一種含有carp基因及其相關產物的抗癌藥物及其用途的制作方法

專利名稱：一種含有carp基因及其相關產物的抗癌藥物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物及其用途，屬于生物制藥領域。
背景技術：
癌癥是嚴重危害人類健康的一類疾病。根據世界衛生組織(WHO)報告，2000年全球新發癌癥病人1010萬人，死亡620萬人，現患癌癥病例2240萬。過去的10年間，全球癌癥發病率增長了22％。無論從發病(120萬)還是死亡(110萬)來看，肺癌均為全球最主要的癌癥，以死亡排序以下為胃癌、肝癌及結直腸癌。全球癌癥仍呈上升趨勢，據世界衛生組織專家預測，未來25年全世界80多億人口中，將有3億人患腫瘤，其中1億人因癌癥而死亡，21世紀癌癥將成為人類健康的“第一殺手”。
根據全國性死因回顧調查表明，20年來中國的癌癥發病和死亡率逐年上升，每200個家庭中，有1個家庭因有癌癥病人而遭受磨難。調查表明，2000年全國癌癥死亡人數約150萬，發病人數約200萬，每死亡5人中就有一人死于癌癥。
癌癥是由控制細胞增生、成熟、轉移與衰老的基因突變引起的贅生情形。目前癌癥發生的分子機制并不十分清楚，但越來越多的證據表明，它與多個癌基因的激活以及抑癌基因的失活有關。抑制癌基因的表達，重建抑癌基因的功能是目前癌癥基因治療所追求的基本目標。尋找有效的針對癌細胞的目的基因以及高效安全的載體的應用，無疑對癌癥的防治具有重要意義。
腺病毒載體是繼逆轉錄病毒載體后，發展得較快的載體系統，它以遺傳毒性低，致病性小，宿主范圍廣，滴度高，感染效率高，裝載容量大等優勢已廣泛用于基因治療。目前腺病毒載體已成為最有應用前景的病毒載體。在腫瘤的基因治療中，基因的轉移主要采取將目的基因直接轉移至宿主體內的in vivo方式，要求選擇的載體高效轉導，只有這樣才能滿足臨床腫瘤基因治療的需要。因此，我們選擇了腺病毒作為載體。在研究中發現，腺病毒感染效率高，能將目的基因轉移到幾乎100％的腫瘤細胞中去，通過GFP(綠色熒光蛋白)顯示在MOI＝50時，培養細胞的感染效率即高達90％以上。如此高的轉導效率對于腫瘤的體內基因治療有很大的促進作用。
CARP基因是從成人主動脈cDNA文庫中克隆到的一個新基因，該基因長2371bp，定位于10p13，CARP蛋白含有445個氨基酸殘基，分子量為49.7kD，該蛋白無跨膜區，包含有一個CARD結構域(aa160-243)、一個核受體結合模體和兩個EF手模體。Northern雜交顯示該基因在心臟、骨骼肌、腎臟以及肝臟中高表達。
目前，針對CARP基因功能的研究還在不斷深入，人們期待著能夠發現與人類疾病相關的CARP基因的新功能，從而為這些疾病的診斷和治療提供分子醫學領域的輔助。

