新的人胚胎肝源性因子的制作方法

專利名稱：新的人胚胎肝源性因子的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有促肝細胞增殖活性的細胞生長因子，特別是涉及衍生于人胚胎肝組織的新的人胚胎肝源性因子，其分離和純化方法，以及所說的因子在維持胎肝細胞擴增和傳代培養、促進肝細胞再生和治療損傷相關疾病以及構建人工肝臟中的應用。
背景技術：
從受精開始，胚胎的發育始終是細胞內合成活性物質的直接或間接結果。胚胎發育最重要的一個方面就是調節這些特殊的蛋白質和其他大分子物質的合成。尋找到這些特殊的發育信號，對它們進行組織定位，確定它們出現的時間，對深入了解胚胎的發育與組織再生都有著非常重要的意義。在胚胎發育過程中，最重要的不是個別基因的表達，而是這些表達產物、即各種蛋白質在時間和空間上的聯系與配合。
胚胎從一個細胞(受精卵)發育為(5～7)×1012個細胞構成的足月胎兒，是一個極其復雜的動態變化的過程。在這個過程中，各臟器并非是從開始即呈現出該器官成熟狀態下的典型結構與功能，它們經歷從細胞到組織到成體結構器官這樣一個從量變到質變的發育過程。
肝臟作為人體的一個重要器官，其發育過程是一個多階段的連續的復雜變化過程，并且受到激素、生長因子和細胞外基質等多種因子的調節和控制。目前已知有多種因子與肝臟的形成及損傷修復過程密切相關。這些因子可以出現在組織發生發育的不同階段，或促進細胞增殖，或促進細胞分化或誘導肝細胞凋亡，從而對肝組織的生理和病理性再生發揮嚴格的調控作用。
研究結果表明，人們多年來所尋找的促進肝組織再生的活性物質并不只是最初所預料的單一物質，而是多種因子的集合體，這些因子通過不同的作用方式或途徑，在肝組織發生和再生的不同階段發揮各自的作用(Imai K et al.，Hepatol.Res.27(4)302-308，2003；Kusaka K etal，J.Physiol.248273-284，1975)。目前已知的參與肝細胞增殖分化過程的物質包括肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子α(TGF-α)、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)，以及胰島素、地塞米松、制瘤素M(OSM)和去甲腎上腺素等，這些物質通過內分泌、自分泌或旁分泌途徑調節并控制肝細胞的增殖與分化(Richman，R.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1976，733589-3593；Kang YH，et al.Exp Cell Res.2004；293(2)239-47；George K.et al.，1997，276(5309)60)。
雖然目前對發育完善的成熟肝組織細胞的增殖與分化過程及相關調控因子已有了比較深入的了解，但人們對胚胎肝臟特別是發育早期肝臟功能和結構以及肝細胞增殖與分化過程和相關調控因子的卻知之甚少。
因此，深入了解胚胎發育期間肝細胞群落形成的影響因素以及這些因素對肝細胞自身和其他細胞、組織和器官發育的作用將是十分必要的。特別是，進一步發現并深入研究影響肝細胞生長和分化的可能因子，必將有利于認識肝組織和器官形成、發育的調控機理，同時也可能為肝細胞損傷相關疾病的治療提供新的治療劑。
發明目的本發明的一個目的是提供一種新的人胚胎肝源性因子(hELF)，特征在于所說的因子在聚丙烯酰胺凝膠電泳中測得的表觀分子量為大約30KD，具有極好的耐熱和耐酸堿能力和極好的促進肝細胞及其他組織來源細胞的體外增殖和分化活性。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的耐熱和耐酸堿能力是指于60℃放置2小時或于100℃加熱15分鐘，或于pH 1.0至pH 12.0條件下處理，該因子均不喪失其生物學活性。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的肝細胞是指人肝細胞和肝腫瘤細胞。
