人血管ibp樣生長因子的制作方法

專利名稱：人血管ibp樣生長因子的制作方法
技術領域：
本發明涉及最新鑒別的多核苷酸、由這種多核苷酸編碼的多肽、這種多核苷酸和多肽的用途以及這種多核苷酸和多肽的生產方法。本發明也涉及抑制這種多肽作用的方法。
背景技術：
本發明的多肽與生長調節劑的一個家族(包括cef 10/cyr 61、結締組織生長因子(CTGF)和nov)以及胰島素樣生長因子結合蛋白質(IBP)家族(調節胰島素樣生長因子(IGF)的活性)相關。與本發明的多肽相應的mRNA在血管細胞-類型(cell-type)中高度表達，因此，下文稱這種多肽為人血管IBP樣生長因子或“VIGF”。
生長因子和其它促細胞分裂原(包括癌基因)能迅速地誘導被某些細胞表達的一套復雜的基因(Lau，L.F.和Nathans，D.，分子水平的細胞調節，1991，6165-202)。這些基因(命名為立即早期基因或早期反應基因)在和一種生長因子或促細胞分裂原接觸后，數分鐘內即可被激活而轉錄，其不依賴于從頭蛋白合成這些立即早期基因編碼分泌性的胞外蛋白，這些蛋白對復雜的生物過程如分化、增殖、再生和創傷愈合起協調作用(Ryseck，R.P.等，細胞生長分化，1991，2235-233)。
屬于這組分泌性胞外蛋白的高度相關蛋白包括小雞的cef 10，這種蛋白是在病毒的致癌基因pp60V-STC誘導后發現的(Simmons，D.L.等，PNAS，美國，1989，861178-1182)。一種密切相關蛋白質，cyr 61，血清或血小板衍生生長因子(PDGF)能迅速激活它(O’Brien，T.P.等，分子細胞生物學，1990，103569-3577)。cef 10和cyr 61之間所有氨基酸的等同性高達83％。這個家族的第三個成員是人類結締組織生長因子(CTGF)(Bradham，D.M.等，細胞生物學雜，1991，1141285-1294)。CTGF是一種富含半胱氨酸的多肽，人類血管內皮細胞在用轉化生長因子β(TGF-β)激活后，能高水平地分泌這種多肽。CTGF顯示了類PDGF的生物和免疫學活性并和PDGF競爭一種特定的細胞的表面受體。
這種立即早期蛋白家族的第四個成員是fisp-12，血清能誘導這種蛋白產生并且已將其作圖在鼠基因組的一個區域(Ryseck，R.P.等，細胞生長分化，1991，2235-233)。這個家族的另一個成員是小雞基因nov，這種基因通常在成熟的腎細胞中獲得，并且發現其在成髓細胞血癥相關病毒1型誘導的腎胚細胞瘤中過量表達。
這些立即早期基因的表達產物在生長因子觸發的級聯反應中充當第三信使。一般認為整合和協調復雜的生物過程(如以細胞增殖為共同活動的分化和創傷愈合過程)也需要這些基因的表達產物。
這個新出現的生長調節劑家族被稱為CCN家族，這個家族由CTGF、cef 10/cyr 61和nov組成。本發明的VIGF多肽被認為是這個生長調節劑家族的一員。VIGF多肽也包含一段和胰島素樣生長因子(IGF)結合蛋白高度同源的半胱氨酸序列。
已在成人血清中鑒別了至少兩種不同的結合蛋白質，即IGF-結合蛋白53和IGF-結合蛋白1。IGF-結合蛋白對IGF既有刺激效應又有抑制效應。Clemmonsetal(J.Clin.Invest.，771548(1986))等研究表明了成纖維細胞及平滑肌細胞表面IGF受體在和其結合蛋白復合時結合增加。已經表明了IGF-結合蛋白在體外對各種IGF活動的抑制作用，這種作用包括刺激脂肪細胞的葡萄糖運輸、軟骨細胞的硫酸鹽并合和成纖維細胞中的胸苷的并合(Zapf，等，J.Clin.Invest.，1979，631077)。此外，研究表明IGF-結合蛋白質對生長因子介導的促細胞分裂劑活性具有抑制作用。

發明內容
按照本發明的一個方面，本發明提供了新的成熟多肽(其是VIGF)以及生物活性的和其診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了編碼人類VIGF的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其類似物和生物學活性的和診斷上或治療上有用的片段和衍生物。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了通過重組技術產生所說多肽的方法，這種方法包括在有利于所說的蛋白表達和隨后回收的條件下，培養含有人類VIGF核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了把這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸用于治療的方法，例如治療肌肉消耗癥(muscle wasting disease)和骨質疏松、幫助植入物固定、刺激創傷愈合或組織再生、促進血管形成、促進血管平滑肌增殖和內皮細胞產生。
按照本發明的另一個方面，本發明提供這種多肽的抗體。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了這種多肽的拮抗劑，其可用于抑制這種多肽的作用，例如在創傷愈合或肺部纖維化期間限制過量結締組織的產生。
按照本發明的另一個方面，本發明也提供了包含足夠長度的和VIGF序列特異性雜交的核酸分子的核酸探針。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了檢測與VIGF多肽表達不足和表達過量及編碼這種多肽的核酸序列中的突變相關的疾病的診斷測定方法。
從本文的教導中，本領域技術人員會清楚本發明的這些和其它方面。


下列圖是用來說明本發明實施方案，而無意于用來限制本發明權利要求所包括的范圍。
圖1顯示VIGF多肽的cDNA和相應的推導的氨基酸序列。開始的21個氨基酸代表推定的前導序列，這樣，成熟的多肽由163個氨基酸組成。用標準的單字母縮寫表示氨基酸。使用373自動DNA測序儀(應用生物系統公司)進行測序。預計測序精確度超過97％。
圖2表明了VIGF和CCN家族其它蛋白之間氨基酸序列的同源性。
圖3是一種SDS-聚丙烯酰胺凝膠，其顯示了VIGF細菌純化和電泳的結果。
圖4是一種凝膠，顯示了VIGF的Northern雜交分析結果。
圖5是一種凝膠，顯示了在所列不同組織中VIGF基因表達的細胞類型分析結果。道1是臍靜脈內皮細胞，道2是主動脈平滑肌細胞，道3是真皮包皮成纖維細胞。圖5A是露置2小時后的結果，圖5B是露置36小時后的結果。
具體實施方案按照本發明的一個方面，本發明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖1的推導的氨基酸序列的成熟多肽或由以保藏號ATCC 75874(1994年8月25日)保藏的cDNA克隆編碼的成熟多肽。
可以從人類臍靜脈和主動脈內皮細胞、主動脈平滑肌細胞、肺動脈中得到編碼本發明多肽的多核苷酸。在人類臍靜脈內皮細胞cDNA文庫中發現了本發明的多核苷酸。其在結構上與IBP和CCN家族相關。它包含一個編碼具有184個氨基酸殘基的蛋白的開放閱讀框架，其中大約起始的21個氨基酸殘基是推定的前導序列，這樣，這種成熟的蛋白包含163種氨基酸。
作為CCN生長因子和IBP兩個家族雜交成員的VIGF的標志主要基于氨基酸序列的保守性。由VIGF和CCN家族整條多肽上40-45％的相似性(全部VIGF的18個半胱氨酸有12個是保守的)和IBP特征區域(GCGCCXXCAXXXXXXC)94％的等同性(這種IBP特征在CCN家族所有成員中是相當保守的)推定VIGF和CCN家族的相似性。
VIGF多肽和IBP家族也有明顯的相似性。在第30-44(IBP特征區)和55-69氨基酸兩個鄰近區內和IBP家族至少有80％的等同性。這些區包含在推定的IBPs IGF結合區內。通過Northern雜交分析方法，確定了人類組織和細胞-類型特異性表達。使用實施例4的方法在成人肺和腎中定位了2.3-2.4kb的VLGF mRNA。在心臟、人腦、胎盤、肝臟、骨骼肌和胰臟中沒有發現VIGF基因的表達。培養的人類臍靜脈內皮和主動脈平滑肌細胞是能高水平表達VLGF mRNA的細胞-類型，而真皮的包皮成纖維細胞的表達水平則很低。總的來說，這些結果表明VIGF主要是血管起源的。
本發明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1所示的或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其能和圖1的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導或分泌序列或前蛋白序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和有或無附加的編碼序列)和非編碼序列，如內含子或編碼成熟多肽的編碼序列5′和/或3′端的非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1的推導的氨基酸序列的多肽或由保藏的cDNA克隆編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產生的多核苷酸等位變體或是非天然產生的多核苷酸變體。
