改進的藥用肉毒桿菌毒素組合物的制作方法

專利名稱：改進的藥用肉毒桿菌毒素組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及改進的藥物組合物，組合物包括肉毒桿菌毒素和螯合劑。發明進一步提供治療多種神經肌肉疾病的藥物組合物和方法。
發明的背景肉毒桿菌毒素是從肉毒梭菌(Clostridium botulinum)前株中分離的毒素，在較高濃度和量是致死的毒素，它用作有價值的治療劑以治療許多神經肌肉疾病(例如張力失常、偏側面肌痙攣、磨牙癥、痙攣狀態、大腦性癱瘓、斜頸)以及感覺障礙和皮膚病(肌筋膜痛、偏頭痛、緊張性頭痛、神經病、多汗癥)。
在本發明之前，從未鑒定白蛋白體內結合肉毒桿菌毒素對基于肉毒桿菌毒素的藥物的臨床效力是重要的。通過增強區域性鰲合神經毒素和促進神經組織上的神經毒素受體的飽和，高濃度白蛋白制劑改善肉毒桿菌毒素的臨床效力并減小副作用如由肉毒桿菌毒素從施用部位擴散引起的副作用。先目前沒有提示通過相對神經毒素增加濃度來改變肉毒桿菌毒素的制劑能提高治療人類疾病的效力。當前臨床實踐可用的現有肉毒桿菌毒素制品是BOTOX、DYSPORT、MYOBLOC。本發明鑒定機制且提供組合物，組合物含效力改善的基于肉毒桿菌毒素的藥物，這是通過增加螯合劑和其它粘性劑的濃度以增強鰲合并改善在其它可用肉毒桿菌毒素制品失敗處的效力。
近年來，Borodic等表征了肉毒桿菌毒素區域性效果，使用肌纖維形態計量法、膽堿脂酶染色和來自面部肌緊張壓抑的皮膚起皺(Borodic(1992))“用于額肌懸帶術后(表現性)瞼下垂矯正過度的肉毒桿菌A毒素”(Botulinum A toxin for(expressionistic)ptosis overcorrection after frontalis sling).OphthalmicPlastic and Reconstrctive Surg.8(2)137-142；全部納入本文供參考)。
由于作為治療劑引入，肉毒桿菌毒素的去神經或生物活性的藥物測量是LD50單位，使用18-22克Swiss-Webster小鼠，通過從純化的肉毒桿菌神經毒素蛋白和其蛋白復合體的不同稀釋度注射小鼠同齡組來統計上定量。此測量的優點是簡單，有清楚的終點確定(活或死小鼠)，然而，LD50單位不預測臨床研究比較中不同肉毒桿菌毒素制劑的臨床特點。例如，一種b型肉毒桿菌毒素(MYOBLOC)的制品需要5,000-15,000LD50單位以治療斜頸，而另一種a型肉毒桿菌毒素(BOTOX)的制品僅需要100-300LD50單位。類似地，LD50單位不能區分不同來源的相同肉毒桿菌毒素免疫類型在治療特點上的差異。例如，與另一種肉毒桿菌a型毒素制品DYSPORT需要200-1200單位相比。需要約50-300單位的BOTOX來治療瞼痙攣和頸張力失常，表1描述了用于不同疾病的可變劑量。
表1不同肉毒桿菌毒素的藥物制劑間的劑量比較

1單位(U)是用20-30g Swiss-Webster小鼠確定的LD50單位，如本文所述。
A.與常規肉毒桿菌毒素制劑相關的并發癥在有效劑量要求外，已在治療量的不同肉毒桿菌制品中注意到并發癥比例的顯著差異。副作用如由肉毒桿菌毒素從施用部位擴散引起的，似乎取決于肉毒桿菌毒素制劑。例如，當用于治療頸張力失常時，吞咽困難比例(困難吞咽)是熟知的肉毒桿菌毒素施用的并發癥(Borodic等，(1990)“用于治療痙攣性斜頸的肉毒桿菌A毒素”(Botulinum A toxin for treatment of spasmodic torticolis)Dysphagia and Regional Toxin Spread Head&Neck，12392-398；全部納入本文供參考)。回顧1984-1995間的現有技術文獻時，很好理解了制劑間此并發癥比例的差異。當比較不同免疫類型和相同免疫類型的不同制品時，報導了瞼下垂癥比例的差異(見表1)。現在公認此并發癥是肉毒桿菌毒素從注射部位擴散的結果，該性質與對特定靶區域的去神經或生物效果的臨床目標相沖突。
表2不同肉毒桿菌毒素的藥物制劑間點擴散相關的并發癥

1Nussgens等，(1997)“比較自發性瞼痙攣治療中的2種肉毒桿菌毒素制品”(Comparasion of two botulinum-toxin preparations in the treatment ofessential blepharospasm)Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 235(4)197-199.
