacat 120atcctctata taattagttc cagaatttaa aaagatttac ggtataataa tagaggcagt 180gccgcggaat cctttcactg aggactctcg gggagctcgg ggaccatctc gcggtggcat 240cagaacagac gagtaacccc agcggctcca ggcactgcga actgggggag agggggaaat 300tttgcaccgc attcggcagt acctaacggt tccgggctcc cagatagggt cagcgaggag 360agttaggaca gtaagtgggg actggttaaa aaaaatcgac ttaattttga aatgatcaga 420agaagctggg agtagttatc acaaagcccc tcccttgccc cccccttttt ttaattgaag 480gaatgacgtt gaaattttca ccgccagcgc ggggctggga accatcctaa acacttgccc 540tgcagccccg agtgggcaga ttccgaagag ttggagtcgg cggggagggg aggaacagct 600gttgggctgt cttgcgcgtg gggctcgggg cgcgggcccc ggggagaggc gctagtcgaa 660agcttgttcc tctcccgcga caggcagcag cgaggtcgag ccactcttta ttacggcctg 720cgggccccgc gcgcagtgtg gctgtccccg cccttgaccg accgcagcgc tttggggtgt 780ttattcagtt gtccgcggcc gctgggtgac tcccggaggc ggcccaggcg tgcgcactgg 840tccctggggt tgcggctgta gcagcccagc tccgcgctct gtcagatgca gtggacagcg 900ccggggtgaa agtaagggtt gagaaatcct cactgccctg ctcctaccca gcctcgattt 960tttcatattg caataattat gcaccttcga ggccgggatg cctgcgcttt gccagtgtat1020caacgccaca tggttttcca ggggctgtcc tcgcctctgc atcccattag ctctgaagag1080gtagaggggt ggtgggtaaa acctccaact ggacgttgag agacccgggt ttcagctcgg1140cgttgccact aacttgtttc ctgtccttaa acagtagtag taacaaaaac tgtaaagttg1200attgagtcaa aggcccacac tgctctccta tctaatcctc agaacaactc tatgaggtgg1260gcgctagtat cccattatcc cgtttgacca gtaaggaaac tgaggctcag agagactgcg1320
gaactcgtct agggtcacac agctgttggt tacctggcag agctgaggtt ccattctggg1380gccaccaacc ccttgctctt tacgtgcgct ccatagactg cctctccttc ggctgtctgg1440gcctcagttt ccttctctgt aaaacgagaa gtttaatctg cagctttctt tgccaatcgg1500tggttcagac caggaacctc tgctacagat ctcggcgctg acaggggtaa gaaggtgggt1560gaaagaaggg ggcgcccagt tttccacagc ctgcttttct ctgggacctc gcgaagggcg1620ggcctcgcga gctaaaggag gtacaggaga gcgcctatcg tccgcggcgg gtgaaggtgc1680tacctgcctt cgtgctaggc tgtgagtcct ggtgcttagc tcagggcgcc aaggccagtg1740tagctggcat gtcccccttg gaaaacctca ggtctcccgc agagaacgtt acccacaaca1800aagaagagga cagagaggca tggagcgccc tgcgactgca ggagtacgtc agttccccag1860cgctggctta gtgtcgcctg ggcttccggg catgtggatc cgttggggtc gtacggagac1920ttcctgtcgg gtccctgggg tcctccgact gcggctcctc agcttagcac tttcttcttg1980gccccgcagg ctgcagggaa ctcctcccac ctctttagtc ggagaagtcc aagtcgggcg2040agggggcacc ccggggttcg caccggtgct cttcccctcc ccncccccac aaggattctg2100agaaaataaa tggcagagga gagaggagtt ctacatttgc ttggctctcc tttcctccta2160tccaccccta catccctcac cccggnncaa aaacttattt ttgaaaaatg ttggcagaga2220tttacgtgtc tttgccttac ctgggtttca caaacacaac gactcacatt caagccagcc2280tcccttcaga taacctcctc tccccccgct aaaagtgcca aggatggtaa aagaagaaac2340aatctcaatc ttttcgtttg gaaatgaaag tccccggctt ttcataaagg gctcctcgcc2400cctcacagtt gagtcctagt taagaaaaac gacttccaag tagaaataat aggcggggag2460aaggaaggga gatacaggga tctggggngt tcttagggca actggcagtg aattttgtct2520cgagagtcct ttctccactc aaaaaaccaa acgcgcgagc cccgcgaaag gtttagggat2580agatcgtgtg ggagaggact gagcagagag cgtgggggca gtgtcttgta gaatctttct2640tttcttaata ataattttaa aagcttctga gtggagacga cgcaaagtca agcagcaaag2700gtggcctggg aggcaagcgg agggctcaag tgccgcatct ttaccctcag ggtctcctgc2760gcctacggga tgcgcattcc caagaagtgc gcccttcgag taagtcctgg gcccgcacac2820acttcgggtc cgcagccaga atttaatggc gacaacgttt atgcaatgca agctaaaaac2880caaagcgtaa aaaattacta tgtcatttat tgaaacgcca ttctttgtca aactgcaact2940actttgcttc acataagttt ggctggaaag cttgcagccc cagcccgggc cagccaggta3000caggaggccg gactgcaacc ggttgcttcc ctcccgtcgc gcctggccgt cccacgctgc3060gccgtcgctg ctgcctcctg gcgcccctgg gattttatac gcacctctga aacacgctcc3120gctccggccc ccggttcttc tccttgccta ggggttgttt cccaatagat actgactcct3180