這樣，本發明包括編碼如圖1所示的成熟多肽或由保藏的cDNA克隆編碼的成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1所示的成熟多肽或由保藏的cDNA克隆編碼的成熟多肽的片段、類似物和衍生物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，這種多核苷酸可以具有圖1中所示的或保藏的克隆的編碼序列的天然產生的等位變體的編碼序列。在本領域大家都知道等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，多核苷酸序列可以具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，這不會從實質上改變編碼多肽的功能。
本發明也包括這樣的多核苷酸，其中所說的編碼成熟多肽的序列可以在相同的閱讀框架中融合進多核苷酸序列，這種多核苷酸序列有助于宿主細胞中多肽的表達和分泌，比如說具有分泌序列功能的前導序列控制細胞中多肽的轉運。具有前導序列的多肽是前蛋白(preprotein)，宿主細胞切除這種前導序列形成成熟的多肽形式。這種多核苷酸也編碼蛋白原(proprotein)，這種蛋白原是5’端有附加的氨基酸殘基的成熟蛋白。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一種無活性的蛋白形式。切除前序列，留下的是有活性的成熟蛋白。
這樣，本發明的多核苷酸可以編碼一種成熟蛋白或有前序列的蛋白或既有序列原又有前序列(presequence)(前導序列)的蛋白。
本發明的多核苷酸也可以具有讀框中融合進標記序列的編碼序列，所述的標記序列使得可以純化本發明的多核苷酸，在細菌宿主的情況下，所述的標記序列可以是由pQE-9載提供的六組氨酸標記，其使得融合進標記的成熟多肽可以純化，或者例如當使用哺乳動物細胞(如COS-7細胞)時，標記序列可以是血細胞凝集素(HA)。所說的血細胞凝集標記相應于源于流感血細胞凝集素蛋白質的表位(Wilson，I.，等，細胞，37767(1984))。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(如果兩個序列之間具有至少50％，優選的具有70％的同一性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術語″嚴格條件″指僅在序列間具有至少95％，優選的具有97％的同一性時雜交才可以發生。在一個優選的實施方案中，雜交到以上所述的多核苷酸上的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實質上保持與由圖1的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽相同的生物學功能或活性。
本文所提及的保藏物按照用于專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約的規定于1994年8月25日保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC)，保藏號ATCC75874。
這些保持物僅僅是為了給本領域技術人員提供方便，并不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾，對保藏材料的任何制造，使用或者銷售需要經過許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發明還涉及具有圖1的推導的氨基酸序列的VIGF多肽或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的VIGF多肽，以及這種多肽的片段，類似物和衍生物。
術語″片段″，″衍生物″和″類似物″，當有關圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。
本發明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優選地是重組多肽。
所說的圖1的或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優選的是保守氨基酸殘基)取代并且取代的氨基酸可以是可以不是由遺傳密碼子編碼的。或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基，或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)，或者(IV)這樣一種，其中附加氨基酸融合進成熟多肽，其用來純化成熟多肽。通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物以及類似物被認為在本領域技術人員的知識范圍之內。
本發明優選提供分離型的多肽和多核苷酸，同時把多肽和多核苷酸優選純化成同質性的。
術語″分離的″意指所述的物質脫離了其原始環境(例如，天然環境，如果其是天然產生的)。例如，一種存在于活的動物中的天然產生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統中某些或全部共存的物質分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，只要這種載體或者組合物不是其天然環境的一部分其仍然是分離的。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體和用本發明的載體經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明的多肽的方法。
宿主細胞是用本發明的載體經基因工程產生的(轉導、轉化或轉染)，所說的載體可以是克隆載體或表達載體，該載體可以是例如，質粒、病毒顆粒噬菌體等形式。所說的工程宿主細胞可以在修飾的常規營養培養基中的培養，所述培養基修飾得適于激活啟動子，選擇轉化子或擴增VIGF基因。培養條件，例如pH值和溫度等，是以前用于選擇來表達的宿主細胞的那些。對普通技術人員是顯而易見的。
本發明的多核苷酸可以用來經重組技術生產多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種表達多肽的表達載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體，非染色體和合成的DNA序列，例如猿猴病毒40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質粒；從質粒和噬菌體DNA組合衍生的載體；病毒DNA(如牛痘，腺病毒，家禽痘病毒，和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復制和穩定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領域已知的方法將DNA序列插入到適當的限制性核酸內切酶位點。這樣的方法和其它方法被認為在本領域技術人員的知識范圍內。
在表達載體中的所說的DNA序列可有效連接到適當的表達控制序列(啟動子)上，以指導mRNA合成。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或猿猴病毒40啟動子，大腸桿菌、lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細胞或它們的病毒中控制基因表達的其它啟動子。所說的表達載體也包含用于翻譯起始和轉錄終止的核糖體結合位點。該載體也可以包含供擴增表達的合適的序列。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型特征，例如真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當的DNA序列以及適當的啟動子或者控制序列的載體可以用于轉變適當的宿主，以使其能夠表達蛋白質。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細菌細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如果蠅S2和Sf9；動物細胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細胞，等。通過本文的闡述，對適當的宿主的選擇被認為在本領域技術人員的知識范圍之內。
