專利名稱：用于癌癥治療的經修飾的細胞因子的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于癌癥治療的經修飾的細胞因子。更優選的是，本發明涉及能夠定向于腫瘤血管以及抗原呈遞細胞的細胞因子衍生物。本發明還涉及含有經修飾的細胞因子的具有協同作用的組合物。
背景技術：
一些細胞因子的抗腫瘤活性是已知的，并且已經有所描述。一些細胞因子也已經應用于人類治療(29)。例如，像白介素-2(IL-2)和白介素α(IFNα)這樣的細胞因子已經在不同類型腫瘤患者中顯示出確切的抗腫瘤活性，所述腫瘤如腎轉移性癌，多毛細胞白血病，卡波西肉瘤，黑色素瘤，多發性骨髓瘤等等。其它細胞因子例如IFNβ，腫瘤壞死因子(TNF)α，TNFβ，IL-1，4，6，12，15和集落刺激因子(CFSs)已經顯示出對于一些類型腫瘤具有確定的抗腫瘤活性，因此它們成為進一步研究的目標。
一般而言，細胞因子的治療性應用極大地受到其全身性毒性的限制。例如，最初發現TNF具有能夠誘導某些腫瘤出血性壞死的能力(1)，并且其在體外對不同腫瘤細胞系產生細胞毒效應(2)，但是后來證明其具有促炎活性，這種活性在產生過量的情況下會對人體產生危險的影響(3)。
由于全身性毒性是細胞因子以藥理學活性量在人類中應用的一個基本的難題，現在旨在保持這類生物學效應物的治療效能的同時減少其毒性作用的新型衍生物和治療性策略正在評估之中。
一些新的方法旨在a)研制能夠將TNF轉移至腫瘤中并提高局部濃度的融合蛋白質。例如，已經生產出由TNF和腫瘤特異性抗體組成的融合蛋白質(4)；b)研制保持抗腫瘤活性并且全身性毒性得以減弱的TNF突變體。因此，現在已經制備出能夠選擇性地識別單一受體(p55或p75)的突變體(5)；c)使用能夠減少TNF的一些毒性作用但不損傷其抗腫瘤活性的抗TNF抗體。文獻中已對這些抗體進行了描述(30)；d)使用具有更高半衰期的TNF衍生物(例如與聚乙二醇綴合的TNF)。
最近已經報道了能夠選擇性地靶向腫瘤位點的TNF衍生物的制備。例如，已經描述了一種融合蛋白質，其通過將抗-轉鐵蛋白受體mAb的重鏈基因與TNF基因相融合而獲得(4)，或是抗腫瘤相關的TAG72抗原的單克隆抗體的“鉸鏈”區域與TNF相融合的融合蛋白(6)，或一種Fv-TNF融合蛋白(6)。
EP 251 494公開了一種診斷劑或治療劑的給藥系統，其包括一種與抗生素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素綴合的抗體，一種能夠使綴合抗體和綴合有生物素的診斷劑或治療劑構成的化合物復合的試劑，其按順序給藥并被充分地延遲，通過由所述抗體識別生物素-抗生物素蛋白鏈菌素在靶細胞上的相互作用，從而使得診斷劑或治療劑的定位成為可能。所述治療劑或診斷劑包括金屬螯合物，尤其是放射性核素和低分子量抗腫瘤劑例如順鉑、阿霉素等螯合物。
EP 496 074公開了一種方法，其提供了以生物素化抗體、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素以及生物素化診斷劑或治療劑順序給藥的方法。雖然其一般地提及了細胞毒素劑如篦麻毒素，但主要公開了與放射性標記的化合物相關的應用。
WO 95/15979公開了一種將高毒性劑定位于細胞靶點的方法，該方法基于以第一結合物給藥之后再以第二綴合物給藥，所述第一結合物包括與一種配體或抗-配體綴合的特異性靶分子，所述第二綴合物由綴合于一種抗-配體或配體的毒性劑構成。
WO 98/10795公開了腫瘤靶向分子，其包括含有氨基酸序列NGR的肽。并未描述所述肽對于將細胞因子靶向于腫瘤的用途。
WO 99/13329公開了基于將一種分子與NGR受體的配體相結合將該分子靶向于腫瘤血管生成的脈管上的方法。許多分子已經被建議為可能的替補物質，但僅僅對阿霉素進行了明確的描述。并未公開NGR受體的配體作為細胞活素載體以誘導免疫反應的用途。
WO 01/61017公開了選自TNF或IFNγ的細胞因子與CD13受體配體的一種綴合產物。
發明概述現在已經驚人地發現與CD13受體的一種配體偶聯的TNF與IFNγ協同作用以至于分別以低于有效劑量的劑量共給藥可以觀察到有效的抗-癌活性。此外，我們發現通過以IFNγ給藥，經修飾的TNF與另一種抗-癌劑例如阿霉素的組合的抗腫瘤活性得到了提高。
發明的目的根據本發明的一個方面，提供了一種藥物組合物，其包括一種有效量的TNF與CD13受體的一種配體的偶聯產物和一種有效量的IFNγ。
發明詳述現在將通過非限制性的實施例描述本發明的各種優選特征和實施方式。
所述CD13受體的配體可以是一種抗體或其片段例如Fab、Fv、單鏈Fv、一種肽或肽模擬物，也就是能夠結合CD13受體的類肽分子，任選地含有經修飾非天然存在的氨基酸。
CD13是一種在各種物種中高度保守的150kDa跨膜糖蛋白。它在正常細胞和骨髓瘤細胞系、血管生成的內皮以及一些上皮細胞中表達。CD13受體通常被認為是“NGR”受體。這些配體可以是天然的或是合成的。術語“配體”也指一種化學修飾的配體。配體的一個或多個結合區域可以由例如與受體結合的天然配體，或保持與受體的結合親和力的天然配體的片段構成。合成的配體包括設計者配體(designer ligands)。這里所用的術語“設計者配體”指的是可基于它們的三維空間形態與受體結合的因子，其可與受體的空間形狀相比擬。
所述配體優選是含有NGR基序的直鏈肽或環肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環狀的CVLNGRMEC或環狀的CNGRC，或更優選的是肽CNGRC。這些配體在WO98/10795中已有描述，其已并入本文作為參考。WO99/13329描述了識別CD13受體的配體的方法，其已并入本文作為參考。
在一個實施方式中，提供了一種篩選能夠結合至CD13受體的試劑的方法，該方法包括將細胞表面分子與一種因子接觸并確定該因子是否與所述的細胞表面分子結合。
這里所用的術語“試劑”包括但不限于一種化合物，例如一種檢測化合物，其可以從任意合適的來源獲得或產生，這種來源可以是天然的，也可以是非天然的。這種因子可以被設計出來或直接由化合物文庫中獲得，這種文庫含有肽和其它化合物，例如小的有機分子，尤其是新的先導化合物。舉例說來，這種因子可以是一種天然物質、一種生物學大分子，或是一種從例如細菌、真菌或動物(尤其是哺乳動物)細胞或組織的生物物質中獲得的提取物、有機或無機分子、合成的試驗化合物、半合成試驗化合物、結構的或功能的模擬物、肽、肽模擬物、衍生的檢測化合物、從完整的蛋白質中切下的肽，或人工合成(例如舉例來說或者使用一種肽合成機)或通過重組技術獲得的肽或其組合、重組的試驗化合物，天然或非天然的試驗化合物、融合蛋白質或其等同物和突變體、衍生物或其組合。
所述因子可以是氨基酸序列或其化學衍生物。該物質甚至可以是一種有機化合物或其它化學制劑。
這里所用的術語“肽模擬物井寬泛地是指具有與CD13配體結合活性的類肽分子。
可供選擇的是，所述配體可從免疫球蛋白(Ig)可變區的重鏈和輕鏈序列獲得。這種可變區可從天然人抗體或從其它物種的抗體例如嚙齒類抗體中獲得。可供選擇的是，可變區可以從工程化抗體如人源化抗體中獲得或從免疫或非免疫動物中所構建的噬菌體展示文庫或經誘變的噬菌體-顯示文庫中獲得。作為另一個選擇，可變區可從單鏈可變片段獲得(scFv)。所述配體可含有其它序列以實現多聚化作用(multimerisation)，或者作為結合區域之間的間隔區而起作用或者作為通過在編碼配體的基因中插入限制性位點所產生的間隔區而起作用，所述序列包括Ig鉸鏈區序列或新的間隔區和工程化的連接子序列。
所述配體除了一個或多個免疫球蛋白可變區之外還可以包括全部或部分Ig重鏈恒定區，因此可以含有天然的完整Ig、工程化Ig和工程化的Ig類分子、單鏈Ig或單鏈Ig類分子。可供選擇的是，或此外，BP可含有從另外的蛋白質例如毒素獲得的一個或多個區域。
這里所用的“抗體”是指由一個或多個主要由免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽構成的蛋白質。抗體可以以完整的免疫球蛋白或一些片段的形式存在，包括通過用各種肽酶消化獲得的經明確表征的片段。然而根據對完整的抗體的消化定義不同的抗體，任何技術人員都能夠認識到抗體片段可以在體外通過化學或通過重組DNA方法合成。因此，這里所用的術語抗體也包括通過對完整抗體進行修飾或通過重組DNA方法體外合成獲得的抗體片段。通過使用術語“抗體”，抗體片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv雙鏈抗體和Fd片段。
如果需要多克隆抗體，用一種帶有一個表位(s)的免疫原性多肽對一種挑選出來的動物(例如，小鼠、兔、山羊、馬等)進行免疫。收集經免疫動物的血清，依照已知方法進行處理。如果在含有針對一種表位的多克隆抗體的血清中含有針對于其它抗原的抗體，則可以通過免疫親合層析法純化這些多克隆抗體。生產和加工多克隆抗血清的技術是本領域中已知的。為了能夠制備出所述抗體，本發明還提供了在動物或人類中作為免疫原的本發明的多肽或被半抗原化而變成其它多肽的該多肽片段。
本領域技術人員也可以容易地獲得定向結合于多肽中的細胞表面表位的單克隆抗體。通過雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法是熟知的。生產抗體的無限增殖細胞系可以通過細胞融合來構建，也可以通過其它技術構建例如直接用致癌DNA轉化B淋巴細胞，或用埃-巴二氏病毒轉染。可以對生產獲得的一組針對表位的單克隆抗體根據不同活性，例如同種型和表位親和性進行篩選。
另一種可供選擇的技術涉及篩選噬菌體展示文庫，所述文庫例如噬菌體在其衣殼表面表達scFv片段和大量決定簇互補區(CDRs)。該技術在本領域中是熟知的。
為了本發明的目的，除非有與此相反的指定，術語“抗體”包括保留對靶抗原的結合活性的完整抗體的片段。如上所述，這些片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段和單鏈抗體(scFv)。此外，抗體和其片段可以是人源化抗體，如EP-A-239400所述。
這里所用的術語“肽”包括多肽和蛋白質。術語“多肽”包括單鏈多肽分子和多倍多肽復合體，所述復合體中單個的組分多肽之間以共價或非共價連接。術語“多肽”包括長度為2個或更多個氨基酸的肽，典型的是具有多于5、10或20個的氨基酸。
