藥理玻璃體溶解術(shù)的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：1079138閱讀：887來源：國(guó)知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：藥理玻璃體溶解術(shù)的制作方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明一般涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的眼部病癥，或者病癥的并發(fā)癥的方法。更為具體地，本發(fā)明涉及使用包含催化結(jié)構(gòu)域的截短的纖溶酶蛋白治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的眼部病癥或者病癥的并發(fā)癥的方法。
            
背景技術(shù)：
            成年人的眼是一個(gè)略微不對(duì)稱的球體，縱向直徑約為24-25毫米，橫向直徑約為24毫米，體積約為6.5毫升。人眼可以分為不同的三層，即外層，中間層和內(nèi)層。眼的外層由經(jīng)常被稱作“眼白”的鞏膜、以及覆蓋在眼睛前面的角膜組成。中間層分為前部分和后部分；前部分由環(huán)狀帶有色素的虹膜、晶狀體和睫狀體組成，而后部分由脈絡(luò)膜層組成。內(nèi)層由視網(wǎng)膜組成，視網(wǎng)膜是眼睛的感覺部分。視網(wǎng)膜基本上是一層神經(jīng)組織，它沿著脈絡(luò)膜層的后表面分布，可以分為視覺部分和非視覺部分。視覺部分參與視覺機(jī)制，由視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞組成，它們是起作用的視覺器官。
            
人眼還可以分為三個(gè)室。前室在角膜和虹膜之間，后室在虹膜和晶狀體之間，都充滿房水。相反，在晶狀體和視網(wǎng)膜之間的玻璃室充滿了更為粘稠的液體，稱為玻璃液(也被稱為玻璃體或者玻璃液)。正常眼的玻璃液是清澈的膠狀，占據(jù)眼球體積的大約80％。通過角膜、瞳孔和晶狀體進(jìn)入眼睛的光線，通過玻璃液被傳送到視網(wǎng)膜上。
            
正常人眼玻璃液呈膠狀，由約99％的水和1％的大分子組成。這些大分子包括膠原纖絲網(wǎng)絡(luò)、透明質(zhì)酸、可溶性糖蛋白、糖和其他低分子量代謝物。II型膠原是玻璃液的主要纖維狀膠原，但是玻璃液還含有V、IX和XI型的膠原。玻璃體后部分，即后玻璃體表面(也被稱為后玻璃體皮質(zhì))，與視網(wǎng)膜的內(nèi)表面直接接觸，接觸的顯著部位在玻璃體底部、視盤以及沿主要的視網(wǎng)膜血管。后玻璃皮質(zhì)和視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜(ILM)之間的細(xì)胞和分子相互作用介導(dǎo)玻璃體在視網(wǎng)膜上的正常附著。ILM基本上是視網(wǎng)膜Mueller細(xì)胞的基底膜。ILM含有I和IV型的膠原、糖蛋白例如層粘連蛋白和纖連蛋白以及其他糖綴合物。認(rèn)為這些組分在玻璃體和ILM之間搭橋并結(jié)合膠原纖維。
            
隨著年齡增長(zhǎng)，玻璃液從膠狀變?yōu)橐后w，隨著這種變化，玻璃體逐漸收縮并從視網(wǎng)膜的ILM上脫離。該過程稱為“后玻璃體脫離”(PVD)，是40歲以后出現(xiàn)的正常現(xiàn)象。但是由于病理狀況如糖尿病、伊爾斯氏病(視網(wǎng)膜靜脈周圍炎)和葡萄膜炎也可以誘發(fā)玻璃體的退行性變化。而且，PVD在近視人群和接受過白內(nèi)障手術(shù)的人中可能較正常出現(xiàn)得早。通常玻璃體從視網(wǎng)膜上完全斷開。但是有時(shí)玻璃體與視網(wǎng)膜在某些部位緊密粘連。這些抵抗性的、異常堅(jiān)固的玻璃體的結(jié)合可以在結(jié)合部位從玻璃體向視網(wǎng)膜傳遞巨大的牽引力。玻璃體的持久牽拉經(jīng)常導(dǎo)致視網(wǎng)膜上馬蹄鐵形狀的破裂。除非對(duì)這些視網(wǎng)膜破裂進(jìn)行修補(bǔ)，否則玻璃液可以通過破裂處滲入視網(wǎng)膜或者到視網(wǎng)膜以下導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，這是一種非常嚴(yán)重的危急視力的情況。此外，玻璃體和ILM之間的永久性粘附可以導(dǎo)致血管破裂出血，這會(huì)引發(fā)玻璃體的混濁和不透明。
            
不完整后玻璃體脫離的發(fā)展對(duì)于許多玻璃體視網(wǎng)膜疾病，包括玻璃體黃斑牽引綜合征，玻璃體出血、黃斑破洞、視黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性視黃斑病變和視網(wǎng)膜脫離都有影響。因此，玻璃體手術(shù)的一個(gè)重要目的是將玻璃體與視網(wǎng)膜分離，目的是防止玻璃體的牽引。
            
為了將玻璃體從眼部分開，實(shí)施一種稱為玻璃體切除術(shù)的微型外科手術(shù)步驟。在該步驟中，使用一個(gè)微小的手握的切割裝置將玻璃體從眼中除去同時(shí)使用鹽溶液替代移去的玻璃體以防止眼部塌陷。使用該方法進(jìn)行手術(shù)移去玻璃體要求高超的技術(shù)，而且完全將皮質(zhì)玻璃體移去仍然是一項(xiàng)困難的任務(wù)。而且機(jī)械的玻璃體切除術(shù)具有并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，如視網(wǎng)膜結(jié)疤、破裂或者其他損傷。顯然我們非常不愿意看到這樣的損傷，因?yàn)樗鼤?huì)在手術(shù)后影響患者的視力。
            
因此最近的研究集中在將玻璃體從視網(wǎng)膜中移去的替代方法上面。這些方法探索了對(duì)于酶和化學(xué)物質(zhì)的使用，它們可以用來誘導(dǎo)或促進(jìn)玻璃體的液化和/或玻璃體視網(wǎng)膜接觸面的分離(PVD)。這些被稱為“藥理玻璃體切除術(shù)”的方法包括了許多蛋白酶，如alpha胰凝乳蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、細(xì)菌膠原酶、軟骨素酶和分散酶，在實(shí)驗(yàn)室或者臨床實(shí)驗(yàn)中向玻璃體內(nèi)注射這些物質(zhì)以誘導(dǎo)PVD。但是這些技術(shù)中的大多數(shù)或者不能使玻璃體后部與ILM完全脫離，或者不能避免并發(fā)癥。此外這些情況中許多都有高度的副反應(yīng)危險(xiǎn)。例如在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中使用細(xì)菌蛋白酶產(chǎn)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變，結(jié)果是復(fù)雜的視網(wǎng)膜重新脫離。有報(bào)導(dǎo)說膠原酶可以使玻璃體液化，但是會(huì)破壞視網(wǎng)膜的外層。有報(bào)導(dǎo)說alpha胰凝乳蛋白酶使經(jīng)過注射的眼產(chǎn)生視乳突外周和玻璃體出血。最后，有報(bào)導(dǎo)說分散酶在注射后15分鐘對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層產(chǎn)生毒性。根據(jù)使用的分散酶的濃度，在經(jīng)過注射的眼中會(huì)產(chǎn)生增殖性視網(wǎng)膜病或者視網(wǎng)膜上細(xì)胞膜。
            
考慮到細(xì)菌蛋白酶的免疫原性和其他副作用，使用內(nèi)生人源的蛋白酶用于藥理玻璃體分離術(shù)可能是合意的。纖維蛋白溶解酶(纖溶酶)是一種來自纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶。纖溶酶原是哺乳動(dòng)物血液的重要組分。人類纖溶酶原是791個(gè)氨基酸組成的單鏈糖蛋白，分子量大約為92000道爾頓(參見Forsgren M.et al.，F(xiàn)EBS Lett.213(2)254-60，1987)。天然的纖溶酶氨基端是谷氨酸(稱為“谷氨酸-纖淀酶原”)，通過纖溶酶對(duì)Arg68-Met69，Lys77-Lys78，或者Lys78-Val79肽鍵進(jìn)行有限酶切，轉(zhuǎn)化為通常稱為的“賴氨酸-纖溶酶原”的蛋白。用纖溶酶原活化劑，如尿激酶或者鏈激酶使纖溶酶原活化時(shí)，Arg561和Val562之間的肽鍵被切割，將纖溶酶原分子轉(zhuǎn)化為雙鏈的、具有酶活性的形式，稱為纖溶酶。纖溶酶包含兩條多肽鏈，一條重鏈A通過兩條二硫鍵與一條輕鏈B相連，B鏈包含絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。纖溶酶在體內(nèi)能夠溶解血凝塊，顯示其具有絲氨酸蛋白酶催化活性。
            
最近有研究提示纖溶酶可作為玻璃體切除術(shù)的輔助物。此外，還有研究提示自體纖溶酶(APE)用作藥理玻璃體切除術(shù)的藥劑。但是有許多與使用纖溶酶有關(guān)的缺點(diǎn)。首先，到目前為止所有涉及纖溶酶的臨床介入都依賴于APE的使用，它的分離是十分費(fèi)力且耗時(shí)的過程，包括抽取患者的血液，分離纖溶酶原，將分離出的纖溶酶原活化為纖溶酶，純化并且進(jìn)行纖溶酶的無菌檢測(cè)。而且，這個(gè)過程可能是是很昂貴的，而且血液攜帶病原的存在會(huì)使這個(gè)過程更加復(fù)雜。而且，纖溶酶極易德解，這樣在其使用之前不能長(zhǎng)期儲(chǔ)存。還有一個(gè)缺點(diǎn)是纖溶酶的分子量大，大約在65000到83000道爾頓之間。因此與小分子相比，大分子，如纖溶酶從其在玻璃體的注射位置向玻璃體視網(wǎng)膜接觸面的擴(kuò)散會(huì)受到阻礙。
            
因此在本領(lǐng)域內(nèi)需要一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，克服在藥理玻璃體溶解術(shù)中使用纖溶酶所產(chǎn)生的缺點(diǎn)。特別地，需要一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，使用比纖溶酶小的分子，比纖溶酶通過玻璃體向玻璃體視網(wǎng)膜接觸面擴(kuò)散得更快且很容易大量獲得而不需要一個(gè)患者一個(gè)患者的分離自體纖溶酶，也沒有耽擱和其他伴隨的問題。
            
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，使用包含截短的纖溶酶蛋白的組合物，該纖溶酶蛋白中包含有一個(gè)纖溶酶的催化結(jié)構(gòu)域(TPCD)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD選自由小纖溶酶(miniplasmin)、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化小纖溶酶、穩(wěn)定化重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化微纖溶酶、穩(wěn)定化重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及以上任意的組合所組成的組。
            
本發(fā)明還提供了一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，使用包含修飾的TPCD的組合物。修飾的TPCD是包含經(jīng)過修飾的纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域的TPCD。
            
本發(fā)明提供了一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，使受治對(duì)象的玻璃體和/或房水與包含TPCD的組合物接觸。本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防眼部病癥的方法，例如，但不限于，視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑點(diǎn)水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。本發(fā)明的方法可以獨(dú)立于玻璃體切除術(shù)使用，或者作為玻璃體切除術(shù)的輔助。
            
本發(fā)明還提供了一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含向受治對(duì)象施用一種包含至少兩種TPCD的組合物。在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使玻璃體和/或房水與包含至少兩種TPCD的組合物接觸，進(jìn)行組合物給藥。
            
本發(fā)明還包括一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，這些方法包含向受治對(duì)象提供一種包含至少一種TPCD的組合物，和另一種包含至少一種TPCD的組合物。在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，通過與玻璃體和/或房水接觸向受治對(duì)象提供一種包含至少一種TPCD的組合物，和另一種包含至少一種TPCD的組合物。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一種TPCD的第一個(gè)組合物和包含至少一種TPCD的第二個(gè)組合物，它們含有的TPCD是相同的TPCD。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一種TPCD的第一個(gè)組合物和包含至少一種TPCD的第二個(gè)組合物，它們含有的TPCD是不同的TPCD。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一種TPCD的第一個(gè)組合物和包含至少一種TPCD的第二個(gè)組合物，基本上同時(shí)施用給受治對(duì)象。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一種TPCD的第一個(gè)組合物和包含至少一種TPCD的第二個(gè)組合物，在不同的時(shí)間施用給受治對(duì)象。
            
本發(fā)明還包括一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，向受治對(duì)象給服包含至少一種TPCD以及至少一種另一藥劑的組合物。另一藥劑包括在治療或者預(yù)防眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥時(shí)單獨(dú)使用或者與TPCD聯(lián)合使用有效的任何物質(zhì)。另一藥劑包括，但不限于透明質(zhì)酸酶、分散酶、軟骨素酶、膠原酶、含有RGD的肽、抗粘合素抗體、尿素、羥基脲、硫脲、P2Y受體促效劑以及任何血管生成抑制劑(包括但不止限于VEGF抑制劑和P1GF抑制劑)。
            
本發(fā)明還包括一些治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，在給服包含另一藥劑的組合物之前或者之后，向受治對(duì)象給服包含至少一種TPCD的組合物。
            
本發(fā)明的方法可以用于治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，實(shí)現(xiàn)一個(gè)或者幾個(gè)結(jié)果，包括但不止限于，降低玻璃液的粘性、使玻璃體液化、誘導(dǎo)后玻璃體脫離、消除或者減少玻璃體和/或房水的出血，從玻璃休和/或房水中清除或者減少眼內(nèi)的外源物質(zhì)，清除或者減少對(duì)于視網(wǎng)膜有毒性的物質(zhì)，增加向玻璃體和/或房水給服的藥劑或者組合物的擴(kuò)散、減少視網(wǎng)膜外的血管新生以及以上的任意組合。
            
本發(fā)明還提供了進(jìn)行玻璃體切除手術(shù)的方法，該方法包含使受治對(duì)象的玻璃體與包含一種TPCD的組合物接觸。接觸步驟可以在玻璃體切除術(shù)之后進(jìn)行或者與玻璃體切除術(shù)同時(shí)進(jìn)行，或者獨(dú)立于玻璃體切除術(shù)進(jìn)行。
            
本發(fā)明還提供了包含至少兩種TPCD的組合物。
            
本發(fā)明還提供了包含至少一種TPCD和至少一種另一藥劑的組合物。
            
附圖簡(jiǎn)述
            

            
圖1顯示了人纖溶酶原的DNA(SEQ ID NO9)和氨基酸序列(SEQID NO10)。
            
圖2顯示了人微纖溶酶原的DNA(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQID NO4)。
            
圖3顯示了人小纖溶酶原(miniplasminogen)的DNA(SEQ ID NO7)和氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
            
圖4顯示了使用微纖溶酶(microplasmin)治療豬眼的結(jié)果。圖A是使用溶于0.1毫升BSS PLUS的0.125毫克微纖溶酶治療豬眼120分鐘，緩慢脫水之后低放大倍數(shù)的圖像(11×)。在該圖像的中心是玻璃體索條(vitreous strand)?？赡茉摬Ａw索條就是萎陷到視網(wǎng)膜表面上的玻璃體。在剩余的圖片中顯示，視網(wǎng)膜表面的大部分是沒有玻璃體的。圖B顯示了與一條血管相鄰的裸露視網(wǎng)膜區(qū)域(放大800倍)。在視網(wǎng)膜表面幾乎看不到細(xì)胞。不規(guī)則的表面是血管自身的。圖C和D分別是B中的視網(wǎng)膜區(qū)域放大1200倍和3600倍之后，顯示了光滑的視網(wǎng)膜表面，幾乎沒有玻璃體或者細(xì)胞物質(zhì)。在3600倍時(shí)，只能看到幾條纖維索條。圖E是放大1500倍時(shí)的圖像，主要顯示了與圖C相同的結(jié)果，位置更為靠近視網(wǎng)膜中心，而圖F顯示了喪失纖絲結(jié)構(gòu)后玻璃體的粗糙顆粒結(jié)構(gòu)。微纖溶酶治療后的眼的玻璃體結(jié)構(gòu)在外觀上與對(duì)照眼的玻璃體結(jié)構(gòu)十分不同(數(shù)據(jù)未顯示)。
            
圖5顯示了使用微纖溶酶處理120分鐘后豬眼的睫狀突未受到影響(圖A和B)。
            
圖6提供了人死后的眼中玻璃體視網(wǎng)膜接觸面的掃描電鏡照片(放大3600倍)。向玻璃體內(nèi)注射62.5微克的微纖溶酶導(dǎo)致后玻璃體脫離(PVD)，只留下不連續(xù)的膠原纖絲殘跡覆蓋在ILM上(圖A)。注射125微克(圖B)和188微克(圖C)的微纖溶酶，產(chǎn)生完全的PVD和裸露的ILM。圖D顯示在用62.5微克微纖溶酶和氣體處理的眼中膠原纖絲受壓倒向ILM。圖E顯示使用125微克微纖溶酶和氣體治療之后出現(xiàn)完全的PVD。與在經(jīng)微纖溶酶治療的眼中觀察到的PVD不同，在對(duì)照眼中有密集的膠原纖絲網(wǎng)絡(luò)。(圖F)。
            
圖7提供了人死后的眼中ILM的透射電鏡照片。注意在微纖溶酶處理的眼中沒有膠原纖絲(箭頭)(圖A，放大13600倍)。相反，在對(duì)照眼的ILM上，膠原纖絲仍然存在(箭頭)(圖B，放大6800倍)。
            
圖8顯示貓眼中玻璃體視網(wǎng)膜接觸面的掃描電鏡照片(放大3600倍)。在玻璃體內(nèi)注射25微克微纖溶酶進(jìn)行處理一天后在ILM上只留下殘余的膠原纖絲(圖A)。注射25微克微纖溶酶處理三天后，產(chǎn)生完全的PVD(圖B)。注射14.5微克微纖溶酶處理三天后，觀察到殘余的膠原纖絲(圖C)。注射14.5微克微纖溶酶(圖D)和25微克微纖溶酶(圖E)處理三周后，觀察到裸露的ILM。與此截然相反的是，對(duì)照眼顯示了密集粘連的皮質(zhì)玻璃體(圖F)。
            
