專利名稱：加強細胞生長抑制藥凋亡作用的5－取代核苷的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及DNA修復基因和/或癌基因的至少一種超表達抑制劑用于生產提高化療后細胞生長抑制劑的凋亡作用的藥物的用途。
人類癌癥是最常見的死亡原因，而化療是最常用的治療方法。化療治療治愈率不夠高是由于耐藥性的產生。這些耐藥性的根源在于細胞生長抑制劑影響基因表達并且具有基因毒性作用，例如引起突變、基因擴增和重組，并因此使基因組不穩定。這樣，化療導致或選擇耐藥性癌細胞。通常癌基因如Ras、Bcl2、Bcr-abl、Myc、ErbB2等受細胞生長抑制劑所致效應的影響。錯誤受控的基因表達連同DNA修復和重組一起也導致化療耐性(例如p53基因、BRCA1/2、UBE2N、APEX和Rad51)，此外代謝和生物激活細胞生長抑制劑的酶(例如DHFR、DT-黃遞酶(DT-D))或運送細胞生長抑制劑的蛋白質(例如MDR1)也導致化療耐性。
大多數細胞生長抑制劑消除腫瘤是因為其導致凋亡。凋亡是一種程序化細胞死亡的形式，首先記述在Kerr，J.F.et al.，Br J Cancer，26(4)(1972)；239-257中。與壞死相反，凋亡是細胞死亡的生理形式。這兩種形式的細胞死亡可通過壞死和凋亡之間的差異來區分。凋亡具有連續發生有序級聯事件的確定的形態學和生物化學特征。該連續過程可劃分為多個階段。凋亡的形態學特征為核染色質凝聚(核固縮)、細胞質收縮、凋亡囊泡和最終的凋亡小體形成。腫瘤細胞可以通過過度活化存活機制而防止凋亡。因此，化療耐性還包含抗細胞凋亡作用基因，例如STAT3，即激活的“轉錄信號轉導物和活化物3”，或者JUN-D。
1995年發現了此前未知的特定激素和5-取代核苷的作用。其抑制中國倉鼠細胞中2-氨基-6-巰基嘌呤(AMP)誘導的SV40擴增(Fahrig，R.et al.，Mutat Res.，356(2)，1996，217-224)和酵母菌中三乙撐三聚氰酰胺誘導的重組(Fahrig，R.，Mutat Res.，372(1)，1996，133-139)。在EP 0 806 956 B1中描述了用5-取代核苷治療小鼠白血病細胞，抑制了阿霉素(亞德里亞霉素)誘導的Mdr1基因擴增和化療耐性。
迄今為止所進行的體外試驗中，5-取代核苷(即堿基類似物)總是與一種或多種細胞生長抑制劑一起應用。
從本文所述的現有技術出發，本發明的目的是防止由耐藥性形成所致的細胞凋亡作用下降或至少延遲這種下降，從而提供相對于現有技術的已知療法改進的治療方法。
該目的通過權利要求1所述的用途實現。其他從屬權利要求說明了有利的方案。
根據本發明，提供了DNA修復基因和/或癌基因的至少一種超表達抑制劑用于生產提高化療后細胞生長抑制劑的凋亡作用的藥物的用途。
值得注意的是，上述所有的DNA修復基因UBE2N和/或APEX、DDX1、STAT3和/或JUN-D都是癌基因。
優選的是，將5-取代核苷、其受保護形式、鹽或前藥用作超表達抑制劑。
優選的是，在化療中聯合使用至少一種細胞生長抑制劑和DNA修復基因和/或癌基因的至少一種超表達抑制劑或包含超表達抑制劑的藥物。
對于5-取代核苷，使用(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧尿苷(BVDU)，可以使用其受保護形式、其鹽和/或前藥。根據本發明的BVDU前藥的實例由以下通式I表示 優選的是，5-取代核苷的所用劑量應使其血液濃度為0.02-50μg/ml。
