靶向傳輸基因的載基因微泡及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：靶向傳輸基因的載基因微泡及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向基因傳輸載體，具體地說是一種應用于超聲破裂微泡靶向傳輸基因系統的載基因微泡。它可應用于心血管疾病的基因治療，也可應用于肝臟、腎臟、前列腺、乳腺、肌肉等實質臟器疾病的基因治療。本發明還提供了這種載基因微泡的制備方法。
背景技術：
隨著人類基因組計劃的開展和分子生物學研究的逐步深入，眾多疾病的分子機制的闡明和致病基因不斷發現，基因治療已經從單基因遺傳性疾病的治療發展到多基因常見多發病的治療，尤其在心腦血管疾病及各種腫瘤的治療中展現出良好應用前景。但成功的基因治療需要安全高效的轉基因載體和基因輸送方法。盡管有多種病毒載體，如腺病毒、腺相關病毒和慢病毒等能導致外源基因高效轉染與表達，然而其表現出的肝臟毒性、致炎性、免疫原性和潛在的致瘤性引起國內外學者對其安全性的深切擔憂。非病毒載體所具有安全性高、容量大和易制備等優點可能較病毒載體具有更好的應用前景，但其基因轉染效率尚有待提高。同時，隨著基因治療研究的逐步深入，人們認識到使目的基因靶向性和特異性的在特定組織部位表達，將其治療作用與效應限制在特定的組織細胞中是基因治療成功的關鍵。現階段基因載體缺乏靶向性，而采用局部注射等方法將目的基因導入特定組織內，由于其基因轉染效率低且可能需要外科手術暴露靶組織，可操作性較差，嚴重限制其廣泛應用。如何開發出無創、高效、靶向基因傳輸系統是基因治療研究的熱點問題。
近來發現超聲誘導傳統超聲對比劑-微泡空化能增強基因轉染效率達10～3000倍。且體內應用發現經靜脈注入微泡后，采用超聲靶向破裂微泡介導基因轉染時，微泡不但作為空化核心增強基因轉染效率，同時也可作為基因傳輸載體釋放基因至特定的部位而達到靶向傳輸基因的目的。作為超聲對比劑的微泡是一種直徑類似于紅細胞(3～6μm)的含氣小泡組成，經靜脈注入后能通過肺循環到達組織毛細血管內，在超聲作用下具有線性散射、非線性散射等特性，使實質器官在超聲檢測時產生良好的對比顯影效果。目前美國FDA已批準Albunex、Optison兩種聲振白蛋白微泡應用于臨床，而Levovist已在歐洲批準臨床應用。其中以含惰性氣體的白蛋白微泡Optison顯影效果最佳，由于其在體內穩定性好，經靜脈注入后其不但能使心腔顯影良好，還能隨血流進入毛細血管達到灌注成像效果，使心肌及其它實質器官顯影。以含氣微泡作為對比劑的超聲造影在歐美國家已廣泛地應用于急慢性心肌缺血的診斷、心功能評價和各種實質腫瘤的診斷。由于國內尚無成熟產品投入市場使用，這方面的研究已明顯滯后。然而超聲靶向照射破裂微泡介導基因轉染與傳統的超聲造影作用機制有所不同，它是通過超聲照射誘導靶器官內微泡空化破裂，由此產生的微波自由基等可明顯增強毛細血管、細胞膜對基因及藥物等大分子物質的通透性，達到增強局部基因轉染的效應。但研究發現超聲靶向破裂微泡介導基因轉染要求微泡與基因具有時間與空間上的協同性，如果基因與微泡處于分離狀態，則不但無法保證基因的靶向傳輸，同時基因轉染效率的增強也是有限的。因而很有必要將基因整合至微泡包膜上或微泡內，把傳統的超聲對比劑—微泡改造成專門化基因傳輸載體—載基因微泡。這是超聲破裂微泡靶向基因傳輸系統的關鍵之所在。
目前國內外尚無作為專門化基因傳輸載體的載基因微泡。現階段多利用微泡包膜白蛋白的粘附性或脂質微泡表面電荷特性，簡單地將基因粘附于傳統超聲對比劑-微泡表面而制備基因黏附微泡，其不但攜帶基因量有限，而且變異性大，可重復性及穩定性差，嚴重影響基因轉染效率。更為重要的是由于基因裸露在微泡表面，其在體內應用時不能防止體液對基因的稀釋及循環中DNase對基因的降解，無法保證將大量的基因輸送至靶組織。因而如何在保證基因性能不受影響的前提下，通過簡單有效的工藝將基因整合至微泡包膜內增加其基因攜帶量及穩定性，制備基因攜帶量大、性能穩定的載基因微泡作為新的基因傳輸載體是一個有待解決的關鍵問題。無疑它的研制成功將具有良好的應用前景和巨大的經濟效益。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種能靶向傳輸基因的新型基因傳輸載體—載基因微泡，這種載基因微泡主要由包膜構成物、含氟惰性氣體內核、基因保護劑、表面活性劑、質粒構成。
