黃精凝集素Ⅱ蛋白及其應用的制作方法

專利名稱：黃精凝集素Ⅱ蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物凝集素及其應用，特別涉及一種以百合科植物囊絲黃精(Polygonatumcyrtonema Hua.)這種中草藥為原料制備的黃精凝集素II蛋白及其應用。
背景技術：
凝集素(Lectin)是自然界中廣泛存在的一類非酶、非免疫來源的、具有糖結合專一性并能使糖復合物沉淀的蛋白或糖蛋白。從第一個植物凝集素在蓖麻籽中發現到目前為止，人們已發現并分離了幾百種凝集素。
百合科植物囊絲黃精(Polygonatum cyrtonema Hua.)是我國傳統中草藥，鮑錦庫等在《生物化學雜志》(第12卷第2期，1996年4月)上發表的論文“黃精凝集素II的純化及部分性質研究”介紹了一種黃精凝集素II，此種黃精凝集素II是一種酸性糖蛋白，以植物黃精塊莖為原料，制備方法是對黃精塊莖用生理鹽水溶液浸取、硫酸銨沉淀后，將沉淀溶于蒸餾水，透析除鹽，冷凍干燥獲得黃精凝集素粗品，然后用豬甲狀腺球蛋白-Sepharose 4B親和柱分離純化、用CM-Sepharose離子交換快速柱純化、以CM柱的d峰進行SephadexG-100分子篩層析，獲得四個蛋白峰，后三峰均有強凝集活性，分別命名為黃精凝集素I(PCLI)、黃精凝集素II(PCLII)、黃精凝集素III(PCLIII)，其中黃精凝集素II含量較多，經紫外和凝血活性檢測，收集第II活性峰，透析除鹽，冷凍干燥得黃精凝集素II蛋白。
鮑錦庫等在《生物化學雜志》(第12卷第6期，1996年12月)上發表的論文“黃精凝集素II分子的穩定性與生物學活性研究”公開了黃精凝集素II對淋巴細胞的促有絲分裂活性，以廣州產PHA為對照，黃精凝集素II對人外周淋巴細胞的轉化率高達97.6％，細胞分裂比達18.3％，是一種極強的促有絲分裂源。
單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是引起人類病毒性疾病中最常見的病毒，大多數人長期攜帶此病毒，以潛伏期感染的形式局限在某些感覺神經節內，受自身或環境因素誘發激活病毒，引起皮膚皰疹性損害。因此，抗HSV研究成為抗病毒研究的主要內容之一。目前國內外研究的抗HSV藥物已有幾十種，但是過渡到臨床治療HSV感染的藥物僅無環鳥苷(ACV)較為有效，而且已經發現有不少耐藥株發生，因此尋找新的抗HSV藥物勢在必行。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新的方法制備黃精凝集素II蛋白，并證明黃精凝集素II蛋白對人類單純皰疹病毒具有抑制作用，以便開發出一類新的藥品。
本發明的技術方案采用細胞病變抑制法(CPE法，見Cotarelo M，CatalanP，Sanchez-Carrillo C，Menasalvas A，Cercenado E，Tenoriao A，Bouza E.Cytopathiceffect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpessimplex virus to antiviral agents.J Antimicrob Chemother，1999，44705~708.)和MTT法(見Campling BG，Pym J，Baker HM，Cole SP，Lam YM.Chemosensitivity testingof small cell lung cancer using the MTT assay.Br J Cancer，1991，63(1)75-83.)，以無環鳥苷注射劑(ACV)為陽性對照藥物，研究黃精凝集素II蛋白抗單純皰疹病毒(HSV)活性，證明了黃精凝集素II蛋白對人類單純皰疹病毒具有很強的抑制作用。因此，可將黃精凝集素II蛋白制備成治療或預防單純皰疹病毒所致疾病的藥品，用藥方法可以通過口服、靜脈內的注射等。
