具有含肽涂層的生物醫學裝置的制作方法

專利名稱：具有含肽涂層的生物醫學裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及涂有肽的醫學裝置和給醫學裝置涂肽的方法。更具體地，本發明提供了在其表面形成了穩定的抗微生物肽涂層的醫學裝置，該涂層是通過所述抗微生物肽的親核部分與醫學裝置表面中的潛在羧酸基團進行反應、由此形成酯和/或酰胺鍵形成的。
背景技術：
用于人體內和人體上的裝置是眾所周知的。這樣的裝置表面的化學組成在決定裝置的總體功效方面起關鍵作用。這些裝置中，已經用涂層來增強理想的性質。在一個實例中，許多裝置(包括導管、支架、透鏡和植入物)需要生物學不污的表面，即細菌、蛋白、脂類和細胞不會粘附到表面。涂層會賦予醫學裝置這些特征。在另一個實例中，給這樣的裝置涂布抗微生物表面，可以減少與微生物有關的感染，也是有利的。
已經開發了眾多方法來涂布裝置表面，以給它們提供理想的特征。但是，仍然需要能提供穩定涂層的簡單、有效的方法。
發明詳述和優選實施方案本發明提供了生產具有穩定的表面抗微生物肽涂層的裝置的簡單的、經濟的方法。“抗微生物的”是指，粘附在裝置表面上的細菌比未涂布的表面減少了約30％或更多。“生物活性的”是指，表面能在使用過程中為周圍環境提供有益的性質。合適的生物活性劑，特別對于隱形眼鏡而言，包括肽，所述肽為但不限于下述的肽親水肽、抗微生物肽、陽離子肽、陰離子肽等。
本發明提供了生產生物醫學裝置的方法，其包括下述步驟、基本由下述步驟組成和由下述步驟組成固化(curing)包含至少一種潛在的羧酸活性組分的活性單體混合物，固化所述的活性單體混合物，形成制品，在涂布條件下，使所述的制品與包含親核部分的抗微生物肽涂層組合物反應，形成有涂層的制品。在另一個實施方案中，本發明提供了生物醫學裝置，其包括下述內容、基本由下述內容組成和由下述內容組成涂肽的生物醫學裝置。
“生物醫學裝置”是指設計為在人組織或液體或兩者的內部或表面使用的任何裝置。這樣的裝置的實例包括但不限于支架、植入物、導管和眼科透鏡。在一個優選的實施方案中，生物醫學裝置是眼科透鏡，包括但不限于隱形眼鏡或眼內透鏡。更優選地，裝置是隱形眼鏡。
本發明意外地發現，羧酸酯官能團可以容易地整合進多種聚合物制品中，并隨后與肽等涂層組分中的親核部分反應。本發明的方法提供了使多種肽涂層共價地結合到成形的聚合物制品上的方便的方法。本發明的肽涂層是穩定的，且能提供理想的性質強化。“穩定的”是指，對涂層進行高壓滅菌、用清潔劑洗滌和/或用鹽水溶液沖洗，基本上不會改變該生物醫學裝置或涂層的化學性質。
本發明使用的潛在的活性組分包括但不限于式R-CO-L的酯化合物，其中，R包含能進行陽離子聚合、陰離子聚合或自由基聚合的基團，L是離去基團。合適的R基團包括包含至多20個碳原子的能進行自由基和/或陽離子聚合的單價基團。優選的R基團包括自由基反應基團，例如丙烯酸酯、苯乙烯基、乙烯基、乙烯基醚、C1-6烷基丙烯酸酯、丙烯酰胺、C1-6烷基丙烯酰胺、N-乙烯基內酰胺、N-乙烯基酰胺、C2-12鏈烯基、C2-12鏈烯基苯基、C2-12鏈烯基萘基、或C2-6鏈烯基苯基C1-6烷基，或陽離子反應基團，例如乙烯基醚或環氧基和其混合物。特別優選的R基團包括甲基丙烯酸酯、丙烯酰氧(acryloxy)、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺和其混合物。
合適的L在反應條件下是穩定的，且能保護羧酸酯基團，并能在涂布條件下容易地離去。合適的L基團包括烷基酯、苯酯、羥基對硝基芳基、對硝基苯酯、N-羥基胺衍生物和甲苯磺酸酯，它們都可以是取代的或未取代的。優選的L基團包括叔丁酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基-氧代二氫苯并三嗪衍生物、1-羥基苯并三唑酯、甲苯磺酸酯和其組合。優選的合適的L基團包括五氟苯酯、甲苯磺酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺酯和其混合物。優選的潛在的活性化合物包括五氟甲基丙烯酸酯和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺和其混合物等。
潛在的活性組分以涂布有效量包含在單體混合物中。足以為涂層聚合物提供理想水平的結合位點的任何量都是足夠的。合適的量包括約0.01至10重量％、優選約0.01至5重量％、更優選約0.01至1重量％，都基于活性組分的總重量。
潛在的活性組分可以加入到任意的透鏡材料中，但是對于不含有羧酸基團的透鏡材料是特別有用的。合適的透鏡材料包括硅水凝膠(silicone hydrogel)。用于制備硅水凝膠的活性組分是已知的，包括含有聚硅氧烷的組分、親水組分和任選的含氟組分。合適的含有聚硅氧烷的組分包括含有聚硅氧烷的單體、預聚物和大分子單體。合適的含氟組分包括含氟單體、預聚物和大分子單體。