2對吞咽困難和肉毒桿菌臨床研究的Oculinum Meta-分析的3期研究1998-1989(Phase 3 Studies1998-1989 for Oculinum Meta-analysis of clinical studieson Dysphagia and Botulinum 1995，攻NIH(Borodic))。
3Lew等，(1997)“肉毒桿菌毒素b型頸張力失常中的雙盲、安慰劑控制、安全性和功效研究”(Botulinum toxin type Ba double-blind，placebo-controlled，safety and efficacy study in cervical dystonia)Neurology 49(3)701-707。
在1991年，Borodic等論證了組織學模型，證明來自肉毒桿菌毒素點注射的組織化學和形態學的擴散梯度。(Borodic等，(1991)“肉毒桿菌毒素臨床和科學方面”(Botulinum toxinClinical and scientific aspects)OphthalmologyClinics of North America 4491-503；全部納入本文供參考)。進一步證明此梯度在單肌肉帶中是劑量依賴性且能使筋膜平面交叉。在人前額的面部起皺模式中更進一步證明擴散模型(Borodic等，(1992)“用于痙攣性斜頸的肉毒桿菌毒素，多個相對單點注射每肌肉”(Botulinum toxin for spasmodictorticollis，multiple vs.single point injections per muscle)Head and Neck1433-37)。之后，擴散用于解釋表面注射用于人頸的肉毒桿菌注射劑之后吞咽困難的機制和眼周注射以治療自發性瞼痙攣后的瞼下垂制(眼瞼下垂并發癥)。瞼下垂癥是由于神經肌肉阻斷活性從眼瞼邊緣擴散到位于上眼窩間隙的上眼瞼縮肌的肌肉部分。吞咽困難是由于神經肌肉削弱作用從靶向用于治療斜頸的胸乳突肌擴散到產生有效吞咽力的咽周肌肉系統。根據組織學模型和臨床經驗，擴散似乎與以LD50單位給出的毒素量直接相關，即所用LD50單位越高，來自點注射的擴散越大。根據80年代到90年代早期的文獻概述，在有效劑量，用DYSPORT產生的吞咽困難比BOTOX更普遍。最近，根據在歐洲中心完成的研究，確認了吞咽困難比例的差異(Ranoux等，(2002)“DYSPORT和BOTOX的各自效力頸張力失常中的雙盲、隨機、交叉研究”(Respective potencies of DYSPORTand BOTOXa double blind，randomized，crossover study in cervical dystonia)J.NeuroLNeurosurg.Psychia try 72459-462)。比較BOTOqX與DYSPORT時也觀察到治療眼瞼痙攣的瞼下垂癥比例的差異，表明BOTOX發生此并發癥不太普遍。(Nussgens等，(1997)“比較自發性眼瞼痙攣治療中的2種肉毒桿菌毒素制品”(Comparisonof two botulinum-toxin preparations in the treatment of essentialBlepharospasm)Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 235(4)197-199)。與肉毒桿菌a型(BOTOX)相比較，當使用肉毒桿菌毒素b型治療眉間和前額皺紋時報導了瞼下垂癥并發癥的主要差異，(Holck等“比較外眥皺紋治療中的高劑量肉毒桿菌毒素B型與肉毒桿菌A型”(Comparison of High Dose Botulinum Toxin TypeB to Botulinum A in the Treatment of Lateral Canthal Rhytides)美國眼科整形和整復外科醫師學會年會，Anaheim，CA 11-14-03)。
B.鰲合白蛋白起初用于制成以肉毒桿菌毒素為基礎的藥物，因為它在高稀釋度對神經毒素的生物活性有穩定作用(參見Schantz，《肉毒桿菌毒素治療》(BotulinumToxin Therapsy)，Marcel Dekker 1994)。用生理鹽水或水稀釋純化的肉毒桿菌毒素晶體在高稀釋度會引起生物活性和藥物性質喪失。另外，已報導白蛋白有助于阻止神經毒素結合玻璃容器。在BOTOX和任何其它制備用于藥物用途的肉毒桿菌毒素的臨床前開發期間，沒有認識到白蛋白在不同于稀釋穩定劑和賦形劑的制劑中對于阻止神經毒素結合玻璃的重要性。
BOTOX和DYSPORT獲得自梭菌種類的不同菌株。BOTOX獲得自肉毒梭菌的Hall菌株，該菌株最初由威斯康星大學保存，而DYSPORT獲得自英國微生物保藏所。產物間存在免疫交叉反應性，因為2種產物都獲得自免疫類型A菌株。盡管有類似的免疫類型，BOTOX和DYSPORT間的臨床反應可通過各制劑中所用的賦形劑差異解釋。BOTOX與DYSPORT間的人血清白蛋白的濃度差異概括于表3。
表3.不同肉毒桿菌毒素的藥物制劑的人血清白蛋白含量

1白蛋白以mg每100LD50單位的肉毒桿菌毒素表示。存在其它差異，包括存在穩定糖，乳糖用于DYSPORT，而不用于BOTOX。