令人驚奇的是，能夠證明在化療完成之后，如果細胞進一步單獨用5-取代核苷(堿基類似物)治療，其生長受抑制程度會比用細胞生長抑制劑繼續化療更高。完全出乎預料的是，5-取代核苷(堿基類似物)的效果上升而非下降。
根據本發明利用篩選體系確定了該效果。該篩選方法為基于在優選8-30天的化療周期期間用劑量逐漸增加的細胞生長抑制劑和恒定劑量的超表達抑制劑治療腫瘤細胞。在該組合處理之后，中斷細胞生長抑制劑，僅使用超表達抑制劑治療。該恢復期(亦稱恢復階段)優選持續3-10天。這類化療周期可連續進行至多6次。
結果，產生了令本領域技術人員驚奇的治療方式的格局。
—單獨給予5-取代核苷顯示無效。
—5-取代核苷與細胞生長抑制劑共同施用有效。
—在5-取代核苷先與細胞生長抑制劑共同施用之后再單獨使用5-取代核苷，表現出更高的效果。
該效果，即抑制化療耐性和增加化療敏感性，可以描述為通過影響特定基因的基因表達對細胞生長抑制劑所致凋亡的無毒保持。其發生是通過1、阻斷恢復期的“存活通路”。
2、阻斷相關酶的DNA修復。
3、引起DT-黃遞酶的活性。
4、減少恢復期內生成ATP的酶的表達。
對于1)，堿基類似物如BVDU理論上在中斷細胞生長抑制劑之后的聯合治療的恢復階段阻斷“存活通路”，從而促進凋亡進程。
利用大鼠AH13r腫瘤細胞的HOPI雙染色，可以檢測到諸如阿霉素(DOX)、米托蒽醌(MXA)或絲裂霉素C(MMC)的細胞生長抑制劑引起凋亡。和堿基類似物(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧尿苷(BVDU)的聯合治療通過阻斷包括STAT3和JUN-D的抗凋亡“存活通路”來促進凋亡。
該效應首先發生在細胞的恢復期，如實施例2所見。
組成型激活的STAT3具有致癌效應，導致不同的人類癌癥的發聲。這通過抑制凋亡而發生。這樣，STAT3促進腫瘤細胞的生存，并使細胞抵抗化療。
相應地，抑制“STAT3信號轉導”引起凋亡，增加對細胞生長抑制劑的敏感性。
作為JUN基因家族一員的JUN-D是廣泛表達的“激活蛋白-1”(AP-1)轉錄因子復合體的基本組分。JUN-D(-/-)原代成纖維細胞表現出UV輻射或TNFα治療之后的早熟老化和凋亡增加。該結果導致JUN-D激活“NF-кB存活通路”的假定。此外，由JUN-D直接調節的p202使得成纖維細胞能夠抵抗凋亡。
通過BVDU的聯合治療減少兩種JUN-D亞型的表達約四分之一。相反，STAT3在恢復期受調節約三分之二(實施例2)。
用絲裂霉素C聯合治療之后的恢復期內的效過尤為印象深刻。在此，堿基類似物減少癌基因JUN-D的超表達至對照水平(實施例2)。
對于2)，堿基類似物如BVDU阻斷DDX1。DDX1與MYCN共同擴增，并且在成神經細胞瘤(NB)和成視網膜細胞瘤細胞系和腫瘤中超表達。DDX1和MYCN擴增的NB患者具有比僅有MYCN基因擴增的患者更差的預后。DDX1因此具有致癌潛力。
MMC與BVDU的聯合治療減少UBE2N和APEX的超表達約三分之一。UBE2N的修飾影響對DNA損傷的耐受性。APEX核酸酶是DNA修復酶。阻斷APEX表達加倍細胞溶解并增加DNA斷裂。