合適的含有硅氧烷的單體包括3-甲基丙烯酰氧-2-羥丙基氧)丙基三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(SiGMA)、3-甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(TRIS)、美國專利4,711,943所述的TRIS的酰胺類似物、美國專利5,070,215所述的氨基甲酸乙烯基酯或碳酸乙烯基酯類似物和美國專利6,020,445中的單體，它們在這里引作參考。更具體地，3-甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(TRIS)、單甲基丙烯酰氧丙基封端的聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、3-甲基丙烯酰氧丙基二(三甲基甲硅烷氧基)甲基硅烷、甲基丙烯酰氧丙基五甲基二硅氧烷和其組合是特別有用的含有硅氧烷的單體。
合適的含有硅氧烷的大分子單體的數均分子量為約5,000至約15,000道爾頓。含有硅氧烷的大分子單體包括含有至少一個硅氧烷基、優選至少一個二烷基硅氧烷基、更優選至少一個二甲基硅氧烷基的材料。含有硅氧烷的大分子單體可以包括其它組分，例如氨基甲酸乙酯基團、亞烷基或烯化氧基團、聚氧化烯(polyoxyalkalene)基團、亞芳基、烷基酯、酰胺基、氨基甲酸酯基團、全氟烷氧基、異氰酸酯基團、其組合等。通過一種或多種硅氧烷與一種或多種丙烯酸或甲基丙烯酸材料的聚合，可以形成優選種類的含有硅氧烷的大分子單體。通過基團轉移聚合(“GTP”)、自由基聚合、縮合反應等，可以形成含有硅氧烷的大分子單體。根據選擇的組分，使用本領域已知的條件，可以在一步或一系列的步驟中形成含有硅氧烷的大分子單體。具體的含有硅氧烷的大分子單體和它們的生產方法包括US5,760,100中公開的材料A-D(甲基丙烯酸酯官能化的聚硅氧烷-氟醚代氨基甲酸乙酯和甲基丙烯酸酯官能化的聚硅氧烷氨基甲酸乙酯)和US6,367,929中公開的那些(羥基官能甲基丙烯酸酯和聚硅氧烷甲基丙烯酸酯的苯乙烯官能化的預聚物)，其公開內容在這里引作參考。
合適的含有硅氧烷的活性預聚物包括氨基甲酸乙烯基酯官能化的聚二甲基硅氧烷，其還公開在US5,070,215中，和基于氨基甲酸乙酯的預聚物，其包含交替的短鏈二醇和二異氰酸酯反應形成的“硬”段和從相對高分子量的聚合物形成的“軟”段，所述聚合物用2個活性氫進行α、ω封端。合適的含有硅氧烷的預聚物和它們的生產方法的具體實例公開在US5,034,461中，其在這里引作參考。
通常，含有硅氧烷的組分的量為約5至約50重量％、優選約10至約50重量％、更優選約15至約45重量％，都基于活性組分的總重量。
合適的含氟單體包括含氟的(甲基)丙烯酸酯，更具體地包括例如(甲基)丙烯酸的含氟的C2-C12烷基酯，例如(甲基)丙烯酸2，2，2-三氟乙基酯、(甲基)丙烯酸2，2，2，2′，2′，2′-六氟異丙基酯、(甲基)丙烯酸2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基酯、(甲基)丙烯酸2，2，3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十五氟辛基酯、(甲基)丙烯酸2，2，3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9-十六氟壬基酯等。含氟大分子單體和活性預聚物包括大分子單體和預聚物，其包括所述的含氟單體。含氟組分的量可以為約0至約10重量％。
本發明的活性組分還可以包含用于制備常規水凝膠的任意的親水單體。例如，可以使用含有丙烯酸基團(CH2＝CRCOX，其中R是氫或C1-6烷基，X是O或N)或乙烯基(-C＝CH2)的單體。其它的親水單體的實例是N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-羥乙基酯、單甲基丙烯酸甘油酯、2-羥乙基甲基丙烯酰胺、單甲基丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基-N-甲基乙酰胺、N-乙烯基-N-乙基乙酰胺、N-乙烯基-N-乙基甲酰胺、N-乙烯基甲酰胺和其組合。
除了上述的親水單體外，可以使用聚氧乙烯多元醇，其有一個或多個末端羥基取代為含有可聚合的雙鍵的官能團。實例包括如US5,484,863公開的聚乙二醇，如US5,690,953、US5,304,584公開的乙氧基化的烷基葡糖苷，和如US5,565,539公開的乙氧基化的雙酚A，它們與一或多摩爾當量的封端基團反應，所述封端基團例如異氰酸乙酯基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、乙烯基苯甲酰氯等，生成具有一個或多個末端可聚合的烯基(olefinic group)的聚乙烯多元醇，所述的烯基通過連接部分(例如氨基甲酸酯、脲或酯基團)與聚乙烯多元醇結合。
其它的實例包括美國專利號5,070,215公開的親水的碳酸乙烯基酯或氨基甲酸酯乙烯基單體、美國專利號4,910,277公開的親水的噁唑酮單體和聚葡聚糖(polydextran)。
優選的其它的親水單體是N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)、甲基丙烯酸2-羥乙基酯(HEMA)、甲基丙烯酸甘油酯、2-羥乙基甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、單甲基丙烯酸聚乙二醇酯和其組合，包含DMA的親水單體是特別優選的。其它的親水單體的量可以為約0至約70重量％、更優選約5和約60重量％、最優選約10和約50重量％，基于活性組分的總重量。