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cggagccgca cgaggagcag tgcctgagcg ccttcactgt ccacttttcc ggccagttca5100ctggcacagc cggagcctgt cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc agccaggcgt5160catccggcca ggccaggatg tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctcgagagcc5220agcccgctat tcgcaatcag ggtaagtagg ccggggagcg ccccctacgc gcggggcagt5280ggcgccaggg actctccgct ctaggacacc cccctctcct accccttttg accgcagctc5340ttacccagct gcttcccaag ggccgtgagg atagcggaag cggcggctgg ggaggaggcc5400ggagagtggg agtgcacgca ggcactggcc cccgacatcc tccaaagcca ggcagagcta5460ggagcctgac tgttcgcaag agccgggagg gcgtctgggg ccc 5503<210>13<211>1816<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素調節因子7B_IRF-7<222>(1)..(1816)<223>GenBank accession No.U53831<400>13ggcacccagg gtccggcctg cgccttcccg ccaggcctgg acactggttc aacacctgtg 60acttcatgtg tgcgcgccgg ccacacctgc agtcacacct gtagccccct ctgccaagag120atccataccg aggcagcgtc ggtggctaca agccctcagt ccacacctgt ggacacctgt180gacacctggc cacacgacct gtggccgcgg cctggcgtct gctgcgacag gagcccttac240ctcccctgtt ataacacctg accgccacct aactgcccct gcagaaggag caatggcctt300ggctcctgag agggcagccc cacgcgtgct gttcggagag tggctccttg gagagatcag360cagcggctgc tatgaggggc tgcagtggct ggacgaggcc cgcacctgtt tccgcgtgcc420ctggaagcac ttcgcgcgca aggacctgag cgaggccgac gcgcgcatct tcaaggcctg480ggctgtggcc cgcggcaggt ggccgcctag cagcagggga ggtggcccgc cccccgaggc540tgagactgcg gagcgcgccg gctggaaaac caacttccgc tgcgcactgc gcagcacgcg600tcgcttcgtg atgctgcggg ataactcggg ggacccggcc gacccgcaca aggtgtacgc660gctcagccgg gagctgtgct ggcgagaagg cccaggcacg gaccagactg aggcagaggc720ccccgcagct gtcccaccac cacagggtgg gcccccaggg ccattcttgg cacacacaca780tgctggactc caagccccag gccccctccc tgccccagct ggtgacaagg gggacctcct840gctccaggca gtgcaacaga gctgcctggc agaccatctg ctgacagcgt catggggggc900agatccagtc ccaaccaagg ctcctggaga gggacaagaa gggcttcccc tgactggggc960
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<221>干擾素誘導的60kDa蛋白質(CIG49)<222>(1)..(2056)<223>GenBank accession No.AF026939<400>14gtggaaacct cttcagcatt tgcttggaat cagtaagcta aaaacaaaat caaccgggac 60cccagctttt cagaactgca gggaaacagc catcatgagt gaggtcacca agaattccct120ggagaaaatc ctcccacagc tgaaatgcca tttcacctgg aacttattca aggaagacag180tgtctcaagg gatctagaag atagagtgtg taaccagatt gaatttttaa acactgagtt240caaagctaca atgtacaact tgttggccta cataaaacac ctagatggta acaacgaggc300agccctggaa tgcttacggc aagctgaaga gttaatccag caagaacatg ctgaccaagc360agaaatcaga agtctagtca cttggggaaa ctacgcctgg gtctactatc acttgggcag420actctcagat gctcagattt atgtagataa ggtgaaacaa acctgcaaga aattttcaaa480tccatacagt attgagtatt ctgaacttga ctgtgaggaa gggtggacac aactgaagtg540
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<221>核自身抗原(SP-100)<222>(1)..(1879)<223>GenBank accession No.M60618<400>15ctgaggccca cgcagggcct agggtgggaa gatggcaggt gggggcggcg acctgagcac 60caggaggctg aatgaatgta tttcaccagt agcaaatgag atgaaccatc ttcctgcaca 120cagccacgat ttgcaaagga tgttcacgga agaccagggt gtagatgaca ggctgctcta 180tgacattgta ttcaagcact tcaaaagaaa taaggtggag atttcaaatg caataaaaaa 240gacatttcca ttcctcgagg gcctccgtga tcgtgatctc atcacaaata aaatgtttga 300agattctcaa gattcttgta gaaacctggt ccctgtacag agagtggtgt acaatgttct 360tagtgaactg gagaagacat ttaacctgcc agttctggaa gcactgttca gcgatgtcaa 420catgcaggaa taccccgatt taattcacat ttataaaggc tttgaaaatg taatccatga 480caaattgcct ctccaagaaa gtgaagaaga agagagggag gagaggtctg gcctccaact 540aagtcttgaa caaggaactg gtgaaaactc ttttcgaagc ctgacttggc caccttcggg 600ttccccatct catgctggta caaccccacc tgaaaatgga ctctcagagc acccctgtga 