本發明的載基因微泡最重要特征在于，將基因穩定整合在微泡包膜內，這種新型載基因微泡不但性質穩定，能提高基因轉染時能達到基因-微泡時間與空間上的協同性；而且由于基因包埋在微泡包膜內，在體內使用時能防止血液對基因沖刷和稀釋，還能保護基因免受循環中DNase的降解，保證將大量基因輸送至靶組織；同時這種新型載基因微泡攜帶基因容量明顯明顯優于基因粘附微泡，且在一定范圍內隨基因投入量增加而呈線性增加。(參見圖1)其有效攜基因量為110～166.7μg/ml，包封率為25.1±4.6％。
本發明的載基因微泡直徑分布范圍為2.6～8.3μm，其中98％以上微泡直徑小于6μm，本發明通過增加表面活性劑后載基因微泡均勻性明顯增加，90％以上載基因微泡直徑分布在3～5μm，這種直徑分布范圍是靶向傳輸基因的先決條件，它能保證載基因微泡通過肺循環而將基因輸送至靶器官微循環內。與傳統的超聲成像不同，超聲靶向照射破裂微泡介導基因轉染的機制是在定向超聲照射作用下，靶器官內微泡空化破裂將基因釋放于靶器官內達到靶向傳輸基因的目的，同時微泡破裂所產生的微波及自由基等可明顯增強基因轉染效率。而微泡空化產生微波能量及自由基多少與微泡直徑成正相關，因而在保證微泡能通過肺循環進入毛細血管的同時微泡直徑應較為均勻，過小微泡影響基因轉染效率。本發明的載基因微泡濃度大于5×108/ml。載基因微泡作為基因傳輸載體，這種濃度可保證微泡能將大量基因輸送靶組織。其有效濃度范圍為1×108/ml～1×1010/ml，優選濃度范圍為5×108/ml～9×108/ml。本發明通過將微泡濃縮可將微泡濃度進一步增加至1.6×109/ml。其完全達到體應用的血液流變學與聲學要求。
本發明的載基因微泡穩定性較好，在室溫開放條件下其半衰期為18.6～25.7小時。經優選法制備的載基因微泡的半衰期為34.1～35.7小時。這種良好的穩定性可防止體內應用時大量載基因微泡在非靶器官處出現塌陷破裂，保證將載基因微泡僅在靶組織處破裂而釋放基因。
本發明的另一目的是提供這種載基因微泡的制備方法，采用同步聲振法制備而成，主要通過以下步驟實現(1)將基因保護劑與含目的基因的質粒按重量比為1/10～3/1混合，(2)將包膜構成物與表面活性劑混合，(3)將步驟(1)的混合物加入步驟(2)的混合溶液中，(4)將一定量的含氟惰性氣體注入步驟(3)的混合溶液中，(5)將步驟(4)的含氣混合液體手搖振動30～40秒，將超聲發生儀探頭置于混合溶液中進行持續性低頻高能超聲聲振，進行超聲聲振處理10～15秒，超聲聲振期間將溶液溫度控制在50～55℃。
步驟(1)中所說的基因保護劑是一種多聚復合物，主要包括多聚門冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚環氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)等，優選PEI及PLL。本發明采用基因保護劑，不但能增強基因轉染效率，還能保護基因在載基因微泡制備及基因轉染時免受超聲聲振能量的破壞。
多聚復合物與基因質粒的重量比選擇在1/10～3/1，均具有基因保護作用，優選重量比為1/2～3/4，此時其保護作用最為有效。