更具體地說，本發明也包括重組構建體，該構建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構建體包含載體，如質粒或病毒的載體，其中已正向或反向插入了本發明的序列。在這一實施方案的更為理想的情況下，構建體還包括可有效連接到所述序列上的調節序列，包括，例如，啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領域技術人員已知的，并且是通過商業途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體。細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)。真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質粒或載體，只要它們在宿主中可復制和穩定，都可以使用。
可以用CAT(氯霉素轉移酶的基因)載體或者其它帶有選擇性標記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區。兩種合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和完全SV40、得自逆轉錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-F。對適當的載體與啟動子的選擇健康在普通的技巧本領域的水平之內。
在另一個實施方案中，本發明涉及包含以上所述構建體的宿主細胞。所說的宿主細胞可以是高等真核細胞，如哺乳動物細胞，或低等真核細胞，如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。可以由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔有效地將構建體引入到宿主細胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學中的基本方法，(1986))。
宿主細胞中的構建體可以用來以常規方式生產由重組序列編碼的基因產物。此外，本發明的多肽可以由常規肽合成儀合成生產。
成熟蛋白質可以在哺乳動物細胞，酵母，細菌，或適當的啟動子的控制之下的其它細胞中表達，采用得自本發明的DNA構建體的RNA，無細胞翻譯系統也可以用來生產這種蛋白質。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用合適的克隆和表達載體。
高等生物編碼本發明的多肽的DNA的轉錄被插入到載體中的增強子序列增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉錄。例子包括復制起點后側100至270bp上的猿猴病毒40增強子，細胞肥大病毒早期啟動子增強子，復制起點后側上的多形瘤增強子和腺病毒增強子。
一般地，重組表達載體包括復制起點和允許宿主細胞轉化的選擇性標記(例如，大腸桿菌和啤酒糖酵母TRP1基因的氨芐青霉素抗性基因)以及源于高表達基因的指導下游結構基因轉錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，α-因子，酸性磷酸酶或熱休克蛋白質等的操縱子。異源結構序列在適當的階段與翻譯起始和終止序列裝配，優選地，與能夠指導翻譯的蛋白質分泌進周質空間或細胞外培養基的前導序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達的重組產物穩定或純化簡單。
通過與具有功能性啟動子的可操作閱讀相(poerable reading phase)中的合適的翻譯起始和終止信號一起插入編碼所需蛋白質的結構DNA序列構建用于細菌的有用的表達載體。所說載體包含一個或多個表型選擇性標記和復制起點，以保證載體的保持和在合適時在宿主內提供擴增。適合轉化的原核宿主包括大腸桿菌枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，假單胞菌屬，鏈霉菌屬，和葡萄球菌屬的各個種，雖然其它的也可以選擇來使用。
作為一個代表性的但不是限制性的例子，用于細菌的有用的表達載體可以包含源于市售質粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標記和細菌復制起點。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學品公司，Vppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322″骨架″片段與適當的啟動子和待表達的結構序列組合。
在合適的宿主菌株轉化和合適的宿主菌株生長至適當的細胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞培養另外一段時間。
典型地經離心收獲細胞，經物理或化學方法破碎細胞，保持所形成的粗產物用于進一步的純化。
可以經任何常規的方法破碎用于表達蛋白質的微生物細胞，所述方法包括凍結-解凍循環，聲處理，機械破碎或使用細胞裂解劑，這些方法是本領域技術人員知道的。
各種哺乳動物細胞培養系統也可以用于表達重組體蛋白質。哺乳動物表達系統的例子包括由Gluzman，細胞，23175(1981)，描述的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系和其它能夠表達相容載體的細胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物的表達載體包括復制起點，適合的啟動子和增強子，也可以包含任何必需的核糖體結合位點，聚腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉錄終止序列，和5’側翼非轉錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用來提供所需的非轉錄遺傳元件。
所說的VIGF多肽可以用多種方法從重組細胞培養物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和外源凝集素層析。需要時在完成成熟蛋白質的構型中可以使用蛋白質再折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發明的多肽可以是天然純化的產物，或化學合成方法的產物，經重組技術從原核或真核宿主(例如細菌，酵母，高等植物，培養的昆蟲和哺乳動物細胞)產生的。依據重組產生方法中使用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
本發明的VIGF多肽可以用于創傷愈合和與組織(如結締組織、皮膚、骨、軟骨、肌肉、肺或腎)再生有關的療法中。
可以用本發明的VIGF多肽促進具有刺激血管形成作用的血管平滑肌和內皮細胞的生長。介導的VIGF在血管形成過程中的增加有利于冠狀狹窄心臟的局部缺血組織和附屬冠狀組織的發育。
也可以利用VIGF多肽刺激植入物周圍細胞的生長，因而有利于植入物縛著在預定的位點。
也可以利用VIGF多肽增加組織中或血清IGF穩定性。也可以增加其和IGF受體的結合。既然離體條件下已顯示了IGF能提高人類骨髓紅細胞和粒細胞祖細胞的生長，因此也可以利用VIGF多肽刺激紅細胞生成或粒細胞生成。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸作為體外科學研究、DNA合成、DNA載體制造的研究試劑，并用來發展對人類疾病治療有用的治療學和診斷學的方法。
全長VIGF基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，用來分離全長VIGF基因和與VIGF基因有高度的序列類似性或類似生物活性的其它基因。這種類型的探針可以在例如20到20000堿基之間。
然而，優選的探針在30到50個堿基對之間。所說的探針也可以用于鑒別相應于全長轉錄物和基因組克隆或包含調節和啟動子區、外顯子和內含子在內的完全基因克隆的cDNA克隆。篩選的實施例包括利用已知DNA序列分離VIGF基因的編碼區，以合成寡核苷酸探針。標記的寡核苷酸具本發明基因的互補序列，可以用來篩選人類cDNA文庫、基因組DNA或mRNA，以確定探針和哪些文庫成員雜交。
