專利名稱：低毒高純度雄黃的制備方法
技術領域：
本發明涉及毒性顯著降低的高純度雄黃的制備方法，具體為用有機酸對天然雄黃進行純化，獲得硫化砷(AS2S2)純度在99％以上，并經毒理學研究證明毒性顯著降低的純化雄黃的制備工藝方法。
背景技術：
中藥雄黃為硫化物類礦物雄黃族雄黃，主含二硫化二砷(AS2S2)，也是許多中成藥的重要成分，又名“雄精”、“腰黃”，其味性辛溫，味苦，有解毒、殺蟲等功效，用于癰疽疔瘡、疥癬、蟲毒蛇傷等諸多病癥的治療，效果確切可靠，是臨床常用的礦物藥之一。然而，長期大量應用雄黃或含雄黃藥物可引起諸多的不良反應。主要原因是雄黃礦石中含有砒石、鉛石、鋁礦石等有毒雜質，特別是劇毒物質砒石，俗稱砒霜，主要成分AS2O3為白色，微溶于水(卞俊.藥物不良反應文獻題錄[M].第1版.北京人民軍醫出版社，1993.337；馬佳雯.對十年來《中國藥學雜志》藥品不良反應的文獻綜述[J].中國藥學雜志，1997，35(2)308)。AS2O3可作為一種細胞原漿毒，進入機體后作用于酶系統，抑制酶蛋白的巰基，使之失去活性，從而減弱酶的正常功能，阻止細胞的氧化和呼吸，嚴重干擾組織代謝，引起心血管、肝、腎、大腦、神經、胃腸等組織器官的損害。并且損害細胞染色體，阻止細胞的正常分裂，也可麻痹血管平滑肌以及損害神經細胞，造成廣泛的神經系統病變，還可引起肝、腎、脾及心肌的脂肪變性和壞死。誤服或超量使用砒石可引起急性中毒，長期使用或接觸可致慢性中毒(易增興等，雄黃內服用量芻議.江西中醫藥，2003，34(2)42-43)。另外砷的慢性蓄積可導致皮膚搔癢、色素沉著，稱砷黑變病；手腳掌角化過度，稱砷角化病(顧春紅，雄黃在血液病中的應用概況.上海第二醫科大學學報，2002，22(1)92-94)。
雄黃中雜質成分AS2O3含量的多少直接決定了雄黃的毒性大小，所以，去除雜質的純化方法至關重要。因為AS2S2在空氣中加熱至180～220℃時，可迅速氧化分解生成AS2O3而致毒，故其炮制“切忌火煅”，“雄黃見火如砒”，絕對不能炒用。2000版《中國藥典》中通過水飛法處理雄黃，以除去其可溶性砷鹽，但是其效果并不理想。
中藥雄黃現在臨床上得到了廣泛應用，2000版《中國藥典》中規定雄黃的每日劑量為0.05～0.1克，在成方中收載了24種含雄黃的制劑，處方中的含量一般較大。例如安宮牛黃丸中雄黃占10％，每丸約含雄黃300mg。安宮牛黃散中的雄黃含量與安宮牛黃丸相同，每日劑量中約含雄黃160mg。而牛黃解毒片中雄黃的含量約為6.4％，每丸約含雄黃192mg，其每日服用劑量較大，每日劑量中約含雄黃150～300mg，大大超過藥典規定的日常用量，隨著用藥劑量的增大和用藥時間的延長，其毒副作用亦相應增加。因此，對于雄黃減毒意義重大。
文獻報道水飛法能降低雄黃中As2O3含量，除去As2O3的量與飛時的用水量有規律性關系，用水量愈多，As2O3去除得愈凈(熊少希中成藥研究(1)15，1984)。影響可溶性砷含量增高的諸因素中，受熱溫度是最關鍵的。目前應用較廣的加水球磨，80度干燥32小時的方法使可溶性砷含量增加至于研品含量的4倍(王允興等中成藥研究(9)11，1985)。
發明內容