本發明的另一個目的是提供一種分離和純化如上限定的人胚胎肝源性因子的方法，該方法包括分離6-12周齡人胚胎肝組織勻漿的上清；經用丙酮分級沉淀后收集沉淀物并超濾；收集分子量大于10,000的蛋白質，使用陰離子交換柱進行反復(兩次)柱層析純化后，得到所需的人胚胎肝源性因子。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中用于分級沉淀的丙酮濃度分別為45％和65％(V/V)。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中超濾所用透析膜的截留分子量為10,000道而頓。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中陰離子交換層析柱是Mono S。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所得到的胚胎肝衍生的細胞生長因子的純度大于95％。
本發明的再一個目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在構建正常人胚胎肝細胞系和人工肝臟中的應用。
本發明的再一個目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在治療肝細胞損傷性疾病中的應用。
本發明的再一個目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在促進人胚胎肝細胞增殖和人胚胎肝細胞傳代培養中的應用。
附圖簡要說明

圖1顯示第一次離子交換層析的洗脫曲線。整個洗脫過程中出現兩個主峰(第5-18ml)，并確定促細胞增殖活性出現在洗脫的第2峰(第16-17ml)。
圖2顯示第二次離子交換層析的洗脫曲線。整個洗脫過程中出現兩個主峰(第13-24管)，并確定第一峰為活性峰(第15和16ml)。
圖3顯示本發明純化產物的十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。其中泳道1為分子量標準品，泳道2為第一次層析后收集的活性部分，泳道3為第二次層析后收集的活性部分。
圖4顯示在hELF作用下HepG2細胞增殖的經時變化。
圖5顯示本發明的hELF對肝腫瘤細胞系增殖的影響。肝腫瘤細胞系HepG2在含有2％NBCS的DMEM培養基中平面培養5天。其中圖5a顯示未加hELF的對照組HepG2細胞的生長狀態(100×)可見細胞增殖緩慢，多單個存在，細胞克隆形成率低，克隆體積小。圖5b顯示培養基中添加hELF的實驗組HepG2細胞的生長狀態(100×)，可見細胞增殖旺盛，克隆形成率高且克隆體積較大，部分克隆發生匯合。圖5c和5d分別為對照組和實驗組HepG2細胞的高倍(200×)顯微鏡檢照片(參見實施例2)。
圖6顯示本發明的hELF對人胚胎肝細胞系增殖的影響。人胚胎肝細胞在含有2％NBCS的DMEM培養基中平面培養12天。其中圖6a顯示培養基中未加hELF的對照組人胚胎肝細胞的生長狀態可見細胞多為成纖維細胞樣增殖，失去肝細胞的典型形態，并且發生了細胞融合(100×)。圖6b顯示培養基中添加hELF的實驗組人胚胎肝細胞的生長狀態可見細胞仍維持肝細胞的典型形態，并有大的肝細胞克隆形成(100×)。
圖7顯示本發明的hELF對培養的Hela細胞增殖的影響。Hela細胞在含有0.3％NBCS的DMEM培養基中平面培養3天。其中圖7a顯示培養基中未加hELF的對照組Hela細胞(0.3％NBCS)的正常形態和生長狀態(200×)。圖7b顯示培養基中加hELF的實驗組Hela細胞的旺盛生長和增殖狀態(200×)。
發明的具體內容本發明涉及具有肝細胞增殖活性的細胞生長因子，特別是涉及衍生于人胚胎肝組織的新的人胚胎肝源性因子(hELF)，其分離和純化方法，以及所說的因子在促進肝細胞再生和治療損傷相關疾病，以及構建正常人胚胎肝細胞系和人工肝臟中的應用。