應當理解的是本發明中使用的多肽序列并不限于某種特定序列或其片段，而且還包括從任何來源獲得的同源序列，例如相關的病毒/細菌的蛋白質、細胞同源物和合成肽以及其變異體或衍生物。本發明的多肽序列還包括由本發明的多核苷酸編碼的多肽。
與本發明的氨基酸序列相關的術語“變異體”或“衍生物”包括對該序列的一個(或更多)氨基酸進行任意的取代、變異、修飾、替換、缺失、添加，只要所獲得的氨基酸序列優選具有靶向活性，更優選具有序列表中所示多肽的至少25至50％活性，更為優選至少具有基本相同的活性。
因此，本發明中使用的序列可以被修飾。典型的是，進行能保持序列活性的修飾。因此，在一個實施方式中，如果經修飾的序列要保持至少大約25至50％或基本相同的活性，那么可以進行例如1、2或3至10、20或30個氨基酸的替換。然而，在一個可供選擇的實施方式中，可以有目的地對本發明的一個多肽的氨基酸序列進行修飾以減少多肽的生物學活性。例如缺少功能效應區域但仍能與靶分子結合的經切割的多肽可能是有益的。
一般而言，優選與序列表中描述的相應區域相比，變異體或衍生物的少于20％、10％或5％氨基酸殘基被改變。
氨基酸替代可以包括使用非天然存在的類似物，例如用以提高用于治療性給藥的多肽的血漿半衰期(參見下文以獲得用于治療的肽衍生物的生產的更多細節)。
例如，可以按照下表進行保守性替代。第二欄的同一單元格中的氨基酸和優選第三欄同一行中的氨基酸可以互相替換
本發明的多肽還包括上述多肽的片段及其變異體，包括其序列的片段。優選的片段包括含有表位或結合區域的片段。合適的片段其長度至少約為5，如10、12、15或20個氨基酸。它們的長度也可以少于200、100或50個氨基酸。蛋白質的多肽片段和等位基因和其物種變異體可以含有包括保守替代在內的一個或更多(如2、3、5或10)替代、缺失或插入。通過例如重組技術進行取代、缺失和/或插入的序列，優選其序列表中所列的序列的少于20％、10％或5％氨基酸殘基被改變。
本發明的多肽和綴合物通常是通過重組方法獲得的，例如通過下述方式獲得。然而也可以采用技術人員已知的技術通過合成方法如固相合成法獲得上述物質。Borgia和Fields在2000，TibTech18243-251中已經對各種化學合成多肽的技術進行了評述，并且其所引用的參考文獻對這些技術進行了詳細描述。
可以將肽直接偶聯于或通過間隔區間接地偶聯于細胞因子，所述間隔區可以是單個氨基酸、一段氨基酸序列或一個有機殘基，例如6-癸酰胺-N-羥基琥珀酰亞胺。偶聯步驟是本領域技術人員已知的，其包含基因工程或化學合成技術。
優選將肽配體連接于細胞因子的N-末端，從而使得經修飾的細胞因子與其受體結合中的任何干擾減少到最小。可供選擇的是，該肽可與分子中天然存在的或通過基因工程技術人工插入的氨基酸殘基相連接，所述氨基酸殘基是氨基-或羧基-鍵受體。所述經修飾的細胞因子優選通過采用含有編碼該肽的5’-鄰近序列的cDNA制備得到。
根據一個優選實施方式，其提供了一種TNF和CNGRC序列之間的偶聯產物。更優選的是，TNF的氨基-末端通過間隔子G(甘氨酸)連接于CNGRC肽。
經證明所得產物(NGR-TNF)比RMA-T淋巴瘤動物模型中的TNF活性更高。而且，經NGR-TNF處理的動物能夠進一步抵抗致瘤劑量的RMA-T或RMA細胞。與正常TNF相比，在免疫活性動物中能夠觀察到抗腫瘤活性獲得提高，但在免疫缺陷性動物中沒有提高。這表明與“NGR”肽綴合的TNF的抗腫瘤活性的提高是由于免疫應答的增強而非該綴合物直接的細胞毒素活性所引起。
還證實了體內由NGR-TNF引起的免疫反應與CD13直接相關。例如，已經觀察到特異于CD13受體的抗體和GNGRC配體在體內均與NGR-TNF相競爭，因此提示了由NGR-TNF介導的一種受體靶向機制。
TNF/CD13配體綴合物的治療指數可以通過使用一種能夠選擇性地結合兩種TNF受體之一的TNF突變型而獲得提高，所述TNF受體為p75TNFR和p55TNFR。所述TNF突變型可通過定點誘變獲得(5；7)。
本發明的經修飾的細胞因子的藥物動力學可通過制備可使得細胞因子的血漿半衰期獲得延長的聚乙二醇衍生物而獲得提高。
本發明的另一個實施方式提供了雙功能衍生物，其中經CD13配體修飾的細胞因子與抗腫瘤抗原或其它腫瘤血管生成的標記物的抗體或其片段、定向于胞外基質的成分的抗體或其片段，如抗肌腱蛋白抗體或抗纖連蛋白EDB區域綴合，其中腫瘤血管生成的標記物例如為αv整聯蛋白、金屬蛋白酶或血管生成因子。最近已經報道了TNF與針對胃腺癌和卵巢腺癌表達的腫瘤相關性TAG72抗原的mAb的鉸鏈區的融合產物的制備(6)。
本發明的另一個實施方式提供了一種采用生物素/抗生物素蛋白的腫瘤預靶向系統。根據這種方法，在不同階段在腫瘤抗原位點獲得一種三元復合物，其由1)生物素化的mAb，2)抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白)和3)經CD13受體和生物素修飾的二價細胞因子形成。許多論文已經證明了與傳統的采用免疫綴合物的靶向法相比，預靶向方法確實能夠提高定位于靶點的活性分子與游離活性分子的比率，從而減少治療毒性(11，10，9，8)。這種方法利用生物素化的TNF產生了良好結果，該生物素化的TNF能夠在體外誘導細胞毒性，并且在正常TNF無活性的條件下減緩腫瘤細胞的生長(14，26)。該預靶向法也可以通過采用同時結合腫瘤抗原和經修飾的細胞因子的雙特異性抗體的雙相法進行。最近已經報道了將針對癌胚抗原和TNF的雙特異性抗體作為一種TNF腫瘤預靶向的工具(31)。
根據另一個實施方式，本發明包含在不同TNF亞基上(直接地或通過生物素-抗生物素蛋白橋間接地)同時與一個CD13配體和一個抗體或其片段綴合的TNF分子，其中抗體或其片段針對腫瘤細胞表達的抗原或腫瘤基質的其它成分，如肌腱蛋白和纖連蛋白EDB區域。這使得經修飾的細胞因子的腫瘤靶向性質獲得進一步改良，并且使得后者通過三聚體-單體-三聚體轉變在腫瘤微環境中得以緩慢釋放。如上述工作所示，事實上，TNF綴合物的經修飾亞基能夠從靶向復合物中分離并重新聚集以形成未經修飾的三聚體TNF分子，其而后在腫瘤微環境中擴散。已經證實生物活性TNF的釋放在靶向后24-48小時出現(21)。
可以將本發明的肽治療性地給藥于患者。優選不采用僅由天然存在的氨基酸構成的肽而是經修飾的肽，例如經修飾以減小免疫原性，或提高患者體內循環半衰期，提高生物利用率和/或提高效力和/或特異性。
已經有許多對肽進行修飾以用于治療性用途的方法。一種方法是將肽或蛋白質與各種聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)連接-參見例如美國專利Nos.5,091,176、5,214,131和US5,264,209。
也可以采用以各種非編碼或經修飾的氨基酸例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸替換天然存在的氨基酸來修飾肽。
另一種方法是使用雙功能交聯劑，例如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯、N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯和硫代琥珀酰亞胺-6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺]己酸酯(參見美國專利5,580,853)。
理想的是使用本發明的構象受約束的肽的衍生物。構象約束指的是肽呈現出其三維形態的穩定性和優勢構象。構象約束包括局部受約束，其包括限制肽中單個殘基的構象的可動性；區域性受約束，其包括限制-組可能形成某個二級結構單元的殘基的構象的可動性；和整體的受約束，其包括整個肽結構。
可以通過共價修飾，例如環化或通過摻入γ-內酰胺或其它類型的橋來穩定肽的活性構象。例如，側鏈可被環化到主鏈上以在相互作用位點的兩側構建起L-γ-內酰胺部分。參見Hruby等，“Applications of Synthetic Peptides”in SyntheticPeptidesA User’s Guide259-345(W.H.Freeman&Co.1992)。也可以通過例如形成半胱氨酸橋，將相應的末端氨基酸的氨基端和羧基端基團相偶聯，或將賴氨酸殘基的氨基或相關同系物與天冬氨酸、谷氨酸或相關同系物的羧基偶聯而實現環化。也可以通過碘代酐將多肽的α-氨基與賴氨酸殘基的ε-氨基相偶聯。參見Wood和Wetzel，1992，Int′l J.Peptide Protein Res.39533-39。
US5,891,418中描述了另一種方法，其包括在肽結構中絡合了金屬離子的主鏈。典型的是，優選的金屬-肽主鏈基于特定的絡合金屬離子的配位區域所需的特殊的配位基團的必需的數量。一般說來，大部分可證明有用的金屬離子的配位數為4-6。肽鏈上配位基團的種類包括具有胺、酰胺、咪唑或胍基官能團的氮原子；硫醇類或二硫化物的硫原子；和具有羥基、酚、羰基或羧基官能團的氧原子。此外，肽鏈和各氨基酸可以通過化學方法被改變成包含一個配位基團例如肟、肼基、巰基、磷酸鹽、氰基、嘧啶、哌啶子基、嗎啉子基。這種肽構建體可以是線性的，也可以是環化的，然而線性構建體通常是優選的。小的線性肽的一個例子是Gly-Gly-Gly-Gly，其主鏈中具有4個氮(N4絡合系統)，該主鏈可與配位數為4的金屬離子絡合。
用于提高治療性肽的特性的另一種技術是采用非肽的模擬肽。可采用許多種有用的技術來闡明肽的精確結構。這些技術包括氨基酸測序、x-射線晶相學、質譜分析、核磁共振分析、計算機輔助的分子模擬、肽圖譜及其組合。肽的結構分析通常提供包含肽的氨基酸序列和其原子組分的三維定位在內的大量數據。根據這些信息，可以設計出非肽的模擬肽，其具有治療活性所需的化學官能團但是更為穩定，例如更不易被生物降解。US5,811,512提供了這種方法的一個例子。
化學合成本發明的肽的技術在上述文獻中均有描述，并且在Borgia和Fields，于2000在TibTech 18243-251發表的文獻中也有評述，其所引用的參考文獻中有具體的描述。
為了用于治療，以合適的方式將本發明的經修飾的細胞因子制備成用于口服或非腸道給藥的藥物制劑。優選用于非腸道給藥的劑型，其包括可注射用溶液劑或混懸劑和輸注用的液體劑。為了制備非腸道給藥制劑，將活性成分溶解或重懸于無菌載體、任選地添加的賦形劑如增溶劑、等滲劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑或分散劑中，接著分裝到小瓶或安瓿中。