本發明要解決的技術問題是通過研究一種能對天然雄黃進行純化以期獲得低毒性的藥用雄黃的制備方法，以提高天然雄黃中的可溶性砷鹽(主要是AS2O3)的去除率高，工藝簡便，并減少用水量，純化后雄黃應該毒副作用顯著降低但不影響藥效。本發明還需要研究純化方法中有機酸種類、濃度、處理時間、溫度、酸液的用量等具體工藝條件。
為解決上述問題，本發明提供如下技術方案。一種高純度雄黃的制備方法是用含一種或兩種以上有機酸的水溶液與天然雄黃混合，溫度25-95℃，放置后，濾去酸水液，取雄黃用水洗滌，所述有機酸不包括單獨使用乙酸。所述有機酸包括帶兩個或兩以上羧基的有機酸。所述有機酸選自檸檬酸、甲酸、草酸或者它們的混合物，或者它們與乙酸的混合物；含有機酸的水溶液中酸的濃度為≥1％。含有機酸的水溶液中酸的較好濃度為2-60％。含有機酸的水溶液中酸的更為合適的濃度為2-10％。
該制備方法是用有機酸的水溶液與天然雄黃混合，溫度30-85℃，較好的溫度為40-60℃。
所述制備方法是用有機酸的水溶液與天然雄黃混合碾磨后，攪拌10-100分鐘，酸水液體積為每克天然雄黃用5-100毫升的酸水液。可以用有機酸的水溶液與天然雄黃混合碾磨后，攪拌20-70分鐘，酸水液體積為每克天然雄黃用10-80毫升的酸水液。
所述制備方法具體為取1克天然雄黃，用4-40％草酸溶液20-60ml，50℃時碾磨后攪拌40分鐘后，濾去酸水液，然后用水洗滌雄黃。
因為AS2O3微溶于水，易溶于酸，而AS2S2難溶于水，故必須選擇合適的方法清除AS2O3，降低毒性，提高質量。而且在常溫至95℃范圍內水溫越高，清除AS2O3效率越高。
表1不同有機酸液處理所得雄黃中可溶性砷鹽的含量比較樣品 檸檬酸甲酸草酸乙酸含量31.3825.0334.35 22.40(mg/g)注含量指的是不同的酸液從每克雄黃中洗脫的可溶性砷鹽。
經研究分析，確定有機酸去除可溶性砷鹽的主要的影響因素為有機酸的種類、酸液濃度和溫度；酸液的用量、處理時間也有一定影響。適合的有機酸濃度為1-10％，時間10-100分鐘，溫度25-95℃，酸液體積為每克天然雄黃用10-100毫升的酸液。
天然雄黃和不同方法處理所得雄黃中可溶性砷鹽的含量比較參照中國藥典2000版附錄IX Ag(DDC)的測定方法測定。精密分別稱取干研、水飛、草酸等不同處理方法處理過的樣品1.88g，分別加入100ml5％的草酸溶液，不斷攪拌30min過濾，殘渣用酸洗滌2次，每次10ml，攪拌10分鐘，最后將洗液濾液合并，置500ml容量瓶中定容至刻度，吸取5ml置50ml容量瓶中定容至刻度，精密吸取4ml于60ml具塞三角瓶中，按照標準曲線繪制項下操作測定其吸收值。測定結果表明，用草酸處理后可使可溶性砷鹽的含量降至2.439mg/g，而水飛法處理后其可溶性砷鹽的含量降至25.458mg/g，證明草酸與常規水飛法處理雄黃相比，除氧化砷能力要強10.4倍。
表2不同方法處理所得雄黃中可溶性砷鹽的含量比較(n＝3)樣品 含量(mg/g) 含量(％)RSD(％)為相對標準偏差天然雄黃37.463 3.75 2.92水飛法 25.458 2.55 3.42草酸法 2.439 0.24 2.58純化雄黃中砷含量的測定參考文獻(劉汗東，史建波，遲泉等.流動注射氫化物-原子熒光光譜法測定土壤中有效態As(III)和As(V).2002，22(5)862-864)取純化雄黃約0.1g，精密稱定，置50ml的錐形瓶中，加硫酸鉀1g，硫酸銨2g與硫酸8ml，用直火加熱至溶液澄明，放冷，緩緩加水定容至50ml。取1ml定容至1000ml待測。精密吸取1ml待測液置于50ml的納氏比色管中，加入5mlHCl，20ml10％硫尿，最后定容至刻度。