BOTOX與DYSPORT間的白蛋白差異與多項臨床研究中觀察到的BOTOX與DYSPORT間在劑量要求上的差異幾乎相同。白蛋白比例/臨床效力比例間的相關性通過白蛋白加入小瓶時DYSPORT的藥理學性質變化來進一步加強，使用小鼠偏側膈動物模型。Wohlfahrt等注意到，使用此加入白蛋白到1個DYSPORT小瓶的模型產生的生物活性高于用小鼠偏側膈模型所得生物活性。(Biglalke等，(2001)“肉毒桿菌A毒素DYSPORT改善生物利用度”(Botulinum A toxinDYSPORTimprovement of biological availability).Exp.Neurol.168(1)162-170)。作者提示生物活性增加歸因于穩定性增加，如用白蛋白濃度增加提供的小鼠LD50生物測定所測量(Biglalke等，(2001)“肉毒桿菌A毒素DYSPORT改善生物利用度”，Exp.Neurol.168(1)162-170)。作者解釋LD50生物測定中的白蛋白差異沒有涉及在組織中的作用機制或藥理-藥物動力學的重要性即體內白蛋白結合，可增強鰲合并改善治療效果。相同作者進一步在大鼠隔膜制品中觀察到加入白蛋白到BOTOX制品不能顯著增加區域性去神經作用且不提倡制劑的任何變化。這些研究者的發現斷定白蛋白濃度對LD50測量有效果，然而，工作沒有證明BOTOX對區域性去神經的效力有任何增加或能提高DYSPORT以產生任何大于BOTOX的去神經效力。工作受其實驗的體外性質限制，即使用非血液灌注的動物運動神經(膈神經)和隔膜肌肉解剖不能說明稀釋液和組織液流動能在神經軸末端受體結合前從靶組織沖走注射的毒素。實時應用需要體內分析白蛋白對區域性去神經的效果，如下列實驗所概括。他們的工作未確定造成小鼠致死測定所測量的LD50差異的原因。結論是不能超出現有BOTOX制品改善效能或效力，與本文所得結論直接相反(德國漢諾威國際肉毒桿菌毒素2002年會議)。
效能差異涉及生物效果的擴散和保持在基于肉毒桿菌的藥物的藥理學中是重要的。本文描述改變基于肉毒桿菌的藥物組成的方法，以提高潛能、增加肉毒桿菌毒素鰲合和限制基于肉毒桿菌的藥物的副作用。
發明的概述本發明提供包含肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，用于治療多種神經肌肉疾病和局限性去神經。在一個實施方案中，螯合劑以每100LD50單位肉毒桿菌毒素550到550,000μg螯合劑的量存在。在另一個實施方案中，螯合劑以每100LD50單位肉毒桿菌毒素550到5,500μg螯合劑的量存在。在進一步的一個實施方案中，螯合劑以每100LD50單位肉毒桿菌毒素5,500到13,000μg螯合劑的量存在。在一個較佳實施方案中，螯合劑以每100LD50單位肉毒桿菌毒素13,000到50,500μg螯合劑的量存在。在一個更佳實施方案中，螯合劑以每100LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到505,000μg螯合劑的量存在。在一個最佳實施方案中，螯合劑配制成包囊的微球體，其含量在每100LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到90,500μg螯合劑之間。
在另一個實施方案中，本發明提供包含肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，其中螯合劑以每100LD50單位肉毒桿菌毒素550到900,500μg螯合劑的量存在，其中白蛋白可配制成固體白蛋白顆粒。
本組合物的肉毒桿菌毒素可選自多種肉毒梭菌菌株。在一個較佳實施方案中，本發明的組合物包含選自肉毒桿菌毒素類型A、B、C、D、E、F和G的肉毒桿菌毒素。在一個較佳實施方案中，肉毒桿菌毒素是肉毒桿菌毒素a型。在一個更佳實施方案中，肉毒桿菌毒素是來自肉毒梭菌的Hall菌株的肉毒桿菌毒素a型。
在另一個實施方案中，本發明的組合物包含肉毒桿菌毒素，基本由分級分離的輕鏈(fractionated-light-chain)肉毒桿菌毒素組成。在又另外一個實施方案中，肉毒桿菌毒素基本由肉毒桿菌毒素的雜合體與鏈易位形式的混合物組成。在進一步的一個實施方案中，肉毒桿菌毒素基本由肉毒桿菌毒素的嵌合形式組成。盡管本發明可使用任何肉毒桿菌毒素，保留神經毒性的肉毒桿菌毒素片段、肉毒桿菌毒素嵌合體和雜合體、化學修飾的肉毒桿菌毒素和本領域普通技術人員熟知的特定活性，在一個實施方案中，肉毒桿菌毒素純化到比活大于或等于約20LD50單位每納克肉毒桿菌毒素。
本發明提供肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，其中肉毒桿菌毒素的LD50單位與μg螯合劑的比例對于肉毒桿菌毒素A型是小于或等于約0.2，對于肉毒桿菌毒素B型是小于或等于約10。
除了包含肉毒桿菌毒素和螯合劑外，本發明的各組合物可進一步包含藥學上可接受的載體和/或鋅和/或鋅鹽。在一個實施方案中，肉毒桿菌毒素非共價結合螯合劑。在另一個實施方案中，肉毒桿菌毒素共價結合螯合劑。
本發明提供肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，其中螯合劑選自蛋白、脂類和碳水化合物。在一個較佳實施方案中，螯合劑是白蛋白、膠原、腎上腺素或透明質酸鹽。在一個更佳實施方案中，螯合劑是透明質酸鹽。在一個最佳實施方案中，螯合劑是白蛋白。
本發明進一步提供包含肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，其中螯合劑是白蛋白，優選人血清白蛋白。此外，在一個實施方案中，本組合物的白蛋白是重組產生的。在一個實施方案中，白蛋白以每100LD50單位肉毒桿菌毒素550到5,500μg白蛋白的量存在。在進一步的一個實施方案中，白蛋白以每100LD50單位肉毒桿菌毒素5,500到13,000μg白蛋白的量存在。在一個較佳實施方案中，白蛋白以每100LD50單位肉毒桿菌毒素13,000到50,500μg白蛋白的量存在。在一個更佳實施方案中，白蛋白以每100LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到505,000μg白蛋白的量存在。在一個最佳實施方案中，白蛋白配制成包囊的微球體，其含量在每100LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到90,500μg白蛋白之間。
在本發明的一個實施方案中，組合物包含肉毒桿菌毒素和至少1種螯合劑。在一個較佳實施方案中，本發明組合物包含肉毒桿菌毒素和白蛋白且進一步包含1種或多種另外的螯合劑。
本發明也提供在有此需要的受試者中產生局限性去神經的方法，包括施用有效量的本文所述任何本發明組合物。在一個實施方案中，本發明方法用于在患神經肌肉疾病的受試者中產生去神經，此疾病與有不隨意運動的肌緊張增加相關。在另一個實施方案中，本發明方法用于在患神經肌肉疾病的受試者中產生去神經。神經肌肉疾病的特征優選是肌緊張增加和/或不隨意運動，包括但不限于肌張力失常、脊髓損傷或疾病、多發性硬化、痙攣狀態、大腦性癱瘓、中風等。與肌緊張增加和/或不隨意運動相關的神經肌肉疾病優選是眼瞼痙攣或斜頸。與有不隨意運動的肌緊張增加相關的神經肌肉疾病更優選是眼瞼痙攣。