活性組分還可以含有其它的組分，例如交聯劑、光敏引發劑、可見性著色劑等。在存在稀釋劑的情況下，將活性組分混合在一起，形成反應混合物。合適的稀釋劑公開在US 6,020,455中。
本領域通常已知的其它組分或添加劑也可以包含在活性單體混合物和/或透鏡材料中。添加劑包括但不限于能吸收紫外線線的化合物和單體、活性顏料(tint)、抗微生物化合物、色素、光致變色化合物、脫模劑、其組合等。
合適的透鏡材料包括aquafilcon A，balafilcon A，lotrafilcon A等。
已知多種在隱形眼鏡的生產中使反應混合物成型的方法，包括旋轉鑄造(spincasting)和靜態澆鑄(static casting)。旋轉鑄造方法公開在美國專利號3,408,429和3,660,545中，靜態澆鑄方法公開在美國專利號4,113,224和4,197,266中。生產含有本發明的聚合物的隱形眼鏡的優選方法是通過硅水凝膠的直接成型，該方法是經濟的，且能對水合的透鏡的最終形狀進行精確控制。為此方法，將反應混合物置于具有最終需要的硅水凝膠(即水溶漲聚合物)的形狀的模具中，使反應混合物處于能使單體聚合的條件中，從而生產出具有最終需要的產品的近似形狀的聚合物。然后，任選地用溶劑、且再用水處理該聚合物混合物，生產出具有最終大小和形狀的硅水凝膠，其與原始模制的聚合物制品的大小和形狀非常相似。該方法可以用于形成隱形眼鏡，且還記載在美國專利號4,495,313；4,680,336；4,889,664和5,039,459中，其在這里引作參考。
已經形成生物醫學裝置后，使其與含肽涂層反應。為了進行涂布，可以使用任意的能與羧酸酯反應、形成酯或酰胺的肽化合物。合適的含肽涂層含有一個或多個親核部分，例如醇、伯胺和仲胺和硫醇官能團。這些含肽涂層包含含有這些官能團的肽、其混合物等。合適的肽包括含有胺、醇和/或硫醇官能團的天然肽和合成肽。在本發明的最廣泛的實施方案中，選擇的肽的序列不是關鍵的，只要該肽包含一個或多個上述的官能團，該官能團能根據本發明的方法進行附著。合適的天然的陽離子肽的實例包括防衛素、爪蟾抗微生物肽和大腸菌素，具體的實例包括魚精蛋白、蜂毒肽、殺菌肽A和乳鏈菌肽。魚精蛋白分離自多種動物(包括但不限于人)的精子。蜂毒肽分離自蜂毒。殺菌肽A和乳鏈菌肽分別分離自埃及伊蚊(Aedes aegypti)和乳酸乳球菌(Lactoccucus lactis)。在本發明中使用的魚精蛋白、蜂毒肽、殺菌肽A和乳鏈菌肽都是市購的。這些陽離子肽和蛋白還可以通過已知的方法生產。為了本發明的目的，使用的陽離子肽的純度通常是至少約75％、優選至少約90％。
或者，可以使用合成的肽和蛋白。具體的實例包括合成的肽，其包含蜂毒肽(mellitin)的15-26段，段ATLISWIKNKRKQ和魚精蛋白的1-17段，段BRPRVSRRRRRRGGRRRR它們存在于肽中的任意位置。肽還可以包含第三段C，其可以是任意的連接基團，其不會在哺乳動物細胞中抑制肽的活性、或誘導毒性，且其包含0至約10個氨基酸的間隔區。如本文所定義的“氨基酸”是指具有化學式-HN-(CR1R2)n-CO-的任意結構，其中，n是1至21的整數，R1和R2獨立地選自H、直鏈的或分支的具有1-4個碳原子的烷基、直鏈的或分支的具有1-2個碳原子的羥基、直鏈的或分支的具有1-3個碳原子的烷硫基基團、具有1-3個碳原子的氨基甲酰基、具有1-3個碳原子的羧基、具有1-4碳原子和1-3個氮原子的伯氨基和仲氨基、芐基、苯酚、苯基吲哚和N，N-吡咯。優選地，n是1至10的整數，且R1和R2中的至少一個是H，另一個選自上述的基團。合成肽的A、B和C段可以是任意的次序，且可以部分地或全部地重復。在一個優選的實施方案中，A和B段是在末端位置，且在另一個優選的實施方案中，合成肽具有式ACB或BCA，且C包含至多5個氨基酸。
本發明還包括這樣的肽，其是本文列舉的那些的肽的保守變異。如本文使用的術語“保守變異”是指這樣的多肽，其中至少一個氨基酸被替換為另一個生物上類似的殘基。保守變異的實例包括一個疏水殘基，例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個，或者一個極性殘基取代另一個，例如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。可以取代另一種的中性親水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸。