本發明提供了用于鑒別VIGF受體的方法。可以用本領域技術人員已知的許多方法來鑒別編碼所說受體的基因，如配體淘選和FACS分類法(Coligan等免疫學最新草案，1(2)，第5章，(1991))。優選使用的是表達克隆，其中的聚腺苷酸RNA由對VIGF響應的細胞制備，把由所說的RNA創造的cDNA文庫劃分成不同的庫，用來轉染COS細胞或對VIGF不響應的其它細胞。生長在載玻片上的轉染細胞暴露在標記的VIGF中。VIGF可以用包括特異性位點蛋白激酶識別部位碘化或其包含體在內的各種手段標記。下列固定和培養中，載玻片易于放射自顯影分析。鑒別了陽性集合，同時利用重復亞集合(iterativesub-pooling)和再篩選(rescreen)方法制備和再轉染子集合，最終產生編碼推定受體的單克隆。
作為另一種受體鑒別方法，標記VIGF可以是光親和性的，可以和能表達受體分子的細胞膜或提取物制劑連接。用PAGE分辨交叉連接的材料并把其暴光在X光膠卷上。可以把包含VIGF-受體的標記復合物切斷、分解成易于蛋白質微測序的肽片段。從微測序中獲得的氨基酸序列可以用來設計一套簡并寡核苷酸探針以篩選用來鑒別編碼推定的受體基因的cDNA文庫。
本發明也涉及篩選化合物以鑒別模擬VIGF(刺激劑)或阻止VIGF作用的那些化合物的方法。這種方法的一個實例利用VIGF在共促分裂原ConA存在的情況下刺激內皮細胞增殖的能力。獲得人類臍靜脈內皮細胞并將其培養在96-孔平底培養平板上(Costar，劍橋，MA)，培養中添加適合用作促進細胞增殖的反應混合物，這種混合物包括ConA(Calbiochem，La Jolla，CA)。把篩選的Con-A和這種化合物添加到培養基中，37℃培養后，用脈沖向培養物中輸送3[H]-胸腺苷，同時在玻璃纖維過濾器上收獲培養物(PhD；劍橋技術，Watertown，MA)。利用液態閃爍計數器確定三重培養物中間的3[H]-胸苷結合物(cpm)(Beekman儀器Irvine，CA)。值得注意的3[H]-胸苷結合物表明對內皮細胞增殖的刺激作用。
用以上所描述的測定方法測定拮抗劑，然而，在這種測定中，VIGF和篩選化合物一同添加，在VIGF存在的情況下，這種化合物抑制3[H]-胸苷結合的能力表明這種化合物是VIGF的拮抗劑。另外，在適合競爭性抑制測定的條件之下把VIGF、潛在的拮抗劑和膜-結合的VIGF受體或重組受體組合，檢測VIGFD的拮抗劑。可以標記VIGF，如通過放射性，這樣，和受體結合的VIGF分子的數量能決定潛在拮抗劑的效能。
也可以把哺乳動物的細胞或表達VIGF受體膜制劑，在這種化合物存在的情況下和標記的VIGF一起培養。然后可以測定這種化合物提高或阻斷這種相互作用的能力。另外，在VIGF能天然和IGF結合的條件下，可以培養VIGF、標記的IGF和一種潛在的化合物。測定這種相互作用的程度，以確定這種化合物是有效的拮抗劑或刺激劑。
潛在的VIGF拮抗劑的例子包括抗體、或在某些情況下為和這種多肽連接的寡核苷酸。另外，潛在的拮抗劑可以是一種密切相關的蛋白質，例如，VIGF的突變形式，其能識別VIGF受體但不能傳遞影響，進而競爭性地抑制了VIGF的作用。
另一個潛在的拮抗劑是采用反義技術制備的反義構建體，反義技術可以通過三螺旋形成或反義DNA或者RNA來控制基因的表達，這兩種方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的結合。例如，編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用來設計長度約10至40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設計成與轉錄所涉及的基因區互補(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學，241456，(1988)；和Dervan等，科學，2511360(1991))，進而阻止轉錄和VIGF的產生。反義RNA體內寡核苷酸雜交到mRNA上，并阻斷mRNA分子翻譯成為VIGF(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細胞中，以便可以體內表達反義RNA和DNA，抑制VIGF的產生。
潛在的VIGF拮抗劑包括小分子，這些小分子和多肽的活性位點、受體結合位點、IGF或者是其它生長因子結合位點結合，進而阻斷VIGF的正常生物活性。小分子例子包括但不限于小肽或類肽的分子。
使用這種拮抗劑可以在繼氣囊血管形成術之后，抑制腫瘤新生血管化(neovascularization)和在粥樣硬化和再狹窄中常見的平滑肌細胞新生內膜增殖。
使用拮抗劑抑制在瘢痕瘤中所看見的瘢痕組織的過分產生，這種瘢痕在外科手術、心肌梗塞之后的纖維化，或和肺部纖維化相關纖維變性損傷之后形成。拮抗劑可用來與藥學上可接受的載體一起組合成組合物，例如，下文描述的。
本發明的VTGF多肽和刺激劑或拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包括所說多肽治療的有效量和藥學上可接受的載體或者賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇，和它們的組合物。其配方應該適宜于施用的方式。
本發明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個或多個填裝有本發明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。與這種容器相關聯的可以是管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機構所規定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品的政府機構的同意。此外，本發明的組合物可以與其它治療化合物結合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服，局部，靜脈內，腹膜內，肌內，皮下，鼻內或真皮內途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
VIGF與其它生長因子結合，可以加速其生理反應，這一點在創傷愈合中已見。這些生長因子包括但不限于PDGF、IGF、FGF、EGF或TGF-B。
VIGF多肽和多肽形式的刺激劑和拮抗劑，可以依據本發明用于體內表達這樣的多肽，這常被稱作″基因治療″。
這樣，例如，可以對患者細胞用體外編碼多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)進行基因工程操作，用工程細胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領域眾所周知的。例如，可以經本領域公知的方法用包括編碼本發明的多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒對細胞進行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領域已知的方法體內對細胞進行基因工程操作，以便體內表達多肽。如本領域已知的，可以將產生包括編碼本發明的多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒的生產細胞施用給患者，以便體內對細胞進行基因工程處理和體內表達多肽。通過本發明的闡述，由這種方式經施用本發明的多肽的這些和其它方法對本領域技術人員是顯而易見的。例如，工程化細胞的載體可以不是逆轉錄病毒載體，如，在與合適的運送載體結合后，腺病毒可以用于體內工程化細胞。
本發明也涉及VIGF基因作為診斷劑的用途。VIGF變異形式的檢測可以診斷疾病或對疾病的易感性，如腫瘤，既然VIGF的突變可以引起腫瘤。
可以用各種技術在DNA水平上檢測具有人VIGF基因突變的個體。可以從患者的細胞(如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸。基因組DNA可以直接用于檢測，或者在分析前用PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作為一個例子，可以用和編碼VIGF的核苷酸互補的PCR引物鑒別和分析VIGF突變。可以通過與正常遺傳型比較擴增產物大小的變化檢測缺失或者插入。點突變可以經擴增的DNA與放射性標記的VIGF RNA或者放射性標記的VIGF反義DNA序列雜交鑒別。經核糖核酸酶A消化，或者從熔點溫度的不同辨別完美配對的序列和錯配雙鏈體。