發明內容
在前期的研究中，我們將CARP穩定轉染7種腫瘤細胞系肺癌A549和PG細胞系，黑色素瘤WM451細胞系，前列腺癌PC-3和PC-3M細胞系，肝癌H7402細胞系以及膀胱癌BIU87細胞系，結果發現相比較于轉染空載體和未經轉染的細胞，轉染了CARP的細胞增殖被顯著的抑制了1.2-5倍(P＜0.02)。本發明則以肺癌A549細胞系作為靶細胞，腺病毒載體介導，進一步驗證CARP基因在體內體外對腫瘤發生生長的抑制作用。探索腺病毒介導CARP基因高表達治療癌癥的可行性，為癌癥的基因治療提供候選基因，并為癌癥基因治療的臨床前研究提供實驗依據。
本發明的目的是提供一利含有抑癌基因CARP的基因抗癌藥物以及調控此基因的相關化學、生物產品。
本發明的另一個目的是提供這種藥物在癌癥治療方面的用途。
為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其有效成分為CARP基因、或其剪接體、或其反義寡核苷酸、或其編碼的肽和肽段中的一種或幾種。
一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其有效成分為攜帶有CARP基因的載體。我們通過Clontech公司的多種腫瘤組織cDNA芯片，分析了CARP在腫瘤組織與正常組織間的表達差異，結果顯示CARP在13種腫瘤組織中相比于其對應的正常組織均表達下調，尤其在乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌和前列腺癌中下調的程度較高。該結果提示，CARP基因極可能是上述腫瘤的抑癌基因，通過攜帶有CARP基因的載體將其導入體內，可以有效抑制腫瘤的生長。
在體外，我們用攜帶CARP基因的腺病毒(Ad-CARP)、腺病毒空載體(Ad-GFP)或PBS分別感染A549細胞，發現Ad-CARP能夠明顯抑制A549細胞的增殖。在體內實驗中，我們發現經過Ad-CARP感染的A549細胞注射到裸鼠皮下，不能形成腫瘤；而由Ad-GFP或PBS處理過的A549細胞注射到裸鼠皮下后，成瘤率為100％。同時，在接種A549細胞的裸鼠腫瘤模型中，用Ad-CARP、Ad-GFP和PBS分別進行治療，相比于兩個對照組，Ad-CARP對腫瘤生長的抑制率分別為72.6％(相比于PBS組)和64.3％(相比于Ad-GFP組)。這些結果都表明，腺病毒介導CARP基因的高表達對于腫瘤的發生及生長有著明顯的抑制作用。
所述CARP基因、或其剪接體、或其反義寡核苷酸整合于載體上。
所述載體為基因治療載體，選自裸體質粒、腺病毒、腺相關病毒和逆轉錄病毒中的一種或幾種。其中，所述載體可以是裸體質粒、腺病毒(Adenovirus)、腺相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)、逆轉錄病毒(Retrovirus和Lentivirus)等基因治療載體。這些載體均實現了商業化，可以方便地購得，使用其進行基因工程操作屬于本領域通用技術。
所述載體內含有一個拷貝正常的CARP基因或突變體CARP基因，具有抑制腫瘤的作用。
所述載體為腺病毒。
所述腺病毒為E1、E3缺失的C種5血清型人腺病毒，帶有CMV啟動子，屬于第二代腺病毒載體。其重組系統為購自QUANTUM公司的AdEasyTM系統，系統由兩種質粒組成，一種是包含有E1、E3缺失的腺病毒基因組DNA的大質粒(骨架質粒)；另一種是小的穿梭質粒，其帶有目的基因表達盒以及在表達盒兩側的與大質粒上的目的基因擬插入部位同源的序列(左、右臂)。
所述腺病毒的濃度為1012病毒顆粒/毫升。
所述藥物中還含有磷酸鹽緩沖液溶劑(PBS)。常用的如在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl調節pH值至7.4，加水至1L。
該藥物可用于治療治療肺癌、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、甲狀腺癌和前列腺癌等癌癥。
由于CARP是癌癥發生發展的一個重要的抑制基因，是抑制癌癥組織生長的關鍵靶點，一切化學、生物、天然、人工合成的能夠調整CARP表達的藥物都會成為有效的抗癌藥物，因此也包含在本發明的范圍之內本發明的有益效果是本發明采用本實驗室克隆的新的抑癌基因-CARP基因，通過基因工程的方法將其整合到重組腺病毒載體中，制備成抗腫瘤的藥物。通過細胞學、體外及動物實驗證實，其腫瘤抑制作用非常明顯，且毒副作用低，致病性小。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，并非對本發明的限制，凡依照本發明公開的內容進行的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。


圖1為實施例1的Northern雜交結果圖，A圖為CARP特異探針與Cancerprofiling array雜交結果，B圖為對照基因(Ubiquitin)與Cancer profiling array雜交結果。
圖2為利用pAdEasy-1系統產生重組腺病毒技術線路。
圖3為重組腺病毒載體的PacI酶切鑒定圖譜。
圖4為重組腺病毒的PCR鑒定圖譜。
圖5為MTT法檢驗腺病毒介導的CARP對A549細胞生長的抑制圖。
圖6為經過PBS、Ad-CARP或Ad-GFP處理的A549細胞接種裸鼠后的腫瘤生長曲線。
圖7為Ad-CARP對腫瘤生長抑制的效果圖。
具體實施例方式
下述實施例使用的材料和主要試劑
一、生物材料1、腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV(購自QUANTUM公司)2、腺病毒骨架載體pAdeasy-1(購自QUANTUM公司)3、大腸桿菌(E.Coli)BJ5183(本實驗室保存)4、宿主菌E.Coli DH10B(本實驗室保存)5、293細胞系(購自中國協和醫科大學基礎所細胞中心)二、工具酶及常用試劑盒各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A等均為TaKaRa或NEB公司產品。轉染試劑Lipofectamine2000購自Gibco BRL，硝酸纖維素膜和Northern Blot尼龍膜購自Schleicher & Schuell公司，PVDF(ImmobilonTM-P)膜購自Millipore公司，隨機引物試劑盒(Prim it)購自QIAGEN，PCR產物回收純化試劑盒購自鼎國。
三、主要化學試劑1、雜交標記試劑盒(e-a-Gene Labeling System)購自Promega，雜交液(ExpressHyb Hybridization Solution)購自BD Biosciences Clontech，質粒提取試劑盒(Hispeed Plasmid Midi Kit)購自QIAGEN，DMEM、F12培養基購自GibcoBRL，胎牛血清購自Hyclone，氯化銫(CsCl)購自Sigma。
其余各種試劑為進口或國產分析純試劑。
2、試劑的配制1)磷酸鹽緩沖液(PBS)在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl調節pH值至7.4，加水至1L。
2)DMEM高糖培養基取1L包裝DMEM(high glucose)加1000ml三蒸水，充分溶解。加3.7g NaHCO3，完全溶解后，用HEPES調PH值至7.2，過濾除菌。
3)F12培養基取1L包裝F12加1000ml三蒸水，充分溶解。加1.374g NaHCO3，完全溶解后，用HEPES調PH值至7.2，過濾除菌。
4)LB培養基胰蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl10g用10mmol/L NaOH調pH值為7.0，加入去離子水至總體積為1L。
5)溴化乙錠(EB)溶液(10mg/ml)取EB100mg于棕色瓶中，加ddH2O10ml溶解，室溫避光儲存。
6)TE緩沖液10mmol/LTris.Cl(pH＝7.0)1mmol/L EDTA (pH＝8.0)7)腺病毒透析緩沖液10mM Tris-Cl pH8.0，1mM MgCl2，10％甘油8)2×病毒儲存液10mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，0.1％BSA，50％甘油實施例1、CARP基因在腫瘤組織中表達下調--多種腫瘤組織芯片分析一、材料多種腫瘤組織芯片(Cancer Profiling Array I，Catalog#；7841-1)購自Clontech公司，包括乳腺癌，子宮癌，結腸癌，卵巢癌，胃癌，宮頸癌，肺癌，腎癌，直腸癌，甲狀腺癌，前列腺癌，胰腺癌，小腸癌13種腫瘤組織及其對應的來自同一病人的正常組織的總共241對cDNA。
二、方法(一)制備CARP基因特異探針的模板1、以下列引物從含有CARP基因cDNA的質粒(pAd-CARP)中擴增CARP基因cDNA的319-1243位上游引物5’-TGGCGGGATTGTTCAGAGGAAGAGC-3’，下游引物5’-TCTGGACCACTGGAGCCCTGATCAG-3’。
2、PCR(聚合酶鏈式擴增反應)體系