如本文所使用的，術語“肽”是指多肽的基本化學結構，其是本領域熟知的，且已經記載在本領域的教科書和其它出版物中。在該背景下，本文使用的術語是指任意的含有2個或多個通過肽鍵成直鏈地彼此連接的氨基酸的肽或蛋白。如本文所使用的，該術語是指短鏈，其在本領域中通常也稱作例如肽、寡肽和寡聚體，也指長鏈，其在本領域中通常也稱作蛋白，它們存在許多類型。應當指出，多肽經常含有20個氨基酸(通常稱作20個天然氨基酸)以外的氨基酸，且可以修飾特定多肽中的許多氨基酸，包括末端氨基酸，所述修飾通過天然方法，例如加工和其它的翻譯后修飾，還通過本領域熟知的化學修飾技術。盡管在多肽中天然產生的常見修飾多得在本文中難以窮盡列舉，但是它們已經詳細地記載在基礎文獻、更詳細的專論和眾多的研究文獻中，它們是本領域的技術人員熟知的。在已知的可以存在于本發明的多肽中的修飾中，解釋性地舉幾個例子乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價附著，血紅素部分的共價附著，核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著，脂類或脂類衍生物的共價附著，磷脂酰肌醇的共價附著，交聯，環化，二硫鍵形成，脫甲基化，共價交聯物的形成，胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧基化，糖基化，GPI錨形成，羥基化，碘化，甲基化，肉豆蔻化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊二烯基化，外消旋化，硒酰化(selenoylation)，硫酸鹽化，轉運-RNA介導的氨基酸向蛋白的添加，例如精氨酰化和遍在蛋白化。這些修飾是本領域的技術人員熟知的，且已經詳細地記載在科學文獻中。幾種特別常見的修飾，例如糖基化、脂類附著、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化和ADP-核糖基化，已經記載在最基礎的文獻中，例如PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)。可以得到許多關于該主題的詳細的綜述，例如Wold，F.，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives和Prospects，pgs.1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter等，(1990)，Meth.Enzymol.182，626-646和Rattan等，“Protein SynthesisPosttranslationalModifications and Aging”，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.663，48-62。應當理解，正如眾所周知的和上面指出的，多肽不總是完全線性的。例如，翻譯后的事件可以導致多肽(線性的和非線性的)的產生，包括天然的加工事件，以及通過不會天然發生的人工操縱發生的事件。另外，通過非翻譯的天然方法和完全的合成方法，可以合成環狀的、分支的和分支的環狀多肽。修飾可以發生于多肽的任意位置，包括肽主鏈、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。實際上，在天然的和合成的多肽中，經常發生通過共價修飾對多肽的氨基或羧基或二者的封閉，這樣的修飾也可以存在于本發明的多肽中。例如，在蛋白水解處理之前，在大腸桿菌(E.coli)或其它細胞中制備的多肽的氨基末端殘基幾乎總是N-甲酰甲硫氨酸。在肽的翻譯后修飾過程中，可以刪除NH2-末端處的甲硫氨酸殘基。因此，本發明預期含有甲硫氨酸的和缺少甲硫氨酸的本發明蛋白的氨基末端變體的用途。在多肽中產生的修飾一般由其如何制備決定。例如，對于通過在宿主中表達克隆的基因制備的多肽，修飾的性質和程度大部分由宿主細胞的翻譯后修飾能力和存在于多肽氨基酸序列中的修飾信號決定。例如，如眾所周知的，糖基化一般不會發生在細菌宿主中，例如大腸桿菌。因此，當需要糖基化時，應當在糖基化宿主(通常是真核細胞)中表達多肽。昆蟲細胞通常能進行與哺乳動物細胞相同的翻譯后糖基化作用，鑒于該原因，已經開發了昆蟲細胞表達系統，以有效地表達尤其具有糖基化自然模式的哺乳動物蛋白。類似的觀點也適用于其它的修飾。應當理解，相同種類的修飾可以以相同的或不同的程度存在于特定的多肽中的幾個位點。同樣，特定的多肽可以含有許多種類的修飾。通常，如本文所使用的，術語多肽包括所有的這樣的修飾，特別是存在于通過在宿主細胞中表達多核苷酸重組地合成的多肽中的那些修飾。
如本文所使用的“Melimine”是指包含下述氨基酸序列的多肽T-L-I-S-W-I-K-N-K-R-K-Q-R-P-R-V-S-R-R-R-R-R-R-G-G-R-R-R-R其中T是蘇氨酸，L是亮氨酸，I是異亮氨酸，S是絲氨酸，W是色氨酸，K是賴氨酸，N是天冬酰胺，R是精氨酸，Q是谷氨酰胺，P是脯氨酸，V是纈氨酸，G是甘氨酸。如本文所使用的，L-melimine包含自然存在的上述氨基酸序列。氨基酸的旋光異構體會發生自發的非酶促的外消旋化。每種氨基酸的速度隨給定的溫度或pH(保藏條件)而異，但是D異構體比L異構體更快。如本文所使用的L-或D-肽可以包含約99％的L或D異構體，分別在pH7和溫度約25℃。
L-氨基酸是生物系統中的天然形式，因此D-異構體對酶促分解更有抗性，且可以具有提高的持久性。可以開發該性質，使用立體異構體的混合物生成理想水平的活性和壽命，用于特定的應用。所以，對于需要長期持久性的應用，優選使用具有優勢(大于約50％、優選大于約70％)的D異構體的立體異構體的混合物。當需要更大的抗菌活性時，優選使用具有優勢(大于約50％、優選大于約70％)的L異構體的立體異構體的混合物。