更詳細的是，包括多肽和多核苷酸的本發明的綴合物可優選與各種成分混合以產生本發明的組合物。所述組合物優選與藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑組合以產生一種藥物組合物(可用于人類或動物)。合適的載體和稀釋劑包括等滲壓鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。可在Wade & Weller，American Pharmaceutical Association著《Handbook of Pharmaceutical Excipients》第二版中找到賦形劑的詳細資料。本發明的組合物可通過直接注射給藥。組合物可以制備成用以非腸道、肌肉內、靜脈內、皮下、眼內、口腔給藥或通過皮膚給藥的形式。
組合物可以制備成每日給藥、每星期給藥或每月給藥一次可提供所需每日劑量的形式。理想的是所述組合物可被便利地制備成以更低頻率給藥的形式，例如每2、4、6、8、10或12小時給藥一次。
編碼多肽組分的多核苷酸/載體可以以裸核酸構建體形式進行直接給藥，其優選進一步包括與宿主細胞的基因組同源的側翼序列。
通過幾種已知的轉染技術，如包括使用轉染試劑的技術來提高哺乳動物細胞對裸核酸構建體的吸收。這些轉染試劑的例子包括陽離子試劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和lipofectants(例如lipofectamTM和transfectamTM)。典型的是，核酸構建體與轉染試劑相混合以產生一種組合物。
優選的是，本發明的多核苷酸或載體與一種藥學可接受的載體或稀釋劑相結合以產生一種藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲壓鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。該組合物可以制備成用以非腸道、肌肉內、靜脈內、皮下、眼內、口腔給藥或通過皮膚給藥的形式。
所述給藥途徑和給藥方案僅意欲作為一種指導，因為熟練的從業人員能夠為任何具體的患者和病癥容易地確定出最佳給藥途徑和給藥方案。
將細胞因子制備成脂質體形式能夠提高其生物活性。事實上，已經觀察到在體外TNF氨基的酰化引起其疏水性增強而其生物活性卻沒有降低。而且，已有報道稱結合于脂質的TNF在體外不影響細胞毒性、在體內的免疫調節作用并減少毒性(12，13)。
在人體內大丸劑TNF的最大耐受劑量為218-410μg/m2(32)，比在動物體內的有效劑量低約10倍。基于從鼠科模型中獲得的數據，人們相信為了在人體內獲得抗腫瘤作用，必需至少加大十倍劑量(15)。在最初的對肢體高溫隔離灌注的臨床研究中，用單獨的劑量為4mg的TNF與苯丙氨酸氮芥和干擾素γ聯合應用獲得了高反應率(16)。其它工作表明也可不用干擾素γ，即使TNF的劑量更低也足以引起治療反應(17，18)。由于這兩種細胞因子對內皮細胞有協同作用，它們組合之后，緊接著選擇的目標可能產生更強的抗腫瘤活性，從而讓克服腫瘤治療中采用相同細胞因子組合物通常會遇到的全身性毒性的問題成為可能。此外，公知的是TNF能夠降低內皮內層導管的屏障作用，從而提高其對大分子的滲透性。利用采用本發明的經修飾的TNF分子進行處理的低毒性，以及其腫瘤血管靶向特性，另一項可供選擇的應用是其在提高腫瘤血管對于其它化合物的滲透性中的用途或用于治療或診斷目的。舉例來說，經修飾的TNF可被用于提高腫瘤的放射性免疫閃爍掃描法和放射免疫性療法中腫瘤對放射性標記抗體或激素(腫瘤成像化合物)的吸收。可供選擇的是，對化療藥、免疫毒素、載有藥物或基因的脂質體或其它抗腫瘤藥的吸收也可被提高，從而使得其抗腫瘤作用獲得增強。
因此，本發明的細胞因子可以用于組合的、分離的或連續的制劑中，也可與其它診斷或治療基質一起用于癌癥的診斷和治療中。
本發明涉及經修飾的TNF與IFNγ的組合的應用。該組合物可用于組合的、分離的或連續的制劑中。有利的是該組合物與其它診斷或治療基質一起用于癌癥的診斷和治療中，例如阿霉素和苯丙氨酸氮芥。因此本發明提供了一種藥物組合物，其含有修飾的TNF與IFNγ的組合，并任選另一種腫瘤治療或抗腫瘤治療基質。而且，該組合物可以用于組合的、分離的或順序的制劑中。
在我們的專利申請PCT/IB03/02187中，我們發現微克劑量的細胞因子的靶向傳輸提高了化療藥的穿透性，為提高化療藥的治療指數提供了一種新穎的并且令人驚奇的方法。因此將專利申請PCT/IB03/02187完整的并入本文作為參考文獻。更為詳細的是，我們已經發現以極低劑量的細胞因子向腫瘤和包括腫瘤脈管系統在內的腫瘤相關環境進行傳輸，為消除負反饋機制以及保存其改變藥物-穿透屏障的能力提供了一種新的方法。
本發明的組合物可以被配制成用以非腸道、肌肉內、靜脈內、皮下、眼內、口腔給藥或通過皮膚給藥的形式。在本發明關于這方面的一個實施方式中，本發明的綴合物可以以0.5至500ng/kg的劑量范圍內給藥，優選在1至50ng/kg范圍內，更優選在5至15ng/kg范圍內。
在本發明關于這方面的一個可供選擇的實施方式中，提供了一種藥物組合物，其含有與IFNγ相組合的本發明的綴合物，其中所述綴合物的存在量使得能夠向被治療的患者的血漿中提供的該綴合物或其代謝物的量不超過約35,000ng/天，優選約3,500ng/天，更優選1,000ng/天。
上述劑量涉及用于一個70kg患者的劑量。本領域的熟練技術人員能夠容易地對所列舉的劑量進行更改以用于質量超過70kg的患者。
所述給藥途徑和給藥方案僅意欲作為一種指導，因為熟練的從業人員能夠針對任何具體的患者和病癥容易地確定出最佳給藥途徑和給藥方案。
本發明的另一方面關注于編碼本文所述綴合的細胞因子的cDNA，其可以通過加入編碼CD13配體，優選編碼上述靶向肽的5’-或3’-鄰近DNA序列而由細胞因子cDNA制備獲得。組合的cDNA可同樣用于或在插入載體后用于基因治療。在(19)中描述了合適的載體的制備和治療性應用，其并入本文作為參考。
本發明所使用的多核苷酸包括編碼本發明的多肽綴合物的核酸序列。本領域熟練技術人員可理解的是由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的核苷酸能夠編碼同樣的多肽。此外，應被理解的是本領域熟練技術人員可以采用常規技術進行不影響本發明的核苷酸所編碼的多肽序列的核苷酸替換，以反應在要表達本發明多肽的任意特定宿主生物體中的密碼子的使用。
本發明的多肽包括DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈。它們也可以是多核苷酸，其包括合成的或經修飾的核苷酸。對寡核苷酸的多種不同類型的修飾是本領域已知的。它們包括甲基膦酸酯和硫逐磷酸酯主鏈，在所述分子的3′和/或5′端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。為了實現本發明的目的，應被理解的是本文所述的多核苷酸可以以任何現有技術中可知方法進行修飾。可以進行這種修飾以提高本發明的多核苷酸在體內的活性和壽命。
本發明的多核苷酸可以被整合到重組的可復制載體中。該載體可被用于在合適的宿主細胞中復制核酸。因此在另一個實施方式中，本發明提供了通過將本發明的多核苷酸導入可復制載體中，將該載體導入到合適宿主細胞中并在引起載體復制的條件下培養宿主細胞來制備多核苷酸的一種方法。可從宿主細胞中回收該載體。合適的宿主細胞包括細菌，例如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞系和其它真核細胞系，例如昆蟲Sf9細胞。
優選的是，載體中的本發明的多核苷酸可操作地連接于一段能夠提供通過宿主細胞表達編碼序列的控制序列，例如該載體是一種表達載體。術語“可操作地連接”是指所述成分處于能夠允許各成分以預計方式起作用的關系中。一種“可操作地連接”于編碼序列的調節性序列通過這種的方式連接，使得在與控制序列不矛盾的條件下實現編碼序列的表達。
可通過例如添加另一種轉錄調節元件對所述控制序列進行修飾以使得由控制序列導向的轉錄水平對轉錄調節因子的反應更強。
為了表達本發明的蛋白質，可以以下文所述方式將本發明的載體轉化或轉染到一種合適的宿主細胞中。這個過程可以包括在提供由編碼所述蛋白的序列的載體表達的條件下培養經上述載體轉化的宿主細胞，并任選地回收表達的蛋白質。
所述載體可以是例如質粒或病毒載體，其裝備有復制起點、任選的表達所述核苷酸的啟動子以及任選的啟動子的調節子。所述載體可含有一個或更多個選擇性的標記基因，例如就細菌質粒而言，是一種氨芐青霉素抗性基因或者就哺乳動物載體而言，是一種新霉素抗性基因。所述載體可用于例如轉染或轉化一種宿主細胞。
可操作性地連接到編碼本發明的蛋白質的序列上的控制序列包括啟動子/增強子和其它表達調控信號。可對這些控制序列進行選擇以與用于表達載體預計使用的宿主細胞相適應。術語“啟動子”是本領域已知的，其包括大小和復雜性可從由最小的啟動子變化至包括上游元件和增強子的啟動子的核酸區域。
盡管也可以使用原核啟動子和在其它真核細胞中有功能的啟動子，但是所述啟動子通常在哺乳動物細胞中有功能的啟動子中選出。所述啟動子通常是從病毒或真核基因的啟動子序列獲得。例如，其可以是從要進行表達的細胞的基因組中獲得的啟動子。至于真核啟動子，它們可以是以普遍存在的方式起作用的啟動子(例如a-肌動蛋白、b-肌動蛋白、微觀蛋白啟動子)或者，可供選擇的是，以組織特異性方式起作用的啟動子(例如丙酮酸激酶基因的啟動子)。也可以使用特異于某種細胞的組織特異性啟動子。它們可以是對特殊刺激源有反應的啟動子，例如與類固醇激素受體結合的啟動子。也可使用病毒啟動子，例如Moloney鼠白血病病毒的長末端重復(MMLV LTR)啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
對于啟動子而言，如果其為可誘導型以使得同源基因在細胞的生存期內的表達水平可被調節也是有利的。也可對采用啟動子獲得表達水平的誘導方法進行調節。
此外，這些啟動子中的任何一個都可通過加入另一種調節序列，例如增強子序列而被修飾。也可使用包括來自兩個或更多個上述不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
為了復制載體/多核苷酸和/或表達由本發明的核苷酸編碼的蛋白質，可將本發明的載體和多核苷酸導入到宿主細胞中。盡管可采用原核細胞作為宿主細胞來生產本發明的蛋白質，但優選采用真核細胞，例如酵母、昆蟲或哺乳動物細胞，尤其是哺乳動物細胞。