基于DNA序列差異的遺傳試驗可以通過檢測在有或沒有變性劑時凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上的區別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點或部分融化溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers等，科學，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保護測定法揭示特定位置上的序列變化，所述測定法如核糖核酸酶保護和S1保護以及化學裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測特定DNA序列，所述方法例如雜交，核糖核酸酶保護，化學裂解，直接DNA測序，或使用限制酶(例如，限制片段長度多形性)和基因組DNA的Southern印跡法。
除很多常規凝膠-電泳和DNA測序法之外，也可用原位分析檢測突變。
VIGF蛋白質表達和血管病或與腫瘤形成相關的新血管化相關聯。VIGF具有單鏈多肽，同時mRNA在內皮細胞中高度表達，在平滑肌細胞中則較少，這表明蛋白質存在于血清中。因此，可以用抗VIGF抗體來診斷血管病或與腫瘤形成相關的新血管化，因為可用多肽的改變水平表明這種紊亂。
可以使用競爭測定方法，其中VIGF特異性抗體吸附在一種固體支持物上，標記的VIGF和來源于宿主細胞的樣品通過所說的固體支持物，檢測出的吸附在固體支持物上的標記物數量和樣品中VIGF數量相關。
本發明的序列對染色體鑒別也有價值。所說的序列特異性地導向單個人染色體的特定位置，并與之雜交。此外，也需要鑒別染色體上的特定位點。極少的基于實際序列數據(重復多形性)的染色體標識試劑現在可用來標記染色體位置。在關聯與疾病有關基因的那些序列中，按照本發明的染色體的DNAs作圖是重要的第一步。
簡言之，可以通過從cDNA制備PCR引物(優選地15-25bp)對染色體序列作圖。對cDNA的計算機分析用來迅速選擇引物，該引物不跨越一個以上的基因組DNA中的外顯子，這樣使擴增方法復雜化。然后，這些引物用于PCR篩選包含單獨的人染色體的體細胞雜種。僅包含相應于引物的人基因的那些雜種產生擴增片段。
體細胞雜種的PCR作圖是指定特定DNA到特定染色體的快速方法。利用本發明及相同的寡核苷酸引物，可以由一組特定染色體的片段或一組大的基因組克隆以類似的方式獲得亞定位。其它可以類似地用于對其染色體作圖的作圖策略，所述策略包括原位雜交、用標記的流式分選染色體預篩選和經雜交預選擇構建染色體特異性-cDNA文庫。
在一個步驟中，中期染色體擴散的cDNA克隆的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的染色體位置。這一技術可以與短至500或600堿基的cDNA一起使用；然而，比2,000bp更大的克隆具有更大的可能性結合到單一染色體位置，這個單一染色體位置具有供檢測的足夠的信號強度。FISH需要衍生出EST的克隆，越長越好。例如，2,000bp是好的，4,000是更好的，超過4,000對獲得好的結果時間的合理的百分比很可能是不必要的。這種技術的綜述，參見Verma等，人染色體基本技術手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列精確定位到染色體位置，染色體上的序列的物理位置就可以與遺傳圖譜數據關聯。這樣的數據可以在例如V.McKusick，在人中的孟德爾式遺傳(可聯機到JohnsHopkins大學Welch醫學文庫上使用)中找到。然后，基因和已定位到相同的染色體區的疾病之間的相互關系經連鎖分析(物理鄰近基因的共遺傳)鑒別。
接著，有必要確定感染和未感染個體之間cDNA或者基因組序列中的不同。如果在某些或全部感染個體中觀察到突變，但在任何正常個體中觀察不到，則，所述的突變很可能是疾病的病因。
采用現有分辨率的物理作圖和遺傳作圖技術，精確定位到與疾病相關的染色體區上的cDNA是50和500之間的致病性基因的一個(這假定1兆堿基作圖分辨率，每20kb一個基因)。
所說的多肽，其片段或衍生物或類似物，或表達它們的細胞可以用作免疫原由此產生抗體。這些抗體可以是例如，多克隆或單克隆抗體。本發明也包括嵌合的、單鏈和人化的抗體以及Fab片段，或Fab表達文庫的產物。本領域中已知的各種方法可以用于產生這樣的抗體和片段。
可以通過對動物直接注射多肽或者對動物(優選的是非人動物)施用多肽獲得產生來針對相應于本發明的序列的多肽的抗體。然后如此獲得的抗體結合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個片段的序列也可以用于產生結合全部天然多肽的的抗體。用這種抗體從表達多肽的組織中分離多肽。
對于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供由傳代細胞系培養物產生的抗體的技術。例子包括雜交瘤技術(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、所說的三瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，當今免疫學，472)和產生人單克隆抗體的EB病毒-雜交瘤技術(Cole，等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。
有關產生單鏈抗體描述的技術(美國專利4,946,778)可以采用來產生針對本發明的免疫原性多肽產品的單鏈抗體。也可以利用轉基因鼠表達針對于本發明的免疫原性多肽產品人化的抗體。
將參照以下實施例進一步描述本發明。然而應該清楚本發明不限于這些實施例。除非特別指明，所有分數或數量均指重量。
為了有利于理解下列實施例，以下描述一些經常出現的方法和/或術語。
“質粒”由前面的小寫p和/或后續的大寫字母和/或數字指定。本文的起始質粒是市售的、無限制的公眾可獲得的或者是可以按已出版的方法從可獲得的質粒構建的。此外，所描述的質粒的等同質粒在本領域中是已知的，對普通技術人員是顯而易見的。
DNA的″消化″指以限制性內切酶催化切割DNA，這種限制性內切酶僅作用在DNA一定的序列上。本發明所有的各種限制酶是市售的，使用它們的反應條件，輔因子和其它需要作為普通技術人員應了解的知識。為了分析的目的，一般地是在約20微升緩沖液中使用1微克質粒或DNA片段以及約2單位的酶。為了質粒構建體分離DNA片段的目的，一般地是在較大體積中用20至250單位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的緩沖液和底物的量由制造者規定。通常使用37℃約1小時的培養時間，但可以按照供應者的說明變化。在消化之后，反應物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，84057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝膠進行切割片段的大小分離。
″寡核苷酸″指單鏈多脫氧核苷酸或兩條互補的多脫氧核苷酸鏈，其可以是化學合成的。這樣合成的寡核苷酸沒有5’磷酸基，同時在激酶存在下不添加帶有ATP的磷酸鹽時，其不連接另一個寡核苷酸。合成的寡核苷酸將連接沒有去磷酸化的片段。
″連接″指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，Id.，p.145)。除非提供其它方式，可以采用已知緩沖液和條件用每0.5微克大約等摩爾量的待連接的DNA片段10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)進行連接。
除非有其它說明，按Graham，F.和van der Eb，A.，病毒學，52456-457(1973)的描述進行轉化。
實施例1
VIGF的細菌表達和純化用相應于加工過的VIGF蛋白質(負單鏈肽序列)的5’序列的PCR寡核苷酸引物和VIGF基因載體序列3’起始擴增編碼VIGF的DNA序列，ATCC#75874。
把相應于VIGF的附加核苷酸分別加入到5’和3’的序列中。具有5′CGCAAGCTTAAATAATTATGCGGTGGACTGC 3′序列的寡核苷酸引物包含一個HindIII限制性內切酶位點(加黑的堿基序列)，后接從假定加工蛋白質的末端氨基酸密碼子(下面劃線)起始的VIGF編碼序列的21個核苷酸。3’端的寡核苷酸引物5′CGCTCTAGATCAGCGTGGATTTAACCA 3′含有一個XbaI限制性內切酶位點(加黑的堿基序列)，其后有相應于所說的羧基末端5個氨基酸的核苷酸的反向互補序列和翻譯終止密碼子(下劃線)。所說的限制性內切酶位點相當于細菌表達載體pQE-9(Qiagen，Chatsworth公司，CA)限制性內切酶位點。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細菌復制起點(ori)、IPTG-調節啟動子操縱子(P/O)、核糖體結合位點(RBS)、6-組氨酸標記和限制性內切酶位點。