圖9顯示了光學(xué)顯微鏡下對(duì)貓眼半薄切片的研究結(jié)果。這些結(jié)果顯示在對(duì)照眼中觀察到的正常視網(wǎng)膜細(xì)胞建構(gòu)(圖B)也可以在微纖溶酶治療的眼中觀察到(圖A)。透射電鏡觀察揭示，微纖溶酶治療的眼中視網(wǎng)膜的內(nèi)層和ILM(圖C和E)同對(duì)照眼中的同樣結(jié)構(gòu)一樣(圖D和F)保持完好。圖A和B使用的放大倍數(shù)是250倍；圖C和D使用的放大倍數(shù)是6000倍；而圖E和F使用的放大倍數(shù)是30000倍。
            
圖10顯示了共聚焦激光掃描電鏡結(jié)果，使用了針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(圖A和B，綠色)和波形纖維蛋白(圖C和D，紅色)的探針。微纖溶酶處理的眼(圖A和C)和對(duì)照眼(圖B和D)之間的神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白染色和波形纖維蛋白染色沒有區(qū)別。使用針對(duì)突觸小泡蛋白(綠色)和神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白(紅色)的探針進(jìn)行雙標(biāo)記免疫組化，也顯示在微纖溶酶纖維的眼(圖E)和對(duì)照眼(圖F)之間沒有區(qū)別。圖A、B和C的放大倍數(shù)是400倍；圖D的放大倍數(shù)是250倍；且圖E和F的放大倍數(shù)是160倍。
            
圖11顯示了整個(gè)豬眼玻璃液的時(shí)間相關(guān)函數(shù)(TCF)與20納米聚苯乙烯納米球的TCF比較。在玻璃體中，該曲線有兩種組分。早期(快)組分是由于透明質(zhì)酸的存在，透明質(zhì)酸可以自由擴(kuò)散，并且表現(xiàn)出顯著的分子運(yùn)動(dòng)(布朗運(yùn)動(dòng))。晚期(慢)組分是由于膠原的存在，膠原更大，且擴(kuò)散的自由程度小(不能活動(dòng)自如)，產(chǎn)生了較慢得布朗運(yùn)動(dòng)。相反，聚苯乙烯納米球溶液只有一種非常快的組分(單擴(kuò)散)，這是由于納米球的形狀小，而且它們完全的球狀結(jié)構(gòu)使其在溶液中運(yùn)動(dòng)的速度非常迅速。
            
圖12顯示了5只使用不同劑量微纖溶酶(μPli)和20納米聚苯乙烯納米球溶液進(jìn)行藥理玻璃體溶解術(shù)的豬眼的標(biāo)準(zhǔn)化的時(shí)間相關(guān)函數(shù)。在空氣和玻璃體接觸面下方4毫米處的光軸中進(jìn)行DSL測(cè)量。在未處理(載體)的玻璃液中，曲線有兩種組分。早期(快)組分是由于透明質(zhì)酸的存在，透明質(zhì)酸可以自由擴(kuò)散，并且表現(xiàn)出顯著的分子運(yùn)動(dòng)(布朗運(yùn)動(dòng))。晚期(慢)組分是由于膠原的存在，膠原更大，擴(kuò)散得自由程度小(不能活動(dòng)自如)，產(chǎn)生了較慢得布朗運(yùn)動(dòng)。相反，聚苯乙烯納米球溶液只有一種非?？斓慕M分(單擴(kuò)散)，這是由于納米球的形狀小，而且它們完全的球狀結(jié)構(gòu)使其在溶液中運(yùn)動(dòng)的速度非常迅速。隨著μPli劑量的升高，TCF曲線的斜率降低，慢組分(大分子)消失，曲線最終接近純20納米的納米球，即全部為小分子的曲線。
            
圖13顯示注射微纖溶酶和熒光素之后代表性的豬眼圖片。兩張圖是同一只眼的，右側(cè)的圖片的拍攝時(shí)間比左側(cè)圖片晚20分鐘，圖片顯示了熒光素在玻璃液中的擴(kuò)散。
            
圖14顯示注射纖溶酶和熒光素之后代表性的豬眼圖片。兩張圖是同一只眼的，下面的圖片的拍攝時(shí)間比上面的圖片晚20分鐘，圖片顯示熒光素在玻璃液中的擴(kuò)散程度小于經(jīng)微纖溶酶注射的眼中觀察到的熒光素?cái)U(kuò)散程度(圖13)。
            
發(fā)明詳述這里引用的專利申請(qǐng)、專利和文獻(xiàn)表明了那些本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員具備的知識(shí)，在這里以其整體引用作為參考。如果任何這里引用的參考與本發(fā)明公開的內(nèi)容中某些特別的說明不一致，則以本發(fā)明公開的內(nèi)容為準(zhǔn)。
            
提供以下的詳述以及相伴的實(shí)施例，目的是描述和解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，而并不是以任何方式意圖限制本發(fā)明的范疇。除非有所說明，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員通常理解的含義是相同的。
            
在詳細(xì)解釋本發(fā)明之前，先給出此后將要用到的某些術(shù)語的定義，對(duì)于本發(fā)明的理解可能是有所幫助的。
            
定義“治療”的意思是任何醫(yī)學(xué)上的病癥任何程度的減輕或者緩解，包括但是不要求疾病的完全治愈。
            
“預(yù)防”的意思是對(duì)疾病的發(fā)生進(jìn)行防御或者保護(hù)，即其功能是預(yù)防用的。
            
“病癥”的意思是任何疾病、功能障礙、綜合征、身體不適、疼痛或者上述的組合。病癥還包括由于任何疾病、功能障礙、綜合征、身體不適、疼痛或者上述的組合引起的任何并發(fā)癥。
            
“受治對(duì)象”的意思是任何哺乳動(dòng)物，特別是人。
            
“接觸”的意思是任何方式的給藥，給藥的結(jié)果是組合物和正在被接觸的目標(biāo)物(例如玻璃體、房水等等)之間的相互作用。組合物和被接觸的目標(biāo)物之間的相互作用可以在組合物給藥的基本上同時(shí)出現(xiàn)，相互作用一段延續(xù)的時(shí)間，從給藥時(shí)開始，或者從組合物給藥的時(shí)間向后推遲。
            
“組合物”的意思是一種或者多種物質(zhì)的聯(lián)合或者混合。
            
“物質(zhì)”的意思是具有質(zhì)量且占據(jù)空間的東西。
            
“外源物質(zhì)”的意思是任何由內(nèi)科醫(yī)生、臨床醫(yī)生、獸醫(yī)或者研究者確定為對(duì)受治對(duì)象有害或者有毒的物質(zhì)，和/或一般情況下在健康哺乳動(dòng)物眼中不會(huì)找到的物質(zhì)。
            
“眼科學(xué)上可以接受的載體”是一種物質(zhì)，另一種物質(zhì)(例如TPCD)可以與該物質(zhì)組合在一起，而不會(huì)使第二種物質(zhì)不適于(由內(nèi)科醫(yī)生、臨床醫(yī)生、獸醫(yī)或者研究者確定)在受治對(duì)象的眼中使用。眼科學(xué)上可以接受的載體的非限制性實(shí)例包括平衡鹽溶液(BBS)和BBS-PLUS。
            
“藥學(xué)上可以接受的載體”包括，但不限于水、緩沖鹽溶液、多聚醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)或者是這些物質(zhì)適當(dāng)?shù)幕旌衔?。藥學(xué)上可以接受的載體的其他實(shí)例和制備這些載體的方法和配方可以在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(第20版，A.Gennaro(ed.)，Lippincott，Williams & Wilkins，2000)中找到。
            
“有效量”是指引起人或者其他哺乳動(dòng)物眼中產(chǎn)生反應(yīng)的物質(zhì)或者組合物的量，所述的反應(yīng)是研究者、獸醫(yī)、內(nèi)科醫(yī)生或其他臨床醫(yī)生所努力獲得的。
            
“誘導(dǎo)”是指引起或者促進(jìn)所需結(jié)果的出現(xiàn)。
            
“降低”是指下降到任何程度。
            
“對(duì)眼的毒性作用”是指任何被研究者、獸醫(yī)、內(nèi)科醫(yī)生或其他臨床醫(yī)生確定為對(duì)受治對(duì)象有害的對(duì)眼不利的影響。
            
“玻璃體”是指玻璃液，也指玻璃體，它占據(jù)了眼內(nèi)晶狀體和視網(wǎng)膜之間的空間。
            
“TPCD”是“包含纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域的截短的纖溶酶蛋白”的同義詞。一個(gè)“截短的纖溶酶蛋白”的意思是任何通過缺失一個(gè)或者多個(gè)Val79-纖溶酶(即人纖溶酶原的79-791號(hào)氨基酸)中的氨基酸產(chǎn)生的纖溶酶蛋白，其中產(chǎn)生的蛋白具有絲氨酸蛋白酶的催化活性。這種氨基酸的缺失可以是位于SEQ ID NO10所示的79-791號(hào)氨基酸的N末端(產(chǎn)生由例如SEQ ID NO10中的444-791、543-791或562-791號(hào)氨基酸組成的TPCD)和/或C末端和/或內(nèi)部的任意位置。應(yīng)當(dāng)理解如果來源于SEQ ID NO10的截短的蛋白是以無酶學(xué)活性的形式制備出來的，則必須使用一種纖溶酶原活化劑將其轉(zhuǎn)化為該截短的蛋白相應(yīng)的活性形式。例如，如果一個(gè)由SEQ ID NO10的543-791號(hào)氨基酸組成的蛋白質(zhì)通過重組制備，很有可能該蛋白質(zhì)不會(huì)以其具有酶學(xué)活性的形式出現(xiàn)。因此，需要使用纖溶酶原活化劑處理該蛋白，在Arg561和Val562之間的肽鍵進(jìn)行切割以活化該蛋白。非限制性的TPCD的實(shí)例包括小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶以及微纖溶酶變異體，其中微纖溶酶和小纖溶酶的變異體包括一個(gè)纖溶酶的催化結(jié)構(gòu)域。
            
“纖溶酶蛋白”是指任何根據(jù)人纖溶酶原氨基酸序列(SEQ IDNO10)制備的蛋白質(zhì)或者來源于人纖溶酶原、在其Arg561和Val562之間的肽鍵處切斷的蛋白質(zhì)。可以使用纖溶酶原活化劑完成Arg561和Val562之間肽鍵的切割。非限制性的纖溶酶蛋白實(shí)例包括Lys-纖溶酶、小纖溶酶和微纖溶酶。
            
“纖溶酶的催化結(jié)構(gòu)域”是指一段來自SEQ ID NO10(人纖溶酶原)中543-791號(hào)氨基酸的氨基酸序列，長(zhǎng)度約為130-240個(gè)氨基酸，包括纖溶酶的催化三元體，即His603、Asp646和Ser741，其中的氨基酸序列具有絲氨酸蛋白酶的活性。
            
“修飾的纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域”是指通過添加和/或缺失和/或替換一個(gè)或者多個(gè)氨基酸改變氨基酸序列從而對(duì)纖溶酶的催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾。當(dāng)然應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)應(yīng)于纖溶酶催化三元體的氨基酸，即His603、Asp646和Ser741是不被改變的。修飾會(huì)使蛋白質(zhì)的類纖溶酶催化活性增加、降低或者不發(fā)生改變。例如，對(duì)微纖溶酶和小纖溶酶的催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾可能使這些蛋白質(zhì)的催化活性增加、降低或者不改變。
            
“修飾的TPCD”是指含有修飾的纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域的TPCD，其中的TPCD具有類纖溶酶的絲氨酸蛋白酶催化活性。
            
“另一藥劑”是指任何可以自身使用或者與TPCD聯(lián)合使用的物質(zhì)，用于治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥。優(yōu)選地，輔助藥劑不妨礙TPCD的催化活性。
            
“穩(wěn)定蛋白質(zhì)”是指通過使用一種或者多種穩(wěn)定劑保護(hù)蛋白質(zhì)不發(fā)生降解和/或失活。
            
盡管可以在實(shí)踐中或者檢測(cè)本發(fā)明時(shí)使用與那些在這里描述的方法和材料相似或者等價(jià)的方法和材料，以下仍然描述優(yōu)選的方法和材料。
            
藥理玻璃體溶解術(shù)是一種方法，它使用一種或者多種蛋白質(zhì)的和/或化學(xué)的和/或核酸的藥劑治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥。本發(fā)明提供一些藥理玻璃體溶解的方法，使用至少一種包含催化結(jié)構(gòu)域(TPCD)的截短的纖溶酶蛋白。特別地，本發(fā)明提供一些方法，通過使玻璃體和/或房水與有效量的包含TPCD的組合物接觸，治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥。這些方法產(chǎn)生不限于以下的結(jié)果，使玻璃體液化、誘導(dǎo)后玻璃體脫離、消除或者減少玻璃體和/或房水的出血，從玻璃體和/或房水減少或清除眼內(nèi)外源物質(zhì)，增加向玻璃體和/或房水給服的藥劑或者組合物的擴(kuò)散、減少視網(wǎng)膜外的新血管生成以及以上的任意組合。這些方法可以作為玻璃體切除術(shù)的輔助使用或者在沒有玻璃體切除術(shù)時(shí)使用。
            
因此，第一方面，本發(fā)明提供治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含TPCD的組合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種TPCD的分子量小于大約40000道爾頓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種TPCD在還原形式下的分子量是大約26500道爾頓，非還原形式下是29000道爾頓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種TPCD的分子量在約20000到30000道爾頓之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD的分子量小于約20000道爾頓。
            
第二方面，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少兩種TPCD的組合物接觸。
            
第三方面，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一個(gè)TPCD的第一種組合物和有效量的包含至少一種TPCD的第二種組合物接觸。在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一種TPCD的第一種組合物和包含至少一種TPCD的第二種組合物，它們含有的TPCD是相同的TPCD。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一種TPCD的第一種組合物和包含至少一種TPCD的第二種組合物，它們含有的TPCD是不同的TPCD。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種和第二種組合物可以基本上同時(shí)或者在不同時(shí)刻給服受治對(duì)象。
            
第四方面，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一種TPCD和至少一種另一藥劑的組合物接觸。在本發(fā)明的該方面中，另一藥劑不意味著是TPCD。
            
第五方面，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防受治對(duì)象的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一種另一藥劑的組合物接觸之前、同時(shí)或者之后，使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一種TPCD的組合物接觸。
            
第六方面，本發(fā)明提供了一種使玻璃體液化的方法，它包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一種TPCD的組合物接觸。在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，玻璃體的液化降低了玻璃體房水的粘度。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，玻璃體的液化提高了從玻璃體腔和/或房水中清除血液、沉積物質(zhì)、外源物質(zhì)和/或?qū)ρ劬μ貏e是對(duì)視網(wǎng)膜有害的物質(zhì)的速率。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，玻璃體的液化降低了視網(wǎng)膜外新血管的發(fā)生。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，玻璃體的液化增加了施用給玻璃體或者房水的藥劑或組合物的擴(kuò)散。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，玻璃體的液化在標(biāo)準(zhǔn)玻璃體切除術(shù)或使用25號(hào)手術(shù)刀(或者更小)進(jìn)行的玻璃體切除術(shù)中有助于玻璃體的去除。
            
第七方面，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)后玻璃體脫離的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一種TPCD的組合物接觸。
            
在以上描述的本發(fā)明的第一到第七方面中的任何一項(xiàng)中，使用包含TPCD的組合物與玻璃體和/或房水接觸的步驟可以作為玻璃體切除術(shù)的輔助或者在沒有玻璃體切除術(shù)時(shí)進(jìn)行。
            
第八方面，本發(fā)明提供了進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的方法，它包含以下步驟使玻璃體和/或房水與包含至少一種TPCD的組合物接觸。接觸步驟可以在玻璃體切除術(shù)進(jìn)行的同時(shí)或者之前進(jìn)行。
            
第九方面，本發(fā)明提供了包含至少兩種TPCD的組合物。
            
第十方面，本發(fā)明提供了包含至少一種TPCD和至少一種另一藥劑的組合物。
            
在本發(fā)明所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD選自由以下各項(xiàng)組成的組小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及以上的任何組合。在本發(fā)明所有方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療或者預(yù)防眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥的方法以及實(shí)施玻璃體切除術(shù)的方法，其結(jié)果是通過達(dá)到以下結(jié)果中的一個(gè)或者更多緩解眼部病癥降低玻璃體的粘度；使玻璃體液化；誘導(dǎo)后玻璃體脫離；從玻璃體、玻璃體腔和/或房水中清除或者減少出血；從玻璃體、玻璃體腔和/或房水中清除或者減少眼內(nèi)外源物質(zhì)或?qū)σ暰W(wǎng)膜有毒的物質(zhì)；提高注射到玻璃體和/或房水中的藥劑或組合物的擴(kuò)散；或者減少視網(wǎng)膜的新血管生成。在本發(fā)明所有方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，試圖治療或者預(yù)防的眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥選自由以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑點(diǎn)水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
TPCD包括任何含有纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域的截短的纖溶酶蛋白。截短的纖溶酶蛋白包括任何通過缺失Val79-纖溶酶(即人纖溶酶原79-791號(hào)氨基酸)的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸而得到的纖溶酶蛋白，其中得到的蛋白具有絲氨酸蛋白酶催化活性。因此，所有的TPCD都必須含有纖溶酶絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化三元體，即His603，Asp646和Ser741。可以通過缺失SEQ ID NO10(人纖溶酶原)的79-791號(hào)氨基酸中的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸對(duì)Val79-纖溶酶進(jìn)行截短的。這種缺失可以是位于SEQ ID NO10所示的79-791號(hào)氨基酸的N末端、C末端或內(nèi)部的任意位置。應(yīng)當(dāng)理解如果SEQ ID NO10的79-791號(hào)氨基酸截短的后的蛋白是以無酶學(xué)活性的形式制備出來的，則必須使用一種纖溶酶原活化劑將其轉(zhuǎn)化為該截短的蛋白相應(yīng)的活性形式，它才能被認(rèn)為是TPCD。纖溶酶原活化劑切割A(yù)rg561和Val562之間的肽鍵，這樣就活化蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD包含主要由SEQ ID NO10中444-791號(hào)氨基酸組成的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD包括由人纖溶酶原的444-791號(hào)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失后得到的蛋白，其中該所得蛋白具有絲氨酸蛋白酶催化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD包含主要由SEQ ID NO10中543-791號(hào)氨基酸組成的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD包括由人纖溶酶原的543-791號(hào)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失后得到的蛋白，其中產(chǎn)生的蛋白具有絲氨酸蛋白酶催化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD包含主要由SEQ ID NO10中562-791號(hào)氨基酸組成的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD包括由人纖溶酶原的562-791號(hào)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失后得到的蛋白，其中產(chǎn)生的蛋白具有絲氨酸蛋白酶催化活性。缺失可以分別在SEQ ID NO10(人纖溶酶原)的444-791號(hào)氨基酸、543-791號(hào)氨基酸以及562-791號(hào)氨基酸的N端、C端或者內(nèi)部的位置。在一個(gè)蛋白中進(jìn)行氨基酸缺失對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的(例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.(eds.)，John Wiley & Sons，2001；和Molecular CloningALaboratory Manual，第三版，Sambrook和Russell，2000)。TPCD的催化活性可以使用顯色底物S2403(Chromogenix，安特衛(wèi)普，比利時(shí))(參見實(shí)施例2)、任何其他顯色底物，測(cè)定TPCD的酰胺水解活性來確定，或者通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法來確定。
            