可采用大量本領域已知的技術，例如轉染、轉化、電穿孔將本發明的載體/多核苷酸導入到合適的宿主細胞中。其中要向動物體給藥本發明的載體/多核苷酸時，有幾種技術是本領域中已知的，例如以重組病毒載體如逆轉錄病毒、單純性皰疹病毒、腺病毒侵染、直接注射核酸和生物導彈式的轉化。
可以采用含有本發明的多核苷酸的宿主細胞來表達本發明的綴合物。可在合適的容許本發明的多肽和綴合物表達的條件下培養宿主細胞。本發明產物的表達可能是組成型的，以便它們可以得到連續生產，或者也可以是可誘導型的，這需要一種刺激源來起始表達。至于可誘導型表達，如果需要可通過如在培養基中加入一種誘導基質如地塞米松或IPTG來起始蛋白質的生產。
本發明的綴合物可以通過大量現有技術中的已知技術從宿主細胞中提取，所述技術包括通過酶法、化學方法和/或滲透溶胞和物理裂解。
附圖1TNF和NGR-TNF對RMA-T淋巴瘤(a和b)的生長以及對動物體重的影響(c和d)。
5個動物/組，在腫瘤移植10天后用單一劑量的TNF或NGR-TNF(腹腔內注射)進行治療。根據對數曲線內推作為劑量(b)的函數的第14天的腫瘤面積值和治療后體重的減少量(第11天和第12天的平均值)(d)。在14天時1μg或9μg的NGR-TNF引起的抗腫瘤作用比相當劑量的TNF所引起的抗腫瘤作用更強(分別為P＝0.024和P＝0.032)，而經治療后體重減少量近似。箭頭表示用外推法求得的引起類似作用的TNF和NGR-TNF的劑量。
附圖2mAb R3-63和CNGRC對NGR-TNF(a)和TNF(b)的抗腫瘤活性的影響。
在腫瘤移植12天后，將MAb R3-63或CNGRC與NGR-TNF或TNF相混合，對長有RMA-T腫瘤的動物(n＝5個動物/組)給藥。在一個單獨的實驗中(c)，將TNF和NGR-TNF與CNGRC或CARAC(對照肽)一起共給藥于載帶有11天大腫瘤的動物體(n＝5)。1μgNGR-TNF比9μg的TNF的抗腫瘤作用更強(P＝0.009，在20天時t檢驗)，并且這種作用極大地受到CNGRC(P＝0.035)和mAbR3-63(P＝0.011)的抑制。
附圖3NGR-TNF和TNF的有限的胰蛋白酶消化對它們質量(a)和抗腫瘤活性的影響(b)。
根據生產商提供的說明，通過1mg胰蛋白酶與1ml活性CH瓊脂糖(Activated CH Sepharose)(Pharmacia-Upjohn)偶聯制備出胰蛋白酶-瓊脂糖。NGR-TNF和TNF(300μl 0.15M氯化鈉，0.05M磷酸鈉，pH7.3中每份170μg)與15μl胰蛋白酶懸液混合(1∶4)或單獨與緩沖液混合并在37℃下在指定的時間由末端-末端轉動。通過0.22μm Spin-X裝置(Costar，Cambridge，MA)對四種產物進行過濾，并將產物保存于-20℃直至使用。(a)電噴霧質譜分析法。分子量值和相應的產物(N-末端序列)均在各峰標出。序列上的箭頭表示切割位點。(b)不與胰蛋白酶(上圖)或與胰蛋白酶(下圖)一起孵育的1或3μg的NGR-TNF和TNF對RMA-T腫瘤和動物體重的影響(經1和3μg的劑量處理的組的平均值+標準誤差)。動物在腫瘤移植后13天進行處理(n＝5個動物/組)。
附圖4變性/重折疊之前和之后人NGR-TNF的SDS-PAGE以及抗腫瘤活性。
在非還原條件下，實施例V中所述變性/重折疊過程之前(b)和之后(c)人TNF(a)，NGR-TNF的SDS-PAGE。
TNF和未重折疊的NGR-TNF對RMA-T淋巴瘤生長(B)和體重(C)的影響。人TNF(D)和重折疊NGR-TNF(由＞95％含有鏈內二硫化物的三聚體構成)(E)對腫瘤生長的影響。在腫瘤移植10天后，用一個劑量腹腔內給藥TNF或NGR-TNF來治療動物(如每張圖所示，15或5只小鼠/組)。
附圖5C57BL6小鼠中中和的抗mIFNγ抗體(AN18)對NGR-mTNF的抗腫瘤活性的影響以及阿霉素對B16F1腫瘤的影響。
附圖6NGR-TNF和阿霉素在敲除IFN的小鼠中的作用。
附圖7在裸鼠中NGR-mTNF、mIFNγ和阿霉素(單獨或組合在一起)對B16F1腫瘤的影響。
附圖8NGR-TNF和阿霉素在裸鼠中的作用。
附圖9在免疫活性小鼠(C57BL6)中，NGR-mTNF、mIFNγ和阿霉素對B16F1腫瘤的影響。
附圖10在敲除IFN的小鼠中，IFN當與NGR-TNF組合在一起時提高阿霉素在腫瘤中的穿透性。
下面的實施例進一步說明本發明。
實施例I鼠TNF和NGR-TNF的制備通過細胞質cDNA在大腸桿菌中表達生產出鼠重組TNF和Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)。通過對從經脂多糖刺激的鼠RAW-264.7單核細胞-巨噬細胞中分離的mRNA進行反向轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)制備出編碼鼠Met-TNF1-156的cDNA(20)，其中采用5′-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′和5′-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3′作為3′和5′引物。
用Nde I和Bam HI(New England Biolabs，Beverley，MA)消化所擴增的片段，并克隆于預先經相同酶消化的pET-11b(Novagen，Madison，WI)中。
采用5′-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3′作為5′引物，上述3′引物對pTNF進行PCR擴增而獲得編碼Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1-156的cDNA。按上述方法消化所擴增的片段并克隆到pET-11b中，并用于轉化BL21(DE3)大腸桿菌細胞(Novagen)。根據pET11b生產商的說明用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導TNF和NGR-TNF的表達。通過在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0中進行細菌的超聲波降解，然后離心(15000xg，20分鐘，4℃)，從2升培養物中獲得可溶性TNF和NGR-TNF。將兩種提取物與硫酸銨混合(25％飽和)，置于4℃下1小時，然后按上述方式離心。那么上清液中的硫酸銨的飽和度就達到了65％，置于4℃下24小時，然后離心。將每個團塊溶解于200ml的1M硫酸銨、50mM Tris-HCl，pH8.0中，然后在苯基-瓊脂糖6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脫，緩沖液A50mM磷酸鈉，pH8.0，含有1M硫酸銨；緩沖液B20％甘油，5％甲醇，50mM磷酸鈉，pH8.0)上通過疏水作用色譜法進行純化。收集含有TNF免疫活性物質(通過蛋白質印跡法)的部分，用2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0透析，通過在DEAE-瓊脂糖Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脫，緩沖液A20mMTris-HCl，pH8.0；緩沖液B1M氯化鈉，20mM Tris-HCl，pH8.0)上的陽離子交換對其進行純化。收集合有TNF-免疫反應活性的部分，通過用150mM氯化鈉、50mM硫酸鈉緩沖液，pH7.3(PBS)預平衡和洗脫的Sephacryl-S-300 HR(Pharmacia-Upjohn)上的凝膠過濾色譜純化。收集符合40000-50000Mr產物的部分，分成等份并于-20℃儲藏。所有在色譜分離步驟中使用的溶液都是用無菌的無內毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)配制的。最后產率為45mg TNF和34.5mg NGR-TNF。
電噴霧質譜法測定純化的TNF和NGR-TNF的分子量。采用商購的蛋白質檢測試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白質的含量。以定量的生色的Lymulus Amoebocyte Lysate(LAL)檢測(BioWhittaker)測得TNF和NGR-TNF的內毒素含量依次為0.75單位/μg和1.38單位/μg。
通過標準方法采用12.5或15％聚丙烯酰胺凝膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質印跡分析。
通過可溶性p55-TNF受體(sTNF-R1)-瓊脂糖凝膠上的親合層析按下列方式對少量TNF和NGR-TNF進行進一步的純化以所述方式(22)制備5mg重組sTNF-R1，并按照生產商的說明偶聯于2ml活化的-CH-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)上。用無菌并且無內毒素的溶液徹底清洗兩根彼此分離的柱子(每根1ml)，往柱中裝載進純化的溶于PBS的TNF或NGR-TNF，用梯度洗脫液(1小時，緩沖液APBS；緩沖液B0.5M氯化鈉，0.2M甘氨酸-HCl)洗脫。中和含有TNF-抗原的部分，在無菌的生理溶液中透析。在透析之前加入無內毒素的人血清蛋白(0.5mg/ml)以阻止蛋白質吸附在膜上。通過ELISA和細胞溶解測試檢測每份中的TNF含量。
TNF的非還原性SDS-PAGE顯示一條17-18kDa條帶，如所預期的單體TNF(未顯示)。所不同的是，NGR-TNF的非還原性SDS-PAGE和蛋白質印跡分析顯示大小為18，36和50kDa的不同的免疫活性形式，其可能對應于單體、二聚體和三聚體。在還原條件下，50和36kDa條帶大部分轉化為18kDa形式，其表明NGR-TNF分子與鏈間二硫橋鍵的存在。18kDa條帶共占總物質的約2/3，而36kDa占剩余的大部分。這些電泳圖案暗示NGR-TNF是一種由含有適當的鏈內二硫鍵的三個單體亞基構成的三聚體(至少50％)和剩余部分大部分為具有一個或多個鏈內二硫鍵的三聚體的混合物。同樣通過還原性SDS-PAGE觀察36kDa條帶得到這樣的啟示NGR-TNF也含有不可逆變性的二聚體(約占總量的10％)。
通過電噴霧質譜法測得TNF和NGR-TNF單體的分子量依次為17386.1+2.0Da和17843.7+2.5Da。這些值與所預期的Met-TNF1-156(17386.7Da)和CNGRCG-TNF1-156(17844.2Da)大小完全吻合。