用HindIII和XbaI消化VIGF PCR產物和pQE-9，然后用T4DNA連接酶，把它們連接在一起。所需重組體將包含從編碼組氨酸標記物位點的下游插入的VIGF編碼序列和核糖體結合位點。按Sambrook J.等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989)中描述的方法用連接混合物轉化大腸桿菌菌株M15[pREP4](Qiagen，公司)。M15[pREP4]包含多拷貝的質粒pREP4，這種質粒表達lacI抑制子并賦予卡那霉素抗性(Kan)。由其在LB平板上的生長能力來鑒別這種轉化體同時選擇抗氨芐青霉素/卡那霉素的菌落。分離質粒DNA，并且通過限制分析確認。在補充Amp(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培養基的液體培養中過夜(O/N)培養包含所需構建體的克隆。所說的O/N培養物用來以1∶100到1∶250的比率接種大量培養物。使細胞生長至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)。添加IPTG(異丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至終濃度1mM。IPTG通過滅活lacI抑制子，清除導致增加的基因表達的P/O誘導。將細胞另外培養3至4小時，這樣出現指數生長的培養物。然后由離心收獲細胞。含有VIGF/6-組氨酸的M15[pREP4]細胞在6M GnHCl、pH8.0的溶液中裂解。把裂解物上螯合鎳柱和通過流出物收集。用6M GnHCl、50mM NaPO4，pH值為8.0、6.0、5.0的溶液洗柱。pH值2.0時洗脫下VIGF融合蛋白(＞90％純化)。用脫氧膽酸鈉和三氯乙酸沉淀來源于預柱裂解物(圖3，2道)、柱流出物(3道)、pH值5.0洗脫液(4道)、pH值2.0洗脫液(5道)的樣品。為了復性的目的，把pH值2.0的洗脫液調節至3摩爾GnHCl、100mM磷酸鹽鈉、10mmolar谷胱甘肽(還原性)和2mmolar谷胱甘肽(氧化性)。在這種溶液中培養24小時后，將所說的蛋白質對10mmolar磷酸鹽鈉透析。為了跑膠，將顆粒狀沉淀再懸浮在裝載緩沖液的SDS/NaOH和SDS-PAGE中，熱變性，然后在1 5％變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。也電泳了Gibco BRL低分子量標準物(1道)。用考馬斯亮藍染色劑顯示所說的蛋白質。圖3是顯示VIGF純化結果的SDS-聚丙烯酰胺凝膠。
實施例2利用桿狀病毒表達系統克隆和表達VIGF用限制酶PvuII和XbaI消化編碼全長蛋白質的DNA序列。639個核苷酸的PvuII、XbaI片段包含全部VIGF編碼區、5’和3’端分別附加11個和77個核苷酸的非翻譯DNA。消化的F2這個片段是用商品試劑盒(″Geneclean″，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離出來的。
用載體pA2由細菌表達系統表達VIGF蛋白質(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細胞培養過程的方法手冊，得克薩斯農業的試驗站公報1555)。這種表達載體包括苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強大的多角體蛋白啟動子，其后面是限制性核酸內切酶SmaI和XbaI的識別位點。這種猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因作為多角體蛋白啟動子以同樣的方向插入，其后是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側是用于細胞介導的共轉染的野生型病毒DNA的同源再重組體的病毒序列。可以用很多其它的桿狀病毒載體代替pA2，所說的載體如pRG1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學，17031-39)。
用限制酶SmaI和XbaI消化所說的質粒，然后由本領域已知的方法利用牛犢腸磷酸酶使質粒去磷酸化。然后用商業試劑盒(″Geneclean″，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA指定為V2。
用T4 DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質粒。然后轉化大腸桿菌菌株XLIBlue(Stratagene克隆系統，11011 North Torrey Pines Road La Jolla，Ca.92037)并利用酶BamHI和XbaI由VIGF cDNA鑒別含有所說質粒(pBac VIGF)的細菌。通過DNA測序確認所克隆的片段的序列。
用脂轉染法(Felgner等，美國科學院學報，847413-7417(1987))將5μg質粒pBac VIGF用1.0μg市售的線性桿狀病毒(″BaculoGoldTM桿狀病毒DNA″，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉染。
將1μgBaculoGoldTM病毒DNA和5μg質粒pBac VIGF在含有50微升無血清Grace’s培養基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。添加10微升脂轉染試劑和90微升Grace’s的培養基后，混合并于室溫下培養15分鐘。然后將轉染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL1711)中，所說細胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養基的35mm組織培養平板上。來回搖動平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養5小時。5小時后，從平板除去轉染溶液，添加1微升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續培養4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。作為一種改變，使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分離染藍的噬斑。(″噬斑測定″的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發布的昆蟲細胞培養和桿狀病毒學用戶指南9-10頁中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮于包含200微升Grace’s培養基的Eppendcrf管中。經簡短離心除去瓊脂，將包含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養皿中的Sf9細胞。4天后，收獲這些培養皿中的上清液，于4℃貯存。
將Sf9細胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace’培養基中生長。在感染復數(MOI)2下用重組桿狀病毒V-VIGF感染細胞。6小時后，除去培養基，用SF900II培養基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(Life Technologies公司，Gaithersburg)替代。42小時后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經離心收獲之前，將細胞進一步培養16小時，標記蛋白質經SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實施例3重組VIGF在CHO細胞中的表達用載體pN346表達所說的VIGF蛋白，質粒pN346是質粒pSV2-dhfr[ATCC 37146]的衍生物。這兩種質粒都含有受SV40早期啟動子控制的小鼠dhfr基因。可以通過在附加了化療劑氨甲蝶呤的選擇培養基(alpha-MES，Lift技術)中生長中國倉鼠卵巢或用這些質粒轉染的缺乏二氫葉酸活性的其它細胞來選擇這些細胞。DHFR基因在抗氨甲蝶呤(MTX)的細胞中的擴增已很好地報道了(參見，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，and Schimke，R.T.，1978，生物化學雜志，2531357-1370，Hamlin，J.L.and Ma，C.1990，Biochem.et Biophys.Acta，1097107-143，Page，M.J.and Sydenham，M.A.1991，生物技術，Vol.964-68)。生長在增加了MTX濃度的培養基中的細胞通過過度產生所說的目標酶DHFR發展了對藥物的抗性，結果使所說的DHFR基因擴增。如果把另一個基因和所說的dhfr基因連接，這個基因通常被共-擴增和過度表達。然后，當撤除氨甲蝶呤時，細胞系包含整合在所說染色體上的擴增基因。