本發(fā)明還包括了修飾的TPCD的應(yīng)用。修飾的TPCD是具有纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域的修飾形式的TPCD，其中經(jīng)修飾的TPCD具有類纖溶酶的絲氨酸蛋白酶催化活性。對(duì)于催化結(jié)構(gòu)域的修飾包括在纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域中氨基酸的插入和/或缺失和/或替代。但是，與纖溶酶絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化三元體相對(duì)應(yīng)的氨基酸，即組氨酸603、天冬氨酸646和絲氨酸741，沒有改變。優(yōu)選地，催化結(jié)構(gòu)域的修飾涉及一個(gè)或者更多的保守氨基酸替代，這些氨基酸不屬于催化三元體。保守氨基酸替代和制備這種保守氨基酸替代的方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的(例如Current Protocols in Molecular Biology，同上，John Wiley & Sons，2001；和Molecular CloningALaboratory Manual，同上)。這些修飾可以提高、降低原來結(jié)構(gòu)域的催化活性或者不使其發(fā)生變化。TPCD的催化活性可以使用顯色底物S2403(Chromogenix，安特衛(wèi)普，比利時(shí))(參見實(shí)施例2)測(cè)定TPCD的酰胺水解活性來確定，或者通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法來確定。
            
TPCD包括，但是不止限于，小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶以及微纖溶酶變異體。微纖溶酶和小纖溶酶變異體包括微纖溶酶和小纖溶酶的縮短形式，它們可以通過從這些蛋白質(zhì)中缺失氨基酸來制備。所有的微纖溶酶和小纖溶酶變異體預(yù)計(jì)都具有絲氨酸蛋白酶催化活性，即使它們不具有分別與微纖溶酶和小纖溶酶相同水平的催化活性。因此所有的微纖溶酶和小纖溶酶變異體都需要含有SEQ ID NO10中的603-741號(hào)氨基酸，這些氨基酸中含有纖溶酶絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化三元體，即人纖溶酶原的His603、Asp646和Ser741。在一個(gè)實(shí)施方案中小纖溶酶的變異體包括的蛋白質(zhì)含有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失的人纖溶酶原444-791號(hào)氨基酸，其中所得到的蛋白質(zhì)具有絲氨酸蛋白酶催化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微纖溶酶的變異體包括的蛋白質(zhì)含有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失的人纖溶酶原543-791號(hào)氨基酸，其中經(jīng)缺失得到的蛋白質(zhì)具有絲氨酸蛋白酶催化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微纖溶酶的變異體包括的蛋白質(zhì)是含有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失的人纖溶酶原562-791號(hào)氨基酸，其中所得到的蛋白質(zhì)具有絲氨酸蛋白酶催化活性。缺失可以分別出現(xiàn)在SEQ ID NO10的444-791號(hào)、543-791號(hào)以及562-791號(hào)氨基酸的N端、C端或者一個(gè)內(nèi)部位置；但是所有的微纖溶酶和小纖溶酶變異體都需要含有SEQ ID NO10中的603-741號(hào)氨基酸。微纖溶酶和小纖溶酶變異體還包括，但是不止限于這些蛋白中的氨基酸插入和/或替代。預(yù)計(jì)微纖溶酶或者小纖溶酶中的氨基酸替代優(yōu)選是保守替代?？梢酝ㄟ^重組方法制備任何微纖溶酶和小纖溶酶變異體或者其他TPCD，并且使用一種纖溶酶原活化劑將其活化為活性的纖溶酶形式?；蛘呖梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的其他方法，例如但是不止限于，使用彈性蛋白酶消化人纖溶酶原或者對(duì)纖溶酶、微纖溶酶和小纖溶酶進(jìn)行部分還原和烷基化，來制備微纖溶酶和小纖溶酶變異體或者其他TPCD?？梢允褂蔑@色底物S2403或者其他顯色底物來檢測(cè)這些微纖溶酶和小纖溶酶變異體，或者相關(guān)的任何TPCD的絲氨酸蛋白酶催化活性。此外，還可以檢測(cè)微纖溶酶和小纖溶酶變異體或者任何其他TPCD誘導(dǎo)PVD的能力和/或使玻璃體液化的能力，這可以通過將溶解于平衡鹽溶液中的不同劑量的變異體注射到豬、貓或者死亡以后的人眼中來實(shí)現(xiàn)。如果在這些眼中的任何一個(gè)中，某種TPCD能夠誘導(dǎo)PVD和/或使玻璃體液化，則認(rèn)為該TPCD在治療哺乳動(dòng)物的眼部病癥方面是有用的。優(yōu)選地，該TPCD不會(huì)導(dǎo)致對(duì)接受注射的眼的毒性。表1提供了微纖溶酶變異體的非限制性實(shí)例。
            
表1微纖溶酶變異體的非限制性實(shí)例以下列舉的微纖溶酶變異體的實(shí)例對(duì)應(yīng)于人纖溶酶原的氨基酸序列和編號(hào)，人纖溶酶原由氨基酸1-791組成(參見圖1 SEQ ID NO10)
            
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598-741，598-742，598-743，598-744，598-745，598-746，598-747，598-748，598-749，598-750，598-751，598-752，598-753，598-754，598-755，598-756，598-757，598-758，598-759，598-760，598-761，598-762，598-763，598-764，598-765，598-766，598-767，598-768，598-769，598-770，598-771，598-772，598-773，598-774，598-775，598-776，598-777，598-778，598-779，598-780，598-781，598-782，598-783，598-784，598-785，598-786，598-787，598-788，598-789，598-790，598-791；599-741，599-742，599-743，599-744，599-745，599-746，599-747，599-748，599-749，599-750，599-751，599-752，599-753，599-754，599-755，599-756，599-757，599-758，599-759，599-760，599-761，599-762，599-763，599-764，599-765，599-766，599-767，599-768，599-769，599-770，599-771，599-772，599-773，599-774，599-775，599-776，599-777，599-778，599-779，599-780，599-781，599-782，599-783，599-784，599-785，599-786，599-787，599-788，599-789，599-790，599-791；600-741，600-742，600-743，600-744，600-745，600-746，600-747，600-748，600-749，600-750，600-751，600-752，600-753，600-754，600-755，600-756，600-757，600-758，600-759，600-760，600-761，600-762，600-763，600-764，600-765，600-766，600-767，600-768，600-769，600-770，600-771，600-772，600-773，600-774，600-775，600-776，600-777，600-778，600-779，600-780，600-781，600-782，600-783，600-784，600-785，600-786，600-787，600-788，600-789，600-790，600-791；601-741，601-742，601-743，601-744，601-745，601-746，601-747，601-748，601-749，601-750，601-751，601-752，601-753，601-754，601-755，601-756，601-757，601-758，601-759，601-760，601-761，601-762，601-763，601-764，601-765，601-766，601-767，601-768，601-769，601-770，601-771，601-772，601-773，601-774，601-775，601-776，601-777，601-778，601-779，601-780，601-781，601-782，601-783，601-784，601-785，601-786，601-787，601-788，601-789，601-790，601-791；602-741，602-742，602-743，602-744，602-745，602-746，602-747，602-748，602-749，602-750，602-751，602-752，602-753，602-754，602-755，602-756，602-757，602-758，602-759，602-760，602-761，602-762，602-763，602-764，602-765，602-766，602-767，602-768，602-769，602-770，602-771，602-772，602-773，602-774，602-775，602-776，600-777，602-778，602-779，602-780，602-781，602-782，602-783，602-784，602-785，602-786，602-787，602-788，602-789，602-790，602-791使用纖溶酶原活化劑，例如，但不止限于，鏈激酶、葡激酶、組織型纖溶酶原活化劑或者尿激酶活化小纖溶酶原和微纖溶酶原而產(chǎn)生小纖溶酶和微纖溶酶。小纖溶酶原和微纖溶酶原來自于纖溶酶原，后者是一條單鏈的糖蛋白，是哺乳動(dòng)物血液的重要組分。人纖溶酶原是791個(gè)殘基組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(SEQ ID NO10)，由N端活化前結(jié)構(gòu)域、5個(gè)同源的Kringle結(jié)構(gòu)域(每個(gè)大約80氨基酸)、一個(gè)絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域間的連接序列組成。纖溶酶或者纖溶酶原活化劑切割人纖溶酶原N端Arg68-Met69，或Lys77-Lys78或Lys78-Val79之間的肽鍵，產(chǎn)生縮短的酶原，稱為L(zhǎng)ys-纖溶酶原(例如，由69-791或78-791或79-791號(hào)氨基酸組成的蛋白質(zhì))。由彈性蛋白酶進(jìn)一步切割除去前4個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生另一個(gè)酶原，小纖溶酶原(通常是442-791號(hào)氨基酸)。進(jìn)一步切掉第五個(gè)Kringle，得到微纖溶酶原(通常是543-791號(hào)氨基酸)。纖溶酶原的Kringle區(qū)含有賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，它們介導(dǎo)纖溶酶原與底物如纖維蛋白的特異性結(jié)合。在Arg561和Val562之間的肽鍵進(jìn)行切割，使纖溶酶原的酶原形式活化為它們具有酶活性的形式，產(chǎn)生與相應(yīng)蛋白質(zhì)的由二硫鍵連接的雙鏈形式。纖溶酶原蛋白活化的產(chǎn)物被稱為纖溶酶。因此，Lys-纖溶酶原活化后的產(chǎn)物稱為L(zhǎng)ys-纖溶酶，而小纖溶酶原和微纖溶酶原活化后的產(chǎn)物被分別稱為小纖溶酶和微纖溶酶。未糖基化的Lys-纖溶酶分子量大約為65000，完全糖基化的Lys-纖溶酶分子量大約為83000道爾頓；而小纖溶酶的分子量約為38000道爾頓，微纖溶酶的分子量約為26500道爾頓(還原形式)以及29000道爾頓(非還原形式)。同纖溶酶一樣，小纖溶酶和微纖溶酶具有催化活性。與纖溶酶相比，小纖溶酶和微纖溶酶的優(yōu)勢(shì)在于它們的形狀比纖溶酶小。因此預(yù)計(jì)在玻璃液內(nèi)小纖溶酶和微纖溶酶都比纖溶酶的擴(kuò)散速率快(Xu，J.et al.，Pharmaceutical Research 17664-669，2000)。
            
在一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD的分子量為小于約40000道爾頓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD的分子量為約20000道爾頓到約30000道爾頓之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD的分子量為約26500道爾頓(還原形式)和約29000道爾頓(非還原形式)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TPCD的分子量為小于約20000道爾頓。
            
如美國(guó)專利4774087所述，可以在pH范圍在9.5到11.5的高度堿性溶液中使纖溶酶和纖溶酶原發(fā)生自身水解反應(yīng)來制備微纖溶酶。或者可以如PCT申請(qǐng)WO 02/50290中所述，用重組方法制備微纖溶酶和小纖溶酶。簡(jiǎn)而言之，編碼微纖溶酶原和小纖溶酶原的DNA被分別克隆到酵母表達(dá)載體(例如pPICZα，一個(gè)來自Invitrogen的分泌型表達(dá)載體)中，用于在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母(例如漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母和球擬酵母)中表達(dá)這些蛋白。挑選產(chǎn)生最高微纖溶酶和小纖溶酶活性蛋白的酵母克隆用于大規(guī)模生產(chǎn)?？梢栽谌魏我?guī)模培養(yǎng)這些克隆，但是通常是約20升到約500升的規(guī)模。分泌出的微纖溶酶原和小纖溶酶原經(jīng)過含三個(gè)步驟的過程純化陽離子離子交換擴(kuò)展床層析、疏水層析和親和層析。通過該過程獲得的純化的微纖溶酶原和小纖溶酶原使用摩爾比例的纖溶酶原活化劑(例如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、SY162葡激酶變異體等)進(jìn)行活化。應(yīng)當(dāng)注意的是生產(chǎn)微纖溶酶和小纖溶酶的重組過程可以擴(kuò)展用于制備任何TPCD。與使用自體纖溶酶相比，使用重組TPCD的優(yōu)勢(shì)在于重組蛋白可以從大批生產(chǎn)制備，得到的酶具有一致的活性。因?yàn)檫@些蛋白具有一致的活性，所以可以實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方案。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是這些蛋白可以隨時(shí)獲得，而沒有與從每個(gè)患者身上分離和純化纖溶酶的耽擱以及其他相伴問題。
            
通過以上描述的過程得到的TPCD可以進(jìn)行濃縮、穩(wěn)定化和/或凍干。濃縮蛋白質(zhì)的方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的(參見例如Protein Purification MethodsA Practical Approach，Harris，E.L.V和Angal，S.(eds.)，IRL Press，1989；A Guideto Protein Isolation(第二版)，Clive Dennison，Kluwer AcademicPublications，2003；和Protein Methods(第二版)，Daniel M.Bollag，Michael D.Rozycki，Stuart J.Edelstein(eds.)，Wiley，1996)。
            
穩(wěn)定化是保護(hù)蛋白質(zhì)不發(fā)生降解和/或失活的一種方法，通過使用一種或者多種穩(wěn)定劑(例如使TPCD與穩(wěn)定劑接觸或者在穩(wěn)定劑存在的情況下純化TPCD)達(dá)到這些目的。穩(wěn)定劑包括，但不限于，氨甲環(huán)酸、己酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、谷胺酰胺、丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、多元醇、藥物上可以接受的糖、葡萄糖胺、硫胺素、煙酰胺、任何包含檸檬酸、乙酸、鹽酸、羧酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或者苯甲酸的酸性緩沖液、以及鹽例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣的鹽，以及任何以上物質(zhì)的衍生物或組合。與自體纖溶酶相比，使用穩(wěn)定化的、重組產(chǎn)生的TPCD的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些蛋白比自體纖溶酶穩(wěn)定得多，自體纖溶酶通過收集血液獲得，其純化、制備和儲(chǔ)存是一個(gè)患者一個(gè)患者分開進(jìn)行的。自體纖溶酶在制備之后需要盡快使用，與此不同的是，穩(wěn)定化的重組TPCD可以在純化之后相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)使用。
            
可以在純化的蛋白濃縮之后或者在穩(wěn)定化后立即凍干本發(fā)明的TPCD。凍干蛋白質(zhì)的方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的。凍干的TPCD可以以任意量?jī)?chǔ)存在小瓶(例如玻璃瓶)中，但優(yōu)選是可以方便迅速重溶使用的量。
            
凍干的微纖溶酶、小纖溶酶或任何其他TPCD可以在用于與玻璃體和/或房水接觸之前，重溶于一種眼科學(xué)可以接受的載體中。在一個(gè)實(shí)施方案中眼科學(xué)可以接受的載體是一種無菌溶劑，它的pH和滲透壓與受治對(duì)象玻璃液的pH和滲透壓相匹配。眼科學(xué)可以接受的載體的非限制性實(shí)例有等滲鹽溶液、平衡鹽溶液(BSS)和BSS PLUS。平衡鹽溶液通常含有0.64％氯化鈉，0.075％氯化鉀，0.048％無水氯化鈣，0.03％六水氯化鎂，0.39％三水乙酸鈉，0.17％二水檸檬酸鈉，用氫化鈉/鹽酸調(diào)節(jié)pH，和水。
            
使用包含TPCD的組合物與玻璃體和/或房水接觸的方法取決于特定的受治對(duì)象、被治療的病情的嚴(yán)重性以及為達(dá)到治療的效果所需的劑量，并且可以由內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)每個(gè)患者的情況分別確定。任何接觸玻璃體和/或房水的方法，只要向玻璃體和/或房水提供了有效量的TPCD，就可以使用。應(yīng)該理解這種與玻璃體和/或房水的接觸不需要與給服包含TPCD的組合物同時(shí)進(jìn)行。接觸可以被延遲或者甚至在給藥之后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。一種接觸玻璃體和/或房水的方法是進(jìn)行一次或者多次眼內(nèi)注射，直接分別注射進(jìn)入玻璃體和/或房水內(nèi)。還可以通過結(jié)膜下、肌肉內(nèi)或者靜脈內(nèi)注射的方式接觸玻璃體和/或房水?？梢允褂靡环N包含TPCD的液體溶液，根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的步驟提供這些注射中的任意一種。但是也可以使用任何其他適宜的方法用TPCD接觸玻璃體和/或房水，使用這些方法使TPCD向玻璃體和/或房水內(nèi)充分分配，以治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部病癥或者病癥并發(fā)癥。還可以在玻璃體內(nèi)植入特定的裝置給服包含TPCD的組合物，這些裝置包括但是不止限于OCUSERT(Alza Corp.，Palo Alto，Calif.)和VITRASERT(Bausch and Lomb，Inc.，Rochester，N.Y.)。本發(fā)明還涉及使用儲(chǔ)備庫、持續(xù)釋放制劑或者任何可植入的裝置連續(xù)不斷地供應(yīng)TPCD，使玻璃體和/或房水接觸TPCD。
            