在一個實施方案中，本發明提供在患眼瞼痙攣的受試者中產生去神經的方法，包括施用10-200LD50單位的本發明組合物，如本文所述。在另一個實施方案中，本發明提供在患斜頸的受試者中產生去神經的方法。本發明組合物的有效量優選在10和3000LD50單位間。
在另一個實施方案中，本發明提供在有此需要的受試者中治療失調的方法，失調選自面部皺紋、皺紋(rhytides)和整容改變(cosmetic alteration)唇和眉毛，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在2.5和400LD50單位間。
在又另外一個實施方案中，本發明提供在有此需要的受試者中治療人頭痛病的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和1000LD50單位間。
在進一步的一個實施方案中，本發明提供在有此需要的受試者中治療人偏頭痛病的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和1,000LD50單位間。
本發明也提供在有此需要的受試者中治療人炎性疾病的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和4,000LD50單位間。
本發明同樣提供在有此需要的受試者中治療肌病性或神經病性疼痛的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和4,000LD50單位間。
本發明也提供在有此需要的受試者中治療背痛或關節痛的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和4,000LD50單位間。
在又另一個實施方案中，本發明提供在有此需要的受試者中治療胃腸痙攣和狹窄的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和4,000LD50單位間。
本發明提供在有此需要的受試者中治療多汗綜合征的方法，包括施用有效量的本發明組合物，如本文所示。有效量優選在5和4,000LD50單位間。
本發明也提供產生本文所述組合物的方法。在一個實施方案中，方法包括混合螯合劑與肉毒桿菌毒素。在另一個實施方案中，方法包括冷凍干燥或急驟干燥螯合劑和肉毒桿菌毒素。肉毒桿菌毒素和螯合劑的重量對重量比例優選超過100μg螯合劑對1mg肉毒桿菌毒素。
本發明也提供使用本文所述任何組合物治療神經肌肉疾病、疼痛、炎性疾病、面部皺紋、皺紋、整容改變唇和眉毛等。本發明同樣提供使用本文所述任何組合物制備藥物以治療神經肌肉疾病、疼痛、炎性疾病、面部皺紋、皺紋、整容改變唇和眉毛等。
發明的詳細描述本發明描述提高臨床使用的肉毒桿菌毒素制品的臨床效力的方法和組合物，通過增加靶向治療的人或哺乳動物身體區域中肉毒桿菌神經毒素分子鰲合的方法，使用螯合劑或“分子錨”。用較高濃度的大分子如蛋白(例如白蛋白、膠原等)和/或脂類和/或多糖(例如透明質酸鹽等)的增強鰲合可用于提供分子錨給神經毒素分子，防止從注射點擴散出去，引起肉毒桿菌神經毒素受體的最大飽和，從而用獲得所需臨床效果的神經毒素量達到較高功效。螯合劑提高區域性去神經的保持，增強臨床結果。鰲合增加允許更好地傳遞到神經末梢，吸收提高并增加去神經和其它生物作用。發明需要加入神經毒素制劑并結合神經毒素的螯合劑，防止神經毒素散布且證明在病人中的臨床反應改善，病人先前沒有用優選濃度的載體分子治療。螯合劑可以是濃度顯著高于以前所用(如人血清白蛋白)的現有賦形劑，或以前未用于穩定肉毒桿菌毒素的物質(如透明質酸鈉)。螯合劑必須結合肉毒桿菌毒素分子且防止它擴散，從而神經毒素可與神經末梢或任何神經結構反應，使治療效果改善。
A.定義如本文所用，“肉毒桿菌毒素”指從肉毒梭菌菌株分離的蛋白毒素和其復合體，包括多種免疫類型如A、B、C1、C2、C3、D、E、F和G。
如本文所用，“有效量”是足以產生治療反應的量。有效量可用開放性標記的臨床試驗中的劑量提高研究或盲法試驗的兩項研究來確定。
如本文所用，術語“神經肌肉疾病”指不利影響神經元件(腦、脊髓、外周神經)或肌肉(橫紋肌或平滑肌)的任何疾病，包括但不限于不隨意運動障礙、張力失常、脊髓損傷或疾病、多發性硬化、痙攣狀態、大腦性癱瘓和中風。
如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”指化學組合物、化合物或溶劑，它們可結合活性成分且結合后能用于施用活性成分給受試者。如本文所用，“藥學上可接受的載體”包括但不限于1種或多種下列賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；粒化劑和分解劑；結合劑；潤滑劑；防腐劑；生理上可降解組合物如明膠；水載體和溶劑；油載體和溶劑；懸浮劑；分散劑或潤濕劑；乳化劑；緩和劑；緩沖液；鹽；增稠劑；填充劑；抗氧化劑；穩定劑、藥學上可接受的聚合或疏水物質和其它本領域已知成分，它們描述于例如Genaro編輯，1985，《雷明頓藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，納入本文供參考。
如本文所用，“螯合劑”指增強肉毒桿菌毒素局部化和/或保持于施用部位的試劑。
如本文所用，“受試者”指哺乳動物。
B.白蛋白內源人血清白蛋白結合天然循環分子，如游離脂肪酸、膽紅素、激素和鋅。另外，循環的人白蛋白能結合許多藥劑，可影響這些試劑的效力、并發癥比例、清除率和其它藥效性質。例子包括水楊酸鹽、磺胺二甲異噁唑、華法林、苯丁唑酮、澤地黃毒苷、苯妥英、苯唑西林、芐青霉素、速尿、吲哚美辛、安定和奎尼丁。也已知肽和蛋白結合人血清白蛋白。也已知肽激素如胃泌素、促腎上腺皮質素、褪黑素結合人血清白蛋白。