步驟(2)中，包膜構成物是由水溶性生物相容蛋白與單糖溶液的混和物，水溶性生物相容蛋白可以是白蛋白、血紅蛋白及膠原蛋白等，這種水溶性生物相容蛋白必須能在超聲聲振能量作用下使部分水溶性蛋白發生變性成為固態，從而構成微泡的包膜，考慮到應用于人體，優先選擇人血清白蛋白，單糖溶液可以是葡萄糖、果糖、右旋糖苷等。水溶性生物相容蛋白與單糖溶液比例決定了超聲聲振參數，選擇單糖溶液與5％～20％的人血清白蛋白混合，蛋白濃度分布范圍為0.5～10％，但為了縮短超聲聲振時間減少其對基因結構及功能的破壞，蛋白最佳濃度選擇8％。
步驟(2)中的表面活性劑主要選擇甘油和Tween20，甘油濃度范圍為0.05～0.075％，Tween20濃度范圍為0.3～0.45％，其優選濃度為甘油0.06％，Tween20為0.40％。本發明在微泡制備時加入了一定量的甘油和Tween20作為表面活性劑，以增加微泡均勻性及穩定性，同時降低微泡制備時對超聲聲振能量要求。
步驟(4)中的含氟惰性氣體主要包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)、全氟戊烷(C5F12)、六氟化硫(SF6)等，優選全氟丙烷和六氟化硫，最優選全氟丙烷。
步驟(5)中所用超聲發生儀，采用Sonicator 3000超聲發生儀(Misonixinc.USA)，探頭為1/2英寸標準探頭，發射超聲頻率為20KHz，輸出能量為最高輸出量(10檔)。通過改變微泡制備配方和表面活性劑的添加，將超聲聲振時間縮短至10～15秒以便減輕超聲聲振對基因結構與功能的影響，超聲聲振期間將溶液溫度控制在50～55℃以防止過多的蛋白變性和基因結構與功能的破壞。
本發明的載基因微泡由持續性低頻高能超聲聲振法制備。其特征在于包膜構成物為水溶性生物相容蛋白與單糖溶液混和物。這種水溶性生物相容蛋白必須能在超聲聲振能量作用下使部分水溶性蛋白發生變性成為固態，從而構成微泡的包膜。這種水溶性生物相容蛋白可以是白蛋白、血紅蛋白及膠原蛋白等。考慮到應用于人體，人體含有蛋白應優先選擇，其中以人血清白蛋白尤為適合。單糖溶液可以是葡萄糖、果糖、右旋糖苷等。蛋白與單糖溶液比例決定了超聲聲振參數，蛋白濃度分布范圍為0.5～10％，但為了縮短超聲聲振時間減少其對基因結構及功能的破壞，其最佳濃度為8％。
含氣微泡的氣體內核可以是空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣及惰性氣體。本發明的氣體內核為含氟惰性氣體，它具有較低的血液溶解性和彌散性，可明顯延長載基因微泡的半衰期，增加其在體內的穩定性，減少其在非靶器官處破裂塌陷，保證載基因微泡能隨血流進入靶器官毛細血管，并在靶向超聲作用下誘導微泡空化破裂而定向釋放基因至靶器官。這種含氟惰性氣體包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)、全氟戊烷(C5F12)、六氟化硫(SF6)等。從安全性考慮，應首先選擇全氟丙烷和六氟化硫，因為這兩種氣體已經應用于眼科視網膜脫離固定術并證明其安全無毒。其中全氟丙烷氣體密度較六氟化硫大，血液溶解度及彌散性更低，尤其適于制備含氣微泡。
由于經靜脈注入載基因微泡必須通過肺循環才能到達靶器官毛細血管，其直徑必須等于或小于紅細胞且分布較為均勻，同時載基因微泡應具有良好的穩定性才能保證有大量載基因微泡進入靶器官。本發明在微泡制備時加入了一定量的甘油和Tween20作為表面活性劑，以增加微泡均勻性及穩定性，同時降低微泡制備時對超聲聲振能量要求。甘油濃度范圍為0.05～0.075％，Tween20濃度范圍為0.3～0.45％。其優化濃度為甘油0.06％，Tween20為0.40％。
本發明采用Sonicator 3000超聲發生儀(Misonix inc.USA)進行持續超聲聲振。探頭為1/2英寸標準探頭，發射超聲頻率為20KHz，輸出能量為最高輸出量(10檔)。通過改變微泡制備配方和表面活性劑的添加，將超聲聲振時間縮短至10～15秒以便減輕超聲聲振對基因結構與功能的影響。超聲聲振期間將溶液溫度控制在50～55℃以防止過多的蛋白變性和基因結構與功能的破壞。