質粒pN346包含用于肉瘤病毒(Cullen等，分子和細胞生物學，1985年3月，438-447)的長末端重復(LTR)的一個強大啟動子基因的表達部分，附加一個從人類細胞肥大病毒(CMV)的立即早期基因增強子中分離出來的片段(Boshart等，細胞41521-530，1985)。所說的啟動子下游是下列單一限制性酶切位點，其使得所說的基因整合BamHI、Pvull和Nrul。在三個讀框中，這些編碼位點之后，所說的質粒包含翻譯終止密碼子，其后是大鼠前胰島素原基因的內含子和聚腺苷酸化位點。也可以用其它高效的啟動子來進行表達，例如，人β-肌動蛋白啟動子、所說的SV40早期或晚期啟動子、或來源于其它逆轉錄病毒的長末端重復，如HIV和HTLVI。為了所說的mRNA其它信號的聚腺苷酸化，例如，也可以用人的生長激素和或珠蛋白基因。
也可以根據用選擇性標記(如gpt、G418或潮霉素)共轉染來選擇攜帶整合在所說的染色體上興趣基因的穩定細胞系。開始時，使用不只一個的選擇性基因是有利的，如附加氨甲蝶呤的G418。
所說的質粒pN346用限制性內切酶BamHI消化，然后通過本領域已知的方法用牛犢腸磷酸酶脫磷酸化。然后從1％瓊脂糖凝膠中分離所說的載體。
采用相應于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴增編碼全長VIGF蛋白質的DNA序列，ATCC#758745’引物具有序列5′CGCAGATCTCCGCCACCATGAAGAGCGTCTTGCTGCTG 3′，包含BglII限制性內切酶位點(粗體)，其后首先為類似真核細胞中翻譯起始有效信號的8個核苷酸(Kozak，M.，分子生物學雜志，196947-950，(1987))，剩下的核苷酸相當于氨基末端包括所說的翻譯終止密碼子(下劃線)在內的7個氨基酸。3’引物具有序列5′CGCAGATCTAGCCTTCTCTCAGAAATCACA 3′，包含限制性核酸內切酶BglII切割位點(粗體)和從翻譯終止密碼子下游7個核苷酸始的3’非翻譯DNA的反向互補鏈的21個核苷酸。用BglII消化PCR產品和用市售的試劑盒(“Geneclean”BIO 101公司，LaJolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠純化該產品。然后用T4 DNA連接酶把這個片段連接到BamHI消化的、帶有磷酸酶pN346質粒上。轉化XlLBlue(Stratagene)大腸桿菌并在LB平板上鋪板(含50μg/ml氨芐青霉素)。在合適的部位，通過PCR方法利用相當于肉瘤病毒啟動子的5’引物和相當于VIGF密碼子73-79的反向互補序列的3’引物來篩選含有所需重組體的菌落。通過DNA測序確認所克隆片段的序列。
CHO-dhfr-細胞的轉染用缺乏活性的DHFR酶的中國倉鼠卵巢細胞進行轉染。用脂轉染法將所說的表達質粒pN346 VIGF 5μg用0.5μg的質粒pSVneo共轉染。所說的質粒pSV-neo含有一個占統治地位的選擇性標記，來源于Tn5的基因neo編碼能賦予包含G418在內的一組抗生素的抗性，所說的細胞培養在添加1mg/mlG418的alpha-MEM培養基中。兩天后，用胰蛋白酶消化這些細胞并種植在雜交瘤克隆平板(Greiner，德國)上培養10-14天。在這個時期之后，用胰蛋白酶消化單克隆，然后使用不同濃度的氨甲蝶呤(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)種植在6-孔培養皿中。然后把生長在最高氨甲蝶呤濃度中的克隆轉移到更高濃度的氨甲蝶呤(500Nm、1μM、2μM、5μM)中。重復同樣的方法至克隆生長在100μM的濃度中。
通過Western印跡分析和SDS-PAGF方法分析所要求的基因產物的表達。
實施例4用Northern印跡分析法組織定位VIGF基因的表達在Church緩沖液(Church，G.M.& Gilbert，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1991-1995(1984))中對多組織Northem印跡(Clontech實驗室，公司，4030 Fabian方法Palo Alto，加利福尼亞96303)60℃下預雜交1小時，每個道中包括的組織有2μg成年人腦、心臟、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎和胰多聚腺苷酸+mRNA。編碼VIGF的DNA序列，ATCC 75874，用M13正向(5′GGGTTTTCCCAGTCACGAC3′)和反向(5′ATGCTTCCGGCTCGTATG3′)引物從在pBluescript SK(-)編碼的全長度cDNA中擴增。25ng的PCR產物是用32P-dCTP放射標記的隨機引物(引物-It II，Stratagene克隆系統，11011North Torrey Pine Rd.La Jolla，加利福尼亞92037)。把熱變性VIGF探針直接加入到預雜交緩沖液中并在60℃下培養16小時。60℃下在0.2X SSC 0.1％SDS中洗脫兩次，每次10分鐘。在-80℃下進行自顯影。
照射四天后，在肺和腎中可見已知2.3kb的轉錄物(圖4)。
實施例5用Northern印跡分析VIGF基因表達的細胞-類型使人類臍靜脈內皮、主動脈平滑肌、真皮的包皮成纖維細胞(Clonetics，9620Chesapeake Drive，Suite 201號；San Diego，加利福尼亞92123)生長至鋪滿75-90％。按Sambrook等的方法用RNAzol提取全部的RNA(Biotecx實驗室，公司，8400 HelgermanCt.，P.O.Box 6009 Gaithersburg，馬里蘭20884)。所說的RNA過夜轉移到Hybond N+膜(Amersham公司，2636 South Clearbrook Drive；Arlington Heights，Illinois 60005)同時用Stratalinker UV交聯劑(Stratagene克隆系統，La Jolla，加利福尼亞)結合在膜上。所說的雜交是60℃下在Church緩沖液(Church，G.M.& Gilbert，W.，PNAS，美國811991-1995(1984))中預雜交1小時。編碼VIGF的DNA序列，ATCC#75874，用M13正向(5′GGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′)和反向(5′ATGCTTCCGGCTCGTATG3′)引物從在pBluescript SK(-)編碼的全長度cDNA中擴增。25ng的PCR產物是用32P-dCTP放射標記的隨機引物(引物-It II，Stratagene)。把熱變性VIGF探針直接加入到預雜交緩沖液中并在60℃下溫育16小時。60℃下在0.2X SSC 0.1％SDS中洗脫兩次，每次10分鐘。在-80℃下進行自顯影。照射2小時后(圖5A)，在臍靜脈內皮(1道)和主動脈平滑肌細胞(2道)或照射36小時后(圖5B)在真皮包皮成纖維細胞(3道)中可見2.3-2.4kb的轉錄物(圖5B)。
序列表(1)一般信息(i)申請人HASTINGS等(ii)發明名稱人血管IBP樣生長因子(iii)序列數2(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)ZIP07068(v)計算機可讀形式(A)介質類型3.5英寸磁盤(B)計算機IBM PS/2(c)操作系統MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(Vi)當前申請的數據(A)申請號(B)申請日同時(C)分類號(Vii)在先申請的數據(A)申請號(B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARC，GREGORY D.
