修飾蛋白質化合物毒性作用的組合物和方法

專利名稱：修飾蛋白質化合物毒性作用的組合物和方法
發明的背景本申請要求2002年10月29日提交的美國臨時專利申請序列號10/282,935的優先權。
政府可依據國立衛生研究院撥款號CA-77701擁有對本發明的權利。
1.發明的領域本發明一般涉及生理學和癌癥生物學領域，具體涉及誘導或引起血管裂隙綜合征(VLS)的毒素和其它蛋白。發明提供突變的免疫毒素(ITs)和細胞因子，它們缺乏誘導VLS和其它毒性副作用的氨基酸序列。披露了突變編碼細胞因子或免疫毒素的DNA區段的方法，從而生成缺乏誘導VLS和其它毒性副作用的序列的免疫毒素。
2.相關領域的描述VLS通常在細菌性膿毒癥期間觀察到且可包括IL-2和多種其它細胞因子(Baluna和Vitetta，1996)。VLS的機制不清楚，可能包括在內皮細胞(ECs)中起始的事件級聯且包括炎性級聯和細胞因子(Engert等，1997)。VLS有復雜的病因學，包含對血管內皮細胞(ECs)的損傷和流體與蛋白的外滲，導致間質性水腫、重量增加，最嚴重的形式是腎損傷、失語癥和肺水腫(Sausville和Vitetta，1997；Baluna和Vitetta，1996；Engert等，1997)。血管裂隙綜合征(VLS)是迄今在人中測試的所有ITs以及細胞因子的主要問題，細胞因子如白介素2(IL-2)、TNF和腺病毒載體(Rosenberg等，1987；Rosensten等，1986)。
ITs是雜合分子，由單克隆抗體(MAbs)或其它細胞結合配體組成，它們生化或遺傳連接毒素、毒素亞基、或來自植物、真菌或細菌的核糖體失活蛋白(RIPs)(Vitetta等，1993)。過去20年中，開發了含去糖基化(dg)篦麻蛋白A鏈(dgRTA)的ITs，在結構上對穩定性和活性最優，且評估了在嚙齒動物、猴和人中的體外和體內活性(Vitetta等，1993；Sausville和Vitetta，1997；Baluna和Vitetta，1996)。
假定dgRTA-ITs通過損傷血管內皮細胞來誘導VLS(Soler-Rodriguez等，1993；Baluna等，1996)。IL-2和ITs用植物毒素、篦麻蛋白(RTA)和其它毒素的催化A鏈制備，體外和體內損害人ECs(Dutcher等，1991；Rosenberg等，1987；Vial和Descotes，1992)。使用人臍靜脈ECs(HUVECs)的研究證明dgRTA或用dgRTA制備的ITs能在1小時內損害這些細胞(Soler-Rodriguez等，1993)，而抑制蛋白合成需要4小時或更長。DgRTA-ITs也干擾纖連蛋白(Fn)介導的粘附(Baluna等，1996)。Fn抑制dgRTA介導的對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的損害(Baluna等，1996)。細胞粘附Fn受整聯蛋白介導，整聯蛋白識別Fn分子中的RGD和LDV序列(Makarem和Humphries，1991；Wayner和Kovach，1992)。
在超過200個病人的I期試驗中評估3種連接dgRTA的Mabs，病人患復發的化療藥性(chemorefractory)淋巴瘤、骨髓瘤、何杰金氏病和移植物抗宿主疾病(GVHD)(Sausville和Vitetta，1997)。沒有證據表明這些ITs有骨髓毒性或肝毒性，但它們都在最大耐受劑量(MTD)時誘導VLS，通過低白蛋白血癥、重量增加確定，最嚴重的病例是肺水腫和低血壓(Baluna等，1996)。此外，它們在MTD時誘發肌痛，在3％的病人中引起橫紋肌溶解(Sausville和Vitetta，1997)；此副作用也可能與VLS有關且由肌肉水腫引起。此外，失語癥在＜5％的病人中發生，這些可能是由于腦微脈管系統中的水腫。
盡管使用dgRTA-ITs的此劑量限制毒性(DLT)臨床反應鼓勵了在I期臨床試驗中，15-30％化療藥難治性復發的淋巴瘤患者經歷客觀的部分或完全反應(Sausville和Vitetta，1997)。然而，DLT，VLS降低了繼續在病人中進行II和III期試驗的熱情。
顯然，通過去除或減少VLS或許極大地促進進一步開發dgRTA-ITs以及其它含毒素和RIPs的ITs以及細胞因子如臨床試劑。如果能避免或減少VLS，會允許使用劑量高許多的多種治療劑如ITs、基因治療和細胞因子，而沒有目前遇到的劑量限制副作用。
發明的概述本發明克服了本領域中的缺陷，通過提供調節各種蛋白質化合物誘導毒性作用的能力的方法和修飾的蛋白質組合物，這樣它們有調節誘導毒性作用的能力。在某些實施方案中，發明可生成ITs，它們促進或誘導這種毒性作用的能力降低，包括例如VLS。根據發明產生的ITs用于任何數量的治療應用，例如治療GVHD、非何杰金氏和何杰金氏淋巴瘤、骨髓瘤和一些實體瘤。本發明也提供通過序列突變減小VLS促進蛋白質組合物的能力的方法，這些序列誘導或促進任何一些毒性作用。本發明提供例如ITs、IL-2、TNF和腺病毒以及其它促進毒性作用的能力減少的蛋白或病毒，和使用這種化合物的方法。
可改變(x)D(y)三肽序列側翼(側翼區)的氨基酸以降低蛋白質組合物誘導VLS的能力。如本文所用，“蛋白質組合物”指大于約200個氨基酸的蛋白或翻譯自基因的全長內源序列、大于約100個氨基酸的多肽和/或從約3到約100個氨基酸的肽，包括3、4、5、6等，10、11、12、13、14等，20、21、22等，30、40、50、60等，100、110、120等，200、220、240等，300、350、400等，500、600、700等和1000個氨基酸長度的肽。在某些方面，改變此序列和/或側翼氨基酸的方法是去除或取代氨基酸或氨基酸序列。
在某些實施方案中，修飾的蛋白質組合物可包含具有(x)D(y)序列和至少1種氨基酸突變的蛋白，突變改變(x)D(y)序列誘導VLS的能力。發明的蛋白可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多種突變。突變可以在側翼區、蛋白活性部位和/或蛋白中的(x)D(y)序列。定義為位于側翼區內的氨基酸可包括位于天然蛋白構象的(x)D(y)序列中天冬氨酸的約10埃內的氨基酸、位于離天然蛋白構象的酶部位殘基(活性部位)大于約6埃的氨基酸、位于至少部分暴露于天然蛋白構象表面的氨基酸、或2種或多種這些參數的組合。側翼區中的氨基酸突變可與本文所述的任何其它突變結合。包含(x)D(y)的蛋白可以是毒素、細胞因子或病毒蛋白。在某些實施方案中，蛋白是毒素。毒素包括但不限于篦麻蛋白A鏈毒素(RTA)、紅豆因A鏈、白喉毒素(DT)A鏈、假單胞菌外毒素(PE)、志賀氏菌毒素A鏈、白樹毒蛋白、木鱉子皂苷(Momordin)、商陸抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麥毒素。在特定的實施方案中，毒素是篦麻蛋白A鏈毒素。
