專利名稱：含干擾素或其類似物的注射用緩釋微球及其制備方法
技術領域：
本發明涉及干擾素或其類似物的注射用緩釋微球及其制備方法。
背景技術：
經檢索發現，干擾素或其類似物或鹽的制劑有口含片、溶液劑、注射劑、貼劑、軟膏劑等，這些劑型或由于干擾素或其類似物的半衰期較短，導致消除較快，或由于非局部使用而使得藥物在局部的藥量偏低且全身毒副作用大，臨床應用受到很大限制。
發明內容
本發明要解決的技術問題，即本發明目的，是提供一種干擾素或其類似物的注射用緩釋微球。
經過長時間的研究，本發明的發明人發現，將占微球重量的0.1～10％(w/w)的干擾素或其類似物和50～99.9％(w/w)分子量在5，000～70,000道爾頓之間的可生物降解和生物可相容性的藥用高分子材料通過適合方法制成注射用緩釋微球，能夠實現本發明的上述目的。
因此，本發明提供了一種注射用緩釋微球，其特征在于它包括以微球重量計0.1～10％(w/w)的干擾素或其類似物和50～99.9％(w/w)分子量在5,000～70,000道爾頓之間的可生物降解且具有生物相容性的藥用高分子材料，所述微球的平均粒徑在10～100μm之間。
本發明的注射用緩釋微球可通過以下方法中的任一方法制備。
復乳法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物和穩定劑溶解或混懸于含非離子型乳化劑的水溶液中后，加入到含所述藥用高分子材料的有機溶液中，經處理后，再加入到含非離子型乳化劑的外水相中形成微球。
無水法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物及其穩定劑的微粉加入到含高分子材料的有機溶劑中，經水浴超聲混懸后再加入到一定量的棉子油中，用分散相萃取使其固化成微球，然后加入輕質石油醚，使微球固化完全。
低溫噴霧提取法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物粉末懸浮在溶有高分子材料的有機溶劑中，通過噴霧形成小液滴，在液氮中冷凍，用低溫有機共溶劑抽提溶解聚合物而制得。
相凝聚法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物分散于適用的高分子材料溶液后，往該溶液中加入凝聚劑，使高分子材料溶解度降低而析出，形成良好的微球。
本發明的緩釋微球還可以通過先將干擾素或其類似物制備成脂質體后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球的方法制成。
本發明的緩釋微球還可以通過先將干擾素或其類似物制備成納米粒后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球的方法制成。
本發明的緩釋微球還可以通過將干擾素或其類似物溶液加入到微粉硅膠中，被微粉硅膠充分吸附后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球的方法制成。
本發明所述的干擾素及其類似物包括α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、各種干擾素的鹽、PEG化、甲基化及用其它基團進行修飾的各種干擾素衍生物。
本發明所述藥用高分子材料為明膠、白蛋白、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-3-羥基丁酸酯、聚鄰酯、聚酐、聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物、聚丙烯葡聚糖、聚內酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PBG)、羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚羥乙酸-聚乙二醇中的一種或其中的兩種或兩種以上的混合物。
優選聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、或聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物。
更優選分子量在5,000～70,000道爾頓之間的聚乳酸-羥基乙酸共聚物，其中乳酸與羥基乙酸的比例為20∶80～80∶20，或者分子量在5,000～70,000道爾頓之間的聚丙交酯-乙交酯，其中丙交酯和乙交酯的聚合比例為20∶80～80∶20。