對于3)，BVDU誘導DT-黃遞酶(實施例3)。DT-黃遞酶具有兩種對于化療非常重要的性質。一方面，它激活來自醌類的細胞生長抑制劑，另一方面，減少基于活性氧物質產生的非特異性毒性效應。
缺少DT-D基因通過減少p53和p73表達導致骨髓增生和相應地凋亡速率減小。這與所觀察到的腫瘤細胞多因子“多藥耐藥性”表型涉及DT-黃遞酶的減少而非增加相一致。令人感興趣的是，DT-D酶活性也穩定了淋巴細胞群。該效應可對化療期間患者免疫系統的穩定具有有利影響。
許多細胞生長抑制劑，例如DOX和MXA，破壞癌細胞的氧化還原態和線粒體呼吸。這導致生成活性氧物質(ROS)。不僅癌細胞而且所有其他細胞均受ROS突然積聚所影響，其結果是化療中發生不期望的副作用。
DT-D使ROS失活，因而保護細胞免受非特異性ROS和親電子攻擊。作為對于化療期間減少不希望的副作用的該BVDU作用的指標，在實施例4中引用了阿霉素+BVDU治療的大鼠體重增加。由于毒性副作用，單獨的DOX治療導致體重下降。顯然使用BVDU僅減少了副作用(可能是DOX的心臟中毒特性)，但未減少對腫瘤的毒性作用。
對于4)，通過改變恢復期不同酶的表達，沒有細胞生長抑制劑時也保持了細胞生長抑制作用。如在實施例5中可見，8種基因的表達增加，6種基因的表達下降。
基因產物影響微絲形成、分化、信號轉導和ATP產生。
參照以下附圖和實施例詳細說明根據本發明的主題，而非限制所述主題于所提及的實施方案。
圖1示出細胞生長抑制劑單獨使用以及和BVDU組合使用對AH13r細胞的作用。
圖2對比圖1，示出使用阿霉素(DOX)、米托蒽醌(MXA)和氨甲蝶呤(MTX)的結果。
圖3示出用阿霉素(DOX)測試“存活通路”的Western印跡分析。
圖4示出對應于圖3用絲裂霉素(MMC)的測試。
圖5示出DT-黃遞酶DT-D、阿霉素(DOX)單獨使用或與BVDU一起使用的測量結果。
圖6示出對應于圖5用氨甲蝶呤(MTX)的測試。
實施例1BVDU治療增加AH13r肉瘤細胞對化療引起的凋亡的敏感性。該效應甚至在所謂恢復期內中斷細胞生長抑制劑后也得以保持。
AH13r細胞經受遞增劑量的細胞生長抑制劑絲裂霉素C(MMC)。單獨給予BVDU顯示無毒性作用。MMC+BVDU治療在三次治療周期之后導致細胞數量相比于單獨使用MMC治療下降。這種抑制作用甚至在所謂恢復期內的下一周期中中斷細胞生長抑制劑之后依然得以保持。未用MMC和BVDU的細胞繼續生長而未受抑制。然而，繼續接受BVDU的這些細胞的生長大大受到抑制(見圖1)。
使用阿霉素(DOX)、米托蒽醌(MXA)和氨甲蝶呤(MTX)得到相應的結果(見圖2)。
細胞數減少的指標基于凋亡，利用Hoechst 33258/碘化丙錠(Hopi)雙染色檢測。
實施例2我們利用Western印跡分析測試了不同的“存活通路”。該分析根據標準方法進行，如Sambook et al，2001，Molecular Cloning(第三版)中所述。抗體稀釋液P-STAT3(細胞信號轉導)1∶500，JUN-D(Santa Cruz，California)1∶1000。兩個JUN-D帶中上面的顯示“全長亞型”，下面的“截短的亞型”短了48個氨基酸。兩種亞型均可激活轉錄，但“全長”變體比“截短的”亞型更為有效。(參見圖3)。
恢復期(r＝恢復期)中DOX治療之后，癌基因蛋白JUN-D和STAT3通過光密度計量測定的含量下降四分之一或三分之二。在“恢復”中僅給予BVDU，沒有細胞生長抑制劑。