一般說來，肝臟在胚胎第12周才由前體細胞發育為分化良好的器官，此時它并不具備成熟肝臟的功能。肝臟在胚胎發育20周之后構建其自身的結構，并在此時才開始逐漸發育出成熟肝臟的復雜的代謝功能。成年人的肝臟具有血漿蛋白的合成、脂肪生成、解毒功能、尿素合成等許多的代謝功能。然而，目前人們對胚胎發育早期肝臟的功能和結構以及發生和發育卻了解甚少。
為了深入了解和分析胚胎肝組織發育和再生的機理，進一步找出受損肝組織的強大再生能力的影響因素和生物化學基礎，本發明人基于長期從事組織再生特別是肝組織再生學研究的實踐，從6-12周齡人胚胎肝組織中分離并純化得到了一種我們稱之為“人肝胚胎肝源性因子”(hELF)的蛋白質物質。在此基礎上，本發明人進一步分析了該物質的理化性質、制備了相應的單克隆抗體并深入研究了該物質的體外生物學活性和其可能的臨床應用，從而完成了本發明。
首先，我們使用從健康人6-12周齡人工流產胚胎分離的肝組織作為材料來源，以常規的化學和生物化學方法由所述的材料分離并純化得到一種對熱和強酸強堿環境均異常穩定的，分子量大約30 KD的蛋白質物質(參見實施例1)。對該物質的進一步生物學活性分析結果顯示，在含新生牛血清(NBCS)的DMEM基本培養基中，本發明得到的這種蛋白質不僅可以顯著地促進體外培養的原代人胚胎肝細胞的增殖和分化，而且對肝癌HepG2細胞和SSMC-7721細胞、小鼠乳腺癌D2F2細胞以及人宮頸癌Hela細胞等腫瘤細胞系均有顯著地生長促進作用(參見實施例2，3，5)。因此，本發明人將該蛋白質定名為“人胚胎肝源性因子”(hELF)。
另外，我們使用肝癌HepG2細胞和SSMC-7721細胞作為靶細胞，以常規噻唑藍比色法(MTT法)檢測本發明的人胚胎肝源性因子對肝癌HepG2細胞和SSMC-7721細胞(作為靶細胞)增殖的影響，結果令人驚奇地發現，由第7至12周齡胚胎肝組織分離的粗提物可以刺激和促進靶細胞的生長，而由大于12周齡胚胎肝組織分離的粗提物則表現有明顯地抑制靶細胞生長并促進細胞凋亡活性。這些實驗結果表明，本發明的hELF在胚胎發育的不同階段可能有不同的表達水平。
為了制備本發明的人胚胎肝源性因子，例如可以首先將胚胎肝組織剪碎制備組織勻漿并離心收集上清。分別用45％和65％(V/V)的丙酮分級沉淀后收集沉淀物。然后使用截留分子量為10,000道爾頓的超濾膜進行超濾。收集分子量大于10,000道爾頓的蛋白質，使用Mono S陽離子交換層析柱進行反復(兩次)層析純化，最終得到純度大于98％、總活性回收率約為9.3％的本發明的人胚胎肝源性因子(hELF)。
使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對如此得到的生物學活性蛋白質的分析結果表明，該蛋白質的表觀分子量約為30KD。進一步的理化性質分析顯示，本發明的hELF在60℃下放置2小時或于100℃加熱處理15分鐘后，該蛋白質仍保留其固有的活性。另外，分別用1M HCL(pH 1)或1M NaOH(pH 12)處理24小時后，本發明的hELF亦不喪失其活性。因此可以認為，本發明的hELF對熱和極端酸性或堿性條件均表現有良好的穩定性。
體外生物學鑒定結果顯示，在含不同濃度新生牛血清(NBCS)的DMEM基本培養基中，本發明的hELF具有顯著地增加人胚胎肝細胞的數目、維持正常肝細胞形態和細胞生長活力的作用。另外，我們實驗還發現，本發明的hELF還可顯著地促進腫瘤細胞系(例如肝癌HepG2細胞和SSMC-7721細胞、小鼠乳腺癌D2F2細胞以及人宮頸癌Hela細胞等)生長增殖的能力(參見實施例2和5)。
因此，可以將本發明的hELF所具有的獨特理化性質和生物學活性總結如下(1)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，顯示其表觀分子量約為30KD。
(2)是一種熱穩定的物質，60℃放置2小時或于100℃加熱15分鐘均不喪失活性。