在多種實施方案中，修飾的蛋白質組合物包括具有(x)D(y)序列和至少1種側翼序列氨基酸突變的蛋白，突變改變蛋白毒性。本文所述組合物的蛋白可進一步包括本文所述的其它突變。在某些實施方案中，例如疫苗組合物和疫苗接種方法，優選失活蛋白(如含活性部位失活改變的蛋白)。蛋白的突變氨基酸可包括上述(x)D(y)序列側翼的氨基酸。蛋白可以是上述的毒素、細胞因子或病毒蛋白。在多種實施方案中，毒素是篦麻蛋白A鏈毒素。
在多種實施方案中，篦麻蛋白A鏈毒素包括至少1種側翼區突變且可結合蛋白活性部位和/或蛋白(x)D(y)序列中的突變或改變，蛋白活性部位中的突變或改變能用于接種疫苗抗篦麻蛋白A鏈毒素，如本文所述。在特定的實施方案中，篦麻蛋白A鏈毒素突變包括至少1種側翼區序列氨基酸突變，包括但不限于R48、N97或R48和N97。蛋白突變包括取代、修飾或缺失天然氨基酸。尤其是天然氨基酸可用丙氨酸殘基取代。本發明的組合物可作為藥物或藥學上可接受組合物提供。
發明也提供修飾的蛋白質組合物，它相對天然蛋白質組合物序列改變至少一個序列的氨基酸，序列包括(x)D(y)，組合物根據上述和本說明書其它地方所述制備，結合側翼區序列的改變。在某些實施方案中，蛋白質組合物包括毒素、細胞因子、病毒序列或其組合。在某些方面，毒素是例如植物毒素、真菌毒素、細菌毒素、RIP或其組合。在另外的方面，毒素包括紅豆因A鏈、白喉毒素(DT)A鏈、假單胞菌外毒素、RTA、志賀氏菌毒素A鏈、白樹毒蛋白、木鱉子皂苷、商陸抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白、大麥毒素或其組合。在其它實施方案中，蛋白質組合物包括細胞因子，例如白介素-2。在其它方面，蛋白質組合物包括病毒序列，例如腺病毒序列。
在某些方面，組合物進一步包括抗體。在具體的方面，組合物進一步包括IT。在另外的方面，IT進一步包括至少第二試劑，例如至少1種效應分子。在具體的方面，效應分子是毒素、抗腫瘤劑、治療酶、抗病毒劑、病毒、細胞因子、生長因子或其組合。在其它方面，試劑是至少1種報道分子。
發明另外提供IT，包括至少1種蛋白質分子，其誘導VLS、細胞凋亡、解整聯蛋白樣活性或EC損傷的能力減小，其中蛋白質分子有至少一個(x)D(y)和/或改變的側翼區序列。
在某些實施方案中，組合物包括治療劑，例如至少1種IT、抗體、細胞因子、病毒或其組合。在特定的實施方案中，組合物和治療劑共價綴合。在具體的方面，組合物是治療劑。
發明也提供RTA，它在病人中促進毒性的能力減小，其中包含74到76位的(x)D(y)序列改變。在某些實施方案中，74位的亮氨酸改變，75位的天冬氨酸改變，和/或76位的纈氨酸改變。在特定的方面，(x)D(y)序列進一步包括約1到約6個(x)D(y)三肽序列的(x)或(y)殘基的位置。在多種實施方案中，(x)D(y)序列的改變結合側翼序列的改變。
發明提供誘導VLS能力降低的蛋白質組合物。一方面，改變蛋白質組合物以去除至少1種與含序列(x)D(y)的組合物毗鄰的氨基酸序列。在本發明的某些方面，蛋白質組合物可以是核糖體失活蛋白(RIP)，包括但不限于白樹毒蛋白、木鱉子皂苷、商陸抗病毒蛋白(PAP)、皂草素或天花粉蛋白；毒素或毒素亞基，包括但不限于紅豆因A鏈、白喉毒素(DT)A鏈、假單胞菌外毒素-A(PE38-lys)、RTA、志賀氏菌毒素A鏈或大麥毒素；細胞因子，包括但不限于IL-2。蛋白、多肽和/或肽可獲得自本發明方法和組合物中待使用的RIPs、毒素或細胞因子。在某些方面，蛋白質組合物可用于產生IT，其促進或增強VLS的能力減小。在其它方面，用于IT的蛋白質組合物是RIP和/或毒素序列。
發明的某些實施方案包括減小蛋白質組合物誘導VLS能力的方法，包括步驟鑒定包含至少1種(x)D(y)的氨基酸序列的蛋白，其中(x)選自亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸，(y)選自纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸；改變至少一個上述(x)D(y)序列側翼區氨基酸殘基，其中誘導VLS的能力降低。
多種實施方案包括制備誘導VLS能力減小的免疫毒素的方法，包括步驟鑒定包含至少1種(x)D(y)的氨基酸序列的毒素，其中(x)選自亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸，(y)選自纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸；改變至少一個上述(x)D(y)序列側翼區氨基酸殘基，其中誘導VLS的能力降低；所述毒素綴合含至少1種抗體的組合物以產生免疫毒素，其中產生的免疫毒素與類似的免疫毒素比較時，促進VLS的能力減小，其中側翼氨基酸序列不改變再毒素。
在某些實施方案中，發明提供修飾蛋白質組合物誘導毒性作用的能力的方法，包括步驟鑒定至少1種含序列(x)D(y)的氨基酸序列，其中(x)選自亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸，(y)選自纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸；改變含序列(x)D(y)的氨基酸序列。在某些實施方案中，改變包含至少1種氨基酸序列突變。在其它實施方案中，去除氨基酸序列。在具體的方面，氨基酸序列包括序列(x)D(y)，其中(x)D(y)序列是GDL、GDS、GDV、IDL、IDS、IDV、LDL、LDS、LDV、LDS、VDL或VDV。在一個更特定的實施方案中，發明提供修飾的蛋白質組合物，相對天然蛋白質組合物的序列，改變至少一個序列的氨基酸，序列包括(x)D(y)，其中(x)選自亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸，(y)選自纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸，組合物用作藥物。