PCR參數94℃ 5分鐘

72℃ 10分鐘3、PCR產物純化(試劑盒購自鼎國)1)PCR產物進行瓊脂糖電泳，切取含有DNA片段的瓊脂糖膠(100-200mg)，按1∶3(切取體積∶溶液A體積)的比例加入溶液A；2)65℃水浴5-10分鐘，待膠完全溶化，加入15μl溶液B，混勻；3)混和液移入離心柱中，靜置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘；4)倒掉液體，加入500μl溶液C，8,000rpm離心1分鐘；5)重復步驟4)；6)倒掉液體，加入500μl溶液D，8,000rpm離心1分鐘；7)重復步驟6)；8)12,000rpm離心1分鐘，甩干殘存的液體；9)離心柱置入新的離心管中，敞開管蓋5-10分鐘使乙醇揮發殆盡；10)加入20μl溶液E(50℃預熱)，靜置2分鐘；11)12,000rpm離心2分鐘，管底溶液即為所需的純化產物，放-20℃保存。
(二)標記探針在一個0.5ml離心管中加入下列試劑(室溫放置1小時)

PCR產物需在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘。
(三)探針純化將純化柱子先顛倒混勻，去掉底部片狀物放入離心管中，700g離心3分鐘，將標記好的探針加到柱子中，換一個新的離心管，700g離心3分鐘。
(四)預雜交將膜用6×SSC浸5分鐘，貼于雜交管壁，除去氣泡，加入6ml預雜交液(15ml購于Clontech的雜交液加1.5mg鮭精DNA 98℃變性5分鐘后，立即冰浴2分鐘)，68℃預雜交1小時。
(五)雜交倒掉預雜交液，加入上一步剩下的雜交液9ml及探針(純化好的探針加入150μg鮭精DNA在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)，68℃雜交5-6個小時。
(六)洗膜先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在68℃洗膜四次，每次30分鐘。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在68℃洗30分鐘，共兩次，最后用200ml2×SSC室溫洗5分鐘。
(七)壓片及洗片用濾紙吸去膜上的液體，用保鮮膜包好，貼于一張與X光片相同大小的濾紙上，壓片；-70℃曝光適當時間，洗片。
三、實驗結果如圖1和表1所示，雜交結果顯示CARP在這13種癌組織中相比于其對應的正常組織均表達下調，尤其在乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌和前列腺癌中下調的程度較高。
表1、CARP在所檢測的13種癌組織中下調的統計情況。

實施例2、重組腺病毒載體的構建以及重組病毒的獲得為了進一步證實CARP基因對腫瘤的抑制作用，我們構建了攜帶CARP基因的重組腺病毒載體pAd-CMV-CARP，以及另一腺病毒空載體pAd-CMV-GFP作為負對照。載體構建好之后，我們利用293細胞包裝、擴增出大量的重組腺病毒，并將所得的病毒進行純化以及滴度的測定。
一、材料方法(一)將目的基因CARP克隆入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV中1、由于CARP基因cDNA上751-758位有一個PacI酶切位點(TTAATTAA)，因此多設計一個中間引物5’-GGCAGCCAAAGTTTGATTAATCTCCTGCTGACGGG-3’，將第753位的A點突變為G。
上游引物5’-CGCCGGTACCCCATCATGTCCGAACTGAC-3’(下劃線為KpnI酶切位點)，下游引物5’-ATACCTCGAGAAATTAATTTAGTGAAGGAGAGC-3’(下劃線為XhoI酶切位點)。
2、第一輪PCR以中間引物為上游引物，與下游引物一起進行擴增1)PCR體系