根據本發明的微球還可包括藥物上可接受的蛋白穩定劑、表面活性劑和其他添加劑。
所述蛋白穩定劑選自HSA、甘露醇、海藻糖、EDTA、Zn鹽、Mg(OH)2、CaCO3、ZnCO3等。
所述表面活性劑選自泊洛沙姆、卵磷脂、聚乙二醇2000或聚乙二醇5000等。
所述其他添加劑選自微粉硅膠、攜帶陽性離子的物質如氨基酸等。
本發明干擾素或其類似物的微球制劑包封率大于75％，且可持續釋放15天、30天或60天左右，減少了用藥次數，提高了生物利用度，降低了全身的毒副作用，增加了患者順從性。
圖1為實施例1中微球的體外累積釋放曲線。
圖2為實施例2中微球的體外累積釋放曲線。
圖3為實施例3中微球的體外累積釋放曲線。
圖4為實施例6緩釋7天的微球的體外釋放曲線。
圖5為實施例9緩釋7天的微球的體外釋放曲線。
圖6為實施例10緩釋7天的微球的體外釋放曲線。
圖7為實施例7緩釋30天的微球的體外釋放曲線。
圖8為實施例8緩釋30天的微球的體外釋放曲線。
圖9為實施例1中微球在小鼠體內的生物活性～時間曲線。
具體實施例方式
以下通過實施例來進一步說明本發明所述干擾素或其類似物的注射用緩釋微球的制備方法。
實施例1復乳法制備α-干擾素微球將一定量的α-干擾素(約5mg，與Zn2+結合后)溶解于0.5ml 20mg/ml明膠溶液(含10％海藻糖)中，經5000rpm攪拌30s后，加入到含150mg PLGA的二氯甲烷溶液1.25ml中，在5000rpm的轉速下攪拌2分鐘，然后加入到20ml含6％PVA的水溶液中，以200rpm速度磁力攪拌5分鐘，然后再加入到含2％的PVA的500ml水溶液中，攪拌進行溶劑揮發，然后洗滌、離心、冷凍干燥，收集即得。微球的平均粒徑為32μm、載藥量為2.95％、包封率為97.34％。
實施例2復乳法制備β-干擾素微球將一定量的α-干擾素(約5mg，與Zn2+結合后)溶解于0.5ml 20mg/ml明膠溶液(含2％CaCO3微粉)中，經5000rpm攪拌30s后，加入到含60mg PLGA(分子量為5000)的二氯甲烷溶液0.25ml中，在5000rpm的轉速下攪拌2分鐘，然后加入到10ml含6％PEG的水溶液中，以200rpm速度磁力攪拌5分鐘，然后再加入到含2％的PEG的200ml水溶液中，攪拌進行溶劑揮發，然后洗滌、離心、冷凍干燥，收集即得。
實施例3復乳法制備γ-干擾素微球將一定量的γ-干擾素(約5mg，與Zn2+結合后)溶解于0.5ml 20mg/ml明膠溶液(含10％EDTA等)中，經8000rpm攪拌30s后，加入到含150mg PLGA(分子量為1000)的二氯甲烷溶液1.25ml中，在3000rpm的轉速下攪拌2分鐘，然后加入到20ml含6％PEG的水溶液中，以200rpm速度磁力攪拌5分鐘，然后再加入到含2％的PEG的500ml水溶液中，攪拌進行溶劑揮發，然后洗滌、離心、冷凍干燥，收集即得。
實施例4無水法制備α-干擾素微球將PLGA約150mg溶于乙腈1ml中，然后向其中加入α-干擾素微粉微粉約10mg，經水浴超聲30s混懸后加入到205ml的棉子油(含泊洛沙姆等作為乳化劑)中，2000rpm攪拌乳化2分鐘，用分散相不斷萃取乳滴中的乙腈溶液使其固化成微球，然后加入輕質石油醚(沸點60-90℃)，繼續攪拌使微球固化完全，離心、石油醚洗滌、冷凍干燥即得。
實施例5無水法制備ω-干擾素微球將PLGA約150mg溶于乙腈1ml中，然后向其中加入ω-干擾素的微粉5mg，經水浴超聲30s混懸后加入到30ml的棉子油(含卵磷脂作為乳化劑)中，2000rpm攪拌乳化2分鐘，用分散相不斷萃取乳滴中的乙腈溶液使其固化成微球，然后加入輕質石油醚(沸點60-90℃)，繼續攪拌使微球固化完全，離心、石油醚洗滌、冷凍干燥即得。
實施例6低溫噴霧提取法制備α-干擾素微球將α-干擾素粉末約5mg懸浮在溶有100mgPLGA的二氯甲烷溶液1ml中，通過噴霧得方法形成小液滴，在液氮中冷凍，并用有機共溶劑乙醚抽提溶解聚合物的二氯甲烷即得。
實施例7先制成脂質體后再包裹成徼球采用薄膜分散法制備出α-干擾素脂質體，然后將相當于5mg干擾素的脂質體粉末加入到100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液1ml中，經超聲30s混懸后加入到5％PVA的水溶液15ml中，以約2000rpm的轉速進行攪拌2min后加入到200ml的1％PVA溶液中，以低轉速繼續攪拌4h后，洗滌、離心、冷凍干燥即得。