如本文所使用的“Protattin”是指包含下述氨基酸序列的多肽R-P-R-V-S-R-R-R-R-R-R-G-G-R-R-R-R-T-L-I-S-W-I-K-N-K-R-K-Q其中，氨基酸如上文定義。
為了本發明的目的，使用的陽離子肽通常是基本上純的。
如本文所使用的，術語“基本上純的”是指蛋白或其生物活性部分基本上不含有來自細胞或組織源(該蛋白源自它)的細胞材料或其它的污染蛋白，或者當化學合成時，基本上不含有化學前體或其它的化學制劑。表述“基本上不含有細胞材料”包括其中的蛋白是從細胞(從中分離或重組生產蛋白)的細胞組分中分離出來的蛋白制品。因此，基本上不含有細胞材料的蛋白包括具有低于約30％、20％、10％或5％(以干重計)的異源蛋白(在本文中也稱作“污染蛋白”)的蛋白制品。當重組生產蛋白或其生物活性部分時，其還優選地基本上不含有培養基，即培養基低于約20％、10％或5％體積的蛋白制品。當化學生產合成蛋白時，其優選地基本上不含有化學前體或其它化學制劑，即其是從蛋白合成所涉及的化學前體或其它化學制劑中分離出來的。因此，這樣的蛋白制品具有低于約30％、20％、10％或5％(以干重計)的目標多肽以外的化學前體或其它化學制劑。
使用標準的肽合成技術，可以化學合成本發明的肽。或者，可以在體外翻譯和/或轉錄系統中合成本發明的肽。
使用常規的固相肽合成技術，可以合成多肽。這樣的方法是本領域的技術人員熟知的。下面描述了使用固相合成技術制備多肽的方法，但是不以任意方式將本發明的范圍限制為該方法。合成可以在任意的合適的合成樹脂上進行。合適的樹脂包括可溶的交聯聚苯乙烯樹脂等。一般使用芴基甲氧基羰基等保護氨基酸，并用N-羥基苯并三唑和任選的二異丙基碳二亞胺(DIC)活化，以促進它們的偶聯。使用(但不限于)三氟乙酸或氨，將完成的肽從樹脂上切割下來，并通過反相高效液相層析(HPLC)純化得到的材料，此后，將候選材料從水/乙腈混合物中凍干成干燥粉末。
還可以使用體外翻譯和/或轉錄系統生產本發明的多肽。這樣的方法是本領域的技術人員熟知的。例如，合成的能編碼Melimine或Protattin的mRNA可以在各種無細胞的系統中有效地翻譯，所述系統包括但不限于麥胚抽提物和網織紅細胞提取物。或者，合成的包含處于T7啟動子控制下的Melimine或Protattin的編碼序列的DNA可以在體外轉錄和翻譯系統中有效地轉錄和翻譯，所述系統例如TNT T7偶聯的網織紅細胞裂解物系統，其商購自Promega。可以通過本文所述的方法純化得到的多肽。優選的含肽涂層聚合物包括melimine、protattin和其組合。
在本發明的方法中，要涂布的表面與涂層肽以任意的方便的方式接觸。例如，可以將裝置置于涂層肽、溶劑和偶聯添加劑的溶液中。
在本發明中使用的合適的溶劑是非親核的溶劑，其能溶解涂層肽，且不與生物醫學裝置消極地反應。合適的溶劑包括但不限于DMF、DMSO、乙酸乙酯、DPMA、其混合物等。優選的溶劑包括DMF和DPMA。
裝置在適于形成涂層的條件下與溶劑/涂層肽溶液接觸。合適的溫度包括在選擇的溶劑的凝固點和沸點之間、優選約0至約100℃、更優選約20至約50℃的溫度。使用的接觸時間是足以將表面涂布到理想的程度的時間長度。接觸時間可以至多約2天、優選至多約1天、最優選至多約12小時。在本發明的涂布反應中，壓力不是至關重要的。但是，本領域的技術人員能夠認識到，高壓和高溫會使要進行的反應需要更短的時間。
偶聯添加劑是能使裝置和要形成的肽涂層之間的酰胺和/或酯鍵比沒有它們的加入時更容易形成的任意化合物，其包括但不限于酯交換試劑、其催化劑等。實例包括4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，1，3-二異丙基碳二亞胺，1，3-二環己基碳二亞胺，1-羥基苯并三唑(HOBt)，1-羥基苯并三唑水合物，冠醚，酸，堿，酶，其組合等。
使用了涂布有效量的涂層肽，是指足以將表面涂布到需要的程度的量。通常，使用的涂層肽的量是約0.1至約20重量％、優選約0.5至約10重量％、更優選約0.8至約5重量％涂層溶液。
接觸后，可以用水或緩沖鹽水溶液洗滌表面，以除去無關的(或未反應的)肽、離去基團、溶劑和副產物。任選地，可以將涂肽的表面在水中加熱，以提取殘余的肽、離去基團和副產物，以確保可能形成的離去基團復合物的分解。
參考下面的非限制性的實施例，可以進一步闡明本發明。在實施例中使用了下面的實驗。
使用Perkin-Elmer Spectram GX FTIR AutoIMAGE系統，用FTIR-ATR行掃描技術分析了透鏡的涂層。在透鏡的中央區域，以300微米的遞增步驟從一邊到另一邊進行了所有的行掃描。所有的樣品都在濕狀態進行了分析。
如下所述檢測了前進接觸角。通過從透鏡切出寬約5mm的中央帶、并在填充溶液中平衡，制備了來自每組的至少3個樣品。當樣品浸入或拉出鹽水時，使用Wilhelmy微量天平，在23℃測量了透鏡表面和硼酸鹽緩沖鹽水之間的潤濕力。使用了下面的方程F＝2γpcosθ或θ＝cos-1(F/2γp)其中，F是潤濕力，γ是探測液體的表面張力，p是彎液面處樣品的周長，且θ是接觸角。從潤濕實驗的一部分得到了前進接觸角，其中樣品浸入在填充溶液中。每個樣品循環4次，取結果的平均值，得到了透鏡的前進接觸角。