2)PCR參數94℃ 5分鐘

72℃ 10分鐘3)PCR產物純化回收(方法及試劑與前面一樣)3、第二輪PCR以第一輪的PCR產物為下游引物，與上游引物一起進行擴增1)PCR體系

2)PCR參數94℃ 5分鐘

72℃ 10分鐘3)PCR產物純化回收(方法及試劑與前面一樣)4、將第二輪的PCR產物與T載體連接，轉化，提質粒，進行測序。驗證無誤后，經KpnI和XhoI雙酶切；同時以這兩種酶雙酶切pAdTrack-CMV。
酶切體系

37℃水浴孵育2小時。
酶切產物純化回收(方法與PCR產物純化回收一樣)。
兩個酶切產物連接，轉化，篩選得到pAd-CMV-CARP。
(二)在大腸桿菌BJ5183中通過同源重組產生腺病毒質粒1、用試劑盒(Hispeed Plasmid Midi Kit，購自QIAGEN公司)純化pAd-CMV-CARP，pAdTrack-CMV以及腺病毒骨架載體pAdeasy-11)挑新鮮的單克隆接種于3ml LB培養基中(分別加入相應的抗生素，pAd-CMV-CARP和pAdTrack-CMV為卡那50μg/ml，pAdeasy-1為氨芐100μml)，37℃，300rpm，8小時；2)按1∶500將其接種于50ml LB培養基中(加入相應抗生素)，37℃，300rpm，12-16小時；3)收獲細菌，4℃，6,000g，15分鐘；
4)用6ml已加RNaseA的Buffer P1重懸細菌，充分混勻；5)加入6ml Buffer P2，小心混勻，室溫放置5分鐘(不能超過5分鐘，以防止染色體DNA斷裂)；6)準備QIAfilter Cartridge，將螺帽擰在其下面的管口上，放于一無菌的50ml管中備用；7)加入6ml預冷的Buffer P3，小心混勻以裂解細菌，不要置于冰上；8)將裂解混合物加入QIAfilter Cartridge中，室溫放置10分鐘，不要插入活塞；9)加4ml Bμffer QBT用來平衡Hispeed Midi Tip，讓液體靠重力通過柱子流盡；10)去掉QIAfilter Cartridge下面的螺帽，小心插入活塞，將裂解液濾入平衡好的Hispeed Midi Tip中；11)讓液體靠重力通過柱子；12)加入20ml Bffer QC，充分洗滌柱子；13)用5ml Bffer QF洗脫DNA(質粒)；14)加入3.5ml室溫放置的異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘；15)在此時間內，拔掉20ml注射器的栓塞，并將QIAprecipitator Midi Modμle小心的插到注射器嘴上；16)將混合物倒入20ml注射器中，插上栓塞，用力壓下，使液體濾過QIAprecipitator；17)將QIAprecipitator從注射器上拔掉，再拔出栓塞，再重新插上QIAprecipitator，加入2ml70％的乙醇，與上一步一樣，插上栓塞，用乙醇洗滌DNA；18)將QIAprecipitator從注射器上拔掉，再拔出栓塞，再重新插上QIAprecipitator，插上栓塞之后用力壓下以空氣干燥膜和DNA；重復此步一次；19)用吸水紙小心吸干QIAprecipitator的管嘴，防止乙醇上吸；20)拔掉5ml注射器的栓塞，并將QIAprecipitator Midi Modμle小心的插到注射器嘴上，加入500μl Bμffer TE，插入栓塞，將溶解的DNA濾到一個1.5ml的離心管中。此即為純化好的質粒，放-20℃保存。
2、BJ5183感受態細菌的制備1)挑取新鮮單克隆于3ml LB(含30μg/ml鏈霉素)中，37℃，300rpm，12小時；2)按1∶500稀釋于250ml LB中(含30μg/ml鏈霉素)，37℃，300rpm，4-6小時，直至OD550＝0.6；3)將菌液收集于50ml離心管中，冰浴2-4hr；4)4℃，3,000rpm離心10分鐘；5)棄上清，將細菌沉淀懸浮于250ml無菌的、冰預冷的WB溶液(甘油∶水＝1∶10)中，于4℃，3,000rpm離心10分鐘；6)棄上清，重復洗滌二次；7)小心吸棄大部分上清，剩約5ml，將細菌懸液轉移至50ml離心管，4℃，3,000rpm離心10min；8)再次倒掉大部分上清，只留0.5ml上清；9)將細菌懸液分裝于在-80℃預冷的離心管中，保存于-80℃。