蛋白質組合物可以是任何目前已知或將來發現的具有(x)D(y)三肽序列。在某些實施方案中，蛋白質組合物包括毒素、細胞因子、病毒序列或其組合。在具體的方面，毒素包括植物毒素、真菌毒素、細菌毒素、RIP或其組合。在某些方面，毒素包括紅豆因A鏈、白喉毒素(DT)A鏈、假單胞菌外毒素、RTA、志賀氏菌毒素A鏈、白樹毒蛋白、木鱉子皂苷、商陸抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白、大麥毒素或其組合。在其它實施方案中，蛋白質組合物包括細胞因子，例如IL-2。在進一步的實施方案中，蛋白質組合物包括病毒序列，例如腺病毒序列。在某些方面，蛋白質組合物進一步包括或包括于IT。
如本說明書所用，“一個”可以指一個或多個。如權利要求所用，當結合單詞“包括”使用時，單詞“一個”可以指一個或大于一個。
本發明的其它目標、特征和優點從下列詳細描述中顯而易見。然而，應理解盡管詳細描述和特定例子說明發明的較佳實施方案，它們僅作為例證給出，因為從此詳細描述中，本領域技術人員對發明精神和范圍內的多種變化和修改是顯而易見的。
附圖的概述下列圖構成本說明書的一部分且包括以進一步證明本發明的某些方面。通過參考1幅或多幅這些圖并結合本文所示關于特定實施方案的詳細描述可更好地理解發明。


圖1A和1B.RFB4-RTA-肽的體內作用。(圖1A)有形成血管的人皮膚異種移植物的SCID小鼠注射200μg RFB4-dgRTA(實心)、RFB4-LDV+(敞開)、RFB4-GQT(交叉陰影線)或鹽水(陰影線)，確定人皮膚活檢的濕/干重比例。(圖1B)SCID小鼠如圖1A所述注射，確定肺的濕/干重比例。值表示3次實驗的平均值±SD。星號指示與鹽水(-)處理小鼠的統計學顯著差異(*，p＜0.02，**p＜0.01)。
圖2A和2B.抑制dgRTA和RFB4-LDV+結合HUVECs。(圖2A)105HUVECs用FITC-dgRTA冰上孵育30分鐘，在有或沒有100μl PBS/BSA/疊氮化物中的100倍過量dgRTA(實心)、RFB4-LDV+(交叉陰影線)、RFB4(暗影)、Fn(陰影線)或PE38-lys(敞開)。顯示對結合HUVECs的百分比抑制。值表示3次研究的平均值±SD。(圖2B)與圖2A相同，除了105HUVECs用FITC-RFB4-LDV+冰上孵育30分鐘。
圖3.酸處理的Sepharose 4B柱的分布-純化篦麻蛋白。
圖4.Sephacryl S-200柱的分布-分離RCA-1和RCA-2。
圖5.DEAE Sepharose柱和酸處理的Sepharose 4B柱的分布-分離dgRTA和dgRTB鏈。
圖6.Blue-Sepharose CL-4B柱的分布-純化dgRTA。
圖7.去唾液酸胎球蛋白-Sepharose柱的分布-純化dgRTA。
圖8.RTA的條帶圖。條帶表示篦麻蛋白A鏈的X光晶體結構，有活性部位殘基側鏈、LDV基序、R48和N97。
圖9.RFB4-RTA ITs的體內VLS作用。SCID小鼠肺中的125I-白蛋白保留，按重量相對用于比較的PBS處理小鼠保留來標準化，小鼠用不同RTA-ITs處理。(n＝小鼠數。P值比較各組與PBS組)圖10.SCID/Daudi存活曲線。SCID小鼠(n＝10)如方法所述處理，監控它們的存活或癱瘓，存活或癱瘓中的任意一個是此模型中的終點。(敞開菱形)PBS、(閉合菱形)RFB4、(敞開三角形)RFB4-R48A、(閉合三角形)RFB4-N97A、(敞開正方形)RFB4-wt rRTA。P值(通過對數階或Wilcoxon檢驗)RFB4-R48A對RFB4，P＝0.0093或P＝0.0037，RFB4-N97A對RFB4，P＝0.0018或P＝0.00012，RFB4-wtrRTA對RFB4，P＝0.0022或P＝0.00012。
例證性實施方案的描述細胞損傷仍是病人的一個問題，特別是內皮細胞損傷，無論是由毒素產生如來自蛇咬或引起膿毒性休克的分子，或是由治療劑產生如ITs或白介素。細胞損傷的類型包括VLS、解整聯蛋白樣活性和細胞凋亡。
為設計減輕VLS的方法和組合物，評估引起VLS的候選分子序列以確定RTA、毒素、RIPS和IL-2是否共享結構基序，結構基序引起干擾細胞-細胞和細胞-基質相互作用并從而損害人ECs。比較誘導VLS的毒素、RIPS和IL-2的序列，鑒定了(x)D(y)共有基序，其中(x)可以是L、I、G或V且(y)可以是V、L或S。在RTA和IL-2的情況中，分子模建表明這些基序完全或基本暴露于其各自分子表面上。病毒解整聯蛋白享有類似基序，基序破壞整聯蛋白的功能，表明RTA、IL-2和或許其它毒素可通過其(x)D(y)基序來損害ECs，因此可以是解聯蛋白。
此基序的血管裂隙促進活性令人驚訝且出乎意料，因為LDV同源序列也在多種非毒性分子的血管功能中發揮作用，包括含IDS序列的血管細胞粘附分子1(VCAM-1)和含GDV序列的纖維蛋白原的γ鏈(Clements等，1994)。LDV構成纖連蛋白CSl結構域中的最小活性部位，導致其結合α4β1整聯蛋白受體(Makarem和Humphries，1991；Wayner和Kovach，1992；Nowlin等，1993)。盡管纖連蛋白具有此序列，它不損害HUVECs。而FN保護HUVECs不受RTA介導的損害(Baluna等，1996)，與具有此基序的毒性劑的VLS活性直接相反。
為確定此基序是否引起EC損害，產生分別含來自RTA或IL-2的肽的短LDV或LDL，附于小鼠MAb并研究體外結合和損害HUVECs的能力及體內損害小鼠肺脈管系統和皮膚異種移植物中人脈管系統的能力。產生一個RTA活性部位突變體和一些LDV突變體。這些LDV突變體包含保守性變化，當模擬時不預期會影響RTA活性部位。綴合抗體的肽在2個動物模型中誘導體外EC損害和體內血管損害，肽來自含序列(L74，D75，V76)的RTA，但不是具有缺失或改變的序列的肽(Baluna等，1999)。這些結果證明誘導VLS的位點不需要活性部位。考慮到損傷ECs不需要不包含LDV的RTA的非毗連活性部位，或僅部分促使血管損害。
這些結果證明誘導血管損害不需要活性部位，可制成1種或多種VLS促進活性減小的活性肽或多肽。隨著此發現，現在可能的是，(x)D(y)序列和/或側翼區序列的1種或多種氨基酸缺失或突變可減少或預防VLS并改善治療指數或VLS誘導分子的耐受劑量。預期可產生包含至少一個突變基序和/或1種或多種側翼區序列的1種或多種肽和小分子藥物抑制劑，減少或去除VLS促進劑誘導的VLS。
在多種實施方案中，位于活性部位和/或(x)D(y)基序的物理區、空間或附近的其它殘基可突變或改變以取消、減少或去除VLS。側翼區中的突變靶向的氨基酸包括天然蛋白表面上或附近的氨基酸，特別是RTA和其衍生物。改變可去除或取代(x)D(y)基序區中的帶電殘基，可使蛋白表面特定區域中的電荷無效或逆轉。改變也能轉變蛋白的(x)D(y)序列或活性部位的物理區、空間或附近中的氨基酸大小和/或親水性。2個示范的側翼殘基是精氨酸48(R48)和天冬酰胺97，發現它們在RTA的三維結構中與(x)D(y)基序物理鄰接。