通過如下步驟測量了混濁度(haze)在平黑背景以上在環境溫度，將水合的實驗透鏡置于裝在透明的20×40×10mm玻璃測定池中的硼酸鹽緩沖鹽水中，用纖維光學燈(Titna Tool Supply Co.，在4-5.4的功率設定具有的0.5”直徑光控制裝置的纖維光學光)從下面沿透鏡測定池法線方向66°角照射，并用置于透鏡平臺以上14mm處的攝影機(DVC 1300C19130 RGB攝像機，具有Navitar TV Zoom 7000變焦距透鏡)，捕獲上面的與透鏡測定池垂直的透鏡的圖像。通過使用EPIX XCAP V 1.0軟件減去空白測定池的圖像，從透鏡的散射中減去背景散射。通過在透鏡中央的10mm上積分，然后與-1.00屈光度的CSI Thin Lens(它任意地設定為100混濁度值，沒有透鏡設定為0混濁度值)對比，定量地分析了減去的散射的光圖像。分析了5個透鏡，取結果的平均值，產生作為標準CSI透鏡的百分比的混濁度值。
如下所述檢測了水含量將要測試的透鏡置于填充溶液中24小時。使用末端包有海綿的棉拭，從填充溶液中取出3個實驗透鏡中的每一個，并置于已經用填充溶液潤濕的吸水擦上。透鏡的兩側與擦子接觸。使用鑷子，將實驗透鏡置于稱量盤上并稱重。如上所述制備了超過2組樣品，并稱重。將盤稱重3次，取平均值作為濕重。
通過將樣品盤置于已經在60℃預熱了30分鐘的真空烘箱中，測量了干重。采用的真空達到至少0.4英寸汞柱。關閉真空閥和泵，干燥透鏡4小時。打開放氣閥，使烘箱達到大氣壓。取出盤子，稱重。如下計算水含量濕重＝盤和透鏡的總濕重-稱量盤的重量干重＝盤和透鏡的總干重-稱量盤的重量％水含量＝(濕重-干重)/濕重×100記錄計算出的樣品的水含量的平均值和標準偏差。
使用裝配有測壓元件(load cell)(其降低至起始計量高度)的運動型張力試驗機的恒定速度的十字頭，測量了模量。合適的試驗機包括Instron型號1122。將八字試塊形的樣品(其具有0.522英寸的長度、0.276英寸的“耳”寬度和0.213英寸的“頸”寬度)裝入夾子中，以2英寸/分鐘的恒定速度的張力拉伸，直到其斷裂。測量了樣品的起始計量長度(Lo)和斷裂時的樣品長度(Lf)。檢測了每種組合物的12個樣品，記錄平均值。在應力/張力曲線的起始線性部分，檢測了抗張模量。
在下面的實施例中，通過Cole和Ralston(1994)開發的方法，定量了結合的肽。使用濾過的在10％乙酸和10％異丙醇中的0.025％考馬斯染料，在37℃對隱形眼鏡染色2-24小時。在10％乙酸和10％異丙醇中，在37℃對透鏡脫色。然后在25％吡啶中提取透鏡過夜。使用25％吡啶作為空白，用分光光度計在A600分析了提取的溶液。通過將提取物與標準曲線(通過吸取已知量的L-Melimine到半干丙烯酰胺凝膠上并如上提取來構建，該方法能從凝膠中提取所有量的肽)相關聯，確定了L-Melimine的定量。
實施例實施例1在氮、環境溫度下，向放在干箱(dry box)內的干容器中加入30.0g(0.277mol)雙(二甲基氨基)甲基硅烷，13.75ml 1M TBACB溶液(386.0g TBACB在1000ml無水THF中)、61.39g(0.578mol)對二甲苯、154.28g(1.541mol)甲基丙烯酸甲酯(相對于引發劑是1.4當量)、1892.13(9.352mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙基酯(相對于引發劑是8.5當量)和4399.78g(61.01mol)THF的溶液。向裝配有熱電偶和冷凝器(都連接到氮源上)的干三頸圓底燒瓶中，裝入上面的在干箱中制備的混合物。
將反應混合物冷卻至15℃，同時攪拌，并用氮吹洗。溶液達到15℃后，將191.75g(1.100mol)1-三甲基甲硅烷氧基-1-甲氧基-2-甲基丙烯(1當量)注射入反應容器中。反應放熱至約62℃，然后將30ml0.40M溶液(154.4g TBACB在11ml無水THF中)計量加入反應的整個殘余物中。反應溫度達到30℃并開始計量后，加入467.56g(2.311mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙基酯(相對于引發劑是2.1當量)、3636.6g(3.463mol)正丁基單甲基丙烯酰氧丙基-聚二甲基硅氧烷(相對于引發劑是3.2當量)、3673.84g(8.689mol)TRIS(相對于引發劑是7.9當量)和20.0g雙(二甲基氨基)甲基硅烷的溶液。
使混合物放熱至約38-42℃，然后冷卻至30℃。此時，加入10.0g(0.076mol)雙(二甲基氨基)甲基硅烷、154.26g(1.541mol)甲基丙烯酸甲酯(相對于引發劑是1.4當量)和1892.13g(9.352mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙基酯(相對于引發劑是8.5當量)的溶液，并使混合物再放熱至約40℃。使反應溫度降至約30℃，并加入2加侖THF以降低粘度。加入439.69g水、740.6g甲醇和8.8g(0.068mol)二氯乙酸的溶液，使混合物回流4.5小時，以對HEMA上的保護基團解封閉。然后去除揮發物，并加入甲苯以輔助去除水，直到達到110℃的蒸汽溫度。