鑒定了一些結合位點且認為結合是非共價的。另外，白蛋白能非共價結合陽離子，陽離子用作肉毒桿菌毒素多肽復合體部分的酶反應性的輔因子。鋅特定是肉毒桿菌毒素輕鏈的內肽酶活性的輔因子，它在重鏈結合細胞表面蛋白受體后進入靶細胞。較高的結合白蛋白的鋅量可提高內肽酶活性。鋅結合白蛋白是劑量依賴性。白蛋白上的鋅結合飽和可增強肉毒桿菌毒素的去神經效果。
由于原子質量較大和其它蛋白性質，白蛋白通過淋巴管吸收(而不是血管吸收)從注射區生理上清除，此過程比去除較小的分子種類慢許多。與肉毒桿菌毒素藥物的關聯性涉及通過促進神經接觸來維持生物活性和防止從注射點的游離神經毒素釋放中沖走。有較低白蛋白濃度的DYSPORT提供更少的鰲合給神經毒素復合體，隨后，結果是在注射后從靶解剖區擴散出去。臨床效果是化學去神經的區域性擴散更大，導致并發癥(瞼下垂癥、吞咽困難，見表2)增加。為補償此生物行為，臨床醫生在實踐或研究中不得不用4到5倍神經毒素以達到與較高白蛋白濃度相同程度的生物活性。用不太有效的免疫類型如肉毒桿菌毒素B型(MYOBLOC)，需要較大劑量以獲得相同區域性生物效果，因而發生進一步擴散，并發癥比例增加(見表2)。施用更多肉毒桿菌毒素(較高蛋白負荷)導致重復注射后免疫速度較高(Borodic等，(1996)“肉毒桿菌毒素、免疫學和用現有材料的問題”(BotulinumToxin，Immunology and Problems with Available Materials).Neurology4626-29)。
MYOBLOC在＜6.0的酸性pH配制，提供穩定性增加和液體制劑在室溫的穩定性。不幸的是，酸性pH對結構和攜帶此生物藥物制劑中人血清白蛋白性質的可能組織有不利的副作用。在不同的pH，白蛋白異構化是可觀的，像白蛋白四級構象和物理性質一樣(參見Peters(1996)《關于白蛋白的一切》(All about Albumin)Academic Press，New York；全部納入本文供參考)。物理性質改變(通過肉毒桿菌毒素結合和組織中肉毒桿菌毒素分子釋放動力學的變化)可用于解釋臨床實踐中比較BOTOX和DYSPORT的劑量需求的一些相當大差異。有較高pH、B型制劑，用相等LD50單位可觀察到類似的組織學效果(參見Borodic等，(1993)“肉毒桿菌B毒素作為肉毒桿菌A毒素的選擇對象，一個組織學研究”(Botulinum B Toxinas an Alternative to Botulinum A Toxin，A Histological study)OphthalmicPlastic and Reconstructive Surgery 9(3)182-190)。
盡管其它蛋白(例如明膠、乳白蛋白、溶菌酶)、脂類和碳水化合物可用作有效的螯合劑，包括包囊的白蛋白和固體微球體的白蛋白是優選的蛋白螯合劑，部分是因為它的免疫原性低。
C.鰲合發明者使用鰲合概念來解釋在缺乏玻璃酸酶給予眼周注射時利多卡因的毒性改變(Troll等，(1999)“缺乏玻璃酸酶TM時用4％利多卡因白內障手術之后復視”(Diplopia after cataract surgery using 4％ lidocaine in the absense ofWydaseTM).Clin Anesth.11(7)615-6)。缺乏透明質酸酶時，可注射利多卡因在此情況中的鰲合引起具有收縮瘢痕的眼外肌的肌原纖維的毒性，且損害眼外運動。利多卡因例子表明來自可注射藥物的動力學擴散的鰲合如何能對藥物的基礎藥理學重要。
然而，從未有提示或建議白蛋白能改變區域性去神經效力或提高臨床效果或用于治療不響應BOTOX、DYSPORT或MYOBLOC的病人。本發明提供增強肉毒桿菌毒素藥物的臨床效力的組合物和方法。
如上面的效力部分所指出，鰲合-區域性保持化學去神經-是本發明制劑最重要的性質之一。此性質對提高效力、減小來自擴散的并發癥比例、降低肉毒桿菌毒素抗原性是重要的。需要較高劑量即施用蛋白負荷增加的制品與較高的免疫速度相關(比較79-11原始Oculinum批與當前的BOTOX批，MYOBLOC與BOTOX比較)。鰲合提高允許蛋白負荷更低、擴散更少、靶向治療區內的生物效果增強。此改進組合物的效用通過它在目前所用常規制劑(如BOTOX、MYOBLOC)失敗或產生亞最佳結果時具有的治療效果來證明。
D.肉毒桿菌毒素的高白蛋白制劑的劑量希望產生治療特定疾病所需有效量較低的肉毒桿菌毒素組合物，因為施用肉毒桿菌毒素與發展免疫學抗性相關。因此，此復雜性需要增加劑量(LD50單位較高)以獲得治療有效量的肉毒桿菌毒素。
Hall菌株衍生的肉毒桿菌毒素組合物用20LD50單位/ng毒素和900μg人血清白蛋白對100LD50單位肉毒桿菌毒素(0.11LD50單位/μg白蛋白)的比活配制(USFDA IND 4891)。此新制劑的治療指示是面神經再生異常，有不隨意的聯帶運動性眼瞼痙攣。研究用5到15LD50單位間的肉毒桿菌A型毒素進行，毒素用對LD50含量增加的白蛋白量配制。
表5使用高白蛋白肉毒桿菌毒素組合物肉毒桿菌毒素有效量的減少

先有文獻表明現有的BOTOX制品需要20LD50單位以達到此適應征的有利結果(Borodic等，(1993)“用于異常面神經再生的肉毒桿菌毒素.劑量反應關系”(Botulinum Toxin for aberrant facial nerve regeneration.Dose responserelationships).Plastic and Reconstructive Surgery，(91)61042-1045，1993)。此外，在BOTOX用于治療眼瞼痙攣的100名患者研究的基礎上并使用可比較的LD50劑量(參見來自Allergan Pharmaceuticals，1998的新分批核準研究；全部納入本文供參考)，有20％的瞼下垂癥發生率(擴散并發癥)，與使用肉毒桿菌毒素用于不隨意眼瞼痙攣相關。比較上面所示高白蛋白研究中此并發癥的發生率與BOTOX等價研究(19/00，與0/30比較，P＜0.01，卡方)，似乎高白蛋白A型肉毒桿菌毒素組合物需要更少LD50單位來獲得可接受的治療結果(毒素有效量減少)且與有限的擴散入眼眶中相關，此擴散常導致瞼下垂癥。此并發癥發生率降低表明，肉毒桿菌毒素的鰲合效果通過較高的白蛋白含量增強。