在某些實施方案中，考慮到可減小或提高蛋白質組合物的解聯蛋白或解聯蛋白樣活性。解聯蛋白具有多種活性，包括損害ECs的能力、干擾細胞粘附的能力和/或干擾血小板聚集的能力。考慮到(x)D(y)序列的1種或多種氨基酸缺失或突變和/或一個或多個側翼區殘基可減少或預防1種或多種包含這些序列的分子的解聯蛋白活性。預期可產生包含至少一個突變基序和/或1種或多種側翼區序列的1種或多種肽和小分子藥物抑制劑，減少或去除這種試劑的解聯蛋白樣活性。
另外，RTA的LDV位點在ECs中誘導細胞凋亡。報導了許多毒素和ITs誘導細胞凋亡以及抑制蛋白合成。也考慮到(x)D(y)序列的1種或多種氨基酸缺失或突變和/或至少一個或多個側翼區殘基可減少或預防1種或多種包含這些序列的分子的細胞凋亡活性。預期可產生包含至少一個突變基序和/或至少1種側翼序列的1種或多種肽和小分子藥物抑制劑，減少或去除這種試劑的細胞凋亡活性。因此，細胞凋亡活性可引起或促使毒素或細胞因子誘導VLS。
還考慮到(x)D(y)序列的1種或多種氨基酸缺失或突變和/或一個或多個側翼區殘基可減少或預防包含這些序列的分子誘導EC損害的能力。預期可產生包含至少一個突變基序和/或一個或多個側翼殘基的1種或多種肽和小分子藥物抑制劑，減少或去除這種試劑的EC損害活性。
本文描述生成方法和包含試劑的組合物，組合物的VLS促進能力減小或提高以蛋白、多肽、肽或其它蛋白質材料內的(x)D(y)、(x)D(y)T或(x)D(y)基序側翼區突變為基礎，突變分別去除或加入這種序列。考慮到所述用于減小或提高VLS促進能力的相同突變也分別減小或提高多肽、肽或蛋白的細胞凋亡活性、EC損害和/或1種或多種解聯蛋白樣活性。因此，要理解本文所述用于產生VLS促進能力增強或降低的蛋白、多肽和肽的所有方法應用于產生細胞凋亡活性、EC損害和/或1種或多種解聯蛋白樣活性減小的蛋白、多肽和肽。本發明包括所有這種方法和通過這種方法鑒定或產生的組合物。
A.鑒定VLS誘導劑中的(x)D(y)基序已鑒定RTA、其它毒素、RIPs和IL-2中的同源結構基序并測試它們在模型系統中促進VLS的能力，這些基序可影響細胞-細胞和細胞-基質相互作用并因而損害人ECs。(x)D(y)基序在誘導VLS的RTA、其它毒素、RIPs和細胞因子的序列中普遍，其中x＝L、I、G或V和y＝V、L或S(表1)。破壞整聯蛋白功能的病毒解聯蛋白也享有此基序(Coulson等，1997)。
1全毒素的酶活性鏈2PE38指PE中的酶活性結構域III(殘基405到613)加殘基253-354和381-404。
3與植物毒素的酶活性A鏈同源的核糖體失活蛋白(RIPs)。
1.定位RTA、解聯蛋白、PE38-lys和IL-2中的(x)D(y)基序隨著(x)D(y)序列在促進VLS中的重要性的發現，現在可能產生保持其酶活性的RTA突變體，這對產生有效Its是重要的，但突變體的VLS誘導性質也減小。
RTA中的LDV基序(殘基74-76，SEQ ID NO1)位于Tyr-80殘基附近第一個結構域的β鏈的C末端，殘基包括在活性部位中(Mlsna等，1993)。酶活性部位(殘基80、123、177、180、209和211)不包括LDV序列，這樣RTA的酶活性不應受此序列中的突變或缺失的影響(Munishkin和Wool，1995)。
為檢測RTA和IL-2的晶體結構，比較了RTA(PDB登記號1br5.pdb)和IL-2(PDB登記號1irl.pdb)的三維結構的空間填充模型。具體地，分析了RTA的LDV殘基的原子、IL-2的LDL殘基的原子和RTA活性部位的原子(Y80、Y123、E177、R180、N209和W211)，分析是關于它們在結構中的相對位置。用Insight II程序(MSI)產生模型。檢測RTA晶體結構表明此基序僅部分暴露，但分子中的結構波動可增加其可接近性。根據此和本文所述其它數據，考慮到(x)D(y)基序、C末端側翼氨基酸、N末端側翼氨基酸、側翼區序列或其組合中的改變可導致由多種試劑喪失VLS誘導活性。
另一稱為解聯蛋白的蛋白家族通常包含RGD序列。在1種存在于輪狀病毒的解聯蛋白中，存在LDV序列(Coulson等，1997)。解聯蛋白損害ECs或干擾細胞粘附和/或血小板聚集(McLane等，1998；Huang，1998；Tselepis等，1997)。在蛇毒解聯蛋白蝮蛇毒素中，LDV可取代RGD而不損害解聯蛋白功能(Tselepis等，1997)。因此，RTA和多種其它分子可以是，在損害人Ecs中與蝮蛇毒素共享性質的解聯蛋白(Blobel和White，1992；Lazarus和McDowell，1993)。在某些實施方案中，考慮到解聯蛋白聯蛋白或具有解聯蛋白聯蛋白樣活性的分子可改變成或不生具有減少的損害Ecs的能力、減少的干擾細胞粘附能力和/或減少的干擾血小板聚集的能力。可通過突變(x)D(y)序列中的至少一個殘基或至少一個側翼殘基產生這種分子。還考慮到能制成阻斷解聯蛋白活性的(x)D(y)序列和/或側翼序列的肽或肽模擬物。
在PE38-lys中，GDL序列遠離活性部位(Li等，1995)。因此，考慮到可類似地突變PE38-lys以減少或去除其VLS促進活性而沒有完全消除其活性。
在IL-2中，在殘基19-21(SEQ ID NO2)的LDL序列位于α螺旋中，同樣部分暴露。Asp-20、LDL基序(表1)中的突變去除IL-2與IL-2受體的β鏈結合和隨后的細胞增殖(Collins等，1988)。已報導IL-2直接體外增加血管內皮對白蛋白的滲透性且此效果可被抗IL-2受體MAbs抑制(Downie等，1992)。實施例1的結果證明IL-2中的LDL序列損害HUVECs。然而，與RTA相反，IL-2的LDL中的Asp-20參與受體結合和功能活性(Collins等，1988)。因此，考慮到在某些實施方案中，去除或減小VLS的IL-2(x)D(y)序列和/或側翼序列突變必須保存Asp-20或可減少IL-2的生物活性。
2.突變側翼序列(x)D(y)序列可能不是唯一引起VLS促進的。在某些實施方案中，考慮到可突變在(x)D(y)序列側翼的另外序列以提高或減小肽、多肽或蛋白促進VLS的能力。這些側翼序列可包括來自(x)D(y)序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100個或更多氨基酸。氨基酸也位于離天然蛋白構象(x)D(y)序列中的天冬氨酸約10埃的側翼區內、位于離天然蛋白構象活性部位殘基大于約6埃、位于至少部分暴露于天然蛋白構象表面、或2種或更多這些參數的組合。