3、電擊共轉化入大腸桿菌BJ51831)重組穿梭質粒(pAd-CMV-CARP和pAdTrack-CMV)分別用PmeI單酶切，使之線性化，純化回收酶切產物；2)0.1μgpAdEasy-1與1.0μg線性化穿梭質粒混合，高壓電轉化入BJ5183感受態細菌中；(電轉條件2,500V，200Ohms，25mFD)3)電轉后立即將1ml LB培養液加入細菌中，37℃培養30分鐘；4)取適量細菌涂在含50μg/ml卡那霉素的培養板上，37℃培養16-20小時；5)挑選卡那霉素抗性克隆(小克隆含陽性重組子的可能性大)，堿裂解法小量提取質粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳初步分析，并以PacI酶切進行鑒定，陽性克隆經測序驗證；6)將所得的陽性重組腺病毒質粒與上述同樣條件電轉化入宿主菌DH10B中(在此宿主菌中容易獲得高拷貝的質粒)。這樣即得到兩個重組腺病毒質粒pAd-CMV-CARP和pAd-CMV-GFP。
(三)在293細胞系中包裝出腺病毒1、腺病毒質粒的線性化取重組腺病毒質粒8μg，用PacI酶切(1U/1μg DNA)，37℃，2小時完全消化以切去ori和kana抗性基因等質粒元件，并暴露其反轉末端重復序列(ITR)。酶切產物經酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于無菌水中。
2、轉染293細胞及病毒的包裝1)轉染前24小時于每T-25cm2培養瓶中接種1×106細胞，轉染時細胞密度為50-70％；2)轉染時，將含有4μg重組腺病毒質粒(線性化好的)和10μl的脂質體(Lipofectamine2000，Gibcol)分別加到1.5ml的離心管中，然后加入500μlDMEM(無抗生素，無血清)，兩種液體混合，室溫放置20分鐘；3)同時吸掉293細胞的舊培養液，用4ml的無血清，無抗生素的DMEM培養液洗1-2次，加入2-3ml DMEM(無抗生素，無血清)，于37℃，5％ CO2，條件下培養10分鐘；4)將脂質體-DNA混合物加入上述293細胞中，輕輕混勻，于37℃，5％ CO2，培養；5)4-6小時后，吸走轉染液，換入5ml的完全DMEM(10％FBS，100單位/ml的青霉素，100單位/ml的鏈霉素)，于37℃，5％ CO2，繼續培養；6)轉染后7-10天，大約30-50％的細胞已經漂起，用吸管吹下細胞轉入50ml離心管中；7)將細胞凍于-70℃，30分鐘，然后放入37℃水浴中融化，待半融化狀態時，渦旋震蕩2分鐘。重復此步3次(一共4次)；8)1,000-2,000rpm，離心10分鐘；9)分裝上清(此即為包裝好的病毒)，保存于-70℃備用。
(四)大規模擴增以得到高滴度的病毒1、首次擴增的存儲病毒的獲得
1)用上述收集的病毒的20-30％去感染1瓶T-25cm2培養瓶的293細胞(50-70％匯合)，感染后2-3天CPE或細胞裂解應當很明顯；2)通常在感染后3-4天，當大部分的細胞脫落時，收集病毒。這稱為首次擴增的存儲病毒，此次擴增的存儲病毒含有最低比例的RCA，所以是非常寶貴的存儲病毒；3)依上述步驟(-70℃/37℃/Vortex)收集病毒上清及細胞，每瓶T-25cm2培養瓶收獲的病毒溶于1-2ml PBS中，此時至少有107感染性病毒顆粒/ml；2、準備下一步大規模擴增病毒每次擴增之前，都應該作MOI試驗以確定下一步擴增所需的病毒用量。
MOI試驗24孔板培養293細胞，待70-80％融合，移去培養基，每孔加入以新鮮培養基梯度稀釋的病毒上清，留一孔作對照。感染3小時，其間隔30分鐘輕搖一次。感染后移去病毒，加0.5ml完全培養基，37℃，5％ CO2，繼續培養。感染后3天產生完全CPE所對應孔的MOI即相當于10-20。
除每次的規模有所不同外，每輪擴增的方法基本相同。另外第一次大規模擴增的MOI值用10，隨后幾輪用25。
3、腺病毒的大規模擴增1)用10ml完全DMEM于T-75cm2的培養瓶中種植3×106個293細胞，使其在感染時約80％匯合；2)從75cm2的培養瓶中移去培養基，小心將病毒上清(MOI＝10-20)加到細胞表面，注意不要破壞細胞層，交叉方向慢搖培養皿3次以鋪展混合物。于5％CO2、37℃孵育90分鐘，其間每15分鐘輕搖一次培養瓶；3)補加9ml的完全DMEM；4)感染后通常于CO2孵箱37℃孵育3-4天，當全部的細胞卷起，約一半細胞脫落時，準備收集病毒。