不同于基因粘附微泡制備是先制備含氣微泡然后將基因與微泡粘附，本發明所研制的載基因微泡是在白蛋白微泡制備的同時將基因穩定地整合至微泡包膜內。由于白蛋白微泡采用高能低頻超聲聲振而成，而以往的研究表明如果對基因直接進行超聲聲振處理，由于超聲剪切力等作用，基因結構及功能將受到明顯的破壞。且發現隨著超聲聲振時間的延長，基因結構與功能破壞愈為明顯。因而本發明通過改進白蛋白微泡的制備配方，縮短超聲聲振時間。同時加入基因保護劑以防止在載基因微泡的制備過程中超聲聲振破壞基因結構與功能以及超聲靶向破裂微泡介導基因轉染時對基因結構與功能的影響。本發明的基因保護劑是一種多聚復合物，它能通過分子間作用力將基因包裹至復合物內核，防止超聲剪切力對基因的破壞。此外其能壓縮基因，減小基因體積而幫助基因進入細胞，同時幫助入胞后基因從內含體逃逸避免內含體酶對基因的降解，從而增強基因轉染效率。多聚復合物包括多聚門冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚環氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)等。但僅具有陽離子活性的PEI及PLL具有明顯保護作用(見圖3)，而其它多聚復合物盡管同樣具有包裹基因的作用，但無法防止超聲聲振對基因的破壞。陽離子多聚復合物與基因重量比分布在1/10～3/1均具有基因保護作用，其中以1/2～3/4重量比時其保護作用最為有效。
本發明所負載的基因為裸質粒，由于其具有制備容易、容量大且安全性高，是一種較病毒載體更具前景的轉基因載體。同理，本發明亦可用于包被病毒載體及具有高度生物活性的藥物。
本發明的再一目的是該載基因微泡在制備超聲破裂微泡靶向基因傳輸載體中的應用。也可在制備載藥微泡及靶向超聲對比劑中的應用。
本發明提供的載基因微泡可用于人體基因治療和動物基因治療研究，它不僅可用于心血管疾病的基因治療，也可應用于肝臟、腎臟、肌肉及其它各種實質器官的基因治療。此外這種載基因微泡還可用于體外轉基因研究。
本發明所負載的基因為裸質粒，由于其具有制備容易、容量大且安全性高，是一種較病毒載體更具前景的轉基因載體。同理，本發明亦可用于包被病毒載體及具有高度生物活性的藥物。
本發明的目的還在于提供一種新型的基因轉染方法—超聲靶向破裂載基因微泡介導基因轉染。它與載基因微泡配合應用不但能明顯增強基因轉染與表達，還可達到靶向傳輸基因的目的。可應用于各種實質器官疾病的基因治療和體外轉基因研究。其超聲照射參數明顯影響基因轉染效率。有效超聲照射頻率為KHz～2.0MHz，超聲照射頻率愈低其誘導微泡空化破裂所需能閾愈低，然而由于KHz超聲發生器價格昂貴，要求復雜，不易在臨床推廣應用。診斷性超聲其不但能監測載基因微泡進入靶組織的情況，同時可發射較高能量超聲誘導載基因微泡空化破裂而定向釋放基因。因而其靶向性明顯優于低頻KHz超聲，更適于在臨床推廣應用。診斷性超聲頻率范圍是1.0～40MHz，進行超聲靶向照射破裂微泡介導基因轉染時其有效頻率應小于2.0MHz。診斷性超聲能量指標為機械指數(Mechanic index，MI)，根據超聲發射頻率不同，其有效能閾有所不同，一般為MI1.0～1.6。由于超聲破裂微泡靶向傳輸基因系統需要超聲照射破裂靶器官內的載基因微泡，故需要根據二維超聲成像確定靶器官的深度，在發射高能超聲時應準確調節超聲靶點深度，以防止非靶組織內微泡破裂而釋放基因。