例如，LDV構成纖連蛋白CS1結構域中的最小活性部位，引起其結合α4β1整聯蛋白受體(Makarem和Humphries，1991；Wayner和Kovach，1992；Nowlin等，1993)。然而，纖連蛋白(FN)不損害HUVECs。而FN保護HUVECs不受RTA介導的損害(Baluna等，1996)。不像RTA，FN具有C末端LDV側翼的脯氨酸，而不是蘇氨酸。
在解聯蛋白中，RGD側翼的殘基在配體結合中發揮作用(Lu等，1996)。LDV或含同源物的分子促進血管完整性(例如FN)或破壞它(例如RTA)的能力的間差異取決于LDV基序的方向或相互作用(即結合)的有效性，因而取決于側翼序列。因此，改變此序列中一個或多個氨基酸或者N或C末端側翼序列的一個或多個氨基酸可使分子從損害內皮細胞(解聯蛋白樣)轉變成增強它們的生長。考慮到(x)D(y)序列的一個或多個側翼殘基變化可提高或減小分子促進VLS的能力。更考慮到使(x)D(y)序列暴露于蛋白外表面以與其它蛋白如受體相互作用的變化會提高VLS促進活性，而暴露更少的構象可降低VLS促進活性。
a.篦麻蛋白A鏈-結構分析以鑒定用于VLS突變的候選殘基鑒定作為側翼區殘基的氨基酸可通過至少1種篦麻蛋白A鏈晶體結構來確定，結構可獲得自NCBI(GenBank)，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/。這兩種示范結構是單獨RTA的2種結構，沒有突變或與復合物中與其它實體的共結晶。這些結構可用軟件分析和操作，軟件獲得自NCBI，Cn3D v.4.0。可使用的示范序列或結構包括但不限于RTA(GenBank登記號1RTC)D.Mlsna，A.F.Monzingo，B.J.Katzin，S.Ernst和J.D.Robertus，29-Oct-92；rRTA(GenBank登記號1IFT)S.A.Weston，A.D.Tucker，D.R.Thatcher，D.J.Derbyshire和R.A.Pauptit，5-Jul-96以及鑒定為含(x)D(y)序列的其它序列，序列易獲得自這些和其它數據庫。
鑒定改變時可能去除、減小或取消VLS的殘基的方法包括但不限于a)鑒定(x)D(y)序列10內的所有殘基且特別是LDV序列-例如確定殘基離天冬氨酸(D)的距離，特別是RTA D75；b)確定各殘基離‘活性部位’的距離-例如選擇RTA的6個主要活性部位殘基(Y80、Y123、E177、R180、N209、W211)并‘測量’各候選物與活性部位最近點的距離；c)目測檢查各殘基的表面暴露-定級的‘Y’-是，‘P’-部分，或‘N’-不是；和/或d)目測檢查各殘基在它們出現的蛋白表面何處，定級為‘F’是相對(x)D(y)、LDV和/或活性部位的前面，或‘B’是后部，或兩者(或在‘邊緣’或延伸通過分子)。
在RTA的情況中，可匯編比較來自不同RTA結構的殘基的表，分析和確定氨基酸間的各自距離。通常，評估各殘基的表面/掩蔽的前面/后部差異，達到一致(由于這些評估的主觀性質，可能難以定義例如部分與暴露間的差異-任何表面暴露通常分類為至少‘部分’暴露。表2提供RTA的示范列表(80個殘基，包括LDVT且提供LDV的10內活性部位的4個殘基)。
此外，方法也包括e)從列表中取出所有‘轉向’殘基如P(脯氨酸)G(甘氨酸)(在RTA情況中為8個殘基)，一般，這些不能改變而不完全破壞分子的完整性；f)從列表中取出所有掩蔽的殘基(上面標為‘N’的殘基；在RTA 17殘基的情況中，L74用于比較目的)和所有獨占地暴露于分子后部的殘基(如上所確定，在RTA 27殘基的情況中，V76用于比較目的)；g)從列表中取出所有在活性部位的6內的殘基；此距離任意選擇，但以失去RTA D75突變體活性和保留2種V76突變體的RTA活性為基礎，前者是3.0遠離，后者是6.0遠離(6個殘基)。例如，此方法使表2的示范列表減少到表3的示范列表(22個殘基，仍包括LDVT和活性部位殘基用于比較)。
表4根據離RTA的LDV區的距離順序粗略地列出剩余的14個殘基(減去LDVT和活性部位)。改變此保守性列表的殘基可去除、減小或取消RTA的VLS活性，盡管改變表2的其它殘基也可有合適結果。此選擇通常基于1)接近于(x)D(y)，在RTA LDV區的情況中；2)離活性部位的距離；3)在與(x)D(y)序列相同的分子表面上表面暴露。例如，RTA的N97和R48滿足這些結構標準，它們都減小、去除或取消VLS，同時保留RTA活性。如本文所述，一個或多個這些改變可單獨使用或與其它改變聯用以產生蛋白，該蛋白毒性減小、VLS特征減少、酶活性降低或具有其組合。
表2RTA氨基酸距離的示范匯編列表
表3使用另外標準的RTA氨基酸距離的示范匯編列表
表4RTA特定側翼殘基的示范匯編列表
B.產生具有改變VLS活性的組合物(x)D(y)和(x)D(y)T基序鑒定為誘導VLS、誘導細胞凋亡和其它作用，可能產生新家族的VLS抑制劑的分子，使這些分子發揮最大有益作用。例如，使用本文所示組合物和方法，抗癌治療劑的毒性減小，可治療較大的腫瘤或更晚期的疾病。現在可能鑒定或合成小藥物分子，它們阻斷細胞與VLS促進、細胞凋亡促進、EC損害和/或解聯蛋白樣分子間的相互作用。在某些實施方案中，以(x)D(y)和/或(x)D(y)T基序或其側翼序列為基礎的肽或藥物模擬物可用于體內抑制VLS或其它活性。可能產生肽或肽-載體綴合物，它們與內皮細胞上的LDV基序結合位點競爭并在多種其它情況中包括膿毒癥、IL-2治療等預防VLS或其它作用。
在某些實施方案中，加入較大分子的一個或多個(x)D(y)、(x)D(y)T基序和/或特定側翼序列也可能增加外滲入組織中。根據本說明書，含(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列的肽作為抗炎癥或抗轉移劑測試(Jackson等，1997；Maeda等，1997；Greenspoon等，1994)，應監控外滲出增加和對脈管系統的毒性作用。然而，在某些實施方案中，需要產生增加外滲入組織中的蛋白質組合物。治療組合物的外滲改善或促進具有本發明蛋白、多肽或肽的治療組合物的外滲可使治療劑更接近組織。因此，提供了增加或減小1種或多種蛋白、多肽、肽或治療劑外滲的方法。優選的治療劑包括但不限于1種或多種ITs、抗體、細胞因子、病毒、藥物等。
為產生缺乏(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列的肽、多肽或蛋白，可缺失或突變保守性天冬氨酸(D)，用另1種氨基酸取代天冬氨酸，或插入一個或多個氨基酸到其位置或鄰近。由于缺失或突變事件的緣故，任何氨基酸可取代序列中的(D)殘基。