實施例II鼠TNF和NGR-TNF的體外細胞毒性活性通過基于L-M小鼠成纖維細胞(ATCCCCL1.2)的標準細胞溶解測試，按照所述方法(23)測定TNF和NGR-TNF的生物活性。在30ng/ml放線菌素D存在的條件下針對TNF和NGR-TNF對RMA-T細胞的細胞溶解活性進行檢測。在三種不同的稀釋度下，一式兩份地對每個試樣進行分析。結果表示為2-3個獨立測試的平均數±標準偏差。
通過采用L-M細胞的標準細胞溶解測試測得TNF和NGR-TNF的體外細胞毒性活性依次為(1.2+0.14)×108單位/mg和(1.8±0.7)×108單位/mg。這些結果表明，NGR-TNF分子上的CNGRCG部分不阻止折疊、低聚反應和與TNF受體的結合。
在先前的研究中我們說明了RMA-T可在30ng/ml放線菌素D存在的條件下被TNF殺死，而若缺少轉錄抑制因子，即使在孵育幾天后這些細胞對TNF仍具有抵抗力。在放線菌素D存在的條件下NGR-TNF對RMA-T細胞的體外細胞毒性活性為(1.4+0.8)×108單位/mg，其是采用TNF((1.2±0.14)×108units/mg)作為標準測量得出的。因此，NGR-TNF和TNF對L-M和RMA-T細胞的細胞毒性活性相似。
實施例III鼠TNF和NGR-TNF的治療活性和毒性的表征在RPMI 1640、5％胎兒牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B、2mM谷氨酰胺和50μM2-巰基乙醇中體外保存C57BL/6來源的勞舍爾病毒誘導的RMA淋巴瘤。通過以一種編碼Thy1.1等位基因的構建體轉染從RMA細胞系中獲得RMA-T并以所述方式培養(14)。
在RPMI 1640、5％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B、2mM谷氨酰胺和1％MEM非必需氨基酸(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)中培養B16F1黑色素瘤。
在動物模型中進行的體內研究已獲Ethical Committee of theSan Raffaele H Scientific Institute批準，并按照規定準則進行。在左側腰窩分別以5×104RMA-T或B16F1活細胞皮下注射來激發C57BL/6(Charles Rivet Laboratories，Calco，Italy)(16-18g)。在腫瘤植入10-12天后，用腹腔注射250μl經無內毒素的0.9％氯化鈉稀釋的TNF或NGR-TNF溶液處理小鼠。預備試驗顯示在TNF和NGR-TNF溶液中加入人血清蛋白作為載體對抗腫瘤活性沒有改變。通過用測徑計測量，對腫瘤生長進行每日監控。通過計算r1×r2估計腫瘤面積，而通過計算r1×r2×r3×4/3估計腫瘤體積，其中r1和r2為縱向和橫向的半徑，r3是由正常皮膚表面上突起的腫瘤厚度。在腫瘤直徑達到1.0-1.3cm之前殺死小鼠。腫瘤尺寸表示為平均值+標準偏差(如圖例所示每組5-10個動物)，并通過t-檢驗進行比較。
在C57BL6小鼠中采用RMA-T淋巴瘤和B16F1黑色素瘤模型比較NGR-TNF與TNF的抗腫瘤活性和毒性。由于RMA-T模型先前已經被表征并被用于以不同靶向方案研究TNF的抗腫瘤活性(26)，我們決定在本研究中也采用該模型。
施于帶有已建立的RMA-T腫瘤的動物體的鼠TNF24小時后，引起腫瘤體積減小并導致腫瘤中心部分出血性壞死，之后腫瘤的生長嚴重延遲了數日(26)。以TNF單一處理甚至以接近LD50的劑量處理并不能誘導該腫瘤完全退化，這是由于壞死區域周圍的活細胞在處理后幾天內開始生長。
在第一組實驗中，我們研究了以不同劑量腹腔內注射的TNF或NGR-TNF對動物存活的效果。為了避免過多的痛苦，當腫瘤直徑超過1-1.3cm時處死動物。處理三天后TNF和NGR-TNF的致死率是相似的(分別為LD50、60μg和45μg)，而它們的抗腫瘤活性卻有顯著性差異(表1)。
表1.經TNF或NGR-TNF處理的長有RMA-T淋巴瘤小鼠的存活率
a)長有腫瘤的動物在腫瘤植入10天后經TNF或NGR-TNF腹腔內注射給藥。當腫瘤直徑超過1-1.3cm時處死動物。
b)用50,000RMA-T細胞(第二次激發)或50,000RMA(第三次)在指定時間對存活動物再次激發。每次針對5個正常動物監控所注射細胞的致腫瘤性。所有對照組動物在10天內都形成出一個腫瘤(數據未示出)。
舉例來說，1或3μg NGR-TNF比27μg TNF對腫瘤生長的延遲更為有效，這表明NGR-TNF至少具有一種更高的數量級的活性。有趣的是，一些動物以低于LD50劑量的NGR-TNF進行治療而獲得治愈，而根本沒有動物通過TNF而獲得治愈。治愈的動物抵制進一步由致腫瘤劑量的RMA-T或野生型RMA細胞的激發，這暗示以NGR-TNF進行一次處理能夠誘導保護性免疫。值得注意的是，加大TNF或NGR-TNF的劑量超過9-27μg將顯著地提高毒性并且略微或根本不改變治療活性。
作為TNF處理帶來的結果，重量的損失是一項公知的全身性毒性的病癥(26)。因此，為了進一步比較TNF和NGR-TNF的功效/毒性的比率，我們在處理后對腫瘤生長和動物的體重進行監控。1μg NGR-TNF對腫瘤生長的作用相似于或更高于9μg TNF的作用(附圖1a)，而其處理1-2天后體重的減少與經1μg TNF造成的體重的減少相當(附圖1c)。當我們使用劑量一反應圖中的對數曲線內插數據時，我們發現14天時9μg TNF的治療效果僅以少至0.6μg的NGR-TNF就可獲得(附圖1b)。與此相反，8.5μg的劑量對于誘導相當的毒性作用是必需的(附圖1d)。因此，在這些條件下計算出的NGR-TNF的功效/毒性比TNF高14倍。
用B16F1黑色素瘤模型也獲得了相似的結果。在第11天和第17天以1μg NGR-TNF進行的處理誘導出在第19天時的抗腫瘤應答比以4μg TNF獲得的更強，與以12μg TNF獲得的相似(數據未示出)。與之相反，由1μg NGR-TNF引起的重量的減少比由4和12μg TNF引起的明顯少。以12μg NGR-TNF進行的處理甚至引起了更強的抗腫瘤效果，而毒性作用僅與12μg TNF相似。
當在第19天進行第三次注射時，在1-2天后各組中出現一些動物死亡(經鹽水和12μg NGR-TNF治療組中每5只中有2只死亡，余下組中每5只中有一只死亡)。值得注意的是，一種經12μg NGR-TNF處理的動物完全抵排斥了腫瘤。當以致腫瘤發生劑量的B16F1細胞第二次激發該動物時，在18天后形成了一個可觸摸到的腫瘤，而對照組動物在6-7天內就形成了腫瘤。
總而言之，這些結果提示NGR-TNF對于抑制腫瘤生長的功效比TNF高10-15倍而毒性相似。而且，NGR-TNF比TNF能更為有效地誘導保護性免疫應答。
實施例IVNGR-TNF作用的機理從腹水中通過蛋白質-G-瓊脂糖凝膠層析(Pharmacia-Upjohn，Uppsala，Sweden)純化出抗-小鼠CD13 mAb R3-63，在0.9％氯化鈉中透析。
由Primm srl(Milan，Italy)購得兔多克隆抗血清，在蛋白質-A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia-Upjohn)上通過親合層析進行純化。以前述方式制備CNGRC和CARAC肽(28)。
為了提供證據證明NGR-TNF的改良活性取決于通過NGR部分的腫瘤靶向，我們研究了NGR-TNF在體內的活性是否可被CNGRC部分競爭。為了這個目的，我們對長有RMA-T腫瘤的小鼠施以添加或不添加1摩爾額外的CNGRC的NGR-TNF(1μg)。與之平行的是其它動物用添加或不添加CNGRC的TNF(3或9μg)進行處理。如所預期的，CNGRC極大地減少了NGR-TNF的抗腫瘤活性(附圖2a)，而未減少TNF的抗腫瘤活性(附圖2b)。不同的是，對照肽(CARAC)不能引起NGR-TNF活性的大幅度減少(附圖2c)。這些結果提示CNGRC與NGR-TNF競爭與CNGRC受體的結合，這就支持了關于改良活性的靶向機理的假設。值得注意的是，CNGRC不能減少NGR-TNF在體外的細胞毒活性(數據未示出)。
由于近來有報道稱氨肽酶N(CD13)是一種CNGRC肽的受體，接著我們研究了這種受體在NGR-TNF的靶向機理中的貢獻。為了這個目的，我們研究了抗-CD13 mAb(R3-63)對NGR-TNF和TNF的抗腫瘤活性的影響。MAb R3-63極大地抑制了NGR-TNF的抗腫瘤活性(附圖2a)但未抑制住TNF(附圖2b)，這表明CD13確實關鍵性地介入于NGR-TNF的抗腫瘤活性。通過對加入mAb R3-63的培養細胞進行FACS分析，觀察到CD13在RMA-T細胞表面不表達(數據未示出)，這暗示可在體內通過抗體識別其它細胞。
盡管這些數據指示CD13是NGR-TNF的一個重要受體，但是我們不能完全排除與其它尚未識別的NGR受體的結合(即使程度很低)也會對靶向機理有貢獻。
部分蛋白質水解的預備試驗顯示TNF(第2-3位殘基)的N-末端區段的Arg-Ser鍵對胰蛋白酶十分敏感，而該分子的其它部分則更具抵抗力。因此，為了進一步提供能夠證明NGR-TNF的改良活性與NGR部分相關的證據，我們設法通過用固定化的胰蛋白酶部分消化而從突變蛋白質N-末端區切下NGR區域。這種處理將NGR-TNF和TNF都轉化成TNF3-156片段(預計大小為16986.2Da；測量的質量及預期序列參見附圖)。
雖然消化并未減少NGR-TNF對L-M細胞(2.3±1.4)×108U/mg)的體外細胞溶解活性，但是其體內的抗腫瘤活性減少至TNF(附圖3b)的水平。值得注意的是，根據處理一天后動物體重減少的量來判斷，消化前和消化后NGR-TNF和TNF的毒性是相似的(附圖3b，右圖)，這說明依賴于NGR的靶向機理并不改變毒性。
實施例V人TNF和NGR-TNF的制備和表征通過重組DNA技術制備人的重組TNF和NGR-TNF(由人TNF1-157與CNGRCG的C末端融合構成)，基本上按照所述鼠TNF和NGR-TNF的純化方式進行純化。通過在含有hTNF編碼序列的質粒(33)上進行PCR，采用下列引物制備出編碼人NGR-TNF的cDNA-NGR-hTNF/1(正義)5’A TATCAT ATGTGC AAC GGC CGT TGC GGCGTC AGA TCA TCdT TCT CG 3’.