660aacagaacag ataaatgcaa agagaaaaga tacaaccagt gacaaagatg attcgctagg 720aagccaacaa acaaatgaac aatgtgctca aaaggctgag ccaacagagt cctgcgaaca 780aattgctgtc caagtgaata atggggatgc tggaagggag atgccctgcc cgttgccctg 840tgatgaagaa agcccagagg cagagctaca caaccatgga atccaaatta attcctgttc 900tgtgcgactg gtggatataa aaaaggaaaa gccattttct aattcaaaag ttgagtgcca 960agcccaagca agaactcatc ataaccaggc atctgacata atagtcatca gcagtgagga1020ctctgaagga tccactgacg ttgatgagcc cttagaagtc ttcatctcag caccgagaag1080tgagcctgtg atcaataatg acaacccttt agaatcaaat gatgaaaagg agggccaaga1140agccacttgc tcacgacccc agattgtacc agagcccatg gatttcagaa aattatctac1200attcagagaa agttttaaga aaagagtgat aggacaagac cacgactttt cagaatccag1260tgaggaggag gcgcccgcag aagcctcaag cggggcactg agaagcaagc atggtgagaa1320ggctcctatg acttctagaa gtacatctac ttggagaata cccagcagga agagacgttt1380cagcagtagt gacttttcag acctgagtaa tggagaagag cttcaggaaa cctgcagctc1440atccctaaga agagggtcag gtaaagaaga ttaggatgcc aagacttggc ctgcagaatg1500tcaggaatgt gaattaaaag ctgctgtttc cagacgcttt ttattctgag caccttcact1560accttgtatc cagttcatct gggaactcct ttttgcattt tagaaaatgg aaagaggcag1620gaaattatga taaactcatg tttaacagaa agagtttcac tgactaaatg tatgtaatta1680tattttgttg ttgtagaaga aataaatagc aaatttgtgg tattcttttt tttaaacctg1740
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<221>KIAA0793<222>(1)..(3997)<223>GenBank accession No.AB018336<400>16ggcgacgccg acgcgagtct ggcggctgct gcttgcgact gcggaggccg ggcgaggccg 60gtgaggacgc ggcgggcgag cgagaggccg aggtgttttc ttcactcatg gtgaagaatg 120ggggagatag aaggaacata cagagtcctg cagactgcag ggatgcgctt gggtgcccag 180acccctgtgg gagttagcac ccttgagcct gggcagactc tcttgcccag aatgcaagag 240aagcacctgc acctcagagt aaagctgctg gacaacacca tggaaatatt tgacattgag 300cctaaatgcg atggccaggt attactgaca caagtgtgga agcgtttaaa cctggtagaa 360tgtgactact tcgggatgga gtttcaaaat actcagtcct actggatttg gcttgaacct 420atgaaaccca tcattaggca aatacgaagg ccaaagaatg tggtgcttcg cctagctgta 480aaattttttc cacctgatcc tggtcagcta caagaagaat atacaagata cttgtttgcc 540ttgcaactta agagagacct gctggaagag cgtttgacct gtgctgacac cacagcggcc 600cttctcacgt cccatctcct gcagtcggaa ataggagatt acgatgaaac gctggaccga 660gagcacctca aagtgaacga gtatttgcct ggccagcagc actgccttga gaagatacta 720gaattccatc agaagcacgt gggccagaca cctgctgagt cggatttcca ggtgctcgaa 780attgctcgaa agttggaaat gtacggcatc agatttcaca tggcttctga cagggaagga 840accaagattc aactggcagt ttcccacatg ggtgtactcg tgttccaggg caccaccaaa 900atcaacactt tcaactggtc caaggtccgt aaactaagct tcaagaggaa aagatttctt 960atcaaacttc atccagaggt tcatggacct taccaggaca cattagaatt tttgttgggt1020agtagagatg aatgtaagaa cttctggaag atttgtgtgg agtatcacac cttttttaga1080cttttggacc aacctaagcc aaaagcaaaa gccgtcttct tcagccgggg ctcctccttc1140agatacagtg gaagaactca gaaacaacta gtagattatt tcaaagacag tggaatgaag1200agaattccat atgaaagaag gcacagcaag acccacacgt ccgttcgagc tctgactgca1260
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<221>2′5′寡腺苷酸合成酶(p69 2-5A合成酶)<222>(1)..(2905)<223>GenBank accession No.M87434<400>17cggcagccag ctgagagcaa tgggaaatgg ggagtcccag ctgtcctcgg tgcctgctca 60gaagctgggt tggtttatcc aggaatacct gaagccctac gaagaatgtc agacactgat120cgacgagatg gtgaacacca tctgtgacgt ctgcaggaac cccgaacagt tccccctggt180gcagggagtg gccataggtg gctcctatgg acggaaaaca gtcttaagag gcaactccga240tggtaccctt gtccttttct tcagtgactt aaaacaattc caggatcaga agagaagcca300acgtgacatc ctcgataaaa ctggggataa gctgaagttc tgtctgttca cgaagtggtt360gaaaaacaat ttcgagatcc agaagtccct tgatgggtcc accatccagg tgttcacaaa420aaatcagaga atctctttcg aggtgctggc cgccttcaac gctctgagct taaatgataa480tcccagcccc tggatctatc gagagctcaa aagatccttg gataagacaa atgccagtcc540