另外，通過插入一個或多個氨基酸可缺失、取代或移動(x)殘基，以去除(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列。由于缺失或突變事件的緣故，任何可取代序列中(x)殘基的氨基酸優選不是亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甘氨酸(G)或纈氨酸(V)。
或者，通過插入一個或多個氨基酸可缺失、取代或移動(y)殘基，以去除(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列。由于缺失或突變事件的緣故，任何可取代序列中(y)殘基的氨基酸優選不是纈氨酸(V)、亮氨酸(L)或絲氨酸(S)。
另外，可通過改變或變化此序列的任何突變去除(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列。這種突變包括但不限于截斷、插入、取代和缺失氨基酸。考慮到化學修飾也可改變(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列以減小其誘導或促進VLS的能力。
因此，考慮到這種影響(x)D(y)序列或側翼序列的突變可改變多肽促進VLS的能力或其它與這些序列相關的能力。例如，1種產生VLS的優選試劑是紅豆因A鏈(GenBank登記號X76721；SEQ ID NO3)，它包含在其氨基酸序列68-70位的IDV序列。甘氨酸(G)在67位。因此，缺失68位的異亮氨酸導致67位的甘氨酸直接毗連在原來69位的天冬氨酸殘基(D)。然后產生的新序列含是在突變紅豆因A鏈67-69位的GDV。此新三肽序列仍匹配VLS誘導序列(x)D(y)和/或(x)D(y)T。然而，考慮到這種缺失會移動所產生的突變紅豆因A鏈蛋白、多肽或肽結構中的三氨基酸序列的位置。三氨基酸序列位置中的移動使它移入的位置不太有利于接觸任何促進或誘導VLS的細胞、受體或分子。所得突變紅豆因A鏈蛋白、多肽或肽促進或誘導VLS的能力降低，因此由本發明包括。
類似地，其它誘導VLS的毒素或化合物包括但不限于表1所列，可突變它們從而去除(即突變)一個或多個(x)D(y)和/或一個或多個側翼殘基。然而，考慮到為產生誘導VLS能力降低的毒素或化合物，優選任何剩余的(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列對蛋白、多肽或肽表面的暴露減少。
例如，考慮到至少部分位于蛋白、多肽或肽的非暴露部分的(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列或另外從完全或部分暴露于分子表面中掩蔽的(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列與促進或誘導VLS的細胞、受體或其它分子的相互作用更少。因此，考慮到產生誘導或促進VLS能力減小的毒素或分子不必需從蛋白、多肽或肽的一級結構中完全去除(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列。然而，優選去除所有(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列以確保組合物誘導或促進VLS的能力最小。
為確定突變是否可能產生更少暴露(x)D(y)和/或(x)D(y)T基序的蛋白、多肽或肽，可確定移動或加入(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列的推定位置，這是通過比較突變序列與未突變蛋白、多肽或肽的二級和三級結構，由本領域普通技術人員已知方法測定，包括但不限于X光晶體學、NMR或計算機模擬。不同多肽和肽結構的計算機模型在于文獻或計算機數據庫中獲得。在一個非限制性例子中，本領域普通技術人員可使用Entrez數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)鑒定誘變的靶序列和區域。如果已知，Entrez數據庫與鑒定氨基酸序列的3-D結構數據庫交聯。這種分子模型可用于鑒定肽和多肽中的(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼序列，這些序列暴露接觸外部分子(例如受體)多于嵌在多肽內部或嵌于多肽的類似序列。考慮到更暴露接觸外部分子的(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼序列更可能有助于促進或減小VLS和與這些序列相關的其它毒性作用，因此應是誘變的主要靶。在某些實施方案中，當需要加入至少1種(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼序列時，更暴露接觸外部分子的蛋白區是加入這種序列的優選位置。在用于體外或體內測定前，突變或野生型蛋白、多肽或肽結構可通過X光晶體學或NMR直接測定，如本領域普通技術人員已知。
一旦包含(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列的氨基酸序列在肽、多肽或蛋白中改變或者加入肽、多肽或蛋白中，其促進至少1種毒性作用的能力變化可通過本文所述或本領域普通技術人員已知的任何技術來測定。
如本文所用，“改變”、“改變的”、“改變中的”、“改動”的包含(x)D(y)序列、(x)D(y)T和/或側翼區序列的氨基酸序列可包括本領域普通技術人員已知的在蛋白、多肽或肽中化學修飾包含(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼區序列的氨基酸序列，以及這種氨基酸序列的任何突變，包括但不限于插入、缺失、截斷或取代。這種變化優選改變1種或多種包含(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列的氨基酸序列的至少1種毒性作用(即促進VLS、EC損害、細胞凋亡、解聯蛋白樣活性的能力)。如本文所用，包含(x)D(y)序列或(x)D(y)T序列的氨基酸序列可包括(x)D(y)和/或(x)D(y)T三或四肽序列C和/或N末端的至少一個側翼序列。這種“改變”可在合成肽或核酸序列中產生，核酸序列表達以產生突變的蛋白、多肽或肽。
在發明的一方面，改變包含(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼區序列的氨基酸序列包括去除氨基酸序列。如本文所用，″去除″、″去除的″、″去除中的″或″除舊″包含(x)D(y)序列、(x)D(y)T和/或側翼區序列的氨基酸序列指一級氨基酸序列突變，突變去除(x)D(y)和/或(x)D(y)T三或四肽序列和/或至少1種天然側翼序列的存在或減小活性。術語“去除”或“缺乏”可交換使用。