(3)具有較強的耐酸堿能力，在pH1.0至pH12.0范圍內都具有活性，并且在堿性條件下活性增強。
(4)對尿素不敏感。
(5)活性分布具有階段性，受到胎齡的限制。在我們收集的不同胎齡來源的樣本中，只有胎齡小于12周的組織提取物表現出極強的促肝腫瘤細胞系增殖作用。但hELF對人胚胎肝細胞增殖的促進作用不存在這種階段性，即hELF對胎齡12周以上的人胚胎肝細胞和胎齡12周以下的人胚胎肝細胞均有促增殖作用。
(6)其生物學活性表現為促進體外培養的人胚胎肝細胞、人源性肝腫瘤細胞株的增殖。但對體外培養的原代大鼠肝細胞的增殖無影響。
(7)活性不具有種屬特異性。雖然該因子對體外培養的成年大鼠肝細胞沒有增殖促進作用，但可明顯地促進小鼠乳腺癌細胞系D2F2細胞的增殖。
(8)活性不具有組織特異性，例如不僅可促進人肝腫瘤來源的細胞系HepG2細胞、SSMC-7721細胞和人胚胎肝細胞的增殖，還可明顯促進乳腺癌來源的細胞系D2F2細胞和人宮頸癌來源的細胞系Hela細胞的增殖。
(9)該因子促進胚胎肝細胞的生長表現為促進胚胎肝細胞的增殖和分化。
(10)在胚胎肝細胞體外傳代培養中發揮關鍵性細胞生長促進作用。加入此因子后，胚胎肝細胞可連續傳3-5代，并能維持肝細胞正常形態。而未加入此因子的對照組人胚胎肝細胞在傳代培養過程中迅速失去肝細胞的典型形態，不能夠傳代培養。
目前已公布的具有肝細胞增殖與肝組織再生促進功能的因子包括HGF、HSS、ALR、抑瘤素-M(OSM)、表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，轉化生長因子-α(TGF-d)等。為了進一步說明本發明的hELF是一種不同于所有目前已知的肝細胞增殖與肝組織再生促進因子的新的蛋白質，現僅就本發明的hELF在理化性質和生物學活性方面與這些已知因子的主要區別簡要比較如下。
(1)hELF與HSS及ALR的區別HSS與ALR的均來源于肝臟，但這兩種因子究竟是否為同一種物質目前還缺乏統一的認識。雖然本發明的hELF在理化性質與HSS和ALR存在有某些相同之處(例如熱穩定性，對酸堿不敏感等)，但hELF在生物學功能和分子大小上與HSS及ALR則存在很大差別。
hELF與HSS的區別HSS的分子量在12～20kD之間(LaBrecque DR.Hepatic stimulator substanceDiscovery.characteristics and mechanism of action.Dig Dis Sci.1991；36(5)669-73.)。HSS的生物活性最大特點就是具有組織特異性，即這種因子的活性作用僅限于肝源性細胞，對其它組織來源的細胞無作用。而本發明的hELF不僅可以促進肝源性細胞的增殖，同時對乳腺癌來源的細胞系和人宮頸癌來源的細胞系亦有明顯的增殖促進作用。
ALR分子的天然結構為二聚體，非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的表觀分子大小為30KD，還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時分子大小為15KD。而hELF無論是在還原還是在未還原的條件下電泳，分子量都是30KD。對于HSS與ALR的研究雖然尚存在某些不確定性，但它們之間公認的最大共同點是生物活性具有組織特異性，即這兩種因子的僅對肝源性細胞有活性，對其它組織來源的細胞無作用(Francavilla A，Hagiya M，Porter A，et al.Augmenter of Liver RegenerationItsPlace in the Universe of Hepatic Growth Factor.Hepatology，1994，20(3)747-757)。