5)按前面的方法收集病毒上清，保存于-70℃。
(五)CsCl密度梯度法純化重組腺病毒純化病毒包含3個步驟不連續CsCl梯度除去大部分細胞碎片和缺陷病毒顆粒(CsCl沉降)；
連續CsCl梯度徹底從缺陷病毒顆粒中分離感染性病毒(CsCl密度梯度)；透析除去CsCl。在大多數情況下，可能是被培養基稀釋的緣故，甘油或CsCl的存在不會對實驗有影響，所以體外細胞學實驗不必透析；但用含CsCl的病毒儲存液直接注射動物組織可能誘發病變，因此體內實驗必須要經過透析。
1、不連續CsCl梯度除去大部分細胞碎片和缺陷病毒顆粒1)制備CsCl低密度母液(67.2g CsCl溶于10mM Tris-HCl pH8.0緩沖液中至總重量為300g即成，密度為1.2g/ml)、高密度母液(126.6g CsCl溶于10mMTris-HCl pH8.0緩沖液中至總重量為300g即成，密度為1.46g/ml)；2)將收集的30瓶T-75cm2培養細胞于12ml PBS中徹底凍/融/振蕩三次，2,000rpm離心5分鐘，所得病毒裂解液上清即可用于超離；3)在超凈臺內，按照密度由高到低的順序分別將4.5m高密度母液、4.5ml低密度母液以及3ml病毒裂解液上清加至13.2ml的超速離心管中，小心操作以形成密度梯度；4)用相應的轉頭(Beckman，SW41Ti)以10,000×g于4℃離心2小時。
5)小心地從梯度上方吸棄大部分細胞碎片等，隨后用21號針頭側向刺穿位于高/低密度CsCl之間的白色條帶，刺入位置在帶的下面，小心吸出病毒條帶。
6)用1倍體積的1×TE(pH7.9)稀釋病毒，以便進行下一步連續CsCl梯度離心。
2、連續CsCl密度梯度徹底從缺陷病毒顆粒中分離感染性病毒離心前估計樣品與CsCl梯度體積的比例，盡量使上樣體積不超過CsCl體積的20％。
1)如上將高密度CsCl母液、低密度母液、病毒條帶溶液加至13.2ml離心管中；2)10,000×g，4℃離心20小時；3)如上操作吸棄目的病毒帶上方的許多空衣殼和不成熟的大分子等，隨后側向穿刺小心吸出病毒條帶，準備用于透析。
3、透析除去CsCl
將上面吸出的病毒條帶加入透析袋(MD-25，12-14kD)中透析12小時，其間更換透析緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM MgCl2，10％甘油)3次。透析完全后，用2×病毒儲存液(10mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，0.1％BSA，50％甘油)按1∶1稀釋病毒，0.22μm濾膜過濾，分裝后放-70℃保存。這樣即得到純化好的兩個病毒Ad-CMV-CARP(簡稱Ad-CARP)和Ad-CMV-GFP(簡稱Ad-GFP)。
(六)病毒滴度測定進行體內實驗需要定量的病毒濃度指導，因此在這之前必須測定病毒的確切滴度。
1、OD法初步測定取15μl純化好的病毒用0.435ml H2O稀釋，另外用0.435ml H2O稀釋15μl高密度CsCl母液作為空白對照，在260nm檢測OD值，按1012VP/OD260進行換算。
2、GFP法(適用于帶GFP的腺病毒滴度測定)將病毒儲存液作不同比例的稀釋，取500μl稀釋液加至T-25cm2培養瓶培養的293細胞中，于37℃吸附30分鐘，換新鮮培養基繼續培養36小時，在熒光顯微鏡下計數GFP陽性細胞數，按病毒滴度＝GFP陽性細胞數×病毒上清稀釋倍數/0.5ml＝pfu/ml計算。
(七)重組腺病毒CARP基因的PCR鑒定1、病毒基因組DNA提取收集正常及2種病毒感染后發生病變的各組293細胞，棄上清，加入2ml PBS，刮下細胞，混勻，凍融細胞4次，于4℃ 10,000rpm離心10分鐘，取上清，加入200μl蛋白酶K(5mg/ml)，并加入2ml SET裂解液(1％SDS，10mM EDTA，20mMTrisCl pH8.0)，56℃消化2小時，12,000rpm離心10分鐘，取上清，等體積的酚/氯仿抽提一次，無水乙醇沉淀，20μl TE溶解。
2、PCR鑒定以上述病毒基因組DNA為模板，以擴增CARP基因的引物進行擴增。
1)PCR體系