本發明的載基因微泡和超聲破裂微泡靶向傳輸基因系統的有益效果在于1.發明的載基因微泡與靶向超聲照射聯合應用，在增強基因轉染效率的同時可達到靶向傳輸基因效應，為基因治療提供一種可通過靜脈注入的新型高效靶向基因傳輸載體；2.發明的載基因微泡通過同步聲振處理將基因穩定地整合至微泡包膜內，其不但攜帶基因量大，且在體內應用是能防止血液對基因沖刷、稀釋和循環中DNase對基因的降解，能高效傳輸及保護基因；3.本發明的載基因微泡的濃度、直徑分布范圍及穩定性完全達到體內應用的血液流變學和聲學特性要求；4.本發明的載基因微泡合成原料均為藥理學可接受材料，安全無毒；5.本發明的載基因微泡制備中引入的基因保護劑不但能防止超聲聲振對基因結構與功能的破壞，還能增強基因轉染效率；6.本發明的載基因微泡新的合成配方和表面活性劑的引入，不但縮短了超聲聲振處理時間，避免超聲聲振對基因的破壞，同時增強了在基因微泡的穩定性和直徑分布的均勻性，使其更適于在超聲破裂微泡靶向傳輸基因系統中的應用；7.本發明工藝簡單，設備要求低，適合推廣應用。
8.本發明的載基因微泡、制備方法及靶向基因傳輸系統不但適用于基因的傳輸，同樣適用于藥物的靶向傳輸。


圖1、本發明載基因微泡及基因粘附微泡基因攜帶量隨基因投入量的增加而變化的趨勢圖，其中*P＜0.05，**P＜0.01，圖2、本發明載基因微泡經兔耳緣靜脈注入后(0.1ml/kg)，二維超聲監測下其進入心腔及心肌毛細血管的圖像，圖3、單純裸質粒(A)及多聚復合物與質粒混合物(B)經超聲聲振(600W，20KHz)處理后電泳圖像(1為對照組，2～6分別為聲振10秒、20秒、30秒、40秒、50秒；OC開口螺旋結構質粒，SC超螺旋結構質粒，Fragmented DNADNA碎片)，圖4、超聲破裂載基因微泡介導磷酸受鈉蛋白反義RNA真核表達質粒心肌細胞轉染后，RT-PCR檢測磷酸受鈉蛋白mRNA表達瓊脂糖凝膠電泳圖(1對照組；2單純質粒轉染組；3超聲照射轉染組；4超聲破裂粘附基因微泡轉染組；5超聲破裂載基因微泡轉染組)，圖5、超聲破裂載基因微泡介導磷酸受鈉蛋白反義RNA真核表達質粒心肌細胞轉染后，Western免疫印跡法檢測磷酸受鈉蛋白蛋白表達(1對照組；2單純質粒轉染組；3超聲照射轉染組；4超聲破裂粘附基因微泡轉染組；5超聲破裂載基因微泡轉染組)。
具體實施例方式
下面將通過實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1載基因微泡及基因粘附微泡的制備載基因微泡制備采用低頻超聲持續聲振法制備，其配方為6％右旋糖苷溶液 100份20％人血清白蛋白40.4份甘油0.08份ween20 0.56份全氟丙烷氣體(C3F8)70份陽離子多聚復合物10～600μg/ml空質粒(PcDNA3.1)20～1200μg/ml將質粒與陽離子多聚復合物混合后，靜置半小時。加入由右旋糖苷、血清白蛋白、表面活性劑組成的混合溶液中，置于一無菌注射器內。通過三通連接器與另一含有全氟丙烷氣體的注射器相連，將全氟丙烷注入上述混合溶液內。手振30秒后拔出針栓，將超聲發生儀1/2英寸無菌探頭插入溶液內。將超聲發生儀輸出能量調節為最大輸出能量，頻率固定為20KHz持續聲振12秒。將上述所得液體直立靜置1小時，待其分為3層后小心抽吸中層(載基因微泡聚集層)液體。將微泡按1∶100稀釋后用細胞計數器測定微泡的濃度，采用測微尺測量微泡的大小。當微泡濃度大于5×108，90％微泡直徑分布在3～5μm者留用。將部分微泡中加入無水乙醇破裂微泡后提取微泡內質粒，紫外分光法測定其載基因量同時進行瓊脂糖凝膠電泳了解質粒結構的改變。基因粘附微泡的制備采用傳統的配方持續聲振120秒制備微泡后與基因混合粘附而得。載基因微泡及基因粘附微泡基因攜帶量隨基因投入量的增加而變化的趨勢參見圖1，表明載基因微泡基因攜帶量明顯大于基因粘附微泡。將載基因微泡經兔耳緣靜脈注入后(0.1ml/kg)，二維超聲監測下心腔及心肌灌注成像情況參見圖2。上述結果表明載基因微泡完全達到體應用的血液流變學與聲學要求。
實施例2、采用不同方法制備載基因微泡A、陽離子復合物對基因保護作用采用實施例1的制備方法制備載基因微泡，僅去除陽離子多聚復合物。將所得微泡按實施例1的方法測定濃度及直徑，與按實施例1方法制備質微泡無明顯差異。瓊脂糖電泳發現其內所攜質粒結構已破壞殆盡，細菌轉化試驗無陽性克隆出現，參見圖3。