實施例下列實施例用于進一步闡述本發明且不以任何方式限制其范圍。
實施例1治療眼瞼痙攣受試者是52歲女性，有嚴重的雙側不隨意眼瞼痙攣。不隨意運動使她不能勝任和保持有收益的工作。BOTOX通過在5個不同場合注射來施用，沒有產生任何顯著的臨床改善。進行手術以去除眼瞼閉合的牽引肌部分(眼輪匝肌)。沒有觀察到持久的改善。
BOTOX的白蛋白含量通過加入5,000μg人血清白蛋白到BOTOX小瓶(100LD50單位)來改變。所得組合物的白蛋白濃度為2,750μg/cc(0.018LD50/μg白蛋白)。施用60LD50單位的高白蛋白制品產生幾乎完全的癥狀消退。即使用于超過2年的后續施用(4個注射循環)時，高白蛋白濃度在臨床上有效。
實施例2治療偏側面肌痙攣受試者是62歲男性，有雙側偏側面肌痙攣史。用BOTOX的肉毒桿菌毒素治療無效。痙攣損害他天天發揮作用的能力。嘗試在2個不同場合手術減壓面神經。手術都證明對獲得可接受的不隨意面痙攣緩解無效且導致1只耳聾。
BOTOX的白蛋白含量通過加入人血清白蛋白來增加，加入的人血清白蛋白足以達到5,250μg/cc(0.00952LD50/μg白蛋白)的濃度。施用30LD50單位的高白蛋白制品證明高度有效并顯著緩解臨床癥狀。
實施例3治療偏側面肌痙攣受試者是66歲男性，有右側偏側面肌痙攣。盡管他用BOTOX成功治療11年，卻產生了抗性，使進一步的注射無效。用遠點注射的抗性-抗性測試證明缺乏循環抗體。另一種肉毒桿菌毒素制劑MYOBLOC的試驗也對緩解征兆和癥狀無效。
BOTOX的白蛋白含量通過加入人血清白蛋白來增加，加入的人血清白蛋白足以達到5,250μg/cc(0.00952LD50/μg白蛋白)的濃度。施用40LD50單位的高白蛋白制品證明高度有效并顯著緩解臨床癥狀。
實施例4治療良性自發性眼瞼痙攣受試者是72歲大學校長，診斷患良性自發性眼瞼痙攣。先前4次注射標準BOTOX制品未獲得任何顯著改善。受試者尋求可能的手術去除肌肉和神經以削弱眼瞼閉合必需的肌肉。而肉毒桿菌毒素的高白蛋白制品施用給對良性自發性眼瞼痙攣特異的常用注射部位。高白蛋白制品通過加入12,250μg/cc(0.004LD50/μg白蛋白)來產生。當施用常規BOTOX制劑失敗時，施用60LD50單位的高白蛋白制品獲得極好結果。初始施用高白蛋白肉毒桿菌毒素制品3個月后，施用每100LD50單位含25,000μg白蛋白(0.002LD50/μg白蛋白)的40LD50單位高白蛋白制品，產生大于80％的眼瞼痙攣臨床癥狀緩解。
實施例5治療眼瞼痙攣受試者是67歲女性，有對BOTOX注射不響應的眼瞼痙攣。手術去除神經和肌肉不能產生任何對不隨意眼瞼閉合的緩解。
白蛋白加入常規BOTOX制品以產生肉毒桿菌毒素的高白蛋白制品，濃度為50,250μg/cc(0.001LD50/μg白蛋白)。注射50單位的高白蛋白制品產生大于50％的癥狀減少。
實施例6治療眼瞼痙攣受試者是77歲男性，他在重復注射肉毒桿菌毒素后發現快速免疫。注射肉毒桿菌毒素B型的常規制劑沒有減輕眼瞼痙攣。
人血清白蛋白和0.5cc Healon(透明質酸鹽)都加入100LD50單位的肉毒桿菌毒素A型(BOTOX)。產生的高白蛋白制品每100LD50單位包含25,500μg白蛋白(0.005LD50/μg白蛋白)。施用60LD50單位減少臨床觀察到的不隨意眼瞼收縮。
實施例7治療自發性眼瞼痙攣受試者是66歲女性，有自發性眼瞼痙攣。用40到300LD50單位范圍的BOTOX(A型)重復治療沒有產生治療益處。肉毒桿菌毒素B型(MYOBLOC)以10,000LD50單位的劑量在眼周區內施用且也不產生任何緩解。雙側面部神經切除也不產生任何顯著的癥狀緩解。去除眼瞼閉合所需肌肉的另外手術程序也同樣無效。
人血清白蛋白加入100LD50單位的肉毒桿菌毒素A型(BOTOX)。產生的高白蛋白制品每100LD50單位包含12,750μg白蛋白(0.00196LD50/μg白蛋白)。當其它制劑和手術方法失敗時，施用50LD50單位產生3到4個月的癥狀顯著緩解。
實施例8治療嚴重慢性眼瞼痙攣受試者是83歲男性，有嚴重慢性眼瞼痙攣。用治療劑量的常規肉毒桿菌毒素制劑重復治療后，受試者產生瞼下垂癥，這是一種擴散副作用。瞼下垂癥的出現需要較低劑量的肉毒桿菌毒素，使此受試者的治療復雜化。較低劑量證實效果更小。
病人接受肉毒桿菌毒素的高白蛋白制劑，此制劑通過混合25,000μg人血清白蛋白與100LD50單位的BOTOX來產生。高白蛋白制品每cc包含12,750μg白蛋白(0.004LD50/μg白蛋白)。使用高白蛋白制品，施用60-70LD50單位，獲得極好的臨床結果且治療后沒有瞼下垂癥跡象。增加鰲合濃度高許多的肉毒桿菌毒素減少神經毒素擴散到眼窩內的肌肉中。
實施例9治療自發性眼瞼痙攣受試者是67歲的女性，有自發性眼瞼痙攣。受試者用常規肉毒桿菌毒素制劑治療，沒有減輕。此外，這些治療產生瞼下垂癥。
高白蛋白肉毒桿菌毒素組合物(20,000μg白蛋白每cc；0.0025LD50BOTOX/μg白蛋白)施用給受試者，獲得眼瞼痙攣的臨床改善且沒有擴散相關的副作用(瞼下垂癥)。
表4實施例1-9所用白蛋白濃度與其它制劑的比較

給出LD50/mcg白蛋白/cc用于BOTOX、DYSPORT、MYOBLOC用于直接比較實施例10制備肉毒桿菌毒素的高白蛋白組合物通過稀釋純化的肉毒桿菌毒素定量生物效果后，加到凍干物質的白蛋白量足以超過500mg每100LD50。增加的白蛋白結合肉毒桿菌毒素并增強注射的神經毒素的螯合，提供更佳的神經毒素受體的飽和改善的臨床效果。
實施例11制備進一步包含透明質酸鹽的肉毒桿菌毒素的高白蛋白組合物通過稀釋純化的肉毒桿菌毒素定量生物效果后，加到凍干物質的白蛋白量足以超過500μg每100LD50單位。此外，加入進一步增強鰲合的另外螯合劑以防止肉毒桿菌神經毒素從注射部位置擴散出來。這種螯合劑包括但不限于稀釋的透明質酸鈉溶液。增加的白蛋白非共價結合肉毒桿菌毒素并增強鰲合神經毒素的螯合，提供更佳的神經毒素受體的飽和，因而改善臨床效果。