使反應燒瓶維持在約110℃，并加入443g(2.201mol)TMI和5.7g(0.010mol)二月桂酸二丁錫的溶液。使混合物反應至異氰酸酯峰消失(通過IR)。在減壓下蒸發甲苯，生成灰白色的無水的蠟狀活性單體。以約2∶1的丙酮與大分子單體的重量比，將大分子單體置于丙酮中。24小時后，加入水，沉淀出大分子單體，將大分子單體過濾，并使用真空烘箱在45-60℃干燥20-30小時。
實施例2通過加入100份表1所示的組分(以表1所示的量)以及20份3，7-二甲基-3-辛醇，形成了反應混合物。更具體地，以下面的次序，向琥珀燒瓶中加入大分子單體、Norbloc 7966、稀釋劑、TEGDMA、HEMA、DMA、TRIS和mPDMS。這些組分在170-300rpm、50-55℃混合90-180分鐘。在維持混合的同時，加入藍HEMA，再混合組分20-75分鐘(在170-300rpm，50-55℃)。仍然混合，加入PVP，再攪拌混合物另外的20-140分鐘(在170-300rpm，50-55℃)。最后，在連續混合下，加入CGI 1850(Irgacure 1850)。
表1
將甲基丙烯酸五氟苯基酯(OPfp)(0.5重量％)加入反應混合物中。劇烈攪拌反應混合物約10分鐘(或直到溶液外觀澄清且均勻地混合)，然后在高真空下脫氣，直到在反應混合物中看不到氣泡(約20分鐘)。將反應混合物置于熱塑性的隱形眼鏡模具中，在50℃、N2氣氛下，用Philips TL 20W/03T熒光燈泡照射約50分鐘。在DowanolDPMA(DPMA，商購自Aldrich)中對透鏡脫模。在DPMA中洗滌透鏡至多5次。每次洗滌持續約120分鐘。將透鏡單獨地置于裝有2mL 2.5mg/mLmelimine和0.05重量％N，N′-二異丙基乙胺(DIPEA)在二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液的小瓶中。用灰色丁基塞塞住小瓶(含有透鏡和溶液)，然后在37℃、100rpm連續振蕩下，在振蕩培養器中溫育18小時。
溫育后，除去每個小瓶的溶劑。然后向每個小瓶中加入約9mL新鮮DMF溶劑。1小時后，去除溶劑，重新加入相同體積的新鮮DMF溶劑。該過程重復共計4次，每次間隔1小時。第4次溶劑改變后，將透鏡直接置于室溫的去離子(D1)水中，并以1小時的間隔洗滌4次。第4次洗滌后，將透鏡置于室溫的填充溶液中1小時，然后在121℃高壓滅菌30分鐘。測量了透鏡的性能，如下面的表2所示。
實施例3重復了實施例2，只是將偶聯添加劑加入含有Melimine的涂層溶液中。所以，完全按照實施例2，將在DPMA溶劑中釋放和洗滌后的透鏡單獨置于裝有3mL 5mg/mL N-羥基苯并三唑(HOBt)于DMF的溶液的小瓶中。使用校正過的移液器，向每個小瓶中加入50μL二異丙基碳二亞胺(DIC)。20分鐘后，使用校正過的Eppendorf移液器，向每個小瓶中加入1mL 3mg/mL melimine于DMF中的溶液(含有0.05重量％N，N＇-二異丙基乙胺(DIPEA))。用灰色丁基塞塞住小瓶。然后在37℃、100rpm連續振蕩下，在振蕩培養器中溫育透鏡19小時。
溫育后，除去每個小瓶的溶劑。然后向每個小瓶中加入約9mL新鮮DMF溶劑。1小時后，去除溶劑，重新加入相同體積的新鮮DMF溶劑。該過程重復共計4次，每次間隔1小時。第4次溶劑改變后，將透鏡直接置于室溫的去離子水中，并以1小時的間隔洗滌4次。第4次洗滌后，將透鏡置于室溫的填充溶液中1小時，然后在121℃高壓滅菌30分鐘。測量了透鏡的性能，如下面的表2所示。
表2
實施例4-7重復了實施例3，只是改變了melimine涂層溶液的濃度和洗滌方法。所以，完全按照實施例3，將在DPMA溶劑中釋放和洗滌后的透鏡單獨置于裝有3mL 5mg/mL N-羥基苯并三唑(HOBt)于DMF的溶液的小瓶中。使用校正過的移液器，向每個小瓶中加入50μL二異丙基碳二亞胺(DIC)。約60分鐘后，使用校正過的Eppendorf移液器，在室溫，向每個小瓶中加入1mL表3所示的各種濃度的melimine涂層溶液于DMF中的溶液(含有0.05重量％N，N′-二異丙基乙胺(DIPEA))。用灰色丁基塞塞住小瓶。然后在37℃、100rpm連續振蕩下，在振蕩培養器中溫育透鏡19小時。
溫育后，將透鏡轉移到裝有300mL新鮮DMF和磁力攪拌器的400mL燒杯中。在DMF中攪拌透鏡1小時。該過程再重復3次(共4次)。第4次溶劑改變后，將300mL去離子水加入燒杯中，用去離子水洗滌透鏡共4次。第4次洗滌后，將透鏡置于裝有填充溶液的小瓶中，然后在121℃高壓滅菌30分鐘。測量了透鏡的性能，如下面的表3所示。標準偏差示于括號中。
表3
N/M表示未測量。
權利要求
1.生產涂布的生物醫學裝置的方法，其包含下述步驟使從包含至少一種潛在的活性組分的活性混合物形成的生物醫學裝置的至少一個表面與涂布有效量的至少一種含肽涂層接觸。
2.權利要求1的方法，其中所述的生物醫學裝置是隱形眼鏡。
3.權利要求2的方法，其中所述的潛在的活性組分是至少一種式R-CO-L的酯化合物，其中，R包含能進行陽離子聚合、陰離子聚合或自由基聚合的基團，L是離去基團。
4.權利要求3的方法，其中所述的R基團選自丙烯酸酯、苯乙烯基、乙烯基、乙烯基醚、C1-6烷基丙烯酸酯、丙烯酰胺、C1-6烷基丙烯酰胺、N-乙烯基內酰胺、N-乙烯酰胺、C2-12鏈烯基、C2-12鏈烯基苯基、C2-12鏈烯基萘基、C2-6鏈烯基苯基C1-6烷基、乙烯基醚和環氧基。