本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員可以很容易地確定TPCD的用藥劑量，劑量根據(jù)患者和所要取得的效果有所不同。TPCD可以以任何達(dá)到合意治療效果的劑量使用，治療效果包括但是不止限于玻璃體液化、后玻璃體脫離、和/或從玻璃體腔中清除血液、毒性物質(zhì)或者外源物質(zhì)，而不會(huì)對(duì)眼部(特別是視網(wǎng)膜)或者相關(guān)的解剖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的毒性。此外，可以以單一劑量或者多劑量給服TPCD。通常的TPCD劑量是每只眼約0.005毫克到0.2毫克。如果進(jìn)行注射，給藥的體積是每只眼約0.05毫升到約0.3毫升含有TPCD的無菌溶劑(例如無菌的BSS或BSS PLUS)。在那些要進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的實(shí)例中，在切除玻璃體之前，使TPCD留在玻璃體和/或房水中約15到120分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每只眼0.125毫克劑量的TPCD用0.1毫升無菌的BSS或BSS PLUS輸送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在玻璃體切除術(shù)之前約15到120分鐘，每只眼0.125毫克劑量的TPCD用0.1毫升無菌的BSS或BSS PLUS輸送。
            
本發(fā)明還涉及使用包含一種以上TPCD的組合物。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，用包含第一種TPCD和第二種TPCD的組合物與玻璃體和/或房水接觸。在本發(fā)明該方面的一個(gè)特別實(shí)施方案中，第一和第二種TPCD選自由以下物質(zhì)組成的組小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及任何以上的組合。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，使用包含至少一種TPCD的第一種組合物與包含至少一種TPCD的第二種組合物與玻璃體和/或房水接觸。TPCD可以是相同或者不同的，給藥可以基本上同時(shí)進(jìn)行或者在不同時(shí)刻進(jìn)行。此外，也可以通過還包含至少一種另一藥劑的組合物給服TPCD。而且，可以先使用包含至少一種TPCD的組合物，再使用包含至少一種另一藥劑的組合物與玻璃體和/或房水接觸；或者反過來進(jìn)行。當(dāng)對(duì)每種組合物所需的時(shí)間不同時(shí)，即當(dāng)與另一種組合物相比，一種組合物起作用需要更多的時(shí)間，這樣做可能就有必要了。另一藥劑是在治療或預(yù)防眼部病癥或者眼部病癥并發(fā)癥中有用的任何蛋白質(zhì)(但不是TPCD)、化學(xué)物質(zhì)或者其他物質(zhì)。這種另一藥劑在美國(guó)專利4,820,516；5,292,509；5,866,120；6,051,698；6,462,071；6,596,725；和6,610,292中有所描述。在本發(fā)明中可以使用的另一藥劑的非限制性實(shí)例包括葡萄糖胺聚糖酶，例如透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶ABC、軟骨素酶AC、軟骨素酶B、軟骨素4-硫酸酯酶、軟骨素6-硫酸酯酶和B-葡萄糖苷酸酶；膠原酶、分散酶；含有RGD的肽，例如RGD，GRGDS，GRGDTP，蝮蝰血抑環(huán)肽和Falvoridin；抗粘合素抗體；P2Y受體拮抗劑；尿素、羥基脲、硫脲和抗血管生成藥劑例如，但是不止限于，血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑(例如抗VEGF抗體、VEGF適體、可溶性VEGF受體等等)以及胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)抑制劑(例如抗P1GF抗體、P1GF適體、可溶性VEGF受體等等)。這些另一藥劑中大部分自身就能夠促進(jìn)玻璃體的液化和/或誘導(dǎo)后玻璃體脫離?？寡苌傻妮o助藥劑對(duì)于阻止眼內(nèi)新血管生成可能是有用的。缺氧視網(wǎng)膜表達(dá)VEGF和/或P1GF被認(rèn)為導(dǎo)致了視網(wǎng)膜外血管新生的發(fā)展。因此，抑制VEGF和/或P1GF將有效阻止新血管生成。
            
包含TPCD的組合物有助于玻璃體的液化和/或玻璃體從視網(wǎng)膜和其他組織(例如視網(wǎng)膜前膜、視黃斑)上脫離。玻璃體液化和/或玻璃體脫離的結(jié)果是玻璃體在視網(wǎng)膜和其他組織上的牽引力被大大減小，并且玻璃體內(nèi)液體的自然循環(huán)代謝速率提高。因此，包含TPCD的組合物對(duì)于治療和預(yù)防眼部疾病是非常適宜的，具有病癥疾病的眼睛受益于玻璃體液化、后玻璃體脫離、視網(wǎng)膜外新血管生成的降低和/或毒素或其他有害物質(zhì)(例如，血管生成因子、水腫液體、出血的血液等)從眼后室和/或鄰近眼后室的組織(如視網(wǎng)膜或者黃斑)中加速清除。這樣的眼部病癥包括，但是不止限于，視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑點(diǎn)水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼和視網(wǎng)膜色素變性，以及其他臨床癥狀對(duì)TPCD給藥有反應(yīng)的疾病。本發(fā)明設(shè)想了對(duì)眼部病癥的治療，這包含使玻璃體與包含TPCD的組合物接觸。預(yù)計(jì)這種接觸會(huì)使玻璃體液化和/或誘導(dǎo)后玻璃體脫離和/或清除玻璃體腔內(nèi)的血液或其他有毒物質(zhì)和/或降低視網(wǎng)膜外新血管生成，這樣使病癥得到預(yù)防和治療。
            
本發(fā)明還針對(duì)預(yù)防或者抑制眼部多種不同病癥的發(fā)作的方法，這些病癥由于玻璃體粘附在視網(wǎng)膜上以及玻璃體收縮而產(chǎn)生或加劇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法能夠預(yù)防或者抑制受治對(duì)象眼部病癥或者病癥導(dǎo)致的并發(fā)癥，而無需從眼中去掉玻璃體。特別地，本發(fā)明針對(duì)治療具有增殖性病癥或者具有發(fā)生增殖性病癥風(fēng)險(xiǎn)的患者(這樣的患者包括，但是不止限于，糖尿患者)的過程，通過誘導(dǎo)后玻璃體脫離作為預(yù)防的步驟，預(yù)防或者延緩與玻璃體收縮有關(guān)或者與玻璃體內(nèi)新血管生成有關(guān)的病癥的發(fā)作。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，向糖尿患者的眼中引入該組合物，以抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)展。優(yōu)選地，在增殖性病癥出現(xiàn)以前向眼內(nèi)引入組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在增殖性疾病發(fā)作以前向眼內(nèi)引入組合物，并且使組合物在眼內(nèi)永久保留而不用從眼中去除玻璃體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)抑制中央和分支視網(wǎng)膜靜脈阻塞并發(fā)癥的方法，這些并發(fā)癥有視網(wǎng)膜新血管生成和黃斑水腫，該方法是通過誘導(dǎo)患者產(chǎn)生后玻璃體脫離實(shí)現(xiàn)的，作用的對(duì)象是需要進(jìn)行這種治療的患者。本發(fā)明提供了通過誘導(dǎo)后玻璃體脫離治療即將出現(xiàn)的黃斑破洞或者全層皮黃斑破洞(不論是先天的還是外傷的)的方法?？梢栽谟捎诓Ａw收縮導(dǎo)致的視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂和視網(wǎng)膜出血出現(xiàn)之前，誘導(dǎo)后玻璃體脫離，從而阻止或者降低這些疾病的發(fā)病，而無需從眼中去除玻璃體。
            
許多眼科疾病出現(xiàn)的原因都有血-視網(wǎng)膜不穩(wěn)定化。這一不穩(wěn)定使脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的多種不同組分(例如血清組分，脂類、蛋白質(zhì))進(jìn)入到玻璃室內(nèi)，破壞視網(wǎng)膜表面。這一不穩(wěn)定還是玻璃室血管浸潤(rùn)的先兆，該現(xiàn)象被稱為新血管生成。玻璃體的新血管生成取決與玻璃體的基質(zhì)。因此，玻璃體的液化以聚合玻璃液的形式除去了基質(zhì)，阻礙了新血管生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療和預(yù)防眼部病癥的方法，該方法包含使玻璃體與包含TPCD的組合物接觸從而阻止或者降低視網(wǎng)膜新血管生成的發(fā)病。
            
許多眼科學(xué)疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病和眼外傷導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管破裂或滲漏，結(jié)果導(dǎo)致向玻璃體內(nèi)流血(即玻璃體出血)。玻璃體出血通常表現(xiàn)為玻璃體混濁或者不透明，有時(shí)但不是總是伴隨視網(wǎng)膜的破裂和剝離。當(dāng)出現(xiàn)伴隨有視網(wǎng)膜破裂或剝離的玻璃體出血時(shí)，迅速診斷并且手術(shù)修復(fù)這種視網(wǎng)膜破裂或剝離是很重要的。如果沒有迅速診斷并且手術(shù)修復(fù)視網(wǎng)膜破裂或剝離，會(huì)導(dǎo)致破裂或剝離區(qū)域的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞出現(xiàn)壞死。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的壞死會(huì)導(dǎo)致失明。此外，如果視網(wǎng)膜脫離在如此長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)沒有進(jìn)行修復(fù)則可能會(huì)導(dǎo)致出血位置發(fā)生進(jìn)一步的玻璃體出血和/或纖維組織的形成。纖維組織會(huì)在玻璃體和視網(wǎng)膜之間形成不良的永久性的粘附。在沒有任何治療的情況下，玻璃體的出血性混濁需要6-12個(gè)月的時(shí)間才能有效清除而使得能夠透過玻璃體觀察視網(wǎng)膜。在這種情況下，當(dāng)內(nèi)科醫(yī)生需要修復(fù)患者視網(wǎng)膜表面的任何部分或者需要觀察視網(wǎng)膜表面時(shí)，這些操作都被玻璃體的混濁或者不透明所阻礙，這時(shí)可能需要進(jìn)行玻璃體切除術(shù)這樣一種微型手術(shù)步驟。該步驟包括用微型手術(shù)刀去除玻璃體的全部或者部分，并用清澈的液體或者其他物質(zhì)代替玻璃體，這些物質(zhì)使眼部空洞保持其形狀。標(biāo)準(zhǔn)的玻璃體切除術(shù)手術(shù)步驟對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使玻璃體與包含至少一種TPCD的組合物接觸，作為玻璃體切除術(shù)的輔助。在其他實(shí)施方案中，在沒有實(shí)施玻璃體切除術(shù)的情況下，使玻璃體與包含至少一種TPCD的組合物接觸。
            
還使用了以下的實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明了本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)該被理解為本發(fā)明范疇或精神限制于實(shí)施例中描述的特異步驟。相反，應(yīng)該清除地認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀了這里的描述之后，在不脫離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范疇的條件下，可能需要尋求多種其他的實(shí)施方案、改動(dòng)或者它們的等價(jià)物。
            
實(shí)施例1在巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)人微纖溶酶原和人小纖溶酶原的載體構(gòu)建(a)pPICZαA載體pPICZαA載體購自Invitrogen Corporation(Carlsbad，Calif.)，用于重組人微纖溶酶原和人小纖溶酶原在巴斯德畢氏酵母中的直接表達(dá)和分泌。該載體的顯著性質(zhì)包括(i)含有乙醇氧化酶1(AOX1)啟動(dòng)子的942bp的片段，其使得在畢氏酵母中重組蛋白的高水平表達(dá)可以被甲醇誘導(dǎo)，而且目標(biāo)質(zhì)粒整合到AOX1的染色體基因座上；(ii)來自AOX1基因的天然轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸信號(hào)；(iii)使大腸桿菌和巴斯德畢氏酵母具有zeocin抗性的表達(dá)盒子；(iv)Co1E1復(fù)制起點(diǎn)，用于質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的擴(kuò)增和維持；(v)c-myc表位和多聚組氨酸(6×His)標(biāo)簽，這可以用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)和純化；以及(vi)唯一的限制性酶切位點(diǎn)(例如Sac I，Pme I，BstXI)，這可以使載體在AOXI基因座處線性化，而有效地整合進(jìn)入畢氏酵母的基因組。
            
除了以上的特點(diǎn)外，該載體還含有啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的分泌信號(hào)α-因子前多肽原，使表達(dá)出的異源蛋白分泌到培養(yǎng)基中。在pPICZα中對(duì)α因子交配信號(hào)序列的加工通過兩個(gè)步驟進(jìn)行1.由KEX2基因產(chǎn)物對(duì)信號(hào)序列進(jìn)行初次切割，切割位置在序列Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala的精氨酸和谷胺酰胺之間，其中*表示了切割的位置。但是Glu-Ala重復(fù)對(duì)于Kex2的切割不總是必需的。
            
2.用STE13基因產(chǎn)物進(jìn)一步切除Glu-Ala重復(fù)。在某些情況下當(dāng)Ste13的切割效率低時(shí)，則Glu-Ala重復(fù)就留在被表達(dá)的目標(biāo)蛋白的氨基端。
            
在pPICZαA載體中緊靠α因子信號(hào)序列的下游用基因工程的手段加入了多克隆位點(diǎn)，具有EcoR I，Sfi I，Kpn I，Xho I，Sac II andXba I的識(shí)別位點(diǎn)，有助于外源基因的克隆。除了多克隆位點(diǎn)中的XhoI位點(diǎn)外，在α因子分泌信號(hào)的羧基端也有一個(gè)XhoI識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)緊靠Lys-Arg Kex2切割位點(diǎn)的上游。該XhoI限制位點(diǎn)可以用于克隆目標(biāo)基因，使其恰好位于Kex2的切割位點(diǎn)，這可以通過PCR克隆方法和適當(dāng)?shù)恼蛞?，使XhoI位點(diǎn)直至精氨酸密碼子部分的序列重新正確形成。這樣表達(dá)出的重組目標(biāo)蛋白就具有天然的氨基端了。
            
(b)微纖溶酶原的表達(dá)載體構(gòu)建編碼人微纖溶酶原的核酸序列(SEQ ID NO4的543-791號(hào)氨基酸)從Fmyc-μPli載體(Lasters et al.Eur.J.Biochem.244946，1997)中擴(kuò)增出來(PCR回收)，使用來自Clontech(Palo Alto，Calif.)的Advantage cDNA聚合酶混合物。在DNA模板在94攝氏度變性3分鐘后，進(jìn)行30次以下的熱循環(huán)94攝氏度30秒，50攝氏度30秒，72攝氏度30秒，然后是最終的延伸步驟72攝氏度2分鐘。在該反應(yīng)中使用以下的寡核苷酸引物L(fēng)Y-MPLG1(有義引物)和LY-MPLG2(反義引物)(SEQ ID NO1)LY-MPLG15′GGGGTATCTCTC GAGAAA AGA GCC CCT TCA TTT GATTG(SEQ ID NO2)LY-MPLG25′GTTTTTGTTCT AGATTA ATT ATT TCT CAT CAC TCCCTCLY-MPLG1引物的退火區(qū)域?qū)?yīng)于人纖溶酶原的543-548號(hào)殘基(Ala-Pro-Ser-Phe-Asp-Cys)，它的前面是非退火區(qū)的延伸，包括α因子交配信號(hào)序列的最后4個(gè)殘基(Leu-Glu-Lys Arg)。在該延伸中，Leu-Glu密碼子確定了XhoI限制位點(diǎn)(帶有下劃線的)，使目的基因的克隆恰好位于Kex2切割位點(diǎn)處。LY-MPLG2引物的退火區(qū)域?qū)?yīng)于纖溶酶原的最后7個(gè)殘基，之后是TAA終止密碼子和包含XbaI識(shí)別序列(帶有下劃線的)的非退火區(qū)域。
            
具有預(yù)期大小(約780bp)的擴(kuò)增片段用XhoI和XbaI酶切，定向克隆到載體pPICZαA中。受體載體片段也使用XhoI和XbaI酶切，并用瓊脂糖凝膠純化，使用Qiaquick gel提取試劑盒(Qiagen GmbH，Germany)。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TG1(DSMZ收集品#1208，德國(guó))，篩選zeocin抗性克隆。根據(jù)限制性酶切分析結(jié)果，保留含有預(yù)期大小插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。使用引物5′AOX和3′AOX對(duì)載體pPICZα-MPLG1(克隆#5)進(jìn)行序列測(cè)定，兩個(gè)引物是Invitrogen Corporation(Carlsbad，Calif.)的EasySelect Pichia表達(dá)試劑盒提供的，測(cè)序結(jié)果確證了微纖溶酶原編碼區(qū)的準(zhǔn)確插入，與α因子交配信號(hào)融合，編碼區(qū)沒有不需要的突變。
            
所用的人微纖溶酶原經(jīng)測(cè)序確定的核苷酸序列和由其導(dǎo)出的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。與以前由Forsgren et al.FEBS Lett.213254，1987確定的序列相比，本核苷酸序列有10個(gè)位置不同。但是氨基酸序列是相同的。
            
(c)小纖溶酶原的表達(dá)載體構(gòu)建如下所述構(gòu)建衍生自pPICZα的分泌載體，用于小纖溶酶原的表達(dá)，使用以上描述的pPICZα-MPLG1載體。
            