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<210>19<211>1230<212>DNA<213>人<220>
<221>GPR12 G蛋白偶聯受體<222>(1)..(1230)<223>GenBank accession No.U18548<400>19aagcttgtgg catttggtac tggtatctga gcaggggctg gctttctgtt tgtctgtgtg 60ttttttgcat gatcttggat tgtcaccctg ctgtatttaa acattaaaaa gcctgtcttt 120tcgttgaaga ggacaggggt taaaatgaat gaagacctga aggtcaattt aagcgggctg 180cctcgggatt atttagatgc cgctgctgcg gagaacatct cggctgctgt ctcctcccgg 240gttcctgccg tagagccaga gcctgagctc gtagtcaacc cctgggacat tgtcttgtgt 300acctcgggaa ccctcatctc ctgtgaaaat gccattgtgg tccttatcat cttccacaac 360cccagcctgc gagcacccat gttcctgcta ataggcagcc tggctcttgc agacctgctg 420gccggcattg gactcatcac caattttgtt tttgcctacc tgcttcagtc agaagccacc 480aagctggtca cgatcggcct cattgtcgcc tctttctctg cctctgtctg cagcttgctg 540gctatcactg ttgaccgcta cctctcactg tactacgctc tgacgtacca ttcggagagg 600acggtcacgt ttacctatgt catgctcgtc atgctctggg ggacctccat ctgcctgggg 660ctgctgcccg tcatgggctg gaactgcctc cgagacgagt ccacctgcag cgtggtcaga 720ccgctcacca agaacaacgc ggccatcctc tcggtgtcct tcctcttcat gtttgcgctc 780atgcttcagc tctacatcca gatctgtaag attgtgatga ggcacgccca tcagatagcc 840ctgcagcacc acttcctggc cacgtcgcac tatgtgacca cccggaaagg ggtctccacc 900ctggctatca tcctggggac gtttgctgct tgctggatgc ctttcaccct ctattccttg 960atagcggatt acacctaccc ctccatctat acctacgcca ccctcctgcc cgccacctac1020aattccatca tcaaccctgt catatatgct ttcagaaacc aagagatcca gaaagcgctc1080tgtctcattt gctgcggctg catcccgtcc agtctcgccc agagagcgcg ctcgcccagt1140gatgtgtagc acccttgcac ccaggaggac tctgcattta ccaagcactt ccactgcctg1200gccaaggttt gagatgcttc ccttgaattc 1230<210>20<211>5141<212>DNA<213>人<220>
<221>類固醇21-羥化酶(CYP21)<222>(1)..(5141)<223>GenBank accession No.M12792<400>20agatctttct cccagtagct gctcagcatg gtggtggcat aagcccattt tccggagcca 60gggattcagt tgcagcaaga catggcccgg tctgggaggt caaccatgaa gaaggcagta 120gctgtcattg cccaacccca gaaatcccaa tcctgttttc tccctctcag tcctgatcat 180ggattcagca gcagcgaact cgccaatgta gtgggtggca cagccagggt cttgactctg 240gctctgcagt agcacagtct ggaaaagctc tgaggggaga gagaccccca ctggtccgag 300ggtctggcac agagccagaa atggggggga aggtatgagg ctgggtcgcc tctgacctct 360caggtaccat ccaggaggcc ctggcctctc actgaacccg gccactcctc tttggcatgg 420cctcttccca aatccccaaa ctgcctcctt acccacaaaa gtggtctctg agtgtcagtc 480cagtgggacc cccacccctt atggcttcag ttccccaaat agggctggac ccttgatcct 540gatccagctg tggctatcca gccccttcct ggggactttg gactttgagg ggggcatgcc 600acttgtgctg ggaatccata ctttccctgg ctggagtaga acctgtggac tgtagtcctg 660agggcagtca tgttctgcct gtgcctggaa agacaagaaa cttgactgca gagagaagaa 720agaggagaga ggaacagagc gaggaaaccg cccgtctccg gggctttttc tgttccctat 780ccttgacttt ctaagaccag tggggtcccc tcctctgctt ctttttcctg agttctgtga 840aattccccaa ttcttatttt ttatctcaaa ccagctcaag gtgggctgtt ttcctttcaa 900ccaaagaaag gtgctcctgg tggctaaagg tacatattcg acagctagat ttccaggctg 960gaatcctgcc ctccacaaca tgcgaacaat acccgtgttg catatagagc atggctgtga1020agagttgagt gagtgcccac aaagcactta gagcagtgtc tggtacatgc tattactccg1080cagcgggaaa ccacttcctc ctttgtcttc tgggcacttt tgtgagtgaa aggaggcact1140aataacaatc acactgggat acctgtatat actggaatgc cccaggcaaa ccaggcttaa1200actgtattac tctatctgta gcttaaacta acaaacaacc cacacaaatc acattttgtt1260cttcaggcga ttcaggaagg cctattaggc agggactgcc attttctctc tgagacaaac1320atcattccat aaactggccc acggtgggtg gcagagggag agggcccagg tgggggcgga1380cactattgcc tgcacagtga tgtggaacca gaaagctgac tctggatgca ggaaaaaggt1440cagggttgca tttcccttcc ttgcttcttg atgggtgatc aatttttttg aaatacggac1500gtcccaaggc caatgagact ggtgtcattc cagaaaaggg ccactctgtg ggcgggtcgg1560tgggagggta cctgaaggtg gggtcaaggg aggccccaaa acagtctaca cagcaggagg1620gatggctggg gctcttgagc tataagtggc acctcagggc cctgacgggc gtctcgccat1680gctgctcctg ggcctgctgc tgctgcccct gctggctggc gcccgcctgc tgtggaactg1740