表3原子熒光光譜法測定砷含量(n＝3)樣品 As含量 As2S2含量純化雄黃 70％ 99.86％
急性毒性實驗參照文獻方法(陳奇(Chen Q)主編.中藥藥理研究方法學[M].第一版.北京人民衛生出版社，1993.112-115)，取昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18-20g，隨機分為5組，組間劑量比為1∶0.7，ig(0.2ml/10g)，觀察動物出現蜷臥、聳毛，死亡時間從給藥后0.5h開始，死亡后剖檢有無明顯可見的病理變化。而純化雄黃給予25g/kg的劑量，7天內飲食飲水正常，生長狀況良好，皮毛光澤，活動度好，外觀、行為等均無異常表現，無一死亡，尸檢無肉眼可見性病變。實驗表明天然雄黃的急性毒性是與劑量成正比，劑量越大，毒性越大，當天然雄黃用量達8.4g/kg時，10只小鼠全部死亡。但是，采用本發明的純化雄黃，即使劑量高達天然雄黃最高用量的2.98倍，仍無一只小鼠死亡。證明本發明純化雄黃降低了可溶性砷鹽的含量后，其毒性也極其顯著地降低。實驗結果見下表。
表4急性毒性比較實驗(n＝10)組 劑量(g/kg)動物死亡數天然雄黃 8.410天然雄黃 5.88 8天然雄黃 4.12 7天然雄黃 2.88 4天然雄黃 2 2純化雄黃 25 0非特異性免疫功能實驗(碳粒廓清實驗)參照文獻方法(朱保華(Zhu BH)主編.中藥藥理現代研究[M].武漢武漢出版社，1999.692-693)，取昆明種雄性小鼠50只，隨機分成5組，每組10只，給藥組分別ig雄黃0.2g/kg、0.1g/kg和純化雄黃0.2g/kg、0.1g/kg，對照組給同體積的溶媒。給藥1.5h后，小鼠尾靜脈注射40％的印度墨汁溶液0.1ml/10g，于iv后2min及10min時分別眼眶取血20μl，加入2ml 0.1％Na2CO3溶液中，搖勻，于600nm處測定其吸收值，稱體重并剖取肝、脾稱重，計算吞噬指數K(K＝lgOD1-lgOD2/10-2)和吞噬系數α(α＝K^(1/3)*體重/肝重+脾重)值，結果見下表。實驗結果表明，雄黃粗品和純化雄黃均能極其顯著性提高正常小鼠網狀內皮系統(RES)的吞噬功能，二者本身無顯著性差異。
表5天然雄黃和純化雄黃的碳粒廓清實驗(x±s，n＝10)組Dose(g/kg)K α對照組 00.028±0.0065.215±0.555天然雄黃組0.1 0.026±0.0116.251±0.801**天然雄黃組0.2 0.032±0.0056.049±0.684**純化雄黃組0.1 0.034±0.0116.244±0.769**純化雄黃組0.2 0.035±0.0056.202±0.687***P＜0.05vs control細胞免疫功能試驗(遲發型變態反應試驗)參照文獻方法(陳奇(Chen Q)主編.中藥藥理研究方法學[M].第一版.