-NGR-hTNF/2(反義)5’TCAGGA TCCTCA CAG GGC AAT GAT CCCAAA GTA GAC 3’消化擴增片段，在pET-11b(Nde I/BamH I)中克隆并用于轉化BL21(DE3)大腸桿菌細胞(Novagen)。根據pET11b生產商的說明，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導NGR-hTNF表達。通過在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0中進行細菌的超聲波降解，然后離心(15000xg，20分鐘，4℃)，從2升培養物中獲得可溶性NGR-TNF。
將提取物與硫酸銨混合(35％飽和)，置于4℃下1小時，然后按上述方式離心。那么上清液中的硫酸銨的飽和度就達到了65％，置于4℃下24小時，然后離心。將每個團塊溶解于1M硫酸銨、50mMTris-HCl，pH8.0中，然后在苯基-瓊脂糖6Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脫，緩沖液A100mM磷酸鈉、pH8.0、含有1M硫酸銨；緩沖液B70％乙二醇、5％甲醇、100mM磷酸鈉，pH8.0)上通過疏水作用色譜法進行純化。收集含有hTNF免疫活性物質(通過ELISA)的部分，用20mM Tris-HCl，pH8.0透析，通過在DEAE-瓊脂糖Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脫，緩沖液A20mM Tris-HCl，pH8.0；緩沖液B1M氯化鈉、20mM Tris-HCl，pH8.0)上的陽離子交換對其進行純化。所有在色譜分離步驟中使用的溶液都是用無菌的無內毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)配制的。
在這一點上從2升培養物中回收了約有30mg TNF和32mgNGR-TNF。非還原性SDS-PAGE顯示了單體、二聚體和三聚體的條帶，這表示人NGR-TNF也是一種有適當的鏈內二硫鍵的三聚體和具有一個或多個鏈間二硫橋鍵的三聚體的混合物(附圖4A，泳道b)，這與鼠NGR-TNF一樣。
通過以下四步變性-重折疊法從所述混合物中分離出具有適當的鏈內二硫鍵橋的三聚體以7M脲使純化的人NGR-TNF變性，通過一種經7M脲、100mM Tris-HCl，pH8.0預平衡的HR Sephacryl S-300柱(1025ml)(Pharmacia)進行純化。收集對應于單體的部分，通過YM MWCO 10kDa膜(Amicon)超濾，并通過在33倍體積的2.33M脲、100mM Tris-HCl，pH8中在4℃(140min)(140分鐘)透析、而后在1.55M脲、100mM Tris-HCl，pH8(140分鐘)透析和在1M脲、100mM Tris-HCl，pH8(140分鐘)中透析而重折疊。最后在80倍體積100mM Tris-HCl(16小時)中透析，以13000xg離心(30分鐘)，經SFCA 0.45μm膜(Nalgene)過濾，并通過經0.15M氯化鈉、0.05M磷酸鈉(PBS)預平衡的HR Sephacryl S-300柱(1020ml)(Pharmacia)凝膠過濾。約23mg重折疊的蛋白質獲得回收。
經非還原性SDS-PAGE后，最終產物大部分為單體(附圖4A，泳道c)，經在Superdex 75 HR柱上進行分析性的凝膠過濾HPLC，最終產物具有與三聚體人TNF相似的流體力學體積(未示出)，經電噴霧質譜分析測得最終產物的分子量為17937.8+1.8Da(預期的CNGRCG-TNF1-157的值為17939.4Da)。非重折疊和重折疊的NGR-TNF在體外對鼠L-M細胞的細胞溶解活性依次為(6.11×107)+4.9和(5.09×107)+0.3單位/mg，而純化的人的TNF為(5.45×107)+3.1單位/mg。這些結果表明變性-重折疊過程不對人NGR-TNF與鼠p55受體之間的相互作用產生影響。
1μg人NGR-TNF(非重折疊)在體內的抗腫瘤活性比10μg TNF高(附圖4B)，而由動物的體重來判斷毒性卻明顯低(附圖4C)。在重折疊之后，0.3μg NGR-TNF足以誘導比用10μg TNF所實現的更強的抗腫瘤效果(附圖4D，4E)。
這些結果表明人NGR-TNF的抗腫瘤效果比人TNF的強。
此外，我們觀察到重折疊的人和小鼠NGR-TNF即使在非常低的劑量(1-10ng/小鼠)下也能夠對長有RMA-T腫瘤的小鼠誘導產生顯著的抗腫瘤效果并且沒有證據顯示有毒效應，而在同樣這些劑量下TNF不能誘導產生顯著的效果(未示出)。
實施例VI鼠TNF和NGR-TNF的制備和表征通過重組DNA技術，以與NGR-TNF基本相同的方式制備與CNGRCG(NGR-IFNγ)融合的鼠干擾素(IFN)γ。CNGRCG區域與IFNγ的C末端相融合。此外，134位點的半胱氨酸被置換為絲氨酸；為了在大腸桿菌中表達，在位點-1處插入蛋氨酸。用于生產NGR-IFNγcDNA的PCR引物為5’-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C(正義)和5’-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTTCCG CTT CCT GAG GC。將cDNA克隆于pET-11b(Nde I/BamH I)中并用于轉化BL21(DE3)大腸桿菌細胞(Novagen)。根據pET11b生產商的說明，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導蛋白質的表達。通過采用固定于瓊脂糖的抗鼠IFNγmAb(AN18)的免疫親合層析，按照標準技術從大腸桿菌提取物中純化出產物。終產物的還原性和非還原性SDS-PAGE顯示出大小為16kDa的單一條帶。電噴霧質譜分析顯示出分子量為16223+3.6Da(預期為1625.5Da)，相應于鼠Met-IFNγ1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFNγ)。
通過免疫組織化學方法研究了NGR-IFNγ和NGR-TNF與抗-CD13抗體競爭結合腫瘤相關性血管的能力。
人腎細胞癌的新鮮外科樣品是從Histopathology Department ofthe San Raffaele H Scientific Institute獲得的。制備出Bouin固定的(4-6h)石蠟包埋的切片(5-6μm厚)，將其吸附于涂布有聚賴氨酸的載玻片上。采用下述的抗生物素蛋白-生物素蛋白復合物的方法檢測CD13抗原按照標準方法采用二甲苯和分級乙醇系列再水合組織切片。將組織切片置于一種含有1mM EDTA的容器中，用微波爐(1000W)煮沸7分鐘。再往該容器中填充1mM EDTA，再煮沸5分鐘。將組織切片冷卻，并在含有0.3％過氧化氫的PBS中孵育15分鐘以抑制內源性過氧化物酶。然后用PBS沖洗樣品，并與100-200μl PBS-BSA一起孵育(室溫下1小時)，然后單獨用mAb WM15(抗-hCD13)孵育或用與各種競爭劑(參見表2)在PBS-BSA中混合的mAb WM15(抗-hCD13)孵育(4℃過夜)。用PBS沖洗載玻片三次，在含有2％正常馬血清的PBS-BSA(PBS-BSA-NHS)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)中孵育5分鐘。然后用3μg/ml生物素化的在PBS-BSA-NHS中的馬抗小鼠IgG(H+L)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)替換該溶液，然后再在室溫下孵育一小時。再次清洗載玻片，用以1∶100稀釋于PBS中的Vectastain Elite Reagent(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育30分鐘。在10ml含有0.03％過氧化氫的去離子水中溶解一片3，3’-二氨基-聯苯胺-四鹽酸鹽(Merck，Darmstadt，Germany)，經0.2μm膜過濾后覆蓋于組織切片上5-10分鐘。以上述方式清洗載玻片，用哈里斯蘇木精復染。通過用抗CD31 mAb(mAbJC/70A，anti-human CD31，IgG1，由DAKO，Copenhagen，Denmark獲得)對組織的系列切片染色來鑒別出與腫瘤相關的血管。
上述結果總結于表2中。如其所示，WM15與腫瘤相關性血管的結合受到過量NGR-TNF、NGR-IFNγ和CNGRC的抑制，但并不受其它缺少NGR基序的對照試劑的抑制。這表示NGR在CD13上的結合位點與WM15表位在空間上重疊。與之相反，NGR-TNF不能與13C03競爭與上皮細胞的結合。
我們推斷NGR-IFNγ和NGR-TNF的NGR部分能夠與由mAb WM15識別的腫瘤相關性血管上的一種CD13形式相互作用。而且，這些結果表明CNGRC基序無論連接于細胞因子的N末端還是C末端都是有活性的。
表2.各種競爭劑存在條件下WM15與腎細胞癌切片的結合競爭劑 WM15與腫瘤相關性血管的結合無 +NGR-TNF(25μg/ml) -NGR-IFNγ(50μg/ml)-CNGRC(100μg/ml) -TNF(25μg/ml) +人血清蛋白(25μg/ml) +合成的CgA(60-68)(100μg/ml)+a在封閉步驟中加入溶于含有2％BSA的PBS中的競爭劑，然后與原初抗體混合。
bmAb WM15(抗人CD13，IgG1)是從Pharmingen(San Diego，CA)獲得的；合成的肽CgA(60-68)對應于嗜鉻粒蛋白A的片段60-68。