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<221>推測的腫瘤抑制蛋白(101F6)<222>(1)..(1117)<223>GenBank accession No.AF040704<400>21tccggaagta aagcggctcc gtgacggagc ggcggtgcgc gcggcagggc ccggagtatc 60ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg caggctacaa 120ccactagcac ggctgacgat ggccctttct gcggagaccg agtcacacat ctaccgagct 180ctgcgtactg cttctggcgc tgccgcccac cttgtggccc tgggctttac catctttgtg 240gctgtgcttg ccaggcctgg ctccagcctg ttctcctggc acccggtgct tatgtctttg 300gctttctcct tcctgatgac cgaggcacta ctggtgtttt ctcctgagag ttcgctgctg 360cactccctct cacggaaagg ccgagcacgc tgccactggg tgctgcagct gctggccctg 420ctgtgtgcac tgctgggcct cggccttgtc atcctccaca aagagcagct tggcaaagcc 480cacctggtta cgcggcatgg gcaggcaggg ctgctggctg tgctgtgggc agggctgcag 540tgctcaggtg gggtggggct gctctacccc aagctgctgc cccgatggcc cctggcgaag 600ctcaagctat accatgctac ttctgggctg gtgggctacc tgctgggtag tgccagcctc 660ttgctgggca tgtgctcact ctggttcact gcctctgtca ctggtgcagc ctggtacctg 720gctgtattat gccctgtcct caccagcttg gtcattatga accaggtgag caatgcctac 780ctataccgca agaggatcca accatgagct cttcccagcc taggggaagc ctggatttgc 840ccctccatgt aggagctggg cctagggacc tgttgaactc tctcagctga gtcaggggac 900acctcaggca ctgggacagt tgggcatttg gaggcccgtg tgtgaattcc tgctcctcat 960gctggagtgc ctcccatttc cttccccttt ctctgtcatc ccagaggaac ataggcatca1020tgtgtctgga tgaagctggg gctgcaagac tgcctctcct gcaaggcagc tcatacttgt1080actgtatgtt cagaaatttt aggagagaaa aaagtaa 1117<210>22<211>4396<212>DNA<213>人<220>
<221>轉錄因子E2A<222>(1)..(4396)<223>GenBank accession No.M31523<400>22gcctgaggtg cccgccctgg ccccaggaga atgaaccagc cgcagaggat ggcgcctgtg 60ggcacagaca aggagctcag tgacctcctg gacttcagca tgatgttccc gctgcctgtc120accaacggga agggccggcc cgcctccctg gccggggcgc agttcggagg ttcaggtctt180
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<221>KIAA0691<222>(1)..(4133)<223>GenBank accession No.AB014591<400>23aaattctccc tgggggtaag gtaccagccc tgtcctttat gggcttcttg ttctaaagca 60tatccgtccc atatggttgc tgctagtcac atgtggtgat tagtaactag ttaaaaatga120aaaattcagt tcctccatta cacttgccac atttcagatg ttcagtggcc aacagatatg180cgcaaataga gtgtttccag cattgcaaag ttctgttgga tagcactgtt tgccagatgt240tcccttcttt gtgggtgagg actcttttgg tgtgacttcc ctctgtattg aggctcttgt300tcctcagtat ggggctgttt ctgtctttac agtaagtgac tactccaggg ttccctgccc360tgcacacgta gagtgggagc ggcccgtgga tcccagggaa ctgtgctttt cattgtaggc420cccctccctg gaggggaaga gggcaatctc cgctggtatc tcagaagtct tcttctgagg480cataagcctc tcttcccagg gctcccctgg tctcgctgtc aggccctaag gtatgtcttc540ccttggacta aagctccttg gaactccctt ttgacctcag tcttctctgg gttccaggta600acttccttta aaataaagac gctcctctct tgaagttttg ggttcctgcc ctgatggtct660atgtctccct gactctaaat taccaatcca cttgctatgg gattcctcca tgagtgcaga720ttggctccct cacagctgcg gtacctttgc accctcttat cttagtaaga tttctgtctt780ctcccaggtc tctcttgggt actgccttct gcccccaaat ctctaagcct tcttggtatt840agcttctttg ggttaggagt gttatttcct tttggtttaa ggatcctgct ctggaataaa900