實施例8先制成納米粒后再包裹成微球采用天然高分子法制備成α-干擾素納米粒凍干粉后，加入到50mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液1ml中，攪拌0.5min混懸后加入到5％PVA的水溶液15ml中，以約2000rpm的轉速進行攪拌2min后加入到200ml的1％PVA溶液中，以低轉速繼續攪拌4h后，洗滌、離心、冷凍干燥即得。
實施例9經微粉硅膠吸附后再包裹成微球先將α-干擾素緩沖液加入到微粉硅膠中，被微粉硅膠充分吸附后，加入甘露醇等凍干保護劑，冷凍干燥制備成凍干粉后，取約相當于5mg干擾素的量加入到100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液中，超聲混懸30s后加入到5％PVA水溶液15ml中，以約2000rpm的轉速攪拌乳化2min后加入到1％PVA溶液中，以低轉速繼續攪拌4h，揮發溶劑，洗滌、離心、冷凍干燥后即得。
實施例10相凝聚法制備微球將α-干擾素凍干粉或α-干擾素溶液約5mg適量加入到150mg/ml的PLGA二氯甲烷溶液中，以約2000rpm的轉速攪拌30s后，降低轉速為1000rpm，并注入硅油。相分離后，將混懸液轉入500ml的己烷中，恒溫20℃以約300rpm的轉速攪拌30min后，收集微球，500ml己烷洗滌，冷凍干燥即得。
微球粒徑的測定試驗樣品根據本發明實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10方法制備的微球。
實驗儀器帶刻度目鏡的光學顯微鏡或激光粒度測定儀。
實驗方法光學顯微鏡測定將微球粉末均勻分散后在顯微鏡(激光計數器)下觀察以上個實施例微球，并記下微球粒徑，微球總數不少于200個，對數據進行統計處理，考察微球的平均粒徑及粒徑分布情況。
激光粒度測定儀測定稱取適當實驗樣品，使用激光粒度測定儀進行測定。
微球載藥量和包封率的測定試驗樣品根據本發明實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10方法制備的微球。
實驗試劑BCA蛋白含量測定試劑盒、NaOH、SDS實驗儀器紫外分光光度計、渦漩儀、離心機實驗方法精密稱取實驗樣品約10mg，加入5.0ml 0.1MNaOH/0.5SDS(w/v)的混合溶液中，37℃水浴振蕩24h，使微球完全溶解，加2M HCL約280μl調pH約7.0，進行BCA法蛋白含量測定。
微球的突釋和釋放曲線的測定實驗樣品根據本發明實施例1、4、6所述的方法制備的微球。
實驗試劑pH為7.4的磷酸緩沖液(含0.02％疊氮化鈉作為抑茵劑，0.02％F-68潤濕劑作為釋放介質)
實驗儀器恒溫振蕩儀、離心機、HPLC儀。
實驗條件溫度37℃，轉速rpm。
實驗方法精密稱取含藥微球10～30mg置10ml離心管中，加入1.5ml 10mM pH7.4緩沖液，置于恒溫水浴搖床中，在100rpm振蕩速度、37℃±0.5℃溫度條件下進行微球的體外釋放度測定。
取樣方法分別在2h、1d、2d取出離心管，于2000rpm離心10min，將全部釋放介質取出并更換新的釋放介質，以后每隔3～4天同以上操作方法取樣一次，并用BCA法測定IFN的含量。
微球在小鼠體內的緩釋性質測定實驗樣品根據本發明實施例1、2、3所述的方法制備的微球。
實驗動物昆明種小鼠實驗方法取健康昆明種小鼠，隨機分組后，靜脈給予rIFNα的微球溶液，劑量為1.5×104kU rIFNα/kg，于給藥后0、1、2、5、8、10、12、15天眼眶取血，血樣經3000rpm離心15min后，取上清夜測定其中IFN-α生物活性。
IFN-α生物活性的測定方法實驗樣品血漿樣品。
實驗儀器冷凍干燥機、離心機。
實驗方法將WISH細胞經0.25％胰酶消化，用完全培養液配成2.5×105～3.5×105個細胞/ml，接種于96孔細胞培養板，每孔100μl。37℃、5％CO2條件下培養4～6、時，棄去上清，將IFN-α樣品溶液和標準溶液進行倍比稀釋后按濃度從高到低加入1～12孔(濃度高的樣品溶液進行預稀釋)，同時設立細胞對照和病毒對照以及樣品空白對照。同樣條件培養18-24小時，棄去上清，加入VSV攻毒培養液(劑量100TCID50)100μl，攻毒24小時，倒置顯微鏡下鏡檢細胞50％病變點，計算IFN-α效價。