編碼小纖溶酶原Kringle 5和部分催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO10的444到604號(hào)氨基酸)的500bpDNA片段從FdTet-SN-miniPlg載體(Lasters et al.，引用見上)中擴(kuò)增出來(PCR回收)。DNA模板在94攝氏度變性3分鐘后，進(jìn)行30次以下的熱循環(huán)94攝氏度10秒，50攝氏度10秒，72攝氏度15秒，然后是最終的延伸步驟72攝氏度2分鐘。在該反應(yīng)中使用以下的寡核苷酸引物L(fēng)Y-MINPLG1(有義引物)和LY-MLNPLG2(反義引物)LY-MINPLG15′GGGGTATCTCTC GAGAAA AGA GCA CCT CCG CCTGTT GTC CTG CTT CC(SEQ ID NO5)LY-MLNPLG25′GCA GTG GGC TGC AGTCAA CAC CCA CTC(SEQ IDNO6)LY-MINPLG1引物的退火區(qū)域?qū)?yīng)于纖溶酶原的444-452號(hào)殘基(Ala-Pro-Pro-Pro-Val-Val-Leu-Leu-Pro)，它的前面是非退火區(qū)的延伸，包括α交配信號(hào)因子的最后4個(gè)殘基(Leu-Glu-Lys Arg)。在該延伸中，Leu-Glu密碼子確定了XhoI限制位點(diǎn)(帶有下劃線的)，使目的基因的克隆恰好位于Kex2切割位點(diǎn)處。
            
LY-MINPLG2引物的退火區(qū)域?qū)?yīng)于人纖溶酶原的596-604號(hào)殘基(Glu-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys)。催化結(jié)構(gòu)域的退化區(qū)域，也出現(xiàn)在微纖溶酶原表達(dá)載體中，包含唯一的Pst I識(shí)別序列(帶有下劃線的)。
            
具有預(yù)期大小的擴(kuò)增片段用XhoI和PstI酶切，且定向克隆到衍生自pPICZα-MPLG1(上述)的受體載體片段中。受體載體片段也使用XhoI和PstI酶切，用瓊脂糖凝膠純化，使用Qiaquick gel提取試劑盒(Qiagen GmbH，德國(guó))。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TG1(DSMZ收集品#1208，德國(guó))，篩選zeocin抗性克隆。根據(jù)限制性酶切分析結(jié)果，保留含有預(yù)期大小插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。使用引物5′AOX和3′AOX對(duì)載體pPICZα-KMPLG1(克隆#3)進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果確證了擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確插入，與α因子交配信號(hào)融合，克隆區(qū)域也沒有任何突變。
            
EXAMPLE 2實(shí)施例2制備重組、穩(wěn)定化的微纖溶酶的方法(a)用pPICZα-MPLG1轉(zhuǎn)化畢氏酵母用Pme I消化10微克的載體pPICZα-MPLG1，在5′AOX1區(qū)域使載體線性化。將DNA沉淀，在無菌蒸餾水中濃縮至大約0.33微克每微升。
            
用5微升轉(zhuǎn)化按照EasySelect Pichia表達(dá)試劑盒制備的感受態(tài)巴斯德畢氏酵母X33細(xì)胞。
            
(b)高表達(dá)菌株的篩選如下進(jìn)行高表達(dá)菌株的篩選。在YPDSZ平板(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％瓊脂，100微克每毫升zeocin)上篩選zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。將34個(gè)單菌落接種在10毫升的BMYZ-甘油培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，1％甘油，100mM磷酸鉀，pH6.0，1.34％酵母氮基礎(chǔ)，4×10-5％生物素，100微克每毫升zeocin)中，在50毫升Falcon試管中培養(yǎng)，30攝氏度培養(yǎng)16小時(shí)。沉淀細(xì)胞，用2毫升BMYZ-甲醇培養(yǎng)基(與BMYZ-甘油培養(yǎng)基相同，但是用0.5％甲醇代替甘油)重懸，誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子表達(dá)，并培養(yǎng)40小時(shí)。在這期間補(bǔ)充4次0.5％的甲醇(6，22，26和30小時(shí)之后)。在誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，根據(jù)Lijnen et al.Eur.J.Biochem.120149，1981的描述檢查培養(yǎng)物上清中微纖溶酶原的存在。簡(jiǎn)而言之，純的或者10倍稀釋的上清與尿激酶共同孵育30分鐘，以使微纖溶酶原活化為微纖溶酶。在不同時(shí)刻由顯色底物S2403(來自Chromogenix，安特衛(wèi)普，比利時(shí))確定產(chǎn)生的纖溶酶的酰胺水解活性，測(cè)得的纖溶酶活性與已知量的純化的纖溶酶或微纖溶酶制品的活性相比。克隆X33-MPLG1#5在尿激酶活化之后顯示出最高的微纖溶酶活性，選擇該克隆進(jìn)行接下來的大規(guī)模生產(chǎn)。根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議的規(guī)定，將該克隆保存于比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM-MUCL-COLLECTION)，保存日期為2001年12月12日，登錄編號(hào)為MUCL 43676。
            
(c)發(fā)酵X33-MPLG1#5的50升規(guī)模發(fā)酵如下分4步進(jìn)行。兩升搖瓶細(xì)胞培養(yǎng)物在400毫升YSG+培養(yǎng)基(6g/l酵母提取物，5g/l of大豆蛋白胨，20g/l甘油)中，30攝氏度下培養(yǎng)23小時(shí)，使用0.7毫升接種物(細(xì)胞庫凍存管編號(hào)甘油OOC17)，270rpm振蕩，(在預(yù)培養(yǎng)步驟結(jié)束時(shí))OD600達(dá)到15。然后在30升的MRP80發(fā)酵裝置中進(jìn)行發(fā)酵，使用30升基礎(chǔ)培養(yǎng)基(26.7ml/l H3PO4 85％，1.05g/l CaSO4.2H2O，18.2g/l K2SO4，14.9g/l MgSO4.7H2O，4.13g/l KOH，40g/l 100％甘油以及4.76ml/l PTM1鹽溶液[包含6g/l CuSO4.5H2O，0.08g/l NaI，3.36g/l MnSO4.H2O，0.2g/l NaMoO4.2H2O，0.02g/l硼酸，0.82g/l CoCl2.6H2O，20g/l ZnCl2，65g/l FeSO4.7H2O，0.2g/l d-生物素和5ml/l HSSO4])，使用600毫升接種物于30攝氏度，以大氣壓下50升每分鐘氣流，溶解氧(DO)＞20％，200-500rpm振蕩，用12.5％氨水維持pH在5.8。在24小時(shí)以及OD600達(dá)到50時(shí)(批步驟結(jié)束)，溶解氧的迅速增加表明甘油耗盡。補(bǔ)充甘油(632g/l甘油100％和12ml/l PTM1)使24小時(shí)的OD600達(dá)到258。然后開始補(bǔ)充甲醇，在6小時(shí)內(nèi)將通氣速率提高至250ml/l，使用988ml/l甲醇和12ml/l PTM1維持66小時(shí)，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)OD600達(dá)到352。使用X33-MPLG1#5進(jìn)行350升規(guī)模的發(fā)酵得到成比例的相似結(jié)果。
            
(d)純化然后使用包含離子交換擴(kuò)展床層析、疏水層析和親和層析三個(gè)步驟的程序純化收獲物，如下i)離子交換擴(kuò)展床層析使用裝在Streamline 200層析柱(Pharmacia Biotechnology目錄號(hào)18-1100-22)中的Streamline SP(從PharmaciaBiotechnology獲得，目錄號(hào)17-0993-01/02)進(jìn)行離子交換擴(kuò)展床吸附層析，裝柱床體積為5120立方厘米，用向上流動(dòng)的方式加入兩倍柱床體積的1M NaCl，25mM乙酸鈉(CH3COONa.3H2O)緩沖液，pH6.0，進(jìn)行擴(kuò)展和平衡，然后是1倍柱床體積的25mM乙酸鈉緩沖液，pH6.0。發(fā)酵培養(yǎng)物用水在線稀釋7倍，向上流動(dòng)至擴(kuò)展的柱床內(nèi)，流速為1000毫升每分鐘。用向上流動(dòng)的乙酸鈉緩沖液pH6.0洗掉松散結(jié)合的物質(zhì)，然后將柱接頭降低到沉降柱床的表面，高度為16.3厘米。將流向逆轉(zhuǎn)，被柱結(jié)合的蛋白由兩體積的0.5M NaCl，25mM乙酸鈉緩沖液pH6.0洗脫。向洗脫的Streamline級(jí)分中加入固體硫酸銨，達(dá)到30％飽和(每升洗脫的Streamline級(jí)分加入164克硫酸銨)，且混合物在4-8攝氏度輕輕攪拌1小時(shí)。
            
ii)疏水層析使用裝在Vantage 180/500層析柱(從Millipore獲得，目錄號(hào)87018001)中的Hexyl TSK 650C(從Toso-Haas獲得，目錄號(hào)19027)于4-8攝氏度進(jìn)行疏水層析，裝柱床體積為2700立方厘米。將Streamline的洗脫級(jí)分上樣于該層析柱上，流速為38升每小時(shí)。然后使用1.5倍柱體積的含有164g/l硫酸銨的25mM乙酸鈉緩沖液pH6.0洗柱，且用7倍柱體積的25mM乙酸鈉緩沖液pH6.0洗脫。
            
iii)親和層析使用裝在Vantage 130/500層析柱(從Millipore獲得，目錄號(hào)87013001)中的Blue Sepharose 6 Fast Flow (從PharmaciaBiotechnology獲得，目錄號(hào)17-0948-02/03)于4-8攝氏度進(jìn)行親和層析，裝柱床體積為3,186立方厘米。洗脫級(jí)分上樣于親和層析柱上，流速為20升每小時(shí)，用1柱體積的25mM磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)緩沖液pH7.0洗柱。用5倍柱體積0.5M氯化鈉，25mM磷酸氫二鈉緩沖液pH7.0從柱上洗脫微纖溶酶原蛋白級(jí)分，將其在-20攝氏度冷凍保存。由SDS凝膠電泳證明該物質(zhì)的純度大于98％。
            
(e)微纖溶酶的定量活化和穩(wěn)定化i)定量活化微纖溶酶原到微纖溶酶的活化在23攝氏度下進(jìn)行30分鐘，使用0.5％摩爾比例的葡激酶變異體SY162，于0.5M氯化鈉、25mM磷酸氫二鈉Na2HPO4.12H2O緩沖液中，pH7.0。SY162是葡激酶的變異體，與野生型相比，免疫原性降低，包含12個(gè)氨基酸替代(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T和K135R)，這在WO 99/40198中有所描述。在微纖溶酶中加入固體硫酸銨至終濃度為1M(132g/l)，在4-8攝氏度攪拌混合物15分鐘。
            
ii)疏水層析使用裝在BPG 100/500層析柱(從Pharmacia Biotechnology獲得，目錄號(hào)18-1103-01)中的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (從Pharmacia Biotechnology獲得，目錄號(hào)17-0965-03/05)于4-8攝氏度進(jìn)行疏水層析，裝柱床體積為1,738立方厘米。用4倍柱床體積的25mM磷酸氫二鈉緩沖液pH7.0〔含有0.1M的穩(wěn)定劑氨甲環(huán)酸(從Bournonville Pharma獲得，Braine-L′Alleud，比利時(shí))和1M硫酸銨pH7.0〕。將活化的微纖溶酶上樣于層析柱上，線性流速為18升每小時(shí)。然后使用4.5倍柱體積的含有0.1M穩(wěn)定劑氨甲環(huán)酸和1M硫酸銨的25mM磷酸氫二鈉緩沖液pH7.0洗柱。使用5倍柱體積的含有0.1M穩(wěn)定劑氨甲環(huán)酸和0.7M硫酸銨的25mM磷酸氫二鈉緩沖液pH7.0將纖溶酶從柱上洗脫下來，線性流速為6升每小時(shí)，并用含有0.1M氨甲環(huán)酸的磷酸緩沖液pH7.0平衡。用含0.1M氨甲環(huán)酸的25mM的Na2HPO4.12H2O緩沖液，pH7.0從柱上洗脫葡激酶變異體SY162。特異性ELISA證明，該步驟從微纖溶酶洗脫峰中除去了99％以上的葡激酶。
            
iii)通過切向流超濾進(jìn)行濃縮和滲濾在這個(gè)步驟中，將步驟(ii)的洗脫液濃縮，并將緩沖液交換為低pH的檸檬酸緩沖液。在本步驟中將步驟(ii)的氨甲環(huán)酸除去，并用低pH的檸檬酸緩沖液使微纖溶酶穩(wěn)定。
            
使用2 Pellicon 2 Biomax膜(5kDa，2.5微米，從Millipore獲得，Bedford，Massachusetts，目錄號(hào)P2B005A25)在2-8攝氏度進(jìn)行超濾。將膜裝到與Microgon Pump Cart System(來自Microgon，Laguna Hills，Calif.)相連的Pellicon 2 Process支架上。用純水洗膜，并在操作前檢查膜的完整性。用0.5M氫氧化鈉連續(xù)循環(huán)60分鐘，再用0.1M氫氧化鈉連續(xù)循環(huán)60分鐘對(duì)膜進(jìn)行清潔。該清潔步驟深入清潔了濾膜，在上樣前除去了任何殘留在膜上的微量蛋白。然后使用5mM檸檬酸pH3.1潤(rùn)洗膜，直至超濾透過物的pH達(dá)到3.1。Phenyl Sepharose洗脫液的pH調(diào)節(jié)至3.1，并通過超濾將蛋白濃縮至4毫克每毫升。對(duì)5倍體積的5mM檸檬酸pH3.1進(jìn)行滲濾60-90分鐘。在50升發(fā)酵裝置中的三次操作分別得到的產(chǎn)量(用克表示)總結(jié)于表2。
            
表2操作1操作2操作3發(fā)酵罐220  240  NDStreamline50   79   130Hexyl 36   37   NDBlue  25   28   30Phenyl17   20   26滲濾   --22(圖注ND未確定)iv)無菌過濾(0.2微米)進(jìn)行這個(gè)步驟以保證沒有微生物的污染。
            
在2-8攝氏度加入甘露醇至濃度為1.5克每克蛋白，在23攝氏度下，在Millipak 100濾膜(500厘米大小，從Millipore獲得，目錄號(hào)MPGL10CA3)上進(jìn)行無菌過濾，然后用大約500毫升的5mM檸檬酸pH3.1潤(rùn)洗，蠕動(dòng)泵的流速是500毫升每分鐘。用無菌和無熱源的袋子收集過濾產(chǎn)物，將其保存于-20攝氏度下。
            
實(shí)施例3制備重組、穩(wěn)定化的小纖溶酶的方法在20微升的反應(yīng)體系內(nèi)用PmeI酶消化約15微克的載體pPICZα-KMPLG1，在5′AOX1區(qū)域內(nèi)使載體線性化。線性的DNA(3微克)用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)的巴斯德畢氏酵母X33細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞根據(jù)EasySelect Pichia表達(dá)試劑盒提供的方法制備。
            
高表達(dá)菌株的篩選基本上如下進(jìn)行。在YPDSZ平板(在實(shí)施例2中詳細(xì)說明的)上篩選Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。50個(gè)分離出的克隆接種于15毫升BMYZ甘油培養(yǎng)基(如實(shí)施例2中詳細(xì)說明的)，在50毫升的Falcon管中于30攝氏度培養(yǎng)16小時(shí)。將細(xì)胞沉淀，重懸于1.5毫升BMYZ甲醇培養(yǎng)基(如實(shí)施例2中詳細(xì)說明的)中，以誘導(dǎo)自AOX1
            
啟動(dòng)子的表達(dá)，并培養(yǎng)40小時(shí)。在這個(gè)過程中定期補(bǔ)充3或4次0.5％的甲醇。在誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，根據(jù)Lijnen et al.(同上引用)描述的方法檢查小纖溶酶原在培養(yǎng)物上清中的存在。簡(jiǎn)而言之，將含有小纖溶酶原的上清稀釋10倍，加鏈激酶孵育10分鐘，使纖溶酶原形成有活性的復(fù)合物。產(chǎn)生的小纖溶酶活性，由顯色底物S2403(參見實(shí)施例2)在不同時(shí)刻測(cè)定，與已知量的純化的纖溶酶原制備物的活性相比較。在這些條件下，所有檢測(cè)的克隆產(chǎn)生的小纖溶酶原產(chǎn)量在3到15毫克每升之間。兩個(gè)克隆X33-KMPLG1 #6和X33-KMPLG1 #25，顯示了最高的纖溶酶活性，選擇它們用于接下來的大規(guī)模生產(chǎn)。這兩個(gè)克隆根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議，與2003年12月4日保存與比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM-MUCL-COLLECTION)，登錄編號(hào)分別為MUCL 45309(克隆X33-KMPLG1 #6)和登錄號(hào)MUCL 45308(克隆X33-KMPLG1 #25)。
            
實(shí)施例4新型固定方法通過本實(shí)驗(yàn)建立一種可靠的固定技術(shù)，以研究培養(yǎng)基和不同的藥劑對(duì)于正常豬眼中后玻璃體脫離(PVD)的作用。
            
從屠宰場(chǎng)得到的新鮮分離的豬眼或者立即進(jìn)行操作或者在室溫放置直至6小時(shí)。除去角膜以有助于固定。在0攝氏度，Peter′s溶液(含有1.25％戊二醛/1％多聚甲醛的0.08M甲次砷酸鹽緩沖液pH7.4)中使眼固定24到36小時(shí)，以終止酶反應(yīng)。然后用0.1M甲次砷酸鹽緩沖液pH7.4洗眼，并以逐步升高至100％的乙醇濃度，使眼逐步脫水。
            
新鮮處理的眼和室溫放置6小時(shí)的眼沒有出現(xiàn)視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的顯著改變，且玻璃體仍然粘附在視網(wǎng)膜表面上。因此，本方法提供了一種非損傷性的眼組織固定步驟，并且使玻璃體從視網(wǎng)膜表面上脫離的可能性降到最小。而且通過這個(gè)方法可以對(duì)從視神經(jīng)到視網(wǎng)膜外周的整個(gè)視網(wǎng)膜表面進(jìn)行研究。
            