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cccggccccc cagcgtccag cctagcggag gcggaggcgg cggcagcgga ggcggaggga2820gcagcagcag tagtaacagc agtgccggtg gaggggctgg caagcagaat ggcgccacca2880gttacagctc agttgtggca gacagcccgg cagaggtggc tttgagcagc agtgggggca2940acaatgccag cagccaggcc ttgggccccc cttccggccc ccacaaccca cctcccagca3000cctcgaagga acccagtgcg gcagccccaa cgggggctgg gggcgtggcc ccaggctcag3060ggaacaactc agggggaccc agcctcctgg tgccactgcc tgtgaatcct cccagctccc3120caacgcccag cttcagtgat gccaaggcag ccggtgccct gctcaatggg cctccacagt3180tcagcaccgc cccagaaatc aaggcccctg agcctctgag ctccttgaag tccatggcgg3240aacgggcagc catcagctct ggcattgagg accctgtgcc aacgctgcac ctgaccgagc3300gagacatcat cctgagcagt acatcagcac ctccggcctc agcccagccg cccctgcagc3360tgtcagaggt gaacataccg ctgtcgctgg gtgtctgtcc actgggccct gtgcccctca3420ccaaggagca gctctatcag caggccatgg aagaggccgc ctggcaccac atgcctcacc3480cctctgactc tgagcgtatt cggcagtacc tcccccggaa cccctgtccg acgcccccct3540accaccacca gatgccaccc ccacactcgg acactgtgga attctaccag cgcctgtcga3600ccgagacact cttcttcatc ttctactatc tggagggcac taaggcacag tatctggcag3660ccaaggccct aaagaagcag tcatggcgat tccacaccaa gtacatgatg tggttccaga3720ggcacgagga gcccaagacc atcactgacg agtttgagca gggcacctac atctactttg3780actacgagaa gtggggccag cggaagaagg aaggcttcac ctttgagtac cgctacctgg3840aggaccggga cctccagtga caccggcccc tccctctacc cacccccttc ccccgcatgc3900tgatccccct gcccaggtga gggccctgcc ctggaagact ggagggaggc cccaagccac3960ggggcatccc cctctcccag gaagcaggga gggggccggg aggttttcct ctcagcccca4020ccctgggggc ccgggggcga gggctgcccc ctcctcccct ccccagtgag ggacattttt4080tggtaaacct attttcattt tggaaaatat ttatgaataa atagttttat atg 4133<210>24<211>1260<212>DNA<213>人<220>
<221>5-羥色胺1D受體5-HT1D<222>(1)..(1260)<223>Genank accession No.M81590<400>24ccctctcctt cgtccgctcc atgcccaaga gctgcgctcc ggagctgggg cgaggagagc 60
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<221>凝血因子XII(Hageman因子)<222>(1)..(1990)<223>GenBank accession No.M31315<400>25ctgctgctcc tggggttcct gctggtgagc ttggagtcaa cactttcgat tccaccttgg 60gaagccccca aggagcataa gtacaaagct gaagagcaca cagtcgttct cactgtcacc120ggggagccct gccacttccc cttccagtac caccggcagc tgtaccacaa atgtacccac180aagggccggc caggccctca gccctggtgt gctaccaccc ccaactttga tcaggaccag240
cgatggggat actgtttgga gcccaagaaa gtgaaagacc actgcagcaa acacagcccc 300tgccagaaag gagggacctg tgtgaacatg ccaagcggcc cccactgtct ctgtccacaa 360cacctcactg gaaaccactg ccagaaagag aagtgctttg agcctcagct tctccggttt 420ttccacaaga atgagatatg gtatagaact gagcaagcag ctgtggccag atgccagtgc 480aagggtcctg atgcccactg ccagcggctg gccagccagg cctgccgcac caacccgtgc 540ctccatgggg gtcgctgcct agaggtggag ggccaccgcc tgtgccactg cccggtgggc 600tacaccggac ccttctgcga cgtggacacc aaggcaagct gctatgatgg ccgcgggctc 660agctaccgcg gcctggccag gaccacgctc tcgggtgcgc cctgtcagcc gtgggcctcg 720gaggccacct accggaacgt gactgccgag caagcgcgga actggggact gggcggccac 780gccttctgcc ggaacccgga caacgacatc cgcccgtggt gcttcgtgct gaaccgcgac 840cggctgagct gggagtactg cgacctggca cagtgccaga ccccaaccca ggcggcgcct 900ccgaccccgg tgtcccctag gcttcatgtc ccactcatgc ccgcgcagcc ggcaccgccg 960aagcctcagc ccacgacccg gaccccgcct cagtcccaga ccccgggagc cttgccggcg1020aagcgggagc agccgccttc cctgaccagg aacggcccac tgagctgcgg gcagcggctc1080cgcaagagtc tgtcttcgat gacccgcgtc gttggcgggc tggtggcgct acgcggggcg1140cacccctaca tcgccgcgct gtactggggc cacagtttct gcgccggcag cctcatcgcc1200ccctgctggg tgctgacggc cgctcactgc ctgcaggacc ggcccgcacc cgaggatctg1260acggtggtgc tcggccagga acgccgtaac cacagctgtg agccgtgcca gacgttggcc1320gtgcgctcct accgcttgca cgaggccttc tcgcccgtca gctaccagca cgacctggct1380ctgttgcgcc ttcaggagga tgcggacggc agctgcgcgc tcctgtcgcc ttacgttcag1440ccggtgtgcc tgccaagcgg cgccgcgcga ccctccgaga ccacgctctg ccaggtggcc1500ggctggggcc accagttcga gggggcggag gaatatgcca gcttcctgca ggaggcgcag1560gtaccgttcc tctccctgga gcgctgctca gccccggacg tgcacggatc ctccatcctc1620cccggcatgc tctgcgcagg gttcctcgag ggcggcaccg atgcgtgcca gggtgattcc1680ggaggcccgc tggtgtgtga ggaccaagct gcagagcgcc ggctcaccct gcaaggcatc1740atcagctggg gatcgggctg tggtgaccgc aacaagccag gcgtctacac cgatgtggcc1800tactacctgg cctggatccg ggagcacacc gtttcctgat tgctcaggga ctcatctttc1860cctccttggt gattccgcag tgagagagtg gctggggcat ggaaggcaag attgtgtccc1920attcccccag tgcggccagc tccgcgccag gatggcgagg aactcaataa agtgctttga1980aaatgctgag 1990