(2)hELF與HGF的區別hELF對HepG2的生物活性作用與HGF完全相反。已知HGF抑制HepG2細胞的增殖，促進HepG2的遷移。在HepG2細胞培養物中加入HGF，可以觀察到細胞不再呈典型的克隆樣生長，而是分散單個存在，且細胞不增殖(Shiota G，Nakamura T，Schmidt EV.Hepatocyte growth factor regulates transforming growth factor alpha inHepG2 hepatic cells.Biochem Biophys Res Commun，1994，200(2)1 099-1104.)。這一現象與我們觀察到的hELF促進HepG2呈典型克隆樣增殖的現象完全相反。另外，本發明的hELF對體外培養成年大鼠肝細胞無促增殖活性，HGF具有很強的促進體外培養成年大鼠肝細胞增殖的作用。
理化性質上看，本發明的hELF具有大約30KD的分子量并且于100℃條件下加熱15分鐘不失活；而HGF的分子量約為82～85kD并且于100℃加熱3分鐘即失去活性。因此可以確定，hELF與HGF是完全不相同的兩種因子。
(3)hELF與抑瘤素-M(OSM)的區別OSM為一種28kDa的糖蛋白，對熱和酸穩定，是IL-6家族的成員。OSM可以促進胚胎肝細胞的分化，并可抑制多種腫瘤細胞的生長(低劑量OSM即可抑制乳腺癌細胞的生長)。這與hELF對乳腺癌細胞D2F2的促增殖作用相反。因此可以確定，hELF是一種不同于OSM的物質。
(4)hELF與其它生長因子的區別從以下幾方面可以明顯看出本發明的hELF與表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，轉化生長因子-α(TGF-α)和激素類物質胰島素等因子的區別(a)從分子量和理化性質上看，EGF分子量6KD，FGF分子量16～17KD，TGF-α分子量6KD，胰島素分子量5773。其中，FGF在60℃加熱5分鐘或pH＜4.0條件下將失去活性。
(b)這些因子雖然都有促進肝細胞增殖的活性，但它們的作用強度均小于hELF。
(c)胰島素主要是與其它生長因子發揮協同作用，其本身并沒有單獨促進肝細胞增殖的活性。
通過以上的比較可以看出，本發明的hELF在理化特征和生物學活性上完全不同所有已知的肝細胞特別是胚胎肝細胞增殖促進因子，是一種此前未知的生物學活性物質。
鑒于本發明的hELF的特有生物學活性，有可能將該因子作為一種關鍵性因子應用于人胚胎肝細胞系的建立、生物肝的構建、惡性腫瘤疾病的診斷或作為肝組織再生促進劑用于促進肝組織因肝切除、創傷或病原體(例如病毒)感染造成的肝組織嚴重損傷后的再生和修復。例如，可以基于本發明的人胚胎肝源性因子的刺激和促進人胚胎肝細胞生長增殖的能力，將該因子用于人胚胎肝細胞系的建立和/或擴增。在構建人工肝臟中，可以使用本發明的hELF作為外源性因子用于促進人工肝臟內肝細胞的快速生長并長期維持其典型表型。另外，在某些肝源性或非肝源性惡性腫瘤發生的情況下，可以通過檢測hELF的分布或病變組織中hELF的水平作為一種腫瘤診斷的輔助手段。特別是，在肝組織遭受各種物理、化學或生物學損傷導致肝細胞大量破壞的情況下，可以使用本發明的hELF作為治療劑，用于促進受損肝組織的盡快再生和修復。再者，也可以使用本發明的hELF作為防止或減輕肝臟損傷的有效保護劑。
下列實施例旨在結合附圖進一步舉例描述而不是限制本發明。本領域技術人員可以理解到，在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明的任何平行改變和改動都將落入本發明的待批權利要求范圍內。
實施例實施例1hELF的提取與純化從得自健康母體人工流產的約10周齡胚胎中無菌分離完整肝臟并稱重。將肝臟剪碎成3mm3大小的組織塊，然后將組織塊移至手動玻璃勻漿器中，加入D-Hanks溶液，溫和地將其破碎，直至勻漿器中無肉眼可見的肝組織塊。將勻漿液移入離心管中，4℃，3,000rpm離心15分鐘。棄去沉淀，留取組織提取物的上清(SA)，4℃保存。以上操作均在無菌條件下進行(參見D.R.馬歇克，J.T.門永，R.R.布格斯等，蛋白質純化與鑒定實驗指南，科學出版社，2000，第一版，p24-31)。