實施例VII采用抗腫瘤抗體和抗生物素蛋白的生物素化的NGR-TNF向腫瘤的靶向性傳遞(預靶向)下面的實施例根據腫瘤靶向抗體和肽CNGRC的結合闡述了TNF的“雙重”靶向的可能性。
通過在pH6.8、1M碳酸鈉緩沖液中將NGR-TNF與D-生物素-6-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SocietáProdotti AntibioticiS.p.A，Milan，Italy)相混合(室溫下3小時)而制備出一種生物素-NGR-TNF綴合物(21)。用1M Tris-HCl，pH7.5中斷反應。
通過質譜分析法鑒定該綴合物，發現其含有1個生物素/三聚體(平均)。在左腰窩處以5×104個RMA-T活細胞皮下注射來激發C57BL/6(Charles River Laboratories，Calco，Italy)。當腫瘤面積達到40mm2時，按照前述“三天”策略向小鼠依次注射生物素化抗體、抗生物素蛋白和生物素-TNF(26)。我們注射了40μg生物素-mAb19E12(腹膜內步驟I)，18和19小時后分別注射60μg抗生物素蛋白和60μg抗生物素蛋白鏈霉素(腹膜內，步驟II)，，24小時后注射3μg生物素-NGR-TNF(腹膜內，步驟III)。每一種化合物均是以無菌的0.9％氯化鈉溶液稀釋的。在對照實驗中，省去了抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。各實驗均在5只小鼠/組中進行。通過以測徑計測量腫瘤大小來對腫瘤進行每日監控。在以mAb19E12-生物素/抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白/生物素-NGR-TNF(5只動物，平均值±標準偏差)處理的組中，處理前和處理后10天的腫瘤面積分別為39+4mm2和8+5mm2。對照組中(僅經mAb 19E12-生物素/生物素-NGR-TNF處理)，處理前和處理后10天的腫瘤面積分別為40+4mm2和20+6mm2，這表明以腫瘤靶向抗體和抗生物素蛋白預靶向提高了NGR-TNF的活性。
實施例VIIINGR-TNF和干擾素γ之間的協同效應以前述方式培養鼠B16F1黑色素瘤細胞(Curnis et al.，2000；Moro et al.，1997)。
中和的抗-IFNγ單克隆抗體AN18由P.Dellabona(Milan，Italy)友情提供。阿霉素(Adriblastina)從Pharmacia-Upjohn(Milan，Italy)商購獲得。重組鼠IFNγ由Peprotech Inc.(USA)商購獲得(內毒素含量＜1單位/μg)。將BALB/c自發性乳腺瘤的TS/A細胞培養于RPMI 1640培養基、10％胎兒牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B、2mM谷氨酰胺和含非必需氨基酸的1％最低必需培養基(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)中。
通過重組DNA技術制備鼠TNF和NGR-TNF(由TNF與CNGRCG的C末端融合構成)，以前述方式從大腸桿菌提取物中將其純化(Curnis，et al.，2000)。所有層析步驟中所用的溶液均以無菌的無內毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)配制。用商購的蛋白質定量檢測試劑盒測量蛋白質濃度(Pierce，Rockford，IL)。NGR-mTNF的細胞溶解活性為9.1×107單位/mg。NGR-mTNF的流體力學體積與mTNF相似，一種經Superdex75HR柱(Pharmacia，Sweden)上的凝膠過濾獲得的同型三聚體蛋白質(Smith and Baglioni，1987)。NGR-mTNF內毒素含量為0.082單位/μg。
以標準的重組DNA方法進行DNA操作。通過對由經佛波醇-12-十四碳烷酸酯-13-乙酸酯刺激的鼠胸腺依賴性細胞獲得的cDNA進行PCR制備出編碼鼠IFNγ的cDNA，所采用的引物是5′AGAATTCATGAACGCTACACACTGCATCTTGGC3’(正向引物)；5’TATATTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCCGC3′(反向引物)。引物被設計成能擴增包括前導序列在內的編碼全長鼠IFNγ的cDNA序列。它們包括用于克隆至哺乳動物表達載體pRS1-neo以產生pRS1neo-IFNγ的EcoRI和HindIII限制位點(下劃線標出)。然后采用Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen Inc.-Diagen，GmbH，Germany)制備出pRS1neo-IFNγ，在無菌的無內毒素的水(S.A.L.F.Laboratorio Farmacologico SpA，Bergamo，Italy)中稀釋成1mg/ml。在RPMI 1640中將pRS1neo-IFNγ(3μg)與100μl 0.03mg/ml脂轉染試劑(Gibco Brl)相混合，在室溫下孵育20分鐘。然后將混合物加入到1天前接種于20-孔微量滴定板的TS/A細胞中。在37℃5％CO2下孵育4小時之后，向每孔中加入2ml培養液。在孵育48小時后，將培養液換成添加有10％胎兒牛血清、2mM谷氨酰胺并含有1mg/ml遺傳霉素的RPMI 1640。一星期后，通過在遺傳霉素存在的條件下在96-孔微量滴定板上的有限稀釋而克隆出存活細胞選擇物。通過IFNγ-ELISA檢測每一克隆的上清液，獲得10個分泌IFNγ的克隆。挑選出一個每ml培養液產生1.13μg IFNγ的克隆，命名為TS/A-IFNγ，將其用于體內實驗。
IFNγ-ELISA.以5μg/ml溶于PBS中的mAb AN18涂布PVC微量滴定板(Becton Dickinson，cod.3912)(4℃下16小時)。用PBS沖洗滴定板三次，用PBS中的2％牛血清蛋白(BSA)中斷反應(PBS-BSA，37℃下1小時)。然后用PBS沖洗滴定板三次，然后用細胞培養上清液或稀釋于PBS-BSA中的鼠IFNγ標準溶液孵育。用含有0.05％Tween-20(Merck)(PBS-TW)的PBS沖洗滴定板8遍，用mAb XMG1.2-bio孵育(PBS中0.2μg/ml，37℃下1小時)。再用PBS-TW沖洗滴定板，用以1∶300稀釋于PBS-BSA中的抗生物素蛋白鏈霉素-辣根過氧化物酶(Sigma)在37℃下孵育1小時。用PBS-TW沖洗后，以鄰苯二胺二鹽酸過氧化物酶底物(Sigma)檢測結合的過氧化物酶。30分鐘后通過加入10％硫酸停止顯色反應。用ELISA微板讀數器(Biorad)檢測A490。
對動物模型的研究已經Ethical Committee of the San RaffaeleH Scientific Institute批準，并按照指定方針進行。對重量為16-18g的小鼠通過在左側腰窩處皮下注射5×104個B16F1活細胞進行激發；5天后，用NGR-mTNF和mIFNγ溶液(100μl)進行處理，兩小時后施以阿霉素溶液(100μl)。所有藥物均經腹膜內給藥(i.p)。這些藥物除了阿霉素均用含有100μg/ml無內毒素的人血清蛋白(Farma-Biagini，Lucca，Italy)的0.9％氯化鈉稀釋，阿霉素僅用0.9％氯化鈉稀釋。以前述方式用測徑計測量腫瘤來對腫瘤生長進行每日監控(Gasparri et al.，1999)。在腫瘤直徑達到1.0-1.5cm之前處死動物。腫瘤尺寸以平均值±標準偏差表示(5個動物/組)。
內源性IFN對于NGR-TNF/阿霉素的治療活性是至關重要的。
我們已經在上文說明了NGR-mTNF和阿霉素在長有B16-F1腫瘤的免疫活性小鼠中有協同作用，通過預先施以0.1ng NGR-mTNF，阿霉素的抗腫瘤作用得到明顯提高(上文以及Curnis et al.，2002)。因此，以低劑量的NGR-mTNF(0.1ng)與阿霉素(80μg)一起向長有B16-F1腫瘤的小鼠給藥所引起的抗腫瘤作用比單獨用阿霉素要強(附圖.5)。這些藥物的協同作用，當單獨以低劑量使用NGR-TNF(0.1ng)時，其活性很低(Curnis et al.，2002)。
為了評價內源性mIFNγ在免疫活性小鼠中對NGR-mTNF的抗腫瘤活性的功能性價值，我們在C57BL6小鼠體中研究了一種中和抗-mIFNγ抗體(mAb AN18)對NGR-mTNF/阿霉素的作用。
當該抗體在NGR-mTNF給藥24小時之前給藥時，NGR-mTNF和阿霉素之間的協同作用完全消失(附圖5)，這支持了關于內源性mIFNγ在NGR-mTNF的抗腫瘤活性中起重要作用的假設。
為了進一步支持IFN在對這些藥的治療反應中的作用，我們進行了其它體內試驗，其中采用BALB/c IFNγ-/-“敲除”小鼠，這種小鼠長有皮下鼠TS/A-乳腺瘤。與之平行的是，我們采用野生型BALB/c IFNγ+/+小鼠進行了相似的試驗。NGR-TNF/阿霉素顯著地減少了BALB/cIFNγ+/+小鼠中的腫瘤質量(附圖6，黑色條)，但是在BALB/cIFNγ-/-小鼠中卻沒有(附圖6，白色條)。值得注意的是，以外源性IFN(300ng)與NGR-TNF和阿霉素一起對BALB/c IFNγ-/-小鼠給藥恢復了這兩種藥物間的協同作用(附圖6，白色條)。這些結果證實了關于IFN對于NGR-TNF/阿霉素協同效應來說是必需的假設。以IFN和阿霉素而不加NGR-TNF共給藥沒有在BALB/cIFNγ-/-小鼠中引起顯著的抗腫瘤作用，這表明這種細胞因子與NGR-TNF具有協同作用與阿霉素有稍許或沒有協同作用。