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<221>原癌基因酪氨酸蛋白激酶c-abl<222>(1)..(3840)<223>GenBank accession No.M14752<400>26ggccttcccc ctgcgaggat cgccgttggc ccgggttggc tttggaaagc ggcggtggct 60ttgggccggg ctcggcctcg ggaacgccag gggcccctgg gtgcggacgg gcgcggccag 120gagggggtta aggcgcaggc ggcggcgggg cgggggcggg cctggcgggc gccctctccg 180ggccctttgt taacaggcgc gtcccggcca gcggagacgc ggccgccctg ggcgggcgcg 240ggcggcgggc ggcggtgagg gcggcctgcg gggcggcgcc cgggggccgg gccgagccgg 300gcctgagccg ggcccggacc gagctgggag aggggctccg gcccgatcgt tcgcttggcg 360caaaatgttg gagatctgcc tgaagctggt gggctgcaaa tccaagaagg ggctgtcctc 420gtcctccagc tgttatctgg aagaagccct tcagcggcca gtagcatctg actttgagcc 480tcagggtctg agtgaagccg ctcgttggaa ctccaaggaa aaccttctcg ctggacccag 540tgaaaatgac cccaaccttt tcgttgcact gtatgatttt gtggccagtg gagataacac 600tctaagcata actaaaggtg aaaagctccg ggtcttaggc tataatcaca atggggaatg 660gtgtgaagcc caaaccaaaa atggccaagg ctgggtccca agcaactaca tcacgccagt 720caacagtctg gagaaacact cctggtacca tgggcctgtg tcccgcaatg ccgctgagta 780tccgctgagc agcgggatca atggcagctt cttggtgcgt gagagtgaga gcagtcctag 840ccagaggtcc atctcgctga gatacgaagg gagggtgtac cattacagga tcaacactgc 900ttctgatggc aagctctacg tctcctccga gagccgcttc aacaccctgg ccgagttggt 960tcatcatcat tcaacggtgg ccgacgggct catcaccacg ctccattatc cagccccaaa1020gcgcaacaag cccactgtct atggtgtgtc ccccaactac gacaagtggg agatggaacg1080cacggacatc accatgaagc acaagctggg cgggggccag tacggggagg tgtacgaggg1140cgtgtggaag aaatacagcc tgacggtggc cgtgaagacc ttgaaggagg acaccatgga1200ggtggaagag ttcttgaaag aagctgcagt catgaaagag atcaaacacc ctaacctagt1260gcagctcctt ggggtctgca cccgggagcc cccgttctat atcatcactg agttcatgac1320ctacgggaac ctcctggact acctgaggga gtgcaaccgg caggaggtga acgccgtggt1380gctgctgtac atggccactc agatctcgtc agccatggag tacctagaga agaaaaactt1440catccacaga gatcttgctg cccgaaactg cctggtaggg gagaaccact tggtgaaggt1500
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ttccactgcc ttcatccctc tcatatcaac ccgagtgtct cttcggaaaa cccgccagcc3420tccagagcgg gccagcggcg ccatcaccaa gggcgtggtc ttggacagca ccgaggcgct3480gtgcctcgcc atctctggga actccgagca gatggccagc cacagcgcag tgctggaggc3540cggcaaaaac ctctacacgt tctgcgtgag ctatgtggat tccatccagc aaatgaggaa3600caagtttgcc ttccgagagg ccatcaacaa actggagaat aatctccggg agcttcagat3660ctgcccggcg tcagcaggca gtggtccggc ggccactcag gacttcagca agctcctcag3720ttcggtgaag gaaatcagtg acatagtgca gaggtagcag cagtcagggg tcaggtgtca3780ggcccgtcgg agctgcctgc agcacatgcg ggctcgccca tacccatgac agtggctgag3840<210>27<211>1628<212>DNA<213>人<220>
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<221>misc_feature<222>(114)..(114)<223>不明確的核苷酸<400>27agtcagcacg ggggtgctgg aagagatcgg gaataatagc gcagaccaat gagcctaggg 60agatgctttc atcgtctctc cttccctcaa gtgttctgga acctatcatt tganttagcc120gagtcaggca ggagggggcg gggaatcctt ccgcccttct taggaggggc tgcattgcag180ggggagagtg aactgacaga ctcagtcact gaagagggaa aaggagtgag aagacaaagc240cgtcaaagcc ccaacagctt tgtatttctc cagcccggcc ggcagacccc ggagctcccg300aggcactccc tccatctttg gaacgcgcca gtaattgaat tgataacagg aagctatgag360ggaccctgtg agtagccagt acagttcctt tcttttctgg aggatgccca tcccagaact420ggatctgtcg gagctggaag gcctgggtct gtcagataca gccacctaca aggtcaaaga480cagcagcgtt ggcaaaatga tcgggcaagc aactgcagca gaccaggaga aaaaccctga540aggtgatggc ctccttgagt acagcacctt caacttctgg agagctccca ttgccagcat600ccactccttc gaactggact tgctctaagg ccaagacttc tctctcccat caccttgccc660tcattgtctt ccctctcaag ccccttcctt tccactcctt tcccatttta atcttgttct720ctccctactg tgttggtggt gctgatgaat ctgccagagt tgagttctat gtatttattt780atctatctgt ctactccatt tctctcaaaa gccctcaagt cacaaagtaa atggttcaag840