所述黃精凝集素II蛋白以植物黃精塊莖為原料，采用工藝步驟依次為“粗品制備、親和柱分離純化、分子篩純化”的方法獲得。粗品制備是將黃精塊莖切成片狀以生理鹽水溶液浸取，再經高速組織搗碎機搗成糊狀以生理鹽水溶液浸取，所得上清加入硫酸銨沉淀，將沉淀溶于蒸餾水，透析除鹽，冷凍干燥即得黃精凝集素粗品；親和柱分離純化是將粗品溶于生理鹽水溶液，透析平衡，離心除去不溶物，取上清液進行親和層析，以甘露糖-Sepharose 4B為親和吸附劑，以0.1～0.3mol/L甘露糖溶液解吸附，洗脫及解吸附過程中皆分部收集，收集管經280nm處測定紫外吸收后，將樣品用生理鹽水透析，以兔紅細胞檢查樣品的凝集活性，合并活性部分并透析去鹽，冷凍干燥得親和層析樣品；分子篩純化以Sephacryl S-100柱為交換柱，將上述親和層析樣品用生理鹽溶液溶解并透析平衡后上柱，用生理鹽溶液洗脫，分部收集，經280nm處測定紫外吸收和檢測活性后，收集活性部分，透析除鹽，冷凍干燥即得到純化的黃精凝集素II蛋白。
本發明的有益效果1、擴大了黃精凝集素II蛋白的應用范圍，為治療單純皰疹病毒引起的病毒性疾病提供了一類新藥。
2、相對于現有黃精凝集素II的裝備方法，簡化了工藝流程，縮短了制備時間，因而可降低制備成本。
3、親和柱分離純化時，甘露糖比現有技術中的甲狀腺球蛋白特異性更高，分離效果更好，分子篩純化時，分子篩S-100比現有技術中的G-100更快速，適于大規模、快速純化。


圖1是本發明所述黃精凝集素II蛋白的SDS-PAGE電泳圖；圖2是本發明所述黃精凝集素II蛋白抗單純皰疹病毒II型(HSV-II)的活性結果圖，圖中，a正常細胞、bHSV-II引起的細胞病變、cde10，2.5，5μg/ml黃精凝集素II(PCLII)對細胞病變的抑制作用。
具體實施例方式
實施例1黃精凝集素II蛋白的制備本實施例中，黃精凝集素II蛋白的制備方法如下1 粗品制備將切成片狀的黃精塊莖以生理鹽水溶液浸取(G/V＝1∶5)過夜，經高速組織搗碎機搗成糊狀，生理鹽水溶液浸取過夜，紗布過濾，離心(4℃，4500r/min，30min)，向上清中加入固體硫酸銨達30％飽和度，置4℃過夜，離心(4℃，4500r/min，30min)去沉淀，上清繼續加硫酸銨至90％，離心收集沉淀，并將沉淀溶于蒸餾水，透析除鹽，冷凍干燥得黃精凝集素粗品。
2 親和柱分離純化取粗品200mg溶于20ml生理鹽水溶液，透析平衡，離心除去不溶物，取上清液進行親和層析(柱2.6×40cm)。以甘露糖-Sepharose 4B為親和吸附劑，用生理鹽溶液平衡層析柱后，將上述凝集素粗品上柱，相同的生理鹽溶液洗脫至流出液在280nm處吸收值小于0.02，換用0.2mol/L甘露糖溶液解吸附，洗脫及解吸附過程中皆分部收集，流速18ml/hr，3-4ml/管，收集管經280nm處測定紫外吸收后，將樣品用生理鹽水透析，以兔紅細胞檢查樣品的凝集活性，合并活性部分并透析去鹽，冷凍干燥得親和層析樣品。
3 分子篩純化取經處理的Sephacryl S-100裝柱(1.6×100cm)，用生理鹽水平衡。將上述親和層析樣品用生理鹽溶液溶解并透析平衡后上柱，用相同溶液洗脫，分部收集，流速為2ml/min，3ml/tube，經280nm處測定紫外吸收和檢測活性后，收集活性部分，透析除鹽，冷凍干燥得到純化的黃精凝集素II，經SDS-PAGE檢測為單一蛋白組分，見圖1。
實施例2黃精凝集素II蛋白對人類單純皰疹病毒的抑制作用1 材料和方法1.1 材料和儀器黃精凝集素II蛋白按實施例1所述方法制備而成。
細胞非洲綠猴腎細胞(Vero cell line)，四川大學華西醫科部基礎醫學院提供細胞株。病毒單純皰疹病毒II型(HSV-II)，333株，-70℃保存，由中國科學院武漢病毒研究所提供毒株。
培養基RPMI-1640(GIBCO產品)按照說明溶解，調節至pH7.2，微孔濾膜過濾除菌，加入小牛血清(成都哈里生物工程有限公司)至濃度為10％，含100U/ml青霉素(重慶藥友制藥有限責任公司)和100μg/ml硫酸鏈霉素(上海四藥股份有限公司)。