實(shí)施例5微纖溶酶對(duì)死亡后豬眼玻璃體視網(wǎng)膜接觸面的作用進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以確定微纖溶酶使后玻璃體皮質(zhì)從視網(wǎng)膜表面的內(nèi)界膜上脫離的能力。
            
使用以下劑量的微纖溶酶0.0625，0.125，0.156，0.25和0.390毫克，分別溶于0.1毫升眼內(nèi)沖洗溶液BSS PLUS。這些微纖溶酶溶液的pH從0.0625毫克劑量的7.92到0.390毫克劑量的6.52。
            
在室溫(24攝氏度)下將以上公開的微纖溶酶溶液分別注射到新鮮宰殺的豬的玻璃液中。在微纖溶酶注射后的15、30、60或120分鐘后根據(jù)實(shí)施例4中的描述固定豬眼。使用0.0625毫克微纖溶酶處理1小時(shí)后即觀察到后玻璃體脫離(PVD)，而對(duì)于0.125毫克微纖溶酶及以上所有劑量，30分鐘處理后即可見到PVD。在注射后120左右這種剝離現(xiàn)象在除了靠近玻璃體基底(從視網(wǎng)膜外周延伸到鋸齒緣的區(qū)帶，這里與玻璃體的粘附最強(qiáng))以外的所有視網(wǎng)膜切片中最為明顯(圖4，A)。除了后玻璃體脫離(圖4，B-E)以外，電子顯微鏡檢查顯示玻璃體的結(jié)構(gòu)被改變，纖維結(jié)構(gòu)減少。纖維結(jié)構(gòu)被改變?yōu)楦鼮闊o定形的、毛玻璃狀，顯示玻璃液的液化(圖4，F(xiàn))。
            
大體檢查或者組織病理檢查，包括電子顯微鏡檢查沒有發(fā)現(xiàn)低于0.25毫克的劑量導(dǎo)致任何眼部或者視網(wǎng)膜毒性。特別的是，沒有發(fā)現(xiàn)自溶的跡象。細(xì)胞空泡的形成通常認(rèn)為是自溶的早期跡象，而低于0.390毫克的劑量沒有觀察到空泡形成。我們還通過電子顯微鏡檢查了其他的眼部結(jié)構(gòu)(圖5，A和B)。低于0.390毫克的劑量沒有觀察到視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)改變。但是在一些使用0.25毫克微纖溶酶處理的眼中，在視網(wǎng)膜表面上稀疏地分布著視網(wǎng)膜隆腫和少量的炎性細(xì)胞。對(duì)最高劑量(0.390毫克)微纖溶酶處理的眼進(jìn)行大體組織學(xué)檢查，顯示視網(wǎng)膜接觸面呈現(xiàn)白色。對(duì)此眼用電子顯微鏡觀察顯示視網(wǎng)膜表面有許多小的隆腫，這提示局部的視網(wǎng)膜脫離。
            
這些實(shí)驗(yàn)顯示0.06到0.2毫克劑量的微纖溶酶產(chǎn)生穩(wěn)定的后玻璃體分離，而沒有誘導(dǎo)視網(wǎng)膜出現(xiàn)任何超微結(jié)構(gòu)的變化。后玻璃體分離不僅僅出現(xiàn)在視神經(jīng)處，而且在玻璃體基底全部出現(xiàn)。后玻璃體分離的結(jié)果是清澈光滑的視網(wǎng)膜表面，使用高倍電子顯微鏡掃描(放大12000倍)沒有觀察到其上有任何膠原纖維的粘附。12000倍的放大倍數(shù)已經(jīng)足以排除未發(fā)現(xiàn)的纖維的可能性。
            
實(shí)施例6人死后眼的后玻璃體脫離進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以確定微纖溶酶是否能夠有效地誘導(dǎo)人眼中玻璃體視網(wǎng)膜的分離。
            
方法(a)劑量以及人死后眼的處理從慕尼黑眼庫獲得26只沒有已知眼病的人眼球。這些眼球是13個(gè)年齡在34到69歲的捐獻(xiàn)者捐獻(xiàn)的，眼球獲得的時(shí)間在他們死亡之后19小時(shí)以內(nèi)。使用14毫米直徑的環(huán)鉆去掉角膜后，在潮濕的孵育室內(nèi)37攝氏度下孵育15分鐘。向13只眼的玻璃體腔內(nèi)注射0.2毫升微纖溶酶。特別地，用4毫升、2毫升或1.5毫升的眼內(nèi)沖洗溶液BSSPLUS將1.25毫克的微纖溶酶分別稀釋至0.3125毫克每毫升、0.625毫克每毫升和0.9375毫克每毫升。將0.2毫升的這些溶液注射到玻璃體腔內(nèi)，使眼中的微纖溶酶量分別達(dá)到62.5微克、125微克和188微克。另外13只對(duì)應(yīng)的眼作為對(duì)照，注射0.2毫升的平衡鹽溶液(BSSPLUS)。
            
在13只使用微纖溶酶處理的眼中，9只眼僅使用玻璃體內(nèi)微纖溶酶注射處理。62.5微克劑量的微纖溶酶(pH7.4)注射到兩只眼的玻璃體腔中；125微克劑量的微纖溶酶(pH7.2)注射到五只眼的玻璃體腔中；188微克劑量的微纖溶酶(pH7.2)注射到兩只眼中。余下的4只眼中，兩只使用62.5微克的微纖溶酶和0.6毫升的六氟化硫(SF6)處理，另兩只使用125微克的微纖溶酶和0.6毫升的六氟化硫(SF6)處理。使用SF6進(jìn)行額外處理的原因是以前有報(bào)導(dǎo)說纖溶酶只在與玻璃體切除術(shù)或者氣體注射共同使用時(shí)才誘導(dǎo)PVD。以上討論的劑量和處理總結(jié)于表3。
            
表3 
            
處理以后，所有的眼在37攝氏度孵育30分鐘。之后將眼球浸入到4％多聚甲醛溶液中，將0.1毫升的固定液(4％多聚甲醛)注射到玻璃體腔內(nèi)終止眼內(nèi)的酶反應(yīng)。對(duì)于使用微纖溶酶和SF6處理的眼球的固定方式是使后極處于垂直的位置。
            
(b)掃描和透射電子顯微鏡檢查然后沿睫狀環(huán)對(duì)眼球進(jìn)行半切，棄掉前半部分。用12.5毫米直徑的角膜環(huán)鉆緩緩?fù)ㄟ^玻璃體，取出后極。然后使用4毫米直徑的角膜環(huán)鉆從后極上取得用于掃描和透射電子顯微鏡的視網(wǎng)膜樣本。
            
用于掃描電子顯微鏡的視網(wǎng)膜盤使用2％四氧化鋨(Dalton′s固定液)進(jìn)行后固定，用乙醇脫水，干燥至臨界點(diǎn)，用濺鍍的方法鍍金，用ISM-35 CF電子顯微鏡(JEOL，東京，日本)照相。
            
用于透射電子顯微鏡檢查的樣本用Dalton′s固定液后固定，脫水，包埋在EPONTM中。半薄切片用2％甲苯胺藍(lán)染色。超薄切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛形成對(duì)比，用Zeiss EM 9電子顯微鏡(Zeiss，Jena，Germany)進(jìn)行分析。
            
兩個(gè)觀察者對(duì)電子顯微鏡照片進(jìn)行獨(dú)立評(píng)價(jià)。每一個(gè)觀察者評(píng)價(jià)玻璃體視網(wǎng)膜分離的程度，評(píng)價(jià)指標(biāo)是連續(xù)還是不連續(xù)的膠原纖絲覆蓋在內(nèi)界膜(ILM)上，或者是單一還是稀疏的膠原纖絲在ILM上存在，或者是ILM沒有任何的膠原纖絲(裸露的ILM)。
            
結(jié)果(a)掃描電子顯微鏡觀察對(duì)注射62.5微克微纖溶酶的死亡后人眼進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了后玻璃體脫離，只留下不連續(xù)的膠原纖絲網(wǎng)絡(luò)覆蓋在ILM上(圖6，A)。對(duì)分別注射125微克(圖6，B)和188微克(圖6，C)微纖溶酶的死亡后人眼進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了裸露的ILM，這與完全玻璃體視網(wǎng)膜分離是符合的。這兩個(gè)高劑量都產(chǎn)生了相似的玻璃體視網(wǎng)膜接觸面超微結(jié)構(gòu)。
            
在注射了62.5微克微纖溶酶和SF6的眼中，觀察到有殘留的皮質(zhì)玻璃體覆蓋在ILM上(圖6，D)。但是在注射125微克微纖溶酶和填塞氣體的眼中，觀察到完全的玻璃體視網(wǎng)膜分離，這與裸露的ILM相符合(圖6，E)。
            
與以上討論的微纖溶酶處理的眼不同，由SEM觀察，對(duì)照眼沒有表現(xiàn)出后玻璃體脫離(圖6，F(xiàn))。這些結(jié)果總結(jié)于表4。
            
表4 
            
〔圖注+++膠原纖絲的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)；++膠原纖絲的不連續(xù)網(wǎng)絡(luò)；+稀疏的膠原纖絲；-沒有膠原纖絲，裸露的ILM〕(b)透射電子顯微鏡觀察與對(duì)照眼相比，所有微纖溶酶處理的眼的視網(wǎng)膜內(nèi)形態(tài)都沒有發(fā)生改變。與對(duì)照眼(圖7，B)相比，在微纖溶酶處理的眼中，ILM的超微結(jié)構(gòu)保持完好(圖7，A)。
            
結(jié)論這些數(shù)據(jù)表明玻璃體內(nèi)注射微纖溶酶可以在沒有玻璃體切除術(shù)或任何其他手術(shù)干預(yù)的情況下誘導(dǎo)玻璃體皮質(zhì)和內(nèi)界膜之間的切割。125微克的纖溶酶在30分鐘內(nèi)切斷人玻璃體視網(wǎng)膜連接。就酶的反應(yīng)而言，125微克微纖溶酶等價(jià)于2u的纖溶酶(Sigma-Aldrich，Munich，Germany)，這使豬尸體上的眼以及捐獻(xiàn)者人眼出現(xiàn)完全的玻璃體視網(wǎng)膜分離。這些數(shù)據(jù)還顯示在微纖溶酶處理的眼中通入氣泡對(duì)切斷玻璃體視網(wǎng)膜連接所需的劑量沒有影響。
            
實(shí)施例7微纖溶酶誘導(dǎo)的后玻璃體分離的體內(nèi)分析這些實(shí)驗(yàn)的目的是確定在體內(nèi)用微纖溶酶針對(duì)PVD的效用方法(a)貓模型解剖學(xué)家和生理學(xué)家已經(jīng)對(duì)貓的視網(wǎng)膜進(jìn)行了大量的研究，使其成為評(píng)價(jià)藥理誘導(dǎo)PVD安全性的有用模型。與人視網(wǎng)膜一樣，貓的視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，而且在視網(wǎng)膜中央凹以外有視網(wǎng)膜內(nèi)循環(huán)。這與兔的視網(wǎng)膜不同，兔視網(wǎng)膜沒有視網(wǎng)膜內(nèi)血管。兔內(nèi)視網(wǎng)膜布滿脈管系統(tǒng)，位于玻璃體表面，這限制了兔視網(wǎng)膜的實(shí)驗(yàn)研究?jī)r(jià)值，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)研究主要側(cè)重的是兔的玻璃體視網(wǎng)膜接觸面。多年來，貓模型已經(jīng)為視網(wǎng)膜對(duì)脫離的細(xì)胞應(yīng)答提供了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。因此，我們使用貓模型研究纖溶酶在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)PVD的適用性。
            
用0.5毫升克他命(Ketaset，Park-Davis，Eastleigh，UK)和0.3毫升美托咪啶(Dormitor，Pfizer，UK)肌內(nèi)注射麻醉五只年齡為12-23個(gè)月的成年家貓。對(duì)麻醉的家貓進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射14.5微克或者25微克微纖溶酶，作為對(duì)照的貓眼注射平衡鹽緩沖液(BSS-PLUS)。在本研究的五只貓中，三只通過玻璃體內(nèi)注射途徑注射了25微克微纖溶酶。這三只貓中，一只在接受注射后1天處死，第二只在注射后3天處死，第三只在3周后處死。剩余兩只貓注射14.5微克的微纖溶酶，其中一只3天后處死，另一只3周后處死。
            
(b)掃描和透射電子顯微鏡觀察從處死的貓中取出眼球，固定并且處理用于電子顯微鏡觀察，方法如實(shí)施例6中對(duì)人死后眼所述的方法相同。由兩個(gè)觀察者獨(dú)立評(píng)價(jià)電鏡照片各觀察者評(píng)價(jià)玻璃體視網(wǎng)膜分離的程度，評(píng)價(jià)指標(biāo)是連續(xù)還是不連續(xù)的膠原纖絲覆蓋在內(nèi)界膜(ILM)上，或者是單一還是稀疏的膠原纖絲在ILM上存在，或者是否ILM沒有任何的膠原纖絲。
            
(c)共聚焦顯微鏡觀察眼樣本用磷酸鹽緩沖液(PBS)潤(rùn)洗，在PBS制備的5％瓊脂糖(Sigma，St Louis Mo.，USA)中定向。用振動(dòng)切片機(jī)(Technical ProductsInternational，Polysciences，Warrington，Pa.，USA)切出100微米厚的切片，在含有正常驢血清(1∶20；Dianova，漢堡，德國(guó))的含0.5％牛血清白蛋白(BSA；Fisher Scientific，Pittsburgh，Pa.，USA)、0.1％Triton X-100(Roche Boehr inger，曼海姆，德國(guó))和0.1％疊氮鈉(Sigma-Aldrich，慕尼黑，德國(guó))的PBS(該P(yáng)BS溶液含有BSA、Triton和疊氮鹽，被稱為PBTA)中4攝氏度在轉(zhuǎn)動(dòng)器上孵過夜孵育。除去封閉血清后，按照以下六對(duì)加入第一抗體抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP；1∶500；DAKO，Hamburg，Germany)與抗膠原IV(1∶50；DAKO)；抗波形纖維蛋白(1∶50；DAKO)與抗纖粘連蛋白(1∶400；DAKO)；抗突觸素(1∶50；DAKO)與抗神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白(1∶25；DAKO)；抗層粘連蛋白(1∶25；DAKO)與抗CD68(1∶50；DAKO)；抗紅/綠視蛋白(1∶100；Santa Cruz Biotechnology，USA)與抗視紫紅質(zhì)(1∶200；Santa Cruz Biotech)；抗藍(lán)視蛋白(1∶100；Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，Calif.，USA)與抗視紫紅質(zhì)(1∶200；Santa Cruz Biotech)。本實(shí)驗(yàn)的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果列于表5中。
            
表5 
            
在轉(zhuǎn)動(dòng)器中4攝氏度孵育過夜后，切片用PBTA潤(rùn)洗，然后再次在4攝氏度與第二抗體孵育。對(duì)于每一組第一抗體分別使用與Cy2或Cy3(Dianova，Hamburg，Germany)偶聯(lián)的驢抗小鼠和驢抗兔二抗。所有的二抗1∶100稀釋使用，所有的抗體都在PBTA中稀釋。然后潤(rùn)洗切片，在含N-丙基沒食子酸鹽的甘油中封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510，Zeiss，Germany)下觀察。
            
結(jié)果(a)掃描電子顯微鏡玻璃體內(nèi)注射25微克微纖溶酶一天后，稀疏的膠原纖絲覆蓋在ILM上(圖8，A)。處理后三天，25微克的微纖溶酶產(chǎn)生完全的玻璃體視網(wǎng)膜分離(圖8，B)；在玻璃體視網(wǎng)膜接觸面上沒有殘留的膠原纖絲。注射后三天，接受14.5微克微纖溶酶注射的眼中發(fā)現(xiàn)稀疏的膠原纖絲覆蓋在ILM上(圖8，C)。用14.5微克(圖8，D)和25微克(圖8，E)微纖溶酶處理21天后，觀察到裸露的ILM。所有的對(duì)照眼都有密集的膠原纖絲網(wǎng)絡(luò)，覆蓋在視網(wǎng)膜上(圖8，F(xiàn))。這些數(shù)據(jù)總結(jié)于表6中。
            
表6 
            
〔圖注+++膠原纖絲的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)；++膠原纖絲的不連續(xù)網(wǎng)絡(luò)；+稀疏的膠原纖絲；-沒有膠原纖絲，裸露的ILM〕(b)光學(xué)和透射電子顯微鏡觀察微纖溶酶處理的眼(圖9，A)和對(duì)照眼(圖9，B)之間沒有觀察到視網(wǎng)膜細(xì)胞建構(gòu)的區(qū)別。與對(duì)照眼的內(nèi)視網(wǎng)膜和ILM(圖9，D和F)相比，微纖溶酶處理眼的內(nèi)視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)和ILM(圖9，C和E)保持完好。
            
(c)激光共聚焦顯微鏡觀察在微纖溶酶處理的眼和對(duì)照眼中，Mueller細(xì)胞的外側(cè)端部分清晰地被抗GFAP(圖10，A和B)和抗波形纖維蛋白標(biāo)記(圖10，C和D)。Mueller細(xì)胞過程沒有擴(kuò)展染色超出內(nèi)核層以外。使用抗膠原IV和抗纖粘連蛋白沒有出現(xiàn)明顯染色(數(shù)據(jù)未顯示)。這可能與這些抗體的種屬特異性有關(guān)。ILM被抗纖粘連蛋白染色。在處理的和對(duì)照眼中幾乎都沒有巨噬細(xì)胞。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突和樹突，水平細(xì)胞以及內(nèi)網(wǎng)和外網(wǎng)叢狀層被抗神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白和抗突觸素清晰地標(biāo)記(圖10，E和F)。感光細(xì)胞層被抗神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白標(biāo)記。在研究中的任何時(shí)刻，對(duì)于使用的任何抗體，在微纖溶酶處理的眼(圖10，A，C，E)和對(duì)照眼(圖10，B，D和F)之間沒有區(qū)別。
            