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<221>胍乙酸N-甲基轉移酶<222>(1)..(993)<223>GenBank accession No.Z49878<400>28cggcggcgcg cgatcgaggt cgggtcgccg tccagcctgc agcatgagcg cccccagcgc 60gacccccatc ttcgcgcccg gcgagaactg cagccccgcg tggggggcgg cgcccgcggc120ctacgacgca gcggacacgc acctgcgcat cctgggcaag ccggtgatgg agcgctggga180gaccccctat atgcacgcgc tggccgccgc cgcctcctcc aaagggggcc gggtcctgga240ggtgggcttt ggcatggcca tcgcagcgtc aaaggtgcag gaggcgccca ttgatgagca300ttggatcatc gagtgcaatg acggcgtctt ccagcggctc cgggactggg ccccacggca360gacacacaag gtcatcccct tgaaaggcct gtgggaggat gtggcaccca ccctgcctga420cggtcacttt gatgggatcc tgtacgacac gtacccactc tcggaggaga cctggcacac480acaccagttc aacttcatca agaaccacgc ctttcgcctg ctgaagccgg ggggcgtcct540cacctactgc aacctcacct cctgggggga gctgatgaag tccaagtact cagacatcac600
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<221>干擾素誘導的核磷蛋白<222>(1)..(835)<223>Genbank accession No.as of 09 Dec 2002L22342<400>29atggcgagca gcggagtcaa gaacacacca cgatggcgga gaaaagcccc tcatgggagg 60gaaaggaaag agaaaggaaa gaaaagaaaa agatgtatct ggtcaactcc aaaaaggaga 120cataagaaaa aaagcctccc aagagagatc attgatggca cttcagaaat gaatgaagga 180aagaggtccc agaagatgcc tagtacacca cgaagggtca cacaaggggc agcctcacct 240gggcatggca tccaagagaa gctccaagtg gtggataagg tgactcaaag gaaagacgac 300tcaacctgga actcagaggt catgatgagg gtccaaaagg caagaactaa atgtgcccga 360aagtccagat cgaaagaaaa gaaaaaggag aaagatatct gttcaagctc aaaaaggaga 420tttcagaaaa atattcaccg aagaggaaaa cccaaaagtg acactgtgga ttttcactgt 480tctaagtccc ccgtgacctg tggtgaggcg aaagggattt tatataagaa gaaaatgaaa 540cacggatcct cagtgaagtg cattcggaat gaggatggaa cttggttaac accaaatgaa 600tttgaagtcg aaggaaaagg aaggaacgca aagaactgga aacggaatat acgttgtgaa 660ggaatgaccc taggagagct gctgaagagt ggacttttgc tctgtcctcc aagaataaat 720ctcaagagag agttaaatag caagtgaatt tctactaccc tctcagtcac catgttgcag 780actttccctg tctggaggct caccttagag cttctgagtt tccaagcccg gaatt 83權利要求
1.一種測定能夠調節基因轉錄的化合物的生物活性的方法，包括以下步驟a)使宿主和化合物接觸；b)測定宿主的總體轉錄基因應答；并且c)對所述化合物誘導的總體轉錄基因應答進行定量。
2.權利要求1的方法，其中總體轉錄基因應答通過DNA陣列技術來測定。
3.權利要求2的方法，其中DNA陣列技術為寡核苷酸陣列技術。
4.權利要求1-3的任意一項的方法，其中化合物為修飾的化合物。
5.權利要求4的方法，其中修飾的化合物是修飾的蛋白質。
6.權利要求5的方法，其中修飾的蛋白質是聚乙二醇化蛋白質。
7.權利要求6的方法，其中聚乙二醇化蛋白質是聚乙二醇化蛋白質的特定的分離的同種型。
8.權利要求6或7的方法，其中聚乙二醇化蛋白質是Epo或IFN。
9.權利要求1-8的任意一項的方法，其中被轉錄調節的基因是選自SEQ ID No.1到29的一個或多個基因。
10.一種測定修飾的化合物的相對生物活性的方法，包括用權利要求1-7的任一項的方法測量修飾的化合物和相應的未修飾化合物的生物活性，其中修飾蛋白的相對轉錄活性由計算出的修飾化合物與未修飾化合物的生物活性之比確定。
11.權利要求8的方法，其中修飾化合物是化學或酶學方法修飾的化合物。
12.權利要求9的方法，其中修飾化合物是聚乙二醇化蛋白質。
13.一種鑒定能間接調節基因轉錄的化合物的方法，其包括用權利要求1-9的任一項的方法測定已知為基因轉錄調節劑的第一化合物在有或沒有第二化合物存在的條件下的生物活性，若第一化合物在有所述第二化合物存在時測定到的生物活性顯著不同于第一化合物在沒有所述第二化合物存在時測定到的生物活性，則鑒定到能夠間接調節基因轉錄的化合物。
14.權利要求13的方法，其中已知的基因轉錄調節劑是Epo或IFN。
15.通過權利要求1-14的方法所鑒定到的能夠調節基因轉錄的化合物。
16.權利要求1-14的方法在鑒定能夠調節基因轉錄的化合物中的用途。
17.包含用于實施權利要求1-14的方法的成分的試劑盒。
18.權利要求17的試劑盒，其中所述的成分包含DNA陣列。
19.藥物組合物，其包含權利要求15的化合物以及可藥用載體。
20.權利要求15的化合物或其可藥用鹽在制備用于治療疾病，優選病毒性疾病或癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發明提供了一種用于測定化合物的生物活性的新方法，包括步驟a)使宿主和化合物接觸；b)測定宿主的總體轉錄基因應答；c)對所述化合物誘導的總體轉錄基因應答進行定量。
文檔編號A61P35/00GK1532292SQ200410029500
公開日2004年9月29日 申請日期2004年3月19日 優先權日2003年3月21日
發明者U·塞爾塔, S·福瑟爾, K·韋耶, , U 塞爾塔 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 弗 哈夫曼-拉羅切有限公司