用丙酮分級沉淀(45％～65％)組織提取物上清(SA)攪拌下向上清中加入預冷的丙酮(終濃度為45％，V/V)，離心去掉不溶物后，繼續向上清中加入終濃度為65％(V/V)的丙酮。放置30分鐘后，離心棄去上清。將沉淀物重新溶解在抽出液中，用蒸餾水充分透析后凍干。然后重新溶解得到SB溶液。檢測結果可知，SB具有促進HepG2細胞和SSMC-7721細胞增殖的活性。由SA溶液到SB溶液，蛋白質純化2倍，活性回收率達到176.3％。
使用截留分子量為10,000道爾頓的透析膜，對SB溶液進行超濾處理(4℃條件下，3,000rpm，連續離心1.5小時)，直到將SB溶液的體積濃縮至原體積的1/5。然后收集超濾的溶液，得到的分子量大于10,000道爾頓的SC溶液和分子量小于10,000道爾頓的SD溶液。分別檢測這些溶液對HepG2細胞增殖的影響，確定SC溶液促進HepG2細胞增殖的作用，且其作用強度與超濾前的SB溶液無差別。而SD溶液對HepG2細胞的增殖無促進作用。
由此可以認為，人胚胎肝組織的促進細胞增殖的活性物質分子量在10,000道爾頓以上，而分子量小于10,000道爾頓的物質則沒有這種活性。
然后，進一步使用Mono S層析柱(50×5mm)對SC溶液進行離子交換層析(AKTA100型層析儀)。梯度洗脫條件是A溶液(0.20mM Tris-HCl溶液(pH 8.0)，含0.01％Tween)B溶液(含2M NaCl的A溶液)＝0％～50％，流速為1ml/分鐘。洗脫期間分別監測各管洗脫物的214nm，254nm和280nm吸光率。
第一次層析開始洗脫前，UV-280曲線在未結合部位可見1個較大的吸收峰。洗脫過程中，有3個主峰被洗脫下來。收集第7ml至第26ml洗脫液。然后將各管洗脫液的pH值調至7.2，以96孔培養板培養的HepG2細胞為靶細胞，檢測各管洗脫液的生物學活性。
第一次層析收集的洗脫液活性檢測顯示活性出現在被洗脫的第2個峰，位于洗脫體積的第14～18ml，洗脫的鹽濃度在25％～35％之間。對HepG2細胞增殖的影響，尤以16～17ml(SE)的促增殖活性作用最強(參見圖1)。
合并第一次層析得到的Mono S洗脫液(SE)的活性部分，使用Mono S離子層析柱再次進行離子交換層析分離。在未結合部位僅有1個小的280曲線吸收峰，洗脫過程中出現了2個主峰，收集為第13～24ml，經活性檢測，確定活性峰為第1個主峰，生物活性出現在第15、16ml，洗脫的鹽濃度與第一次層析結果重合(參見圖2)。
由SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可見，純化后的物質在分子量30kD的位置有一條明顯的單一的銀染色區帶(參見圖3)。第二次純化后產物純度提高11398倍，回收率約為9.3％。我們將此因子命名為人胚胎肝源性因子(hELF)。
整個分離、純化過程中產物的總蛋白含量、活性、比活性、純度和回收率變化情況如下列表1所示。
表1hELF產物純化過程中的各參數變化
實施例2hELF對肝腫瘤細胞系增殖的影響分別將HepG2細胞(購自中國科學院細胞庫)和SSMC-7721細胞(購自中國科學院細胞庫)分為空白對照組和實驗組，接種于含10％新生牛血清(NBCS)的DMEM培養基的96孔培養板的孔(8000細胞/孔)中，于5％ CO2培養箱中37℃培養。
HepG2細胞培養24小時后，將空白對照組的培養基換成含D-Hanks液(20μl)和2％新生牛血清(NBCS)的DMEM培養基，并將實驗組的培養基換成含hELF溶液(20μl，終濃度5ng/ml)的上述培養基。
繼續培養期間，實驗組HepG2細胞在加入hELF因子后的第2～3天便開始明顯增殖，細胞很快形成較多克隆。從HepG2細胞的生長過程可見，hELF對HepG2細胞的促增殖作用非常顯著。到第7天結束培養時，實驗組OD490數值達到對照組的2倍以上(參見圖4)。然而，此時對照組的細胞未見明顯增殖，幾乎沒有克隆形成。高倍鏡下可見，實驗組HepG2細胞生長狀態非常典型，細胞形態不規則，克隆內的細胞界限不清，連接緊密。培養至第5天時，鏡下可見對照組的細胞增殖緩慢，多為單個細胞或幾個細胞組成的小克隆，而實驗組的細胞克隆形成率非常高，并且克隆體積較大，部分克隆間發生匯合。實驗組與對照組的增殖狀況相比較，差異非常明顯(參見圖5a-5d)。