例如，考慮到在1種或多種(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列位置(x)的突變會降低其促進VLS的能力，突變包括但不限于至少1種插入或取代至少一個氨基酸，氨基酸選自苯丙氨酸(F)；半胱氨酸/胱氨酸(C)；甲硫氨酸(M)；丙氨酸(A)；蘇氨酸(T)；絲氨酸(S)；色氨酸(W)；酪氨酸(Y)；脯氨酸(P)；組氨酸(H)；谷氨酸(E)；谷氨酰胺(Q)；天冬氨酸(D)；天冬酰胺(N)；賴氨酸(K)和精氨酸(R)，且突變包括但不限于表1所示。下表5列出示范但非限制性的修飾或稀有氨基酸，預期這些氨基酸在發明的某些方面有用。
也考慮到在1種或多種(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列位置(D)的突變會降低其促進VLS的能力，突變包括但不限于至少1種插入或取代至少一個氨基酸，氨基酸選自異亮氨酸(I)；纈氨酸(V)；亮氨酸(L)；苯丙氨酸(F)；半胱氨酸/胱氨酸(C)；甲硫氨酸(M)；丙氨酸(A)；甘氨酸(G)；蘇氨酸(T)；絲氨酸(S)；色氨酸(W)；酪氨酸(Y)；脯氨酸(P)；組氨酸(H)；谷氨酸(E)；谷氨酰胺(Q)；天冬酰胺(N)；賴氨酸(K)和精氨酸(R)，且突變包括但不限于表1所示。
考慮到在1種或多種(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列位置(y)的突變會降低其促進VLS的能力，突變包括但不限于至少1種插入或取代至少一個氨基酸，氨基酸選自異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；半胱氨酸/胱氨酸(C)；甲硫氨酸(M)；丙氨酸(A)；甘氨酸(G)；蘇氨酸(T)；色氨酸(W)；酪氨酸(Y)；脯氨酸(P)；組氨酸(H)；谷氨酸(E)；谷氨酰胺(Q)；天冬氨酸(D)；天冬酰胺(N)；賴氨酸(K)和精氨酸(R)，且突變包括但不限于表1所示。
在(x)D(y)序列的(x)或(y)殘基側翼的氨基酸也有助于其促進VLS的能力。例如，考慮到在1種或多種(x)D(y)T序列位置T的突變會降低其促進VLS的能力，突變包括但不限于至少1種插入或取代至少一個氨基酸，氨基酸選自異亮氨酸(I)；纈氨酸(V)；亮氨酸(L)；苯丙氨酸(F)；半胱氨酸/胱氨酸(C)；甲硫氨酸(M)；丙氨酸(A)；甘氨酸(G)；絲氨酸(S)；色氨酸(W)；酪氨酸(Y)；脯氨酸(P)；組氨酸(H)；谷氨酸(E)；谷氨酰胺(Q)；天冬氨酸(D)；天冬酰胺(N)；賴氨酸(K)和精氨酸(R)，且突變包括但不限于表1所示。
進一步考慮到在(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列的N或C末端側翼序列的至少1種突變、化學修飾、移動或其它改變也產生促進VLS能力減小的蛋白、多肽或肽。這種突變或改變優選在不影響活性部位的一個或多個殘基中發生。在其它實施方案中，突變或改變在一個或多個殘基中發生，從約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200個或更多N末端和/或C末端殘基到(x)D(y)三肽序列。在其它方面，不與(x)D(y)三肽相鄰的一個或多個殘基可有助于(x)D(y)基序的功能。這種殘基通過它們在三維模型中與三肽序列的鄰近性來鑒定，如本文所述且對本領域普通技術人員已知，考慮作為部分側翼序列用于改變。這種改變可包括上述任何用于改變(x)D(y)和x)D(y)T序列的，只要一個或多個“野生型”側翼殘基被改變、去除、移動、化學修飾等。
用本發明方法產生成的誘導VLS能力減小的蛋白、多肽和肽用作保護劑抗組合物產生的VLS，組合物含(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列。預期這種蛋白、多肽和肽可用作阻斷(x)D(y)和/或(x)D(y)T序列活性的抑制劑。另外，這種蛋白、多肽和肽能用于形成具有產生VLS能力降低的ITs。
1.誘變在某些方面，誘變編碼肽、多肽或蛋白的核酸可用于產生所需突變以提高或減少組合物促進VLS、細胞凋亡或與(x)D(y)和側翼序列有關的其它作用的能力。誘變可通過本文所示或本領域普通技術人員已知的任何方法進行。
一種特別有用的誘變技術是丙氨酸掃描誘變，其中一些殘基用丙氨酸單獨取代，從而可確定失去側鏈相互作用的效果，同時將大規模擾動蛋白構象的風險減至最低程度(Cunningham等，1989)。
由于可靶向特定氨基酸，位點特異性誘變是用于制備單獨肽、或生物功能等價蛋白或肽的技術，通過特異性誘變基本DNA。此技術進一步提供制備和測試序列變體的簡便能力，結合一個或多個上述考慮，通過將1種或多種核苷酸序列變化引入DNA。位點特異性誘變可產生突變體，通過使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列以及足夠量的相鄰核苷酸，以提供足夠大小和序列復雜性的引物序列，在經過的突變位置兩側形成穩定的雙鏈體。通常，優選約17到25個核苷酸長度的引物，改變序列匯合處的兩側上約5到10個殘基。
一般，位點特異性誘變技術在本領域熟知。要理解此技術通常使用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點誘變的典型載體包括載體如M13噬菌體。這些噬菌體載體可商業購買且它們的使用一般對本領域技術人員熟知。雙鏈質粒也常規用于定點誘變，這去除了將感興趣基因從噬菌體轉移到質粒的步驟。
一般，進行定點誘變首先要獲得單鏈載體，或熔解雙鏈載體的兩條鏈，雙鏈載體的序列內包括編碼所需蛋白的DNA序列。攜帶所需突變序列的寡核苷酸引物是合成制備的。此引物然后用單鏈DNA制品退火，受到DNA聚合酶如大腸桿菌(E.coli)聚合酶I Klenow片段作用以完成攜帶突變鏈的合成。因此，形成異源雙鏈，其中一條鏈編碼原始未突變序列且第二條鏈攜帶所需突變。然后，此異源雙鏈載體用于轉化適當細胞，如大腸桿菌細胞，選擇包括重組載體的克隆，重組載體攜帶突變的序列排列。另外，一對引物可退火成雙鏈載體的兩條單獨鏈以在PCRTM反應中同時合成具有所需突變的對應互補鏈。
用定點誘變制備選擇基因的序列變體作為一種產生潛在有用種類的方法提供且不想限制，因為有其它可獲得基因序列變體的方法。例如，編碼所需基因的重組載體可用誘變劑如羥胺處理以獲得序列變體。