2)PCR參數94℃ 5分鐘

72℃ 10分鐘PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
二、實驗結果1、重組腺病毒載體的構建及酶切鑒定腺病毒骨架載體pAdeasy-1與帶CARP基因的穿梭載體pAd-CMV-CARP以及作為陰性對照的空載體pAd-CMV-GFP共轉化大腸桿菌BJ5183，在同源重組相關酶的作用下發生同源重組。穿梭載體的右臂與骨架載體的右臂均含有Ad5病毒基因組3524bp-5772bp的序列，可介導二者的同源重組；而穿梭載體的左臂與骨架載體的左臂共有腺病毒Ad5的右端34931-35935序列，同源重組可在此區發生(PacI酶切出35kb和3.0kb片段)，也可在其共有的質粒復制原點ori處發生(PacI酶切出35kb和4.5kb片段)。PacI酶切鑒定構建好的pAd-CARP和pAd-GFP質粒，發現屬于第二種情況，如圖3所示，其中M為Marker(DL 15,000，TaKaRa)，1為pAd-CARP+PacI，2為pAd-GFP+PacI，3為pAd-CARP，4為pAd-GFP。
2、重組腺病毒的制備及鑒定Ad-CARP及Ad-GFP重組腺病毒，經293細胞包裝、擴增并純化后制備成病毒貯存液，各重組腺病毒的滴度測定為Ad-CARP1.0×1011pfu/mL，Ad-GFP5.0×1010pfu/mL。提取各重組腺病毒DNA，以CARP基因的引物進行PCR鑒定，結果如圖4所示，其中M為Marker(DL 2,000，TaKaRa)，1、2為Ad-CARP，3、4為Ad-GFP，5為陰性對照。Ad-CARP可見1.4Kb的陽性擴增條帶，而Ad-GFP和陰性對照均沒有條帶。
用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制病毒濃度為1012病毒顆粒/毫升的溶液，即得本發明所述的含有抑癌基因CARP的藥物。該藥物可用于治療乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌和前列腺癌等癌癥。
實施例3、MTT分析CARP對腫瘤細胞增殖的影響一、材料和方法接種1,000個A549細胞(購自協和醫大基礎所細胞中心)到96孔板，接種前在含0.5％FBS的F12培養基中饑餓12小時，貼壁3-4小時后用不同濃度(MOI＝50或100)的Ad-CARP、Ad-GFP或PBS分別感染48小時，之后換入新鮮的培養液(F12，10％FBS)繼續培養6天后(每兩天換液一次)，加入20ul MTT(5mg/ml，Sigma)，37℃，5％CO2培養4小時，換入100ul DMSO二甲基亞砜)，充分溶解后490nm測OD，重復三次。
二、實驗結果圖5為MTT檢驗腺病毒介導的CARP對A549細胞生長的抑制(*，P＜0.01)，我們通過MTT方法的分析發現，腺病毒介導的CARP基因超表達能夠抑制肺癌A549細胞的增殖。
實施例4、腺病毒介導的CARP基因高表達對腫瘤發生的抑制一、材料和方法(一)材料1、免疫缺陷小鼠為了排除其它因素的干擾，本實驗均用免疫缺陷小鼠，即俗稱的裸鼠，購自中國醫學科學院動物所，BALB/c-nu、5-6周齡、雌性。這種小鼠胸腺缺失，為第11對染色體隱性遺傳；由于無胸腺，不能使T細胞正常分化，故T細胞免疫缺陷；B淋巴細胞正常，但功能缺陷，抗體主要為IgM，只有少量IgG；無接觸敏感性，無移植排斥反應，因此廣泛用于免疫學、腫瘤學和疾病發生機理的研究。
2、細胞選用一種肺癌細胞系A549，用F12完全培養基(10％FBS，100單位/ml的青霉素，100單位/ml的鏈霉素)，37℃，5％CO2進行培養。待A549細胞長至70-80％匯合，分別用腺病毒Ad-CARP和Ad-GFP(作為負對照)以MOI＝10-20進行感染；另外設一對照組，加入與病毒等體積的PBS作處理。48小時后，A549細胞經0.125％胰蛋白酶消化，離心去上清，而后用無血清F12離心洗滌2次，用血球計數板進行細胞計數以調整細胞濃度，最后將細胞懸浮于適量PBS中，使細胞懸液濃度為5×107cells/ml。
(二)方法1、腫瘤細胞皮下接種裸鼠用帶6號針頭的一次性1ml注射器抽取上述準備好的細胞懸液200μl(即大約107cells/只)，接種于裸鼠(BALB/c Nude，♀，5～6周齡)右側腹背部皮下。每個處理組(PBS、Ad-CARP和Ad-GFP)均有7只裸鼠。2、觀測腫瘤的生長狀況每2-3天觀察一次腫瘤的形成情況，并用游標卡尺測量腫瘤的直徑。腫瘤的體積用公式V＝a×b2/2來計算，其中a為腫瘤最長的直徑，而b則是與這條長徑垂直的直徑。
二、實驗結果將經Ad-CARP及Ad-GFP以MOI 10-20的感染強度處理48小時的A549細胞，分別注射于2組裸鼠皮下，每組7只，每只注射5×107cells/ml的細胞懸液200μl，另1組7只則注射經PBS處理的A549細胞(5×107cells/ml)200μl，結果顯示，1個月后注射經Ad-CARP處理過的A549細胞的裸鼠成瘤率為零，而Ad-GFP及PBS處理組成瘤率為100％，見表2和圖6所示。
表2、A549細胞經Ad-CARP處理后裸鼠致瘤檢測