胰蛋白酶GIBCO產品；MTT3-(4，5)-雙甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑藍，Sigma產品；96孔板Nunclon產品。
陽性對照藥物無環鳥苷注射劑(ACV)，麗珠集團湖北科益藥業有限公司。
磷酸緩沖液PBS(不含Ca2+、Mg2+)為Na2HPO4和NaH2PO4配制成的濃度0.02M的水溶液，pH＝7.0，所用化學試劑為國產分析純。
微孔濾膜φ25mm，孔徑為0.22μm，上海醫藥工業研究院；酶標儀Model 550，Bio-Red產品。
所有的細胞培養用品經121～126℃高溫高壓滅菌30分鐘后使用。
將待測樣品用培養基溶解，其中不易溶解的樣品則用少量二甲基亞砜(DMSO)助溶，過濾除菌，然后用培養基倍比稀釋若干濃度，置于-20℃保存。
1.2 方法1.2.1 黃精凝集素II蛋白質濃度的測定用Folin-酚試劑測定，以牛血清白蛋白作標準。
1.2.2 非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)培養將培養瓶中長成單層的非洲綠猴腎細胞(Vero)用PBS洗3次，然后加入0.25％胰蛋白酶溶液1～2ml消化成單細胞，經細胞計數后，用培養基稀釋成1×105cell/ml的細胞懸液，接種至96孔細胞培養板，每孔0.2ml，37℃，5％ CO2培養箱中培養24小時，待Vero細胞長成單層后進行實驗。
1.2.3 單純皰疹病毒II型(HSV-II)溶液的制備取凍存的HSV-II溶液一管，解凍后取0.2ml接種到長成單層細胞的10ml培養瓶中，37℃，5％CO2培養箱中吸附1個小時，用PBS洗去未吸附的病毒，加入新鮮培養基10ml，培養2～3天。觀察細胞全部病變但尚未脫壁時，輕輕吸去上層培養基，加入新鮮培養基10ml，用滴管吹下細胞成細胞懸液，轉移到10ml離心管中，置于-70℃冰箱反復凍融三次，4℃、4000rps離心15分鐘，分裝上清0.5ml/管，-70℃保存。
病毒滴定(細胞病變效應法)取-70℃凍存病毒液，室溫解凍，用PBS連續10倍稀釋6個濃度，接種到長成單層細胞的96孔板上，每個濃度作四個復孔，吸附1個小時，用PBS洗去未吸附病毒，加入新鮮培養基，37℃，5％CO2培養箱培養72小時后觀察細胞病變效應。計算50％組織培養感染劑量(median tissue culture infection dose，TCID50)。
1.2.4 黃精凝集素II樣品的細胞毒性實驗CPE法待96孔板細胞長成單層后傾去培養基，按每個濃度4個復孔，每孔加入0.2ml經系列倍比稀釋的黃精凝集素II溶液，對照孔加入新鮮培養基0.2ml，37℃，5％CO2培養箱繼續培養72h，倒置顯微鏡下每日觀察記錄結果。
MTT法72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，37℃，5％CO2培養箱繼續培養4小時，可見藍黑色甲瓚顆粒，輕輕吸去上清，加入0.2ml二甲亞砜，在振蕩器上振蕩5min，使甲瓚顆粒充分溶解，用酶標儀進行雙波長(570及630nm)法測定吸光度值，按照Reed和Muench法計算藥物對細胞的半數毒性濃度(CC50)。
1.2.5 黃精凝集素II樣品的抗HSV-II活性實驗待96孔板細胞長成單層后吸去培養基，取凍存病毒液，用PBS稀釋100倍后，每孔加入稀釋的病毒液20μl，置37℃，5％CO2培養箱中吸附1小時，吸去病毒液，按每個濃度3個復孔，每孔0.2ml加入經系列倍比稀釋的黃精凝集素II樣品溶液，同時陰性對照中加入新鮮培養基0.2ml、陽性藥物對照中加入0.2ml的0.5mg/ml ACV、細胞對照中不加病毒液，只加0.2ml新鮮培養基，37℃、5％CO2培養箱中培養72小時，鏡檢記錄，同時用MTT法測定O.D值。按照Reed和Muench法計算藥物對病毒的半數抑制濃度(IC50)和治療指數(TI)。