SSMC-7721細胞培養24小時后，將空白對照組的培養基換成含D-Hanks液(20μl)和0.3％新生牛血清(NBCS)的DMEM培養基，并將實驗組的培養基換成含hELF溶液(20μl，終濃度5ng/ml)的上述培養基。
在含0.3％ NBCS的DMEM培養基中，SSMC-7721細胞的增殖相對比較緩慢。培養第3天，對照組細胞只形成少量克隆。而培養基中添加了本發明的hELF的實驗組細胞則可見增殖迅速，并形成較大的克隆。實驗組細胞的形態與對照組細胞相近。培養7天后細胞基本長滿培養板的底部。
實施例3hELF對體外原代培養的人胚胎肝細胞增殖的影響取大約10周的胚胎，采用已知的體外膠原酶消化與機械分離相結合的方法分離肝細胞。細胞總數在5×105～7×106之間，并且多為5個細胞左右的小細胞團(細胞存活率約為60％～70％)。
所得人胚胎肝細胞懸液按比例稀釋后，以3.5×104/cm2的細胞密度接種于膠原被覆的96孔培養板和24孔培養板中，置于37℃，5％CO2培養箱中培養。培養24小時后，更換培養液。
在常規培養條件下平面培養8小時后，人胚胎肝細胞完全貼壁，呈多邊形，可見較多雙核細胞且核仁清晰。其中30％～40％的細胞處于有絲分裂狀態。培養的第8天，細胞長滿培養板底部。培養12天后，鏡下可見培養基(含2％ NBCS的DMEM)中添加hELF(20μl，終濃度5ng/ml)的實驗組胚胎肝細胞形成大片細胞克隆，細胞輪廓清晰，細胞間連接緊密并保持肝細胞的典型形態。培養皿內細胞以典型肝細胞形態的細胞為主，肝細胞克隆間偶而可見一些成纖維樣細胞的增殖。相反，此時對照組細胞發生融合，形成體積較大的融合體，每個融合體內含有多個細胞核，并且很難發現具有典型肝細胞形態特征的細胞。大片的肝細胞克隆消失，取而代之的是成纖維細胞樣細胞增殖旺盛，在培養細胞中占較大比例(參見圖6a和6b)。另外，培養5天后，在含10％NBCS的DMEM培養基中培養的實驗組細胞的數量明顯高于對照組。
以上的實驗結果表明，本發明的hELF作為人胚胎肝細胞傳代培養的一個關鍵性因子，可以在維持肝細胞的表型特征的前提下顯著地促進細胞的增殖，可使體外培養的人胚胎肝細胞連續傳代培養3-5代。相反，未加hELF的對照組細胞傳代后失去了肝細胞的典型形態，并主要表現為成纖維樣細胞增殖。
在多次重復實驗中還發現，盡管hELF來源于胎齡小于12周的胚胎肝臟，但其對胚胎肝細胞增殖的促進作用并沒有受到胎齡的限制。hELF對實驗中所取不同胎齡的多個樣本的胚胎肝細胞均表現出明顯的促增殖作用。胎齡小于和大于12周齡的胚胎肝細胞在hELF作用下的生長狀態沒有明顯差別。
實施例4hELF對體外原代培養成年大鼠肝細胞增殖的影響采用兩步原位膠原酶灌流法(Seglen PO.Exp.Cell Res.，1973；82391.)分離大鼠肝細胞。形態學檢查可見，體外培養的成年大鼠肝細胞呈典型肝細胞形態，細胞體積較大，呈多邊形，細胞核大而圓，核仁清晰可見，有雙核細胞，并且某些細胞正處于分裂狀態。將大鼠肝細胞懸液按比例稀釋后，以3.5×104/cm2的細胞密度接種于膠原被覆的96孔培養板和24孔培養板中，置于37℃，5％CO2培養箱中培養。培養24小時后，將96孔培養板中的培養液更換為含8％NBCS的Williams培養液。將96孔培養板中培養的肝細胞分為對照組和實驗組，實驗組加入hELF，終濃度為5ng/ml。培養5天后，以MTT法檢測各組細胞的增殖狀況。
結果如下列表2所示。
表2 hELF對原代培養成年大鼠肝細胞增殖的影響(x±s)
P＞0.05由表2所示數據及鏡下觀察結果可以得知，體外平面培養5天后，實驗組與對照組細胞形態及數量均無明顯差異。而且，SA、SE、hELF組與對照組比較，細胞增殖無明顯差異。這些結果表明，hELF對體外原代培養的成年大鼠肝細胞的增殖沒有明顯的促進作用。