T-細胞和局部產生的IFN在NGR-TNF/阿霉素治療活性中的作用T-和NK-細胞是免疫活性小鼠中IFN的最初來源。為了研究作為IFN的一種來源的T-細胞在NGR-TNF/阿霉素組合治療中的作用，我們在缺少T-細胞的長有B16F1腫瘤的nu/nu小鼠中研究了這些藥物的作用。在這種模型中，NGR-TNF/阿霉素的協同活性喪失了(附圖7A-C)。然而，當這些藥物與IFN結合給藥時，又重新觀察到了協同作用(附圖7D)。這很可能是這些動物體中的內源性IFN的量并不足以激活NGR-TNF/阿霉素的協同作用，而以外源性IFN給藥時恢復了協同作用。
免疫活性小鼠和nu/nu小鼠的體內試驗結果可能暗示存在于免疫小鼠而非nu/nu小鼠的腫瘤塊中的T-細胞產生足量的IFN以促進NGR-TNF與化學治療劑之間的協同反應。為了評價腫瘤微環境中的IFN的產生是否能在nu/nu小鼠體內恢復協同效應，我們以鼠IFN cDNA轉染TS/A細胞(附圖8)。在培養基中篩選出一個能分泌IFN的克隆，命名為TS/A-IFN。然后將TS/A-IFN和野生型TS/A細胞皮下植入到nu/nu小鼠中。如所預期，NGR-TNF/阿霉素對TSA-IFN起著顯著的抗腫瘤效果，而對TS/A腫瘤卻沒有這種效果，這充分表明了局部產生的IFN對于NGR-TNF/阿霉素的協同作用是至關重要的。
總而言之，這些結果以及上文提到的結果表明，NGR-TNF/阿霉素的治療效果充分依賴于局部IFN的產生，其可能是由腫瘤浸潤性胸腺依賴性細胞分泌的。
外源性IFN提高NGR-TNF/阿霉素在免疫活性小鼠中的治療效果然后采用長有B16F1腫瘤的C57B16小鼠來評價NGR-TNF和阿霉素與外源性IFN(300ng)組合時的治療活性。所附圖9中所示，這三種物質組合時的抗腫瘤效果比NGR-TNF/阿霉素強。因此，以外源性IFN與NGR-TNF/阿霉素一起給藥，在免疫活性小鼠中也誘導了更強的抗腫瘤效果。
三種物質組合(IFN、NGR-TNF和阿霉素)的作用機理我們在前面已經說明了，NGR-TNF/阿霉素協同作用的重要機理與由NGR-TNF造成的內皮屏障功能的改變以及腫瘤中阿霉素穿透性的提高相關。因此，我們研究了IFN是否對于這種作用是關鍵的。為了這個目的，我們測量了外源性IFN對于阿霉素在TS/A腫瘤中的穿透性的影響(附圖10)。該試驗利用了阿霉素是一種熒光化合物這一事實，從處理后的動物中回收的腫瘤細胞的熒光強度是穿透到腫瘤中的阿霉素的量的一種指征。該試驗在nu/nu鼠中進行以減少內源性IFN的作用。與未處理的對照組相比，當長有腫瘤的小鼠經NGR-TNF處理2小時后，再施以阿霉素，腫瘤細胞中的阿霉素沒有明顯的增加。然而以IFN與NGR-TNF組合給藥時，阿霉素在腫瘤中的穿透性獲得提高。這表示IFN對于TNF誘導的化學治療藥的穿透性來說是至關重要的。
本研究顯示內源性IFN對于NGR-TNF/阿霉素的協同作用是關鍵的，外源性mIFNγ與NGR-mTNF一起在免疫缺陷型及免疫活性小鼠中均誘導了更強的抗腫瘤作用。這一點已經由上述觀察的結果所支持，即a)一種中和抗-IFN的抗體在免疫活性小鼠中顯著地抑制了NGR-TNF/阿霉素的協同作用和b)在缺少IFN基因的小鼠中(IFN-/-小鼠)不出現協同效應。
已知T-和NK-細胞是免疫活性小鼠中IFN的最初來源，并且無胸腺nu/nu小鼠中缺少T-細胞，上述結果充分支持了T-細胞是對于NGR-TNF/阿霉素的協同作用所必需的IFN的主要來源。與該觀點相一致的是，發現外源性或內源性IFN(經IFN cDNA轉染的腫瘤細胞所生產的)在nu/nu小鼠中恢復了NGR-TNF/阿霉素的協同作用。
這些結果均指向IFN對于將NGR-TNF和阿霉素靶向腫瘤血管的重要作用。
IFN與阿霉素組合(沒有NGR-TNF)沒有治療效果，這表示這種細胞因子與NGR-TNF具有協同作用，很少或不與阿霉素協同作用。考慮到化學治療藥物必須穿過血管壁，并遷移跨過間質組織以到達腫瘤細胞，IFN和NGR-TNF的作用位點很可能在血管內皮的內層上。已知的是，TNF可在內皮細胞上誘導細胞骨架肌動蛋白發生改變并誘導形成能導致對大分子穿透性增強的的胞間縫隙。在相同細胞上，TNF能誘導白細胞粘附分子、前炎癥細胞因子、纖維蛋白沉積、一氧化氮生產以及細胞凋零。因此，我們發現與單獨暴露于TNF相比，暴露于TNF和IFN的組合的體外內皮細胞單層對于辣根過氧化物酶的滲透性獲得提高。考慮到TNF和IFN可對內皮細胞施加的不同作用，我們不能排除體內血管通透性的改變也可能是與可影響內皮細胞滲透性的其它重要炎性分子的局部釋放相關的間接作用的結果。
我們的發現還有其它的重要含義。在動物模型中以及患者的幾項研究顯示TNF可以選擇性地影響和損傷腫瘤血管而非與正常組織相關的血管。因此，當以TNF聯合苯丙氨酸氮芥向患者進行隔離肢灌注后，觀察到患者腫瘤而非正常組織的微-和大-血管的大面積地受到破壞。這種選擇性的分子基礎尚不清楚。假設為腫瘤血管的結構差異與/或腫瘤衍生的-“激活因子”的存在可能是TNF-血管選擇性的原因。我們的研究表明了IFN的局部產生可能是其中的敏化因子之一。
上述說明書中所有提到的出版物均并入本文作為參考。在不偏離本發明的范圍和精神下，對于本領域技術人員而言，對本發明所述方法及系統的各種修飾和變化形式是顯而易見的。盡管以某些具體的實施例對本發明進行了描述，但應理解的是，本發明所要求保護的不應被過度地局限于這些具體的實施方式中。事實上，所述的對于本領域技術人員顯而易見的用于對本發明的方法進行各種修飾的形式均確定為包含在權利要求書中。
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序列表<110>Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor<120>用于癌癥治療的經修飾的細胞因子<130>modcyt<140>
<141>
<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCR引物<400>1ctggatcctc acagagcaat gactccaaag 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明PCR引物<400>2tgcctcacat atgctcagat catcttctc 29<210>3<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCR引物<400>3gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc 46<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCR引物<400>4atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg 45
<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCR引物<400>5tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac36<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCR引物<400>6atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 35<210>7<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明PCP引物
<400>7tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc ttttccgctt cttgaggc58
權利要求
1.一種藥物組合物，其含有一種有效量的TNF與CD13受體的配體或編碼該配體的多核苷酸的綴合物以及一種有效量的IFNγ或編碼IFNγ的多核苷酸。
2.根據權利要求1的組合物，其還含有一種藥學上可接受的載體和賦形劑。
3.根據權利要求1或2的組合物，其中所述TNF是TNFα或TNFβ。
4.根據前述任一權利要求的組合物，其中CD13受體的配體選自抗體或其活性片段、肽或肽模擬物。
5.根據權利要求4所述組合物，其中所述配體是一種含有NGR基序的肽。
6.根據權利要求5所述組合物，其中所述肽選自CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環狀的CVLNGRMEC、線性的CNGRC和環狀的CNGRC。
7.根據前述任一權利要求的組合物，其中TNF是用聚乙二醇或一種酰基衍生的。
8.根據前述任一權利要求的組合物，其中TNF進一步與抗體、抗體片段、生物素中的一種化合物綴合，其中所述抗體或其片段針對選自下列組的一種化合物腫瘤抗原、腫瘤血管生成標記或細胞外基質成分。
9.根據權利要求8的組合物，其中TNF與CD13配體以及選自抗體、抗體片段、生物素中的一種化合物綴合。
10.根據前述任一權利要求的組合物，其以可注射溶液或懸浮液或者可灌輸的液體形式存在。
11.根據權利要求1-9中任一項的組合物，其以脂質體形式存在。
12.根據前述任一權利要求的組合物，進一步包括另一種抗腫瘤劑或一種診斷用的腫瘤成像化合物。
13.根據權利要求12的組合物，其中所述的另一種抗腫瘤劑為阿霉素。
14.一種治療或診斷癌癥病人的方法，其包括以前述任一權利要求的藥物組合物給藥。
15.根據權利要求14的方法，其包括另外再以其它抗腫瘤劑或診斷用的腫瘤成像化合物給藥。
全文摘要
能夠定向于腫瘤血管和抗原呈遞細胞的細胞因子衍生物以及其作為抗腫瘤制劑的用途。
文檔編號A61K31/70GK1732016SQ200380107843
公開日2006年2月8日 申請日期2003年11月5日 優先權日2002年11月5日
發明者A·科爾蒂 申請人:圣拉斐爾德爾蒙特塔博基金中心