在用絲裂霉素C(MMC)的測試中得到相應的結果(見圖4)。
在用絲裂霉素C(MMC)的測試中，在“恢復”中給予的BVDU的作用是將MMC引起的JUN-D超表達完全抑制到對照水平。
實施例3DT-黃遞酶(DT-D)的測定如可受雙香豆素抑制的NAD(P)H二氯苯酚靛酚還原酶進行，如Hodnick et al.，Anal.Biochem 252(1)，1997，165-168所述。我們對類似數目的已用DOX+/-BVDU處理過的細胞的提取物進行了檢測。以BVDU處理的細胞表現出相對于來自對照組和來自單獨用DOX處理的細胞組約3倍的活性(見圖5)。
用米托蒽醌(MXA)和氨甲蝶呤(MTX)得到相應的結果。單獨使用BVDU穩定增加DT-D活性，但在某種程度上僅少量增加。
圖6中引用了使用氨甲蝶呤(MTX)和人K562腫瘤細胞的結果。MB表示MTX和BVDU，傳代意味著稀釋和轉移細胞以進一步生長。相對DT-D活性示于Y軸。
實施例4阿霉素(DOX)的毒性副作用下降可表現在利用大鼠的試驗中(見表1)。SD大鼠用二甲基苯并蒽(DMBA)處理。通過DOX治療(1mg/kg)抑制了因此而引致的腫瘤的生長。治療期間和每次治療后一天，即恢復期，所述動物分別得到15mg/kg的BVDU。
表1
實施例5列出受堿基類似物和絲裂霉素C處理影響的蛋白質。進行雙向凝膠電泳的結果匯編于下表2。
表權利要求
1.DNA修復基因和/或癌基因的至少一種超表達抑制劑用于生產提高化療后細胞生長抑制劑的凋亡作用的藥物的用途。
2.根據權利要求1的用途，其特征在于所述修復基因為UBE2N和/或APEX。
3.根據權利要求1或2的用途，其特征在于所述癌基因是DDX1、STAT3和/或JUN-D。
4.根據權利要求1-3之一的用途，其特征在于5-取代核苷、其受保護形式、鹽或前藥用作超表達抑制劑。
5.根據權利要求1-4之一的用途，其特征在于在化療期間至少一種細胞生長抑制劑和DNA修復基因和癌基因的至少一種超表達抑制劑聯用。
6.根據權利要求5的用途，其特征在于5-取代核苷用作超表達抑制劑。
7.根據權利要求5或6的用途，其特征在于化療期間，聯合使用在限定的時間期間遞增劑量的細胞生長抑制劑和恒定劑量的超表達抑制劑，在化療之后，即恢復期內，單獨使用超表達抑制劑。
8.根據權利要求7的用途，其特征在于恢復期的持續時間為3-10天。
9.根據權利要求5-8之一的用途，其特征在于化療周期的持續時間為8-30天。
10.根據權利要求1-9之一的用途，其特征在于(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧尿苷(BVDU)、其受保護形式、鹽和/或前藥用作5-取代核苷。
11.根據權利要求10的用途，其特征在于通式1的化合物用作前藥。
12.根據權利要求1-11中至少一項的用途，其特征在于使用至少一種5-取代核苷的所用劑量應使得其在血液中的濃度為0.02-50μg/ml。
全文摘要
本發明涉及DNA修復基因和癌基因的至少一種超表達抑制劑用于生產用來提高化療后細胞生長抑制藥的凋亡作用的藥物的用途。
文檔編號A61P35/00GK1758918SQ200380110201
公開日2006年4月12日 申請日期2003年11月20日 優先權日2003年3月24日
發明者魯道夫·法里希, 約爾格-克里斯蒂安·海因里希, 格奧爾格·克魯皮察 申請人:雷斯普羅泰克特有限公司