實施例12制備進一步包含膠原的肉毒桿菌毒素的高白蛋白組合物通過稀釋純化的肉毒桿菌毒素定量肉毒桿菌神經毒素的去神經效果后，白蛋白與凍干的肉毒桿菌神經毒素混合，量足以超過每100LD50單位500μg白蛋白。此外，加入進一步增強鰲合的另外螯合劑以防止肉毒桿菌神經毒素從注射區擴散出去。這種試劑可能是動物或人膠原的稀釋混合物。增加的白蛋白非共價結合肉毒桿菌毒素并增強神經毒素的鰲合，提供更佳的神經毒素受體的飽和改善的臨床效果。
實施例13制備包含重組產生的肉毒桿菌毒素-白蛋白融合蛋白的肉毒桿菌毒素的高白蛋白組合物產生肉毒桿菌毒素作為具有白蛋白的融合蛋白，從而產生共價連接肉毒桿菌毒素的白蛋白分子。融合蛋白用小鼠LD50生物測定測試以確定有效量。區域性去神經大鼠瞼下垂癥生物測定和小鼠后肢生物測定可用于確定包含融合蛋白的組合物的有效量。臨床劑量提高研究可能進一步用于確認和改進有效量。
權利要求
1.一種包含肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，其特征在于，所述螯合劑以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素550到550,000μg螯合劑的量存在。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素550到5,500μg螯合劑的量存在。
3.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素5,500到13,000μg螯合劑的量存在。
4.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素13,000到50,500μg螯合劑的量存在。
5.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到505,000μg螯合劑的量存在。
6.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑配制成包囊的微球體，其含量在每100 LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到90,500μg螯合劑之間。
7.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素選自肉毒桿菌毒素類型A、B、C、D、E、F和G。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素是來自Hall菌株肉毒梭菌的肉毒桿菌毒素a型。
9.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素包括分級分離的輕鏈肉毒桿菌毒素。
10.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素基本由分級分離的輕鏈肉毒桿菌毒素組成。
11.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素基本由肉毒桿菌毒素的雜合體與鏈易位形式的混合物組成。
12.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素基本由肉毒桿菌毒素的嵌合形式組成。
13.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素具有比活大于或等于20 LD50單位每納克肉毒桿菌毒素。
14.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素的LD50單位與μg螯合劑的比例對于肉毒桿菌毒素a型是小于或等于0.2。
15.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素的LD50單位與μg螯合劑的比例對于肉毒桿菌毒素b型是小于或等于10。
16.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括藥學上可接受的載體。
17.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素非共價結合螯合劑。
18.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素共價結合螯合劑。
19.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括鋅或鋅鹽。
20.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑是白蛋白。
21.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素550到5,500μg白蛋白的量存在。
22.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素5,500到13,000μg白蛋白的量存在。
23.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素13,000到50,500μg白蛋白的量存在。
24.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到505,000μg白蛋白的量存在。
25.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白配制成包囊的微球體，其含量在每100 LD50單位肉毒桿菌毒素50,500到90,500μg白蛋白之間。
26.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白配制成固體白蛋白顆粒。
27.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述白蛋白是重組產生的。
28.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述所述組合物進一步包含1種或多種另外的螯合劑。