B＝log(＜50％樣品濃度)C＝log(稀釋倍數) 2 實驗結果和討論2.1 病毒毒力測定結果細胞病變效應法測得HSV-II的效價為TCID50＝1×10-4，使用時用PBS稀釋100倍，按照病毒量為100×TCID50接種，每孔接種20微升。
2.2 黃精凝集素II的抗HSV-II活性研究2.2.1 用MTT法研究黃精凝集素II細胞毒性和抗HSV-II活性以5ug/ml ACV作為陽性對照，用MTT法研究黃精凝集素II細胞毒性和抗HSV-II活性，結果見表1和表2。
表1 黃精凝集素II的Vero細胞毒性結果濃度 細胞CC508 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625(mg/ml)對照mg/mlO.D平均值 0.453 1.145 1.214 1.245 1.220 1.291 1.301 1.312 1.350±s 0.02 0.03 0.01 0.04 0.030.03 0.020.040.025.29抑制率(％) 33.8 84.8 89.9 92.2 90.495.6 96.497.2表2 黃精凝集素II抗HSV-II活性結果病毒細胞 IC50濃度(ug/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125對照對照 ug/mlO.D平均值 1.244 0.810 0.511 0.245 0.195 0.199 0.107 1.3461.45±s 0.330.280.12 0.140.09 0.110.050.03抑制率(％) 92.460.238.0 18.214.5 14.5
由表1可以，黃精凝集素II濃度在4mg/ml時，細胞病變抑制率(即細胞存活率)已經達到了84.8％，半數細胞毒性濃度為5.29mg/ml。5ug/ml ACV陽性對照的O.D平均值為1.222±0.05，細胞存活率為90.5％。從表2中結果可以看出，黃精凝集素II在濃度為4ug/ml時效果與5ug/ml ACV相當。其半數毒性濃度(CC50)為5.29mg/ml，半數抑制濃度(IC50)為1.45ug/ml，其治療指數TI為3648.3，表明黃精凝集素II治療安全性好。
2.2.2 細胞病變抑制法(CPE)測定黃精凝集素II蛋白抗HSV-II活性結果用培養基將黃精凝集素II蛋白配成1mg/ml濃度溶液，過濾除菌，并稀釋成相應濃度，進行細胞毒性和抗HSV-II活性研究。
●黃精凝集素II蛋白的細胞毒性經過72h的觀察，黃精凝集素II蛋白在10-1-10-6稀釋度下均未出現細胞病變，表明黃精凝集素II在這些濃度下無細胞毒性，結果見表3。
表3 黃精凝集素II對Vero細胞的毒性孔 PCLII(1000ug/ml)溶液稀釋倍數 細號 胞10-110-210-310-410-510-61- - - - - - -2- - - - - - -3- - - - - - -注“-”表示無細胞病變；“+”表示25％左右的細胞病變；“++”表示50％左右的細胞病變；“+++”表示75％左右的細胞病變；“++++”表示100％的細胞病變。(下同)●黃精凝集素II蛋白抗HSV-II實驗結果細胞接種病毒并加入含黃精凝集素II蛋白的培養基后，每日觀察、記錄細胞病變狀況。72小時后，細胞空白對照組未出現病變，陰性對照組出現顯著的細胞病變，陽性對照藥物組未出現細胞病變，結果見表4、表5、表6和圖2。
表4 ACV抗HSV-II實驗結果孔號 AVC濃度(ug/mL)500 100 50 25 12.5 6.251-----+2-----+3-----+