討論為了評(píng)價(jià)微纖溶酶在體內(nèi)玻璃體視網(wǎng)膜接觸面的切割效果，我們向五只成年貓的玻璃體腔內(nèi)注射兩個(gè)不同劑量。我們使用的第一個(gè)劑量是25微克微纖溶酶，這是在人死后眼中發(fā)現(xiàn)足以誘導(dǎo)完全PVD的劑量的五分之一。引人注意的是25微克的微纖溶酶等價(jià)于0.4U的纖溶酶(Sigma)，在臨床上0.4U的自體纖溶酶已經(jīng)用于具有黃斑破洞和糖尿病性視網(wǎng)膜病的人眼玻璃體腔中?？紤]到貓眼較小的玻璃體體積(大約是人眼玻璃體體積的60％)，第二個(gè)劑量14.5微克纖溶酶相當(dāng)于人眼中的25微克微纖溶酶。
            
在貓眼中玻璃體內(nèi)注射25微克微纖溶酶后三天，出現(xiàn)完全的玻璃體視網(wǎng)膜分離，而處理后一天，在玻璃體視網(wǎng)膜接觸面仍然存在一些膠原纖絲。這顯示微纖溶酶的作用在24小時(shí)以后仍然在持續(xù)，這與纖溶酶在血液中被其天然拮抗劑α-2-抗纖溶酶迅速滅活形成鮮明對(duì)比。微纖溶酶活性長(zhǎng)命的原因之一可能是α-2-抗纖溶酶被另外一個(gè)底物飽和，或者與纖溶酶相比，微纖溶酶對(duì)于抗纖溶酶拮抗劑有不同的親和性。另一個(gè)可能的原因可能是微纖溶酶下游的代謝途徑(例如膠原酶的活化或者基質(zhì)金屬蛋白酶的活化)在微纖溶酶被α-2-抗纖溶酶失活后仍然保持活性。
            
經(jīng)微纖溶酶處理的眼的細(xì)胞建構(gòu)與對(duì)照眼相比沒有改變。從超微結(jié)構(gòu)角度講，微纖溶酶處理的眼和對(duì)照眼之間的解剖學(xué)沒有差異。在所有樣本中ILM和視網(wǎng)膜保持完好。此外我們沒有觀察到微纖溶酶注射后任何炎癥反應(yīng)的跡象。特別地，電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察沒有顯示任何視網(wǎng)膜炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)的證據(jù)。
            
在貓的模型中，視網(wǎng)膜脫離產(chǎn)生了顯著的Mueller細(xì)胞增殖，以及Mueller細(xì)胞質(zhì)中中間細(xì)絲蛋白的大量上調(diào)，例如神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和波形纖維蛋白。這種Mueller細(xì)胞應(yīng)答被廣泛稱為神經(jīng)膠質(zhì)增生，據(jù)認(rèn)為其在視網(wǎng)膜對(duì)脫離的復(fù)雜細(xì)胞應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。在正常的視網(wǎng)膜中，Mueller細(xì)胞是沉默的，表達(dá)非常少量的GFAP和波形纖維蛋白。但是已經(jīng)顯示即使沒有誘導(dǎo)視網(wǎng)膜脫離的玻璃體切除術(shù)也會(huì)導(dǎo)致GFAP的上調(diào)。最近我們小組的工作顯示在試圖剝離貓眼中的ILM之后，中間絲蛋白出現(xiàn)顯著上調(diào)(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)顯示Muller細(xì)胞對(duì)任何形式的手術(shù)性外傷的高反應(yīng)性。
            
在本研究中，通過微纖溶酶誘導(dǎo)PVD后我們沒有觀察到任何的Muller細(xì)胞反應(yīng)性的變化。而且，就使用的任何抗體而言，在處理的眼和對(duì)照眼之間沒有區(qū)別。在研究中的任何時(shí)刻Mueller細(xì)胞的沉默狀態(tài)以及視網(wǎng)膜未改變的超微結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)性提供了使用微纖溶酶誘導(dǎo)PVD安全性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
            
總之，這些研究顯示微纖溶酶在體內(nèi)誘導(dǎo)PVD是有效的。此外，這些研究表明，因?yàn)樵诔⒔Y(jié)構(gòu)水平?jīng)]有觀察到視網(wǎng)膜的改變所以微纖溶酶是安全的。
            
實(shí)施例8通過使用動(dòng)態(tài)光散射評(píng)價(jià)微纖溶酶對(duì)于豬玻璃體的作用本研究的進(jìn)行目的在于使用非侵入性的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)評(píng)價(jià)微纖溶酶(μPli)的作用，表征μPli對(duì)新鮮獲得的死后豬玻璃體的體外和原位生物物理作用。DLS通過測(cè)量散射光強(qiáng)度的時(shí)間波動(dòng)，提供了關(guān)于溶液和懸液中粒子和大分子動(dòng)態(tài)的信息。
            
在一個(gè)DLS實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)光通過大量懸浮于液體中的小顆粒時(shí)，在遠(yuǎn)視野看到恒定的斑點(diǎn)振蕩型式(參見Chu B.，Laser lightscatteringBasic priniclples and practice，Academic Press，NewYork，1991)。這種斑點(diǎn)型式是在光路中干涉的結(jié)果，且由于在散射介質(zhì)中顆粒之間和與液體分子之間的碰撞(布朗運(yùn)動(dòng))而出現(xiàn)的大于1微秒時(shí)間級(jí)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，斑點(diǎn)型式也出現(xiàn)波動(dòng)。沒有顆粒顆粒相互作用時(shí)(稀釋色散)，從小顆粒散射出的光振蕩很快，而從大顆粒散射出的光振蕩慢得多。
            
為我們的研究建造的DLS設(shè)備提供了例如擴(kuò)散系數(shù)、大小、散射強(qiáng)度和多分散性(異質(zhì)性的量度)的動(dòng)態(tài)信息。一般來說，顆粒大小的增加(從幾納米到幾微米)以及這些顆粒數(shù)目和密度的增加導(dǎo)致光散射強(qiáng)度的增加。多分散性是具有不同大小的不同物質(zhì)組數(shù)目的量度。在DLS測(cè)量中可以鑒定多達(dá)三組大小不同的物質(zhì)，這是由于它們擴(kuò)散的時(shí)間級(jí)不同(小顆粒移動(dòng)得快而大顆粒移動(dòng)得慢)。因此，散射光強(qiáng)度和多分散性的改變與顆粒大小的數(shù)據(jù)可以彼此互相參證。如果在藥物干涉后玻璃液顆粒變小，散射強(qiáng)度增加，則很可能在溶液中較小分子數(shù)目增加，這或者由于較大分子發(fā)生斷裂，和/或在這些實(shí)驗(yàn)的情況下，本來被連續(xù)的玻璃液結(jié)構(gòu)排除在外的20納米多聚苯乙烯納米球發(fā)生流入。如果多分散性降低，則最可能的解釋是樣品中分子種類群體的均質(zhì)性增加，同樣這也指示本來被排除在外的20納米多聚苯乙烯納米球發(fā)生流入。DLS最吸引人的特點(diǎn)是它是非侵入的并且是定量的，對(duì)于幾納米到幾微米的顆粒都有效，只需要小的樣品量，對(duì)于多分散性或者多重大小(多達(dá)2-3種組分)的分散系也能相當(dāng)好地工作。使用從Brookhaven Instruments，NY獲得的累積量和指數(shù)大小分布程序分析這里的數(shù)據(jù)。Stock和Ray(Stock R.S.和Ray W.H.，J.Polym.Sci.231393，1985)對(duì)這些方案進(jìn)行了綜述。作為一個(gè)實(shí)例，圖11表示了一個(gè)典型的DLS測(cè)量，使用的是時(shí)間自相關(guān)函數(shù)或TCF，測(cè)量對(duì)象是整個(gè)豬玻璃液(多分散性系統(tǒng))和20納米直徑的多聚苯乙烯納米球溶液(單分散性系統(tǒng))。
            
材料和方法(a)用于玻璃液研究的DLS裝置的構(gòu)成制作新型致密DLS光學(xué)纖維探頭(美國(guó)專利5,973,779)，用于這里描述的玻璃液研究。它包含一對(duì)0.25間距(pitch)Selfoc GRIN透鏡，刺入深度為16毫米，散射角度為160度。包含兩個(gè)單模光纖和兩個(gè)GRIN透鏡的光纖探頭為研究眼中大分子的動(dòng)態(tài)性質(zhì)提供了簡(jiǎn)潔和遙控的手段。分別裝在一個(gè)不銹鋼金屬環(huán)內(nèi)的兩個(gè)單模光纖，裝到分開的不銹鋼托架內(nèi)。在纖維托架和透鏡托架之間有意留出一段空氣間隔，目的是在散射體積內(nèi)產(chǎn)生緊密的聚焦點(diǎn)。位于托架上的兩個(gè)光纖對(duì)齊，并固定在遠(yuǎn)離微透鏡軸的位置。將兩個(gè)托架放到第三個(gè)(外)不銹鋼托架中，該托架的背端由熱縮管覆蓋。光纖的自由末端是FC/PC類型的凸起連接器，可以容易地與激光和光檢測(cè)器組件相連接。
            
實(shí)驗(yàn)設(shè)置的主要組分是由DLS致密光纖探頭(以上描述)，含有數(shù)字相關(guān)器卡(BI-9000 Brookhaven Instruments NY)的電腦(Gateway PC 500S)，和635納米波長(zhǎng)的1毫瓦固態(tài)激光發(fā)射器(OZOptics，Canada)，以及一臺(tái)雪崩光電二極管檢測(cè)器(Perkin Elmer，Canada)。探頭裝在光學(xué)組件上，該組件通過手工控制的轉(zhuǎn)換站連接，可以控制并將探頭伸到眼內(nèi)所需的位置。
            
每一個(gè)時(shí)間自相關(guān)函數(shù)(TCF)要20秒鐘收集(除了過濾比色杯研究，這需要1分鐘)。對(duì)于所有測(cè)量保持延遲時(shí)間5微秒恒定。在開始玻璃液研究之前，通過使用聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物的水分散系(20納米直徑的乳膠納米球)全面檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性。
            
(b)玻璃液和粘性組織的動(dòng)態(tài)光散射DLS能夠非侵入性地提供溶液中懸浮顆粒平均直徑的客觀定量，在這里的溶液是玻璃液。為精確計(jì)算顆粒大小，需要知道或者猜想溶劑的粘度。如以前提到的，現(xiàn)在還不能準(zhǔn)確測(cè)量非牛頓流體的粘度，所以必需進(jìn)行猜測(cè)。考慮到玻璃液中大約有99％的水，認(rèn)為玻璃液的粘度由水產(chǎn)生是合理的。為檢測(cè)這個(gè)猜想的正確性，對(duì)整個(gè)玻璃液膠體、不能通過濾器的玻璃液亞級(jí)分(凝膠)、能夠通過濾器的玻璃液亞級(jí)分(非凝膠)、通過0.22微米Millipore濾膜的玻璃液亞級(jí)分(液體玻璃液)進(jìn)行了DLS測(cè)定。這些研究在光學(xué)比色皿中進(jìn)行，加入散射性20納米多聚苯乙烯納米球作為已知直徑且高度均一的示蹤劑。對(duì)于整個(gè)玻璃液以及所有不同亞級(jí)分的DSL測(cè)定給出相似的結(jié)果，表明玻璃液的微粘度的確非常接近純水的微粘度。玻璃液中的微粘度是指被束縛的水的粘度，在水中透明質(zhì)酸(HA)分子和膠原束懸浮。HA分子的布朗運(yùn)動(dòng)比膠原束要快得多，這是由于膠原束的形狀比HA分子要大。在DLS光譜中，HA的分子信息體現(xiàn)在較快(短)的延遲時(shí)間中，而膠原的分子信息體現(xiàn)在較慢(長(zhǎng))的延遲時(shí)間中。得到的信息以顆粒大小的分布表示。
            
(c)試劑所有的溶液使用BSS PLUS(ALCON Labs，F(xiàn)t.Worth，Tex.)制備。使用濃度為4毫克每毫升的微纖溶酶的儲(chǔ)液。懸浮于雙蒸去離子水中的20納米直徑的多聚苯乙烯納米球(Bangs Laboratories，F(xiàn)ishers，Ind.)以固定的比例加入到所有的樣品中，保證所有樣品中有一致數(shù)目的納米球。
            
(d)空曠天空模式新鮮未固定的豬眼(n＝11)通過平坦部?jī)?nèi)切切割其前部，并從前玻璃體上精細(xì)地切下晶狀體/虹膜之間的橫隔膜。切片的位置盡可能地靠近后晶狀體囊，而不切開這個(gè)組織。將眼放在固定器上，眼球后部分向下。
            
在室溫下將含有60微升20納米多聚苯乙烯納米球的溶液(300微升)置于暴露的玻璃體的前表面上，而用對(duì)照和劑量分別為0.08，0.125，0.4，0.6和0.8毫克的μPli處理樣本。在位于玻璃體/空氣接觸面以下1、2和4毫米沿中央光軸的單個(gè)點(diǎn)進(jìn)行DLS。每15分鐘記錄一次DLS讀數(shù)，記錄時(shí)間為90到360分鐘。
            
(e)閉眼模式使用30G針將300微升含有多聚苯乙烯納米球和劑量分別為0.0125、0.025、0.05、0.125、0.25、0.5、0.6和0.8毫克μPli的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照溶液通過刺入方式注射到完整無缺的豬眼的平坦部(n＝39)。在37攝氏度下將眼在固定器(角膜在上面，眼球后部分在下面，像平臥位置)上孵育30或者120分鐘。在將眼放置于溫控的水浴中之前(在任何時(shí)候要避免樣本和水的任何接觸)，以及放到水浴中以后每15分鐘，將眼沿光軸旋轉(zhuǎn)10至15秒鐘。水浴后，通過平坦部?jī)?nèi)切而切下眼前部。在沿光軸的幾個(gè)不同的點(diǎn)(平均值＝18.6，sd＝11.8)以及沿水平軸在玻璃體/空氣接觸面后深4毫米處的點(diǎn)(平均值＝30.8，sd＝18.0)進(jìn)行DLS。
            
結(jié)果(a)豬玻璃液的分子形態(tài)學(xué)對(duì)于完整(完好無缺)玻璃體在沿眼杯(eye cup)(已將前部分切掉)光軸的多個(gè)點(diǎn)進(jìn)行DLS測(cè)定，在所有空氣/玻璃體接觸面下方1.25毫米到4.75毫米的點(diǎn)顯示了非常相似的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)與將全部玻璃液放到一個(gè)比色皿中的發(fā)現(xiàn)、以及在染色后保留的殘余玻璃液中的發(fā)現(xiàn)以及在通過濾器的玻璃液亞組分的發(fā)現(xiàn)是相似的。所有的發(fā)現(xiàn)顯示了幾乎一致的顆粒大小分布。具有較大顆粒大小的組(靠右側(cè))，其平均大小為約1000納米，主要代表的是膠原。較小顆粒大小的分布(靠左側(cè))主要代表的是透明質(zhì)酸(HA)。該顆粒大小分布型式與接受多聚苯乙烯納米球注射的眼的顆粒分布是一致的。
            
(b)空曠天空模式圖12顯示5只不同的豬眼中空氣/玻璃體接觸面下方4毫米處的點(diǎn)獲得的TCF以及20納米多聚苯乙烯納米球溶液獲得的TCF(用于對(duì)照)。可以看到隨著μPli劑量的增加，TCF的斜率降低，慢組分(較大的分子)消失，使得TCF最終靠近純20納米納米球的TCF，即全部為較小形狀的分子。
            
在使用不同溶液在室溫進(jìn)行處理后，1毫米深度下DSL測(cè)定的結(jié)果(n＝5)安慰劑和0.08毫克基本上相同。0.125毫克劑量在210分鐘后整體平均顆粒大小降低了大約三分之一。使用0.6毫克劑量，60分鐘后平均顆粒大小降低了80％，且?guī)缀跬耆档推骄?只檢測(cè)到20納米的多聚苯乙烯納米顆粒)。
            
在空氣/玻璃體接觸面后2毫米深處，180分鐘后整體平均顆粒大小下降了約三分之一(n＝3)(數(shù)據(jù)未顯示)。在兩個(gè)不同的時(shí)刻，用0.5毫克μPli分別處理兩只不同的眼60分鐘，將樣本在37攝氏度孵育并且在DSL測(cè)量中維持這個(gè)溫度，導(dǎo)致整體平均顆粒大小降低了40％。對(duì)于所有這些樣本的整體強(qiáng)度測(cè)量以及多分散性測(cè)量支持并且確證了顆粒大小的確定。
            
(c)閉眼模型與從0.0125到0.8毫克劑量范圍的μPli于37攝氏度孵育30分鐘后，沿光軸和縱軸都出現(xiàn)顯著的變化。在光軸中標(biāo)準(zhǔn)化的平均顆粒大小在最高劑量0.8毫克時(shí)出現(xiàn)7倍的下降。0.125毫克劑量在30分鐘后使標(biāo)準(zhǔn)化的平均顆粒大小降低了約三分之一。最低劑量0.0125毫克看起來沒有任何顯著的效果。從整體劑量范圍看來，顆粒大小的降低與μPli的劑量呈反比(相關(guān)系數(shù)為0.93)。將數(shù)據(jù)擬合到線性(直線)擬合程序中。標(biāo)準(zhǔn)化的總強(qiáng)度和多分散性曲線進(jìn)一步支持了該數(shù)據(jù)的可靠性。顆粒大小分布證明了隨著μPli劑量的升高，顆粒大小分布呈現(xiàn)顯著的左移。這提示μPli在顯著減弱或者斷裂多種不同化學(xué)鍵中以及在降解玻璃液中大分子結(jié)構(gòu)中是有效的。沿水平軸檢測(cè)到相似的改變。
            