29.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑選自蛋白、脂類和碳水化合物。
30.如權利要求29所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑是膠原。
31.如權利要求29所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑是透明質酸鹽。
32.如權利要求29所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑是腎上腺素。
33.一種在有此需要的受試者中局限性去神經的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述受試者患神經肌肉疾病，此疾病與肌緊張增加或不隨意運動相關。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，與有不隨意運動的肌緊張增加相關的神經肌肉疾病是眼瞼痙攣或斜頸。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，與有不隨意運動的肌緊張增加相關的神經肌肉疾病是眼瞼痙攣。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述有效量在10-200 LD50單位間。
38.如權利要求35所述的方法，其特征在于，與有不隨意運動的肌緊張增加相關的神經肌肉疾病是斜頸。
39.如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述有效量在10-3000 LD50單位間。
40.一種在有此需要的受試者中治療失調的方法，所述失調選自面部皺紋、皺紋和整容改變唇和眉毛，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述有效量在2.5和400 LD50單位間。
42.一種在有此需要的受試者中治療人頭痛病的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
43.如權利要求42所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和1000 LD50單位間。
44.一種在有此需要的受試者中治療人偏頭痛病的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和1,000 LD50單位間。
46.一種在有此需要的受試者中治療人炎性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
47.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和4,000 LD50單位間。
48.一種在有此需要的受試者中治療肌病性或神經病性疼痛的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
49.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和4,000 LD50單位間。
50.一種在有此需要的受試者中治療背痛或關節痛的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
51.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和4,000 LD50單位間。
52.一種在有此需要的受試者中治療胃腸痙攣和狹窄的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
53.如權利要求52所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和4,000 LD50單位間。
54.一種在有此需要的受試者中治療多汗綜合征的方法，其特征在于，所述方法包括施用有效量的權利要求1所述的組合物。
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述有效量在5和4,000 LD50單位間。
56.一種產生如權利要求1所述的組合物的方法，其特征在于，所述方法包括混合白蛋白與肉毒桿菌毒素，其重量對重量比例超過100μg白蛋白對1ng肉毒桿菌毒素。
57.一種產生如權利要求1所述的組合物的方法，所述其特征在于，所述方法包括冷凍干燥或急驟干燥肉毒桿菌毒素與白蛋白的混合物，其重量對重量比例為100μg白蛋白對1ng肉毒桿菌毒素。
58.一種產生如權利要求1所述的組合物的方法，其特征在于，所述方法包括冷凍肉毒桿菌毒素與白蛋白的混合物，其重量對重量比例為100μg對1ng肉毒桿菌毒素。
59.一種包含肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，其特征在于，所述螯合劑以每100 LD50單位肉毒桿菌毒素550到900,500μg螯合劑的量存在。
60.如權利要求59所述的組合物，其特征在于，白蛋白配制成固體白蛋白顆粒。
全文摘要
肉毒桿菌毒素是熟知的全身性毒物，通過區域性附著肌神經接點內的神經和特定組織的靶區域中可能的其它組織來產生有利的治療效果。本發明提供含肉毒桿菌毒素和螯合劑的組合物，與可利用的肉毒桿菌毒素制劑相比，螯合劑增加肉毒桿菌毒素的鰲合和傳遞到神經組織及關聯組織，從而產生有益的臨床效果。本發明的螯合劑包括蛋白、脂類和碳水化合物。本發明優選的組合物包含肉毒桿菌毒素和白蛋白。本發明也提供治療神經肌肉疾病和疼痛的方法，使用公開的組合物和制成公開的組合物的方法。
文檔編號A61K47/42GK1729011SQ200380106796
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月22日 優先權日2002年12月20日
發明者G·E·博羅迪克 申請人:肉毒素研究同仁股份有限公司