B、表面活性劑對微泡性質的影響采用實施例1的方法制備載基因微泡，僅去除表面活性劑甘油及Tween20。鏡下測量微泡直徑、濃度及半衰期結果見表1。
表1.表面活性劑對載基因微泡物理參數的影響載基因微泡參數 未添加表面活性劑 添加表面活性劑直徑 6.31±3.97μm 4.6±1.3μm P＜0.01濃度 4.3±2.6×106/ml 8.9±2.6×108/mlP＜0.01半衰期 5.73±1.32小時34.9±0.8小時 P＜0.01上述結果表明表面活性劑引入明顯改善載基因微泡各種參數，使微泡大小接近血細胞，直徑分布范圍更為均勻，同時增加微泡濃度和半衰期，是使載基因微泡達到體內應用血液流變學要求的重要保障。
實施例3經靜脈注入載基因微泡及靶向超聲破裂載基因微泡對心功能的影響載基因微泡的制備同實施例1，解剖分離4只兔的右頸總動脈，將5F的動脈鞘管置于其內。經動脈鞘管置入動脈導管至左心室，將導管尾端與Medlab心功能監測系統的壓力換能器相連，持續監測心功能變化。經兔耳緣靜脈注入載基因微泡(0.1ml/kg)，二維超聲監測微泡進入心腔及心肌毛細血管情況，同時觀察心功能改變。一旦微泡進入心肌毛細血管內，即將超聲機械指數調節至1.7進行超聲靶向破裂載基因微泡，同時觀察心功能變化。二維超聲監測發現當微泡注入后約10秒可見心腔內信號明顯增強，2～3個心動周期后心肌聲學密度值基本與心腔相同，表明載基因微泡已進入心肌毛細血管。二維超聲監測下心腔及心肌灌注成像情況，此時調節超聲機械指數至1.7，約4～5個心動周期心肌聲學密度值降至基礎水平，表明其內載基因微泡已完全破裂。如此重復4～5個循環直至體內載基因微泡完全耗竭。
表2.載基因微泡注入前、后及超聲靶向破裂微泡心功能參數的變化心功能參數 載基因微泡注入前 載基因微泡注入后 超聲破裂載基因微泡時左室峰壓 128.48±11.97 124.62±13.96 126.95±7.83 P＝0.195左室舒張末期壓 6.71±1.736.28±1.366.92±1.65 P＝0.435+dp/dt Max*2536.308±259.18 2453.21±168.57 2499.31±210.83 P＝0.588-dp/dt Max** -2235.88±152.36 -2130.87±120.98 -2245.65±143.22 P＝0.640*左室壓力最大上升速率；**左室壓力最大下降速率上表結果顯示經靜脈注射載基因微泡及超聲靶向破裂載基因微泡對心功能無明顯影響，表明載基因微泡不但能成功將基因輸送至靶器官，同時表明超聲破裂微泡靶向傳輸基因技術對機體無明顯有害影響，是一種安全高效的基因傳輸技術。
實施例4超聲破裂載基因微泡介導心肌細胞報告基因轉染載基因微泡制備同實施例1，僅將空質粒改為β-galactosidase質粒及質粒投入量為10～600μg/ml。基因粘附微泡制備采用兩步法，即先制備含氣微泡后將其與質粒混合孵育2小時而得。原代培養乳鼠心肌細胞達到70％匯合時進行基因轉染。
本實驗設立未加任何干預的空白對照組；單純質粒轉染組僅加入質粒10μg/孔；、超聲照射轉染組加入10μg/孔質粒后進行超聲照射；超聲破裂載基因微泡轉染組和超聲破裂黏附基因微泡轉染組分別含有不同量質粒載基因或粘附基因微泡后進行超聲照射，每次試驗設3個復孔，每組試驗均重復3次。超聲破裂微泡轉染組細胞轉染2小時前更換新鮮培養液，加入載基因微泡后，在無菌條件下將超聲探頭(HP SONOS 5500，S3探頭)直接浸入培養液中，在細胞層上方約0.5cm發射超聲(照射參數為頻率1.3MHz，MI1.4，照射時間120秒)，超聲照射過程中轉動探頭(3rpm)。轉染后8小時換液，繼續孵育40小時后進行原位染色和半乳糖苷酶定量測定。
β-Galactosidase原位染色示空白對照組及單純質粒轉染組未見明顯細胞藍染。超聲照射轉染組可見稀疏藍染細胞；超聲破裂微泡轉染組細胞藍染較強，其中以超聲破裂載基因微泡轉染組為甚。