圖6，經過PBS、Ad-CARP或Ad-GFP處理的A549細胞接種裸鼠后的腫瘤生長曲線。(PBS組與Ad-GFP組比較，差異不顯著，P＝0.325)實施例5、腺病毒介導的CARP基因高表達在體內對腫瘤生長的抑制一、材料方法我們首先建立A549的裸鼠腫瘤模型，再直接注射攜帶CARP基因的腺病毒進行治療，以驗證CARP基因的高表達能否抑制腫瘤的生長。
1、裸鼠腫瘤模型的建立如上，取對數生長期的正常A549細胞，經0.125％胰蛋白酶消化，離心去上清，而后用無血清F12離心洗滌2次，細胞計數調整細胞濃度，將細胞懸浮于PBS中，細胞濃度為5×107cells/ml。然后1ml注射器抽取細胞懸液200μl(大約107cells/只)，接種于裸鼠(BALB/c Nude，♀，5～6周齡)右側腹背部皮下。大約一周后，腫瘤即開始形成，肉眼可見。同樣，每2-3天測量一次腫瘤的大小。2、腺病毒介導的治療待腫瘤長至5-10mm直徑時(大約在細胞接種后10天左右)，分別給每只裸鼠注射Ad-CARP、Ad-GFP(作為負對照)或者PBS，直接注射到腫瘤內部；每兩天注射一次，總共四次，其中前兩次注射的病毒劑量為0.5×1010pfu/tumor，后兩次注射的病毒劑量為1.0×1010pfu/tumor。每個治療組都有6只裸鼠。病毒注射結束后，繼續觀測腫瘤的生長情況20天，在此期間腫瘤大小的測量和計算方法與上面一樣。
二、實驗結果將A549細胞制成5×107cells/ml的細胞懸液，以每只200μl的量分別注射于裸鼠右側腹背部皮下，待腫瘤長至直徑5mm左右時取瘤體較為均一的裸鼠，隨機分為3組，每組6只，分別直接向瘤內注射Ad-CARP，Ad-GFP以及PBS；每兩天注射一次，總共四次，其中前兩次注射的病毒劑量為0.5×1010pfu/tumor，后兩次注射的病毒劑量為1.0×1010pfu/tumor。此后每2-3天測量1次腫瘤大小(根據公式計算腫瘤體積)，整個治療實驗持續1個月。結果顯示，在實驗過程中由Ad-CARP治療的裸鼠腫瘤明顯小于Ad-GFP組和PBS組，到實驗終期Ad-CARP對腫瘤生長的分別抑制率為72.6％(相比于PBS組)和64.3％(相比于Ad-GFP組)，結果見表3和圖7所示。
表3、Ad-CARP對裸鼠A549腫瘤的體內治療

*P＜0.01 vs Ad-GFP or PBS圖7，Ad-CARP對腫瘤生長抑制的效果。箭頭所指為安排的治療日程。Ad-CARP組跟兩個對照組相比較差異均顯著(P＜0.007 vs Ad-GFP，P＜0.002 vs PBS)。
權利要求
1.一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于其有效成分為CARP基因、或其剪接體、或其反義寡核苷酸、或其編碼的肽和肽段中的一種或幾種。
2.根據權利要求1所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述CARP基因、或其剪接體、或其反義寡核苷酸整合于載體上。
3.根據權利要求2所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述載體為基因治療載體，選自選自裸體質粒、腺病毒、腺相關病毒和逆轉錄病毒中的一種或幾種。
4.根據權要求2或3所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述載體內含有一個拷貝正常的CARP基因或突變體CARP基因，具有抑制腫瘤的作用。
5.根據權利要求4所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述載體為腺病毒。
6.根據權利要求5所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述腺病毒為E1、E3缺失的C種5血清型入腺病毒，帶有CMV啟動子，屬于第二代腺病毒載體。其重組系統為購自QUANTUM公司的AdEasyTM系統，系統由兩種質粒組成，一種是包含有E1、E3缺失的腺病毒基因組DNA的大質粒(骨架質粒)；另一種是小的穿梭質粒，其帶有目的基因表達盒以及在表達盒兩側的與大質粒上的目的基因擬插入部位同源的序列(左、右臂)。
7.根據權利要求6所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述腺病毒的濃度為1012病毒顆粒/毫升。
8.根據權利要求7所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物，其特征在于所述藥物中還含有PH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液溶劑。
9.一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物的用途，其特征在于該藥物可用于治療治療乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌和前列腺癌等癌癥。
10.根據權利要求9所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物的用途，其特征在于所述癌癥為肺癌、肝癌、乳腺癌及前列腺癌。
11.根據權利要求1至10中任何一項所述的一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物或其用途，其特征在于所述的抗癌藥物是指一切化學、生物、天然、人工合成的能夠調整CARP表達的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種含有CARP基因及其相關產物的抗癌藥物及其用途，屬于生物制藥領域。本發明的優點是本發明采用本實驗室克隆的新的抑癌基因－CARP基因，通過基因工程的方法將其整合到重組腺病毒載體中，制備成抗腫瘤的藥物。通過細胞學、體外及動物實驗證實，其腫瘤抑制作用非常明顯，且毒副作用低，致病性小。
文檔編號A61K48/00GK1555890SQ20041000007
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優先權日2004年1月8日
發明者惠汝太, 石毅, 張震, 劉寶華, 韓玉, 王偉, 張芊, 甄一松, 張雪燕, 婁可佳, 鄒玉寶 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院