5.權利要求3的方法，其中所述的R基團選自甲基丙烯酸酯和丙烯酰氧。
6.權利要求3的方法，其中所述的L基團選自羥烷基、羥芳基、羥基對硝基芳基、烷基酯、苯酯、對硝基苯酯、N-羥基胺衍生物和甲苯磺酸酯，它們都可以是取代的或未取代的。
7.權利要求3的方法，其中所述的L基團選自叔丁酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基-氧代-二氫苯并三嗪衍生物和1-羥基苯并三唑酯。
8.權利要求3的方法，其中所述的至少一種潛在的活性化合物包含五氟甲基丙烯酸酯、N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺和其混合物。
9.權利要求3的方法，其中所述的潛在的活性組分是以約0.01至約10重量％的量包含在活性混合物中，基于活性組分的總重量。
10.權利要求3的方法，其中所述的潛在的活性組分是以約0.01至約5重量％的量包含在活性混合物中，基于活性組分的總重量。
11.權利要求3的方法，其中所述的潛在的活性組分是以約0.01至約1重量％的量包含在活性混合物中，基于活性組分的總重量。
12.權利要求2的方法，其中所述的活性混合物包含至少一種含有聚硅氧烷的組分和至少一種親水組分。
13.權利要求2的方法，其中所述的含肽涂層選自防衛素、爪蟾抗微生物肽、大腸菌素和其組合。
14.權利要求2的方法，其中所述的含肽涂層選自魚精蛋白、蜂毒肽、殺菌肽A、乳鏈菌肽melimine、protattin和其組合。
15.權利要求2的方法，其中所述的含肽涂層選自魚精蛋白、蜂毒肽、melimine、protattin和其組合。
16.權利要求2的方法，其中所述的含肽涂層包含至少一種陽離子肽。
17.權利要求2的方法，其中所述的含肽涂層包含至少一種合成肽，其包含任意次序的3段A、B和C，其中，段A是具有下述序列的肽TLISWIKNKRKQ段B是具有下述序列的肽RPRVSRRRRRRGGRRRR段C是至多10個氨基酸的連接基團，其不會在哺乳動物細胞中抑制肽的抗微生物活性或誘導毒性，并且其包含0至約10個氨基酸的間隔區。
18.權利要求17的方法，其中，段C具有式-HN-(CR1R2)n-CO-，其中，n是1至21的整數，R1和R2獨立地選自H、直鏈的或分支的具有1-4個碳原子的烷基、直鏈的或分支的具有1-2個碳原子的羥基、直鏈的或分支的具有1-3個碳原子的烷硫基基團、具有1-3個碳原子的氨基甲酰基、具有1-3個碳原子的羧基、具有1-4碳原子和1-3個氮原子的伯氨基和仲氨基、芐基、苯酚、苯基吲哚和N，N-吡咯。
19.權利要求17的方法，其中，n是1至10的整數，R1和R2中的至少一個是H。
20.權利要求17的裝置，其中，段A和B是在末端位置，并且段C包含至多5個氨基酸。
21.權利要求1的方法，其中所述的接觸步驟包含將所述的裝置置于包含所述的涂層肽和溶劑的溶液中。
22.權利要求21的方法，其中所述的溶劑選自DMF、DMSO、乙酸乙酯、DPMA和其混合物。
23.權利要求21的方法，其中所述的溶劑包含DMF、DPMA或其混合物。
24.權利要求21的方法，其中所述的接觸步驟包含所述溶劑的凝固點和沸點之間的溫度。
23.權利要求21的方法，其中所述的接觸步驟包含約0和約100℃之間的溫度。
24.權利要求21的方法，其中所述的接觸步驟包含約20和約50℃之間的溫度。
25.權利要求21的方法，其中所述的接觸步驟包含至多約2天的接觸時間。
26.權利要求21的方法，其中所述的接觸步驟包含至多約12小時的接觸時間。
27.權利要求21的方法，其中所述的溶液還包含至少一種偶聯添加劑。
28.權利要求21的方法，其中所述的偶聯添加劑選自4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、1，3-二異丙基碳二亞胺、1，3-二環己基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑(HOBt)、1-羥基苯并三唑水合物、冠醚、酸、堿、酶和其組合。
29.生物醫學裝置，其從包含至少一種潛在的活性組分的反應混合物形成，其中所述的裝置涂布有涂布有效量的至少一種含肽涂層。
30.權利要求29的裝置，其中所述的生物醫學裝置是隱形眼鏡。
31.權利要求29的裝置，其中所述的潛在的活性組分是至少一種式R-CO-L的酯化合物，其中，R包含能進行陽離子聚合、陰離子聚合或自由基聚合的基團，L是離去基團。
32.權利要求29的裝置，其中所述的活性混合物包含至少一種含有聚硅氧烷的組分和至少一種親水組分。
33.權利要求29的裝置，其中所述的涂層肽包含一個或多個選自醇、伯胺、仲胺、硫醇和其組合的親核部分。
全文摘要
本發明提供了具有穩定的肽涂層的生物醫學裝置。涂層是如下所述形成的將至少一種潛在的活性組分加入活性混合物中，從所述的活性混合物形成醫學裝置，并使所述的醫學裝置與涂布有效量的涂層肽相接觸，以使所述的涂層通過酯或酰胺鍵結合到所述表面。
文檔編號A61L27/14GK1726057SQ200380106492
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月18日 優先權日2002年12月19日
發明者D·扎尼尼 申請人:莊臣及莊臣視力保護公司