采用定量試劑盒檢測各組細胞轉染后48小時galactosidase酶表達水平，空白對照組未檢出基因表達，單純質粒轉染組基因表達水平較低(0.871±0.135U/g protein)，質粒加超聲照射轉染組基因表達水平(3.644±0.89U/gprotein)與單純質粒轉染組比有所升高(P＜0.05)；超聲破裂載基因轉染組基因表達水平明顯升高，其中10μg/ml質粒合成載基因微泡組基因表達水平為(93.19±8.46U/g protein)，約為單純質粒轉染組表達水平的107倍，差異具有顯著性(P＜0.01)。
隨著質粒量的增加，超聲破裂載基因轉染組基因表達水平呈線性增高直至平臺期(500μg/ml微泡)；而超聲破裂粘附基因組基因表達水平很快達到平臺期，隨后基因表達水平有所降低。超聲破裂載基因微泡基因轉染組平臺期基因表達水平(356.46±12.53U/g protein)約為超聲破裂粘附基因組最高水平(59.23±2.41U/g protein)之6.85倍，差異具有顯著性(P＜0.01)。
上述結果表明超聲破裂微泡明顯增強心肌細胞外源基因轉染與表達，是一種高效的基因轉染技術。同時表明載基因微泡不但攜帶基因明顯高于基因粘附微泡，其增強基因轉染效率亦明顯優于后者。
實施例5超聲破裂微泡介導心肌細胞磷酸受納蛋白(Phospholamban，PLB)反義RNA真核表達質粒心肌細胞轉染磷酸受納蛋白為一種定位于心肌細胞肌漿網上22KDa的膜蛋白，具有重要的調節心肌舒縮功能的作用。其通過磷酸化和去磷酸化調節肌漿網鈣ATP酶(SERCA)的功能而達到調節肌漿網攝取鈣離子及心肌細胞的舒縮活動。研究發現在心力衰竭、糖尿病心肌病等心臟疾患的心肌細胞中，PLB表達明顯上調。且心臟舒縮功能與PLB表達尤其是PLB/SERCA比值明顯相關。通過反義RNA抑制PLB表達或敲除PLB可明顯增強正常和心力衰竭心臟的舒縮功能。已有多種技術可介導反義RNA表達質粒轉染心肌細胞，但均存在轉染效率過低、毒性強等不足。本研究擬采用超聲破裂載基因微泡技術介導PLB反義RNA真核表達質粒轉染心肌細胞，為進一步研究尋找安全有效轉染方法。
磷酸受納蛋白反義RNA真核表達質粒的構建由PAAV-antiPLB亞克隆而得，PAAV-antiPLB為本研究所構建，其內含有反向連接的全長Phospholamban cDNA序列。PcDNA4.0及PAAV-antiPLB質粒分別經EcoRI及XhoI雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，以凝膠純化試劑盒純化相應的DNA片段。用T4噬菌體DNA連接酶將701bp Phospholamban cDNA全長序列反向連接到PcDNA4.0真核表達質粒的EcoRI-XhoI間，構建成PcDNA4.0-asPLB反義RNA表達載體，轉化感受態細菌DH5α，隨機挑選氨芐青霉素抗性的轉化克隆，限制性內切酶酶切鑒定后雙向測序分析。陽性克隆擴增后采用柱層析法提取質粒，調整濃度至1ug/ul。
載基因微泡的制備、細胞培養及基因轉染方法同實施例2。本研究分為5組1、空白對照組；2、空質粒轉染組；3、裸質粒轉染組；4、超聲破裂基因粘附微泡轉染組；5、超聲破裂載基因微泡轉染組。基因轉染后48小時收集細胞，提取RNA及蛋白，行RT-PCR及Western Blot檢測基因表達，參見圖4、圖5。
結果顯示空白對照組及空質粒轉染組PLB表達無明顯改變，裸質粒轉染組PLB mRNA及蛋白表達水平有輕度降低，超聲破裂基因粘附微泡轉染組PLB表達約降低30％，而超聲破裂載基因微泡轉染組基因表達水平降低達60％以上，與其它各組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。上述結果表明超聲破裂載基因微泡能明顯增強反義RNA真核表達質粒的轉染，載基因微泡是一種新的高效反義RNA傳輸載體，可進一步應用于體內實驗及臨床基因治療研究。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