使用0.0125到0.6毫克劑量范圍的μPli在37攝氏度孵育2小時(shí)也有顯著的變化。在最高劑量時(shí)，沿光軸測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)化的平均顆粒大小降低了87.5％。標(biāo)準(zhǔn)化的散射強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)化的多分散性曲線確證了該數(shù)據(jù)。隨著劑量的增加，顆粒大小分布顯示了左移，在較高的劑量左移顯著。沿水平軸在4毫米深處的DSL測(cè)定顯示了相似的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化平均顆粒大小降低了大約85％，在標(biāo)準(zhǔn)化的散射強(qiáng)度和多分散性曲線中也有支持性的發(fā)現(xiàn)。
            
30分鐘時(shí)和2小時(shí)時(shí)結(jié)果的比較表明隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，顆粒大小降低的程度更大?？紤]到當(dāng)劑量是0.6毫克時(shí)，在30分鐘的孵育中標(biāo)準(zhǔn)化的平均顆粒直徑是(原來的)約20％，且2小時(shí)孵育后是(原來的)約10％。因此，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，顆粒大小有約兩倍多的降低。
            
從DSL測(cè)量得到的主要參數(shù)是散射系數(shù)。散射系數(shù)的改變預(yù)示著玻璃液大分子結(jié)構(gòu)對(duì)μPli處理的響應(yīng)的改變。隨著μPli劑量的升高，玻璃液的散射系數(shù)升高。在μPli劑量范圍內(nèi)，散射系數(shù)與μPli的劑量呈正相關(guān)。因此，隨著μPli劑量的升高，散射系數(shù)降低，而且與顆粒大小確定相似的是，此相關(guān)性在統(tǒng)計(jì)上是顯著的(相關(guān)系數(shù)r＝0.93)。
            
討論在本實(shí)驗(yàn)中，使用DSL通過測(cè)量顆粒大小，散射強(qiáng)度和多分散性，非侵入性地估計(jì)了玻璃液的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，在整個(gè)玻璃液中不同的位置，DSL特征是相似的。在37攝氏度孵育整個(gè)玻璃液時(shí)微纖溶酶有最顯著的影響，特別是在更高的劑量時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)化平均顆粒大小顯著下降，并且建立了統(tǒng)計(jì)顯著的劑量-響應(yīng)關(guān)系。這提示μPli在玻璃體-視網(wǎng)膜手術(shù)中是有用的輔助物，因?yàn)?0分鐘的時(shí)間范圍對(duì)于一種不影響當(dāng)前手術(shù)操作的藥物作用是合理的。與前面實(shí)施例中提示μPli誘導(dǎo)玻璃體視網(wǎng)膜接觸面斷裂的數(shù)據(jù)相一致，此藥物看起來可以獲得藥理玻璃體分離術(shù)所需要達(dá)到的兩個(gè)結(jié)果后玻璃體脫離和玻璃液大分子的分解，分解使得玻璃液的散射系數(shù)升高，最終使其液化。
            
實(shí)施例9微纖溶酶作為玻璃體切除術(shù)的輔助物具有玻璃體視網(wǎng)膜疾病，需要進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的患者在玻璃體切除術(shù)前使用微纖溶酶注射治療?；颊呓邮苋娴难劭茩z查以確定眼部健康的基線。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查、裂隙燈生物顯微鏡檢查、外周視網(wǎng)膜檢查、眼內(nèi)壓力測(cè)定、視覺敏銳度(無矯正和最佳矯正)癥候、眼底照相、熒光素血管造影術(shù)、電子視網(wǎng)膜照相和A-掃描測(cè)量。
            
在玻璃體切除術(shù)開始前多達(dá)30分鐘或者前多達(dá)1天，使用0.025毫克到0.125毫克微纖溶酶(溶于0.2毫升眼內(nèi)沖洗溶液BSS PLUS或者其他沖洗溶液)對(duì)將要治療的眼睛進(jìn)行注射，以促進(jìn)玻璃液的液化和/或誘導(dǎo)后玻璃體脫離。
            
通過促進(jìn)玻璃液的液化和/或誘導(dǎo)后玻璃體脫離，玻璃體切除術(shù)的進(jìn)行可以更快捷簡(jiǎn)單，減少醫(yī)療引起的視網(wǎng)膜外傷以及手術(shù)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。使玻璃體被更為完全地去除可以降低術(shù)后并發(fā)癥，例如增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病的風(fēng)險(xiǎn)。
            
實(shí)施例10使用微纖溶酶治療糖尿病性視網(wǎng)膜病在本實(shí)施例中，一個(gè)表現(xiàn)出糖尿病性視網(wǎng)膜病的糖尿患者用玻璃體內(nèi)注射微纖溶酶的方法進(jìn)行治療。
            
糖尿患者將要接受全面的眼科檢查以確定眼部健康的基線。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查、裂隙燈生物顯微鏡檢查、外周視網(wǎng)膜檢查、眼內(nèi)壓力測(cè)定、視覺敏銳度(無矯正和最佳矯正)癥候、眼底照相、熒光素血管造影術(shù)、電子視網(wǎng)膜照相和A-掃描測(cè)量。
            
在初步的檢查后，向患者受疾病影響的眼玻璃體內(nèi)注射微纖溶酶。如果雙眼都受到疾病影響，它們可以分別接受治療。使用從0.005毫克到0.125毫克劑量范圍的微纖溶酶(纖溶酶溶解于0.05到0.2毫升的BSS PLUS或者其他沖洗溶液)注射要治療的眼，以促進(jìn)玻璃體的液化。
            
在治療后，患者的眼睛要定期檢查。該患者糖尿病性視網(wǎng)膜病的程度在定期的視網(wǎng)膜檢查和熒光素血管造影中進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，以監(jiān)測(cè)靜脈出血(beading)、IRMA、視網(wǎng)膜缺血、牽引性視網(wǎng)膜脫離、玻璃體出血、是否需要玻璃體切除術(shù)或者其他糖尿病性視網(wǎng)膜病的并發(fā)癥。
            
實(shí)施例11在死后豬眼中比較微纖溶酶與纖溶酶對(duì)熒光素?cái)U(kuò)散速度的影響微纖溶酶的分子量大約是全長(zhǎng)纖溶酶分子量的三分之一。由于其形狀小，預(yù)計(jì)在玻璃液中微纖溶酶比纖溶酶擴(kuò)散的會(huì)更迅速(Xu，J.etal.，同以上的引用)。預(yù)計(jì)更為迅速的擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致更迅速的藥理效果。進(jìn)行本研究的目的是既確證微纖溶酶比纖溶酶擴(kuò)散得更迅速，又確證微纖溶酶能夠改變玻璃液凝膠。
            
方法使用從屠宰場(chǎng)獲得的新鮮分離的豬眼。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一只眼注射微纖溶酶(0.125mg)，另一只眼注射載體對(duì)照(BSS-PLUS)。在室溫維持兩只眼兩小時(shí)，使用熒光素注射兩只眼，并繼續(xù)孵育30分鐘。在0、10、20和30分鐘時(shí)拍攝照片。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，注射0.125毫克微纖溶酶(N＝2)或者1U的纖溶酶(Sigma提供，N＝2)，并于37℃孵育兩小時(shí)。然后向所有四只眼注射熒光素，繼續(xù)孵育30分鐘，在0、10、20和30分鐘時(shí)拍攝照片。
            
結(jié)果在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照眼在玻璃體中幾乎沒有觀察到熒光素的擴(kuò)散(數(shù)據(jù)未顯示)。而在微纖溶酶處理的眼中，可以觀察到清晰的熒光素?cái)U(kuò)散(數(shù)據(jù)未顯示)。
            
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，微纖溶酶處理的眼在20分鐘后其熒光素?cái)U(kuò)散分別為14％和16％(圖13)，而纖溶酶處理的眼其熒光素?cái)U(kuò)散低于10％(圖14)。
            
討論與載體對(duì)照相比，微纖溶酶清楚地顯示出對(duì)熒光素?cái)U(kuò)散的促進(jìn)。而且，正如根據(jù)對(duì)微纖溶酶分子量進(jìn)行的預(yù)測(cè)，這種熒光素?cái)U(kuò)散比使用全長(zhǎng)纖溶酶給藥時(shí)觀察到的熒光素?cái)U(kuò)散程度要大。這些發(fā)現(xiàn)支持了微纖溶酶擴(kuò)散得比纖溶酶迅速的理論預(yù)測(cè)。這些發(fā)現(xiàn)可能具有臨床益處，因?yàn)榭梢缘玫礁杆俚乃幚碜饔谩?br>
權(quán)利要求
            
1.治療或預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含截短的纖溶酶蛋白的組合物接觸，所述的截短的纖溶酶蛋白包含纖溶酶催化結(jié)構(gòu)域(TPCD)。
            
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述TPCD具有的分子量小于約40000道爾頓。
            
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述TPCD具有的分子量介于約20000到30000道爾頓。
            
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述TPCD在還原形式時(shí)具有分子量約26500道爾頓，在非還原形式時(shí)具有分子量約29000道爾頓。
            
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述TPCD具有的分子量小于約20000道爾頓。
            
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是小纖溶酶。
            
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是穩(wěn)定化的小纖溶酶。
            
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是重組小纖溶酶。
            
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是穩(wěn)定化的重組小纖溶酶。
            
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是微纖溶酶。
            
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是穩(wěn)定化的微纖溶酶。
            
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是重組微纖溶酶。
            
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是穩(wěn)定化的重組微纖溶酶。
            
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述的TPCD是微纖溶酶變異體。
            
15.權(quán)利要求1的方法，其中眼部病癥選自由下列疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法降低了玻璃體的粘度。
            
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法誘導(dǎo)后玻璃體脫離。
            
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法減輕玻璃體和/或房水出血。
            
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法從玻璃體和/或房水中減少眼內(nèi)外源物質(zhì)。
            
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法提高了向玻璃體和/或房水給服的藥劑或者組合物的擴(kuò)散。
            
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法降低了視網(wǎng)膜外血管新生。
            
22.權(quán)利要求1的方法，其中的組合物是一種液體溶液，且其中使玻璃體和/或房水與組合物接觸的步驟包含向玻璃體和/或房水中注射該液體溶液。
            
23.權(quán)利要求1的方法，其中的受治對(duì)象是人。
            
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法在沒有玻璃體切除術(shù)時(shí)進(jìn)行。
            
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法作為玻璃體切除術(shù)的輔助而進(jìn)行。
            
26.權(quán)利要求1的方法，其中有效量的TPCD處于0.005毫克到0.2毫克之間。
            
27.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含重組微纖溶酶或者其變異體的組合物接觸，其中所述方法導(dǎo)致玻璃體液化和/或后玻璃體脫離。
            
28.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含穩(wěn)定化的重組微纖溶酶或者其變異體的組合物接觸，其中所述方法導(dǎo)致玻璃體液化和/或后玻璃體脫離。
            
29.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含重組小纖溶酶或者其變異體的組合物接觸，其中所述方法導(dǎo)致玻璃體液化和/或后玻璃體脫離。
            
30.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合，該方法包含使玻璃體和/或房水與有效量的包含穩(wěn)定化的重組小纖溶酶或者其變異體的組合物接觸，其中所述方法導(dǎo)致玻璃體液化和/或后玻璃體脫離。
            
31.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與包含至少兩種TPCD的組合物接觸，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
32.權(quán)利要求31的方法，其中的至少兩種TPCD選自由以下各項(xiàng)組成的組小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及以上的任何組合。
            
33.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與包含至少一種TPCD的第一種組合物以及包含至少一種TPCD的第二種組合物接觸，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
34.權(quán)利要求33的方法，其中的包含至少一種TPCD的第一種組合物以及包含至少一種TPCD的第二種組合物選自由以下各項(xiàng)組成的組小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及以上的任何組合。
            
35.權(quán)利要求33的方法，其中的包含至少一種TPCD的第一種組合物以及包含至少一種TPCD的第二種組合物在基本上同時(shí)或者在不同的時(shí)刻施用給受治對(duì)象。
            
36.治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與包含至少一種TPCD以及至少一種另一藥劑的組合物接觸，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
37.權(quán)利要求36的方法，其中的TPCD選自由以下各項(xiàng)組成的組小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及以上的任何組合；其中的另一藥劑選自由下列各項(xiàng)組成的組透明質(zhì)酸酶、分散酶、軟骨素酶、膠原酶、含有RGD的肽、抗粘合素抗體、尿素、羥基脲、硫脲、P2Y受體促效劑、血管生成抑制劑、VEGF抑制劑、PIGF抑制劑以及以上任意的組合。
            
38.在受治對(duì)象中進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的方法，該方法包含以下步驟使玻璃體和/或房水與有效量的包含至少一種TPCD的組合物接觸。
            
39.權(quán)利要求38的方法，其中的接觸步驟在玻璃體切除術(shù)之前進(jìn)行。
            
40.權(quán)利要求38的方法，其中的接觸步驟與玻璃體切除術(shù)同時(shí)進(jìn)行。
            
41.權(quán)利要求38的方法，其中的TPCD選自由以下各項(xiàng)組成的組小纖溶酶、重組小纖溶酶、穩(wěn)定化的小纖溶酶，穩(wěn)定化的重組小纖溶酶、小纖溶酶變異體、微纖溶酶、重組微纖溶酶、穩(wěn)定化的微纖溶酶、穩(wěn)定化的重組微纖溶酶、微纖溶酶變異體以及以上的任何組合。
            
42.權(quán)利要求38的方法，其中受治對(duì)象是人。
            
43.權(quán)利要求38的方法，其中實(shí)施玻璃體切除術(shù)以治療或者預(yù)防眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
44.權(quán)利要求38的方法，其中實(shí)施玻璃體切除術(shù)的目的選自以下各項(xiàng)組成的組降低玻璃體的粘性、使玻璃體液化、誘導(dǎo)后玻璃體脫離、清除或者減少玻璃體的出血，清除或者減少玻璃體的眼內(nèi)外源物，清除或者減少對(duì)于視網(wǎng)膜有毒性的物質(zhì)，增加向玻璃體和/或房水施用的藥劑或者組合物的擴(kuò)散、減少視網(wǎng)膜外的血管新生以及以上的任意組合。
            
45.權(quán)利要求38的方法，其中的組合物是液體溶液，且其中使玻璃體和/或房水與組合物接觸的步驟包含向玻璃體和/或房水中注射該液體溶液。
            
46.權(quán)利要求38的方法，其中有效量的TPCD處于0.005毫克到0.2毫克范圍之間。
            
47.在受治對(duì)象中進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的方法，該方法包含下面的步驟在去除玻璃體之前使受治對(duì)象眼的玻璃體和/或房水與有效量的組合物接觸的步驟，所述的組合物包含穩(wěn)定化的重組微纖溶酶，其中實(shí)施玻璃體切除術(shù)以治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
48.在受治對(duì)象中進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的方法，該方法包含下面的步驟在去除玻璃體之前使受治對(duì)象眼的玻璃體和/或房水與有效量的組合物接觸的步驟，所述的組合物包含穩(wěn)定化的重組小纖溶酶，其中實(shí)施玻璃體切除術(shù)以治療或者預(yù)防受治對(duì)象眼部的病癥或者病癥并發(fā)癥，其中的眼部病癥選自以下疾病組成的組視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜破裂、玻璃體出血、糖尿病性玻璃體出血、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、與衰老有關(guān)的黃斑變性、黃斑破洞、玻璃體黃斑牽引、黃斑皺褶、黃斑滲出物、囊狀黃斑水腫、纖維蛋白沉積、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜下出血、弱視、眼內(nèi)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性以及以上任意的組合。
            
49.使受治對(duì)象玻璃體液化的方法，包含向受治對(duì)象的玻璃體和/或房水中注射有效量的穩(wěn)定化的重組微纖溶酶。
            
50.使受治對(duì)象玻璃體液化的方法，包含向受治對(duì)象的玻璃體和/或房水中注射有效量的穩(wěn)定化重組小纖溶酶。
            
51.在受治對(duì)象的眼中誘導(dǎo)后玻璃體脫離的方法，包含向受治對(duì)象的玻璃體和/或房水中注射有效量的含穩(wěn)定化的重組微纖溶酶的溶液。
            
52.在受治對(duì)象的眼中誘導(dǎo)后玻璃體脫離的方法，包含向受治對(duì)象的玻璃體和/或房水中注射包含有效量的穩(wěn)定化的重組小纖溶酶的溶液。
            
53.降低受治對(duì)象的眼中視網(wǎng)膜外血管新生的方法，包含向受治對(duì)象的玻璃體和/或房水中注射包含有效量的穩(wěn)定化的重組微纖溶酶的溶液。
            
54.降低受治對(duì)象的眼中視網(wǎng)膜外血管新生的方法，包含向受治對(duì)象的玻璃體和/或房水中注射包含有效量的穩(wěn)定化的重組小纖溶酶的溶液。
            
55.包含至少兩種TPCD的組合物。
            
56.包含至少一種TPCD以及至少一種另一藥劑的組合物。
            
全文摘要
            
預(yù)防或者治療受治對(duì)象眼睛疾病、或疾病并發(fā)癥的方法，該方法包含使玻璃體和/或房水與包含截短的形式纖溶酶(包含纖溶酶的催化結(jié)構(gòu)域TPCD)的組合物接觸。TPCD包括，但是不限于，小纖溶酶(miniplasmin)、微纖溶酶以及它們的衍生物和變異體。本發(fā)明的方法可以用于降低玻璃體的粘性、使玻璃體液化、誘導(dǎo)后玻璃體脫離、降低眼部的出血、清除或減少對(duì)眼睛有毒性的物質(zhì)、從眼內(nèi)清除或者減少外源物質(zhì)、增加向眼部給服的組合物的擴(kuò)散、減少視網(wǎng)膜外的血管新生以及上述的任何組合。該方法可以在沒有玻璃體切除術(shù)時(shí)使用或者作為玻璃體切除術(shù)的輔助。
            
文檔編號(hào)A61K38/48GK1738641SQ200380108773 
            
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
            
發(fā)明者S·帕科拉, M·德斯梅特 申請(qǐng)人:思羅姆-X股份有限公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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