實施例5hELF對其他組織來源的腫瘤細胞株增殖的影響人宮頸癌細胞系Hela細胞采用含10％NBCS的DMEM培養液在37℃，5％CO2培養箱中進行常規培養。每3天更換培養液。培養約4～5天，細胞長滿培養皿底部的70％～80％時進行消化傳代。將計數后的細胞懸液稀釋為6×104細胞/ml，以6,000細胞/孔的密度均勻接種于96孔培養板中。培養24小時后，將含10％NBCS的DMEM培養液更換為含0.3％NBCS的DMEM培養液(180μl/孔)。實驗組加入待測物質后，用D-Hanks溶液將每孔培養液體積補至200μl。空白對照組加D-Hanks溶液(20μl/孔)。每組設6個平行孔。結果可見，培養開始第24～48小時后，添加本發明hELF的實驗組中人宮頸癌來源的Hela細胞即表現出明顯地增殖狀態，而且與對照組相比細胞形態無差異(參見圖7a和7b)。
小鼠乳腺癌細胞系D2F2細胞采用含10％NBCS的DMEM培養液在37℃，5％CO2培養箱中進行常規培養。每3天更換培養液。培養約4～5天，細胞長滿培養皿底部的70％～80％時，進行消化傳代。將計數后的細胞懸液稀釋為6×104細胞/ml，以6,000/孔的密度均勻接種于96孔培養板。培養24小時后，將10％NBCS的DMEM培養液更換為含0.3％ NBCS的DMEM培養液(180μl/孔)。實驗組加入待測物質后，用D-Hanks溶液將每孔培養液體積補至200μl。空白對照組加D-Hanks溶液(20μl/孔)。每組設6個平行孔。
在D2F2細胞培養物中，添加hELF后也出現與Hela細胞相似的生長狀態。雖然在含0.3％NBCS的DMEM培養基中培養的D2F2細胞增殖緩慢，但添加hELF后48小時內便開始迅速增殖。至培養的第4天，與對照組相比細胞數量上的差異已經非常顯著。而且，實驗組細胞在增殖過程中始終維持D2F2細胞的典型形態，與對照組細胞形態相近。
權利要求
1.人胚胎肝源性因子，特征在于所說的因子在聚丙烯酰胺凝膠電泳中測得的表觀分子量為大約30KD，并具有極好的耐熱和耐酸堿能力和促進肝細胞及其他組織來源細胞的體外增殖和分化活性。
2.根據權利要求1的因子，其中所說的耐熱和耐酸堿難看、能力是指于60℃放置2小時或于100℃加熱15分鐘，或于pH1.0至pH12.0條件下處理，將該因子均不喪失其生物學活性。
3.根據權利要求1的因子，其中所說的肝細胞是指人肝細胞和肝腫瘤細胞。
4.分離和純化如上限定的人胚胎肝源性因子的方法，該方法包括分離8-12周令人胚胎肝細胞懸液的上清；經用丙酮分級沉淀后收集沉淀物并超濾；收集分子量大于10,000的蛋白質，使用陰離子交換柱進行反復的柱層析純化后，得到所需的人胚胎肝源性因子。
5.根據權利要求4的方法，其中用于分級沉淀的丙酮濃度分別為45％和65％(V/V)。
6.根據權利要求4的方法，其中超濾所用透析膜的截留分子量為10,000道而頓。
7.根據權利要求4的方法，其中陰離子交換層析柱是Mono S。
8.如權利要求1限定的人胚胎肝源性因子在人工肝臟構建中的應用。
9.如權利要求1限定的人胚胎肝源性因子在治療肝細胞損傷性疾病中的應用。
10.如權利要求1限定的人胚胎肝源性因子在促進人胚胎肝細胞增殖和人胚胎肝細胞傳代培養中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有肝細胞增殖活性的細胞生長因子，特別是涉及衍生于人胚胎肝組織的新的人胚胎肝源性因子，其分離和純化方法，以及所說的因子在促進肝細胞再生、治療損傷相關疾病和構建人工肝臟中的應用。
文檔編號A61P1/16GK1721441SQ200410010989
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月14日 優先權日2004年7月14日
發明者顏煒群, 胡春光 申請人:吉林圣元科技有限責任公司