(B)登記號36，134(c)證書號325800-219(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1271個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CTGCTTCCCA CCAGCAAAGA CCACGACTGG AGAGCCGAGC CGGAGCAGCT GGGAAACATG60AAGAGCGTCT TGCTGCTGAC CACGCTCCTC GTGCCTGCAC ACCTGGTGGC CGCCTGGAGC 120AATAATTATG CGGTGGACTG CCCTCAACAC TGTGACAGCA GTGAGTGCAA AAGCAGCCCG 180CGCTGCAAGA GGACAGTGCT CGACGACTGT GGCTGCTGCC GAGTGTGCGC TGCAGGGCGG 240GGAGAAACTT GCTACCGCAC AGTCTCAGGC ATGGATGGCA TGAAGTGTGG CCCGGGGCTG 300AGGTGTCAGC CTTCTAATGG GGAGGATCCT TTTGGTGAAG AGTTTGGTAT CTGCAAAGAC 360TGTCCCTACG GCACCTTCGG GATGGATTGC AGAGAGACCT GCAACTGCCA GTCAGGCATC 420TGTGACAGGG GGACGGGAAA ATGCCTGAAA TTCCCCTTCT TCCAATATTC AGTAACCAAG 480TCTTCCAACA GATTTGTTTC TCTCACGGAG CATGACATGG CATCTGGAGA TGGCAATATT 540GTGAGAGAAG AAGTTGTGAA AGAGAATGCT GCCGGGTCTC CCGTAATGAG GAAATGGTTA 600AATCCACGCT GATCCCGGCT GTGATTTCTG AGAGAAGGCT CTATTTTCGT GAYTGTTCAA 660CACACAGCCA ACATTTTAGG AACTTTCTAG ATTATAGCAT AAGGACATGT AATTTTTGAA 720GACCAAATGT GATGCATGGT GGATCCAGAA AACAAAAAGT AGGATACTTA CAATCCATAA 780CATCCATATG ACTGAACACT TGTATGTGTT TGTTAAATAT TCGAATGCAT GTAGATTTGT 840TAAATGTGTG TGTATAGTAA CACTGAAGAA CTAAAAATGC AATTTAGGTA ATCTTACATG 900GAGACAGGTC AACCAAAGAG GGAGCTAGGC AAAGCTGAAG ACCGCAGTGA GTCAAATTAG 960TTCTTTGACT TTGATGTACA TTAATGTTGG GATATGGAAT GAAGACTTAA GAGCAGGAGA 1020AGATGGGGAG GGGGTGGGAG TGGGAAATAA AATATTTAGC CCTTCCTTGG TAGGTAGCTT 1080CTCTAGAATT TAATTRTGCT TTTTTTTTTT TTTTTGGGCT TTGGGAAAAG TCAAAATAAA 1140ACAACCAGAA AACCCCTGAA GGAAGTAAGA TGTTTGAAGC TTATGGAAAT TTGAGTAACA 1200AACAGCTTTG ANCTGAGAGC AATTYCAAAA GGCTGCTGAT GTAGCCCCCG GGTTNCCTNT 1260NTCTNAAGGA C 1271
(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度184個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His-20 -15 -10Leu Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln-5 1 5His Cys Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg10 15 20Thr Val Leu Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly25 30 35Arg Gly Glu Thr Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met40 45 50Lys Cys Gly Pro Gly Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp55 60 65Pro Phe Gly Glu Glu Phe Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly70 75 80Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly85 90 95Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe100 105 110Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn Arg Phe Val Ser Leu Thr115 120 125Glu His Asp Mer Ala Ser Gly Asp Gly Asn Ile Val Arg Glu Glu130 135 140Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val Met Arg Lys Trp145 150 155Leu Asn Pro Arg160
權利要求
1.一種藥物組合物，包含針對選自如下一組的一種多肽的抗體，所述的組包括(a)具有圖1的推導的氨基酸序列的人血管胰島素結合蛋白樣生長因子多肽及其保持人血管胰島素結合蛋白樣生長因子活性的片段；(b)圖1的推導的氨基酸序列中一或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代后的多肽，其中所述多肽保持人血管胰島素結合蛋白樣生長因子活性；(c)由ATCC保藏號75874的cDNA編碼的人血管胰島素結合蛋白樣生長因子多肽以及所述多肽的保持人血管胰島素結合蛋白樣生長因子活性的片段；和(d)由ATCC保藏號75874的cDNA編碼的人血管胰島素結合蛋白樣生長因子多肽中一或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代后的多肽，其中所述多肽保持人血管胰島素結合蛋白樣生長因子活性。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述的抗體是多克隆抗體。
3.權利要求1的藥物組合物，其中所述的抗體是單克隆抗體。
4.權利要求1的藥物組合物，其中所述的抗體選自(a)一種嵌合抗體；(b)一種人化的抗體；(c)一種單鏈抗體；和(d)一種Fab片段。
全文摘要
本發明公開了一種人血管IBP樣生長因子多肽(VIGF)、編碼這種多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術產生這種多肽的方法。本發明也公開了將這種多肽用于創傷愈合或組織再生、促進植入物固定和血管形成的方法。本發明還公開了針對這種多肽的拮抗劑和它們作為治療動脈粥樣硬化、腫瘤和瘢痕形成的治療劑的用途。此外，本發明還公開了鑒別VIGF核酸序列中的突變和VIGF多肽改變水平的診斷測定方法。本發明特別涉及VIGF抗體在診斷血管疾病或與腫瘤形成相關的新血管化中的應用。
文檔編號A61P35/00GK1526447SQ20041000416
公開日2004年9月8日 申請日期1994年12月9日 優先權日1994年12月9日
發明者格雷格·A·黑斯廷斯, 克雷格·A·羅森, A 羅森, 格雷格 A 黑斯廷斯 申請人:人體基因組科學有限公司