北京人民衛生出版社，1993.747)，取25-28g昆明種雄性小鼠40只，腹部刮毛，用1％PC無水乙醇100μl涂于小鼠腹部致敏。隨機分4組，每組10只，致敏同時ig蒸餾水，左旋咪唑20mg/kg，雄黃和純化雄黃0.1g/kg，1日1次，連續6日；末次給藥后3h以1％PC橄欖油30μl涂于右耳兩面進行攻擊，左耳涂等體積的橄欖油作對照，24h后測兩耳重量，以腫脹率來表示遲發型變態反應強度，以此反應細胞免疫功能，結果見表。結果表明，純化雄黃能顯著增強PC誘導小鼠遲發型變態反應，進而顯示明顯細胞免疫功能促進作用，而天然雄黃并無顯著性變化。
表6純化雄黃的遲發型變態實驗(x±s，n＝10)組別 劑量(g/kg) 腫脹率(％)對照組 0 15.83±8.312左旋咪唑組 0.02 28.023±9.667*天然雄黃組 0.122.977±3.343純化雄黃組 0.127.091±9.844**P＜0.05vs control本發明用有機酸，尤其是帶兩個或兩個以上羧基的有機酸去除天然雄黃中的水溶性砷鹽，純化前后急性毒性實驗表明純化雄黃的毒性顯著性降低，藥效實驗證明，雄黃純化后抗炎、鎮痛藥效無顯著性變化，而遲發型變態實驗表明其明顯藥效增加。總之，所純化的雄黃活性無顯著變化，毒性顯著降低，可以較大劑量使用，具有良好的醫藥應用前景。
本發明僅需要考慮有機酸的濃度和溫度，例如草酸，砷與草酸的絡合反應與溫度有關，本發明不需要多次重復，用有機酸處理后只需少量的水洗滌既可得高純度的純化雄黃。有報道傳統水飛法中用水量越大處理的雄黃純度越高，本發明無須用大量的水，同時保證其純度。
具體實施方法天然雄黃來源購至湖南藥材公司(塊狀)實施例1稱取1.88g天然雄黃，置于燒杯中，加入4％甲酸溶液20ml，40℃時不斷的攪拌30分鐘，過濾，殘渣用酸洗滌2次，每次10ml，攪拌10分鐘，最后將洗液濾液合并，置500ml容量瓶中定容至刻度，吸取5ml置50ml容量瓶中定容至刻度，精密吸取2ml于60ml具塞三角瓶中，參照中國藥典2000版附錄IX Ag(DDC)的測定方法測定可溶性砷鹽含量，結果顯示每克天然雄黃中去除可溶性砷鹽(三氧化二砷)25.03mg。獲得純化雄黃1.81g，去除可溶性砷鹽0.05g。
實施例2稱取1.88g天然雄黃，置于燒杯中，加入3％甲酸溶液30ml，35℃時不斷的攪拌30分鐘，過濾，殘渣用酸洗滌2次，每次10ml，攪拌10分鐘，最后將洗液濾液合并，置500ml容量瓶中定容至刻度，吸取5ml置50ml容量瓶中定容至刻度，精密吸取2ml于60ml具塞三角瓶中，參照中國藥典2000版附錄IX Ag(DDC)的測定方法測定可溶性砷鹽。結果顯示每克天然雄黃中去除可溶性砷鹽(三氧化二砷)24.03mg。獲得純化雄黃1.82g，去除可溶性砷鹽0.05g。
實施例3稱取1.88g天然雄黃，置于燒杯中，加入5％草酸溶液50ml，50℃時碾磨后攪拌40min，過濾，殘渣用酸洗滌2次，每次10ml，攪拌10分鐘，最后將洗液濾液合并，置500ml容量瓶中定容至刻度，吸取5ml置50ml容量瓶中定容至刻度，精密吸取2ml于60ml具塞三角瓶中，參照中國藥典2000版附錄IX Ag(DDC)的測定方法。測定可溶性砷鹽。結果顯示每克天然雄黃中去除可溶性砷鹽(三氧化二砷)34.35mg。獲得純化雄黃1.80g，去除可溶性砷鹽0.06g。