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權利要求
1.一種載基因微泡，其特征是該載基因微泡主要由包膜構成物、含氟惰性氣體內核、基因保護劑、表面活性劑、含目的基因的質粒構成。
2.如權利要求1所述的載基因微泡，其濃度為5×108/ml～9×108/ml，直徑分布范圍為2.6～8.3μm，90％以上載基因微泡直徑分布在3～5μm，半衰期為34.1～35.7小時。
3.如權利要求1和2所述的載基因微泡采用同步聲振法制備而成，主要通過以下步驟實現(1)將基因保護劑與含目的基因的質粒按重量比為1/10～3/1混合，(2)將包膜構成物與表面活性劑混合，(3)將步驟(1)的混合物加入步驟(2)的混合溶液中，(4)將一定量的含氟惰性氣體注入步驟(3)的混合溶液中，(5)將步驟(4)的含氣混合液體手搖振動30～40秒，將超聲發生儀探頭置于混合溶液中進行持續性低頻高能超聲聲振處理10～15秒，超聲聲振期間將溶液溫度控制在50～55℃。
4.如權利要求3所述的載基因微泡的制備方法，所說的基因保護劑是一種多聚復合物，主要包括多聚門冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚環氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)等，優選PEI及PLL。
5.如權利要求3-4所述的載基因微泡的制備方法，所說的多聚復合物與基因質粒的重量比選擇在1/10～3/1，優選重量比為1/2～3/4。
6.如權利要求3所述的載基因微泡的制備方法，所說的包膜構成物主要為水溶性生物相容蛋白與單糖溶液的混和物，蛋白濃度分布范圍為0.5～10％，最佳選擇蛋白濃度為8％。
7.如權利要求3所述的載基因微泡的制備方法，所說的表面活性劑主要選擇甘油和Tween20，甘油濃度范圍為0.05～0.075％，Tween20濃度范圍為0.3～0.45％，其優選濃度為甘油0.06％，Tween20為0.40％。
8.如權利要求3所述的載基因微泡的制備方法，所說的含氟惰性氣體主要包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)、全氟戊烷(C5F12)、六氟化硫(SF6)，優選全氟丙烷和六氟化硫，最優選全氟丙烷。
9.如權利要求1-8所述的載基因微泡，在制備超聲破裂微泡靶向基因傳輸載體中的應用。
10.如權利要求1-8所述的載基因微泡，在制備載藥微泡及靶向超聲對比劑中的應用。
11.如權利要求1-8所述的載基因微泡，在制備實質臟器疾病治療的基因藥物中的應用。
12.如權利要求1-8所述的載基因微泡，在制備心血管疾病治療的基因藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種能靶向傳輸基因的新型基因傳輸載體—載基因微泡，這種載基因微泡主要由包膜構成物、含氟惰性氣體內核、基因保護劑、表面活性劑、質粒構成。本發明還提供了這種載基因微泡主要采用同步聲振法制備而成。本發明為基因治療提供一種可通過靜脈注入的新型高效靶向基因傳輸載體，不但適用于基因的傳輸，同樣適用于藥物的靶向傳輸。不僅能高效傳輸及保護基因，而且合成原料均為藥理學可接受材料，安全無毒，適于在超聲破裂微泡靶向傳輸基因系統中的應用。本發明工藝簡單，設備要求低，適合推廣應用。
文檔編號A61K9/00GK1579554SQ200410018530
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月18日 優先權日2004年5月18日
發明者胡申江, 汪國忠 申請人:浙江大學醫學院附屬第一醫院