權利要求
1.一種注射用緩釋微球，其特征在于它包括以微球重量計0.1～10％(w/w)的干擾素或其類似物和50～99.9％(w/w)分子量在5,000～70,000道爾頓之間的可生物降解且具有生物相容性的藥用高分子材料，所述微球的平均粒徑在10～100μm之間。
2.按照權利要求1的注射用緩釋微球，其中所述藥用高分子材料選自明膠、白蛋白、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-3-羥基丁酸酯、聚鄰酯、聚酐、聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物、聚丙烯葡聚糖、聚內酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚羥乙酸-聚乙二醇中的一種或其中的兩種或兩種以上的混合物。
3.按照權利要求2的注射用緩釋微球，其中所述藥用高分子材料為聚乳酸-羥基乙酸共聚物，其中分子量在5,000～70,000道爾頓之間，乳酸與羥基乙酸的比例為20∶80～80∶20；或聚丙交酯-乙交酯，其中分子量在5,000～70,000道爾頓之間，丙交酯與乙交酯的比例為20∶80～80∶20。
4.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物和穩定劑溶解或混懸于含非離子型乳化劑的水溶液中后，加入到含所述藥用高分子材料的有機溶液中，經處理后，再加入到含非離子型乳化劑的外水相中形成微球。
5.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物及其穩定劑的微粉加入到含高分子材料的有機溶劑中，經水浴超聲混懸后再加入到一定量的棉子油中，用分散相萃取使其固化成微球，然后加入輕質石油醚，使微球固化完全。
6.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物粉末懸浮在溶有高分子材料的有機溶劑中，通過噴霧形成小液滴，在液氮中冷凍，用低溫有機共溶劑抽提溶解聚合物而制得。
7.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于先將干擾素或其類似物制備成脂質體后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球。
8.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于先將干擾素或其類似物制備成納米粒后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球。
9.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將干擾素或其類似物溶液加入到微粉硅膠中，被微粉硅膠充分吸附后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球。
10.一種制備權利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素或其類似物分散于適用的高分子材料溶液后，往該溶液中加入凝聚劑，使高分子材料溶解度降低而析出，形成良好的微球。
全文摘要
本發明涉及干擾素或其類似物的注射用緩釋微球及其制備方法。該緩釋微球包括以微球重量計，0.1～10％(w/w)的干擾素或其類似物和50～99.9％(w/w)分子量在5,000～70,000道爾頓之間的可生物降解和生物可相容性的藥用高分子材料。它可以采用W/O/W法、S/O/O法、噴霧干燥法等方法制備。本發明的微球制劑包封率大于75％，且可持續釋放15天、30天或60天左右，減少了用藥次數，提高了生物利用度，降低了全身的毒副作用，增加了患者順從性。
文檔編號A61K9/16GK1754570SQ200410012069
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月28日 優先權日2004年9月28日
發明者梅興國 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所