2.重組載體、宿主細胞和表達術語“表達載體或構建物”指任何類型的含基因產物編碼核酸的遺傳構建物，其中能轉錄部分或所有編碼序列的核酸。轉錄物可翻譯成蛋白，但不需要。因此，在某些實施方案中，表達包括基因轉錄和RNA翻譯成基因產物。在其它實施方案中，表達僅包括核酸轉錄，例如用于產生反義構建物。
特別有用的載體預期是DNA區段編碼部分置于啟動子轉錄控制下的載體，無論是編碼全長蛋白、多肽或是較小的肽。“啟動子”指由細胞合成機器或導入的合成機器識別的DNA序列，需要起始基因的特異性轉錄。短語“有效地定位”、“控制下”或“轉錄控制下”指啟動子相對基因產物編碼核酸處于正確的位置和方向以控制RNA聚合酶起始和基因表達。
啟動子的形式可以是與基因天然相關的啟動子，可通過分離位于編碼區段或外顯子上游的5′非編碼序列獲得，例如用重組克隆和/或PCRTM技術，連同本文所示組合物(PCRTM技術公開于美國專利4,683,202和美國專利4,682,195，它們各納入本文供參考)。
在其它實施方案中，將編碼DNA區段置于重組或異源啟動子控制下預期會獲得一些優勢。如本文所用，重組或異源啟動子是指在天然環境中通常不與基因相關的啟動子。這種啟動子可包括通常與其它基因相關的啟動子和/或從任何其它細菌、病毒、真核細胞或哺乳動物細胞分離的啟動子和/或人手工造的非“天然產生”的啟動子，即包含與來自不同啟動子的差異元件或者增加、減少或改變表達的突變。
通常，使用在選擇用于表達的細胞類型、生物體或甚至動物中有效指導DNA區段表達的啟動子是重要的。使用蛋白表達用的啟動子和細胞類型組合一般對分子生物學領域技術人員已知，例如參見納入本文供參考的Sambrook等，(1989)。使用的啟動子可以是組成型或誘導型，能在適當條件下使用以指導所引入DNA區段的高水平表達，這在大規模生產重組蛋白或肽中有優勢。
啟動子中至少一個模塊通常發揮功能以定位RNA合成的起始位點。這方面最熟悉的例子是TATA框，但在一些缺乏TATA框的啟動子中，如用于哺乳動物末端脫氧核苷酸轉移酶基因的啟動子和用于SV40晚期基因的啟動子，在起始位點上面的不連續元件本身有助于固定起始位置。
另外的啟動子元件調節轉錄起始的頻率。通常，這些位于起始位點上游30-110bp區，盡管一些啟動子顯示也包含起始位點下游的功能元件。啟動子元件間的間距通常靈活，以便當元件彼此轉化或移動時保存啟動子功能。在tk啟動子中，在活性開始下降前，啟動子元件間的間距可增加到50bp相隔。單獨元件似乎能協同或獨立地發揮功能以激活轉錄，這取決于啟動子。
不認為用于控制核酸表達的特定啟動子是關鍵的，只要它能在靶細胞中表達核酸。因此，當靶向人細胞時，優選將核酸編碼區置于能在人細胞中表達的啟動子鄰近和控制下。一般而言，這種啟動子可包括人或病毒啟動子。
在表達中，通常包括聚腺苷酸化信號以實現轉錄物的適當聚腺苷酸化。不認為聚腺苷酸化信號的性質對發明的成功實踐是關鍵的，可使用任何這種序列。較佳實施方案包括SV40聚腺苷酸化信號和牛生長激素聚腺苷酸化信號，它們方便且已知在多種靶細胞中作用良好。也考慮終止子作為表達盒的元件。這些元件可用于提高信息水平和將盒到其它序列的通讀減至最低程度。
也需要特異性起始信號用于有效翻譯編碼序列。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。需要提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。本領域普通技術人員能容易確定并提供必需信號。眾所周知起始密碼子必須與所需編碼序列的讀框“符合讀框”以確保翻譯完整插入物。外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然或合成的。可通過包含適當轉錄增強子元件提高表達效率。
考慮一蛋白、多肽或肽可與其它選擇蛋白共表達，其中蛋白可在相同細胞中共表達或基因可提供給已有另一種選擇蛋白的細胞。可通過用2種不同重組載體共轉染細胞完成共表達，載體各攜帶任一DNA的拷貝。另外，單重組載體可構建成包括2種蛋白的編碼區，蛋白隨后能在轉染單載體的細胞中表達。在任一情況中，本文中術語“共表達”指在相同重組細胞中表達基因和其它選擇蛋白。
如本文所用，術語“工程”和“重組”細胞或宿主細胞指導入外源DNA區段或基因如cDNA或蛋白編碼基因的細胞。因此，工程細胞與天然產生細胞可區分，后者不含重組導入的外源DNA區段或基因。因而，工程細胞是具有一個或幾個人工引入基因的細胞。重組細胞包括具有引入的cDNA或基因組基因的細胞，也包括位置與啟動子相鄰的基因，啟動子不與特定引入的基因天然相關。
為表達重組蛋白、多肽或肽，無論是突變或是野生型的，可根據本發明制備表達載體，載體包括一個或多個啟動子控制下的野生型或突變型蛋白編碼核酸。為使編碼序列在啟動子“控制下”，將轉錄讀框的轉錄起始位點5′末端一般置于所選啟動子的“下游”(即3′)約1和約50個核苷酸之間。“上游”啟動子刺激DNA轉錄且促進編碼的重組蛋白的表達。這是“重組表達”在上下文中的意義。
有許多標準技術能用于構建含適當核酸和轉錄/翻譯控制序列的表達載體以便在多種宿主表達系統中完成蛋白、多肽或肽表達。表達可用的細胞類型包括但不限于細菌，如用重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。
原核宿主的某些例子是大腸桿菌菌株RR1、大腸桿菌LE392、大腸桿菌B、大腸桿菌X 1776(ATCC號31537)以及大腸桿菌W3110(F-，λ-，原養型，ATCC號273325)；桿菌如枯草芽孢桿菌；和其它腸桿菌科如鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)和多種假單胞菌(Pseudomonas)屬。
一般，含復制子和控制序列的質粒載體連同這些宿主一起使用，復制子和控制序列來源于與宿主細胞相容的種類。載體通常攜帶復制位點以及能提供轉化細胞中表型選擇的標記序列。例如，大腸桿菌常用pBR322的衍生物轉化，pBR322來源于大腸桿菌種的質粒。pBR322包含氨芐青霉素和四環素抗性基因并因此提供鑒定轉化細胞的簡便方法。pBR質粒或其它微生物質粒或噬菌體也必須包含或修飾以包含微生物能使用的啟動子以表達其自身的蛋白。
此外，含與宿主微生物相容的復制子和控制序列的噬菌體載體連同這些宿主可用作轉化載體。例如，噬菌體λGEMTM-11可用于產生重組噬菌體載體，載體可用來轉化宿主細胞，如大腸桿菌LE392。
更多有用的載體包括pIN載體(Inouye等，1985)；和pGEX載體，用于產生谷胱甘肽S-轉移酶(GST)可溶性融合蛋白，用于稍后的純化和分離或切割。其它合適的融合蛋白是具有β-半乳糖苷