表.5 PCLII抗HSV-II實驗結果孔號PCLII濃度(ug/ml) 細胞10 52.5 1.25 0.6250.3125 HSV-II1-+++++ +++ ++++++++-2-+++ ++++++ ++++++++-3--++++++ ++++++++-表6 黃精凝集素II抗HSV-II活性結果樣品 最高無細胞毒濃度(TC)最低抗病毒活性濃度(IC)TC/IC黃精凝集素II 1000ug/ml 0.625ug/ml 1600(PCLII)從表5結果可以看出，當黃精凝集素II濃度大于10ug/mL時完全抑制HSV-II引起的Vero細胞病變。隨黃精凝集素II濃度的降低，開始發生細胞病變，黃精凝集素II樣品濃度為1.25ug/mL時約有50％左右細胞發生了病變，有部分抗HSV-II活性，IC50在1.25-2.50ug/ml之間。其最高無細胞毒性結果和最低抗HSV-II活性結果如表6。樣品的最高無細胞毒濃度(TC)越大，則樣品的細胞毒性越小；最低抗病毒活性濃度(IC)越小，則抗病毒效果越強。TC/IC是評價樣品潛在的抗病毒安全性的一個大致指標，TC/IC越大，則該樣品安全高效。從表6中可以看出，黃精凝集素II樣品的TC/IC為1600，二者相差1600倍，表明黃精凝集素II是一種有效的體外抗HSV-II糖結合蛋白。
采用MTT法和CPE法測定黃精凝集素II抑制HSV-II對Vero細胞感染的作用，得出的結論一致，IC50分別為1.45ug/ml和1.25ug/ml，CC50為5.29ug/ml，表明黃精凝集素II在低濃度下即可有效抵抗HSV-II對正常細胞的感染，并且黃精凝集素II對Vero細胞的毒性很低，其治療指數高達3460，TC/IC值也達到1600，說明黃精凝集素II是一種低毒高效的體外抗HSV-II的生物活性糖結合蛋白。由于黃精凝集素II是一種糖結合蛋白，可以和HSV-細胞表面的糖鏈相互結合，從而封閉或阻斷HSV-II與宿主細胞的識別和結合并降低感染，具有抗人類II型單純皰疹病毒臨床應用價值。
權利要求
1.黃精凝集素II蛋白在制備治療或預防單純皰疹病毒所致疾病的藥中的應用。
2.權利要求1所述的黃精凝集素II蛋白，以植物黃精塊莖為原料，采用以下工藝步驟制備而成(1)粗品制備粗品制備是將黃精塊莖切成片狀以生理鹽水溶液浸取，再經高速組織搗碎機搗成糊狀以生理鹽水溶液浸取，所得上清加入硫酸銨沉淀，將沉淀溶于蒸餾水，透析除鹽，冷凍干燥即得黃精凝集素粗品，(2)親和柱分離純化親和柱分離純化是將粗品溶于生理鹽水溶液，透析平衡，離心除去不溶物，取上清液進行親和層析，以甘露糖-Sepharose 4B為親和吸附劑，以甘露糖溶液解吸附，洗脫及解吸附過程中皆分部收集，收集管經280nm處測定紫外吸收后，將樣品用生理鹽水透析，以兔紅細胞檢查樣品的凝集活性，合并活性部分并透析去鹽，冷凍干燥得親和層析樣品，(3)分子篩純化分子篩為Sephacryl S-100柱，將上述親和層析樣品用生理鹽溶液溶解并透析平衡后上柱，用生理鹽溶液洗脫，分部收集，經280nm處測定紫外吸收和檢測活性后，收集活性部分，透析除鹽，冷凍干燥即得到純化的黃精凝集素II蛋白。
3.根據權利要求2所述的黃精凝集素II蛋白，其特征在于親和柱分離純化時解吸附所用的甘露糖溶液的濃度為0.1～0.3mol/L。
全文摘要
一種黃精凝集素II蛋白，以植物黃精塊莖為原料，制備工藝步驟依次為粗品制備、親和柱分離純化和分子篩純化。親和柱分離純化以甘露糖－Sepharose 4B為親和吸附劑，以甘露糖溶液解吸附；分子篩為Sephacryl S－100柱，將親和層析樣品用生理鹽溶液溶解并透析平衡后上柱，用生理鹽溶液洗脫，分部收集，經280nm處測定紫外吸收和檢測活性后，收集活性部分，透析除鹽，冷凍干燥即得到純化的黃精凝集素II蛋白。本發明采用CPE法和MTT法，以ACV為陽性對照藥物，研究黃精凝集素II蛋白抗單純皰疹病毒(HSV)活性，證明了黃精凝集素II蛋白對人類單純皰疹病毒具有很強的抑制作用，以便開發出一類新的藥品。
文檔編號A61P31/00GK1562350SQ20041002235
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月20日 優先權日2004年4月20日
發明者吳傳芳, 常麗青, 榮艷珍, 高順, 趙曦, 陳放, 鮑錦庫 申請人:四川大學