實施例4稱取1.88g天然雄黃，置于燒杯中，加入5％草酸溶液50ml，35℃時碾磨后攪拌40min，過濾，殘渣用酸洗滌2次，每次10ml，攪拌10分鐘，最后將洗液濾液合并，置500ml容量瓶中定容至刻度，吸取5ml置50ml容量瓶中定容至刻度，精密吸取2ml于60ml具塞三角瓶中，參照中國藥典2000版附錄IX Ag(DDC)的測定方法。測定可溶性砷鹽。結果顯示每克天然雄黃中去除可溶性砷鹽(三氧化二砷)32.65mg。獲得純化雄黃1.81g，去除可溶性砷鹽0.06g。
實施例5稱取1.88g天然雄黃，置于燒杯中，加入7％檸檬酸溶液的80ml，80℃時不斷的攪拌30分鐘，過濾，殘渣用酸洗滌2次，每次10ml，攪拌10分鐘，最后將洗液濾液合并，置500ml容量瓶中定容至刻度，吸取5ml置50ml容量瓶中定容至刻度，精密吸取2ml于60ml具塞三角瓶中，參照中國藥典2000版附錄IX Ag(DDC)的測定方法測定可溶性砷鹽。結果顯示每克天然雄黃中去除可溶性砷鹽(三氧化二砷)32.41mg。獲得純化雄黃1.80g，去除可溶性砷鹽0.06g。
權利要求
1.一種高純度雄黃的制備方法，其特征在于用含一種或兩種以上有機酸的水溶液與天然雄黃混合，溫度25-95℃，放置后，濾去酸水液，取雄黃用水洗滌，所述有機酸不包括單獨使用乙酸。
2.權利要求1的制備方法，其特征在于所述有機酸包括帶兩個或兩以上羧基的有機酸。
3.權利要求1的制備方法，其特征在于所述有機酸選自檸檬酸、甲酸、草酸或者它們的混合物，或者它們與乙酸的混合物；含有機酸的水溶液中酸的濃度為≥1％。
4.權利要求3的制備方法，其特征在于含有機酸的水溶液中酸的濃度為2-60％。
5.權利要求4的制備方法，其特征在于含有機酸的水溶液中酸的濃度為2-10％。
6.權利要求1的制備方法，其特征在于用有機酸的水溶液與天然雄黃混合，溫度30-85℃。
7.權利要求6的制備方法，其特征在于用有機酸的水溶液與天然雄黃混合，溫度40-60℃。
8.權利要求1的制備方法，其特征在于用有機酸的水溶液與天然雄黃混合碾磨后，攪拌10-100分鐘，酸水液體積為每克天然雄黃用5-100毫升的酸水液。
9.權利要求8的制備方法，其特征在于用有機酸的水溶液與天然雄黃混合碾磨后，攪拌20-70分鐘，酸水液體積為每克天然雄黃用10-80毫升的酸水液。
10.權利要求9的制備方法，其特征在于取1克天然雄黃，用4-40％草酸溶液20-60ml，50℃時碾磨后攪拌40分鐘后，濾去酸水液，然后用水洗滌雄黃。
全文摘要
一種高純度雄黃的制備方法，包括用含一種或兩種以上有機酸尤其是草酸的水溶液與天然雄黃混合,溫度25℃－95℃，放置后，濾去酸水液，取雄黃，用水洗滌，無需大量用水，即可獲得純度在99％以上硫化砷，經毒理學研究證明毒性顯著降低，所述有機酸不包括單獨使用乙酸。
文檔編號A61K33/36GK1557334SQ20041001389
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月13日 優先權日2004年1月13日
發明者余伯陽, 張偉, 劉吉華, 嚴永清, 寇俊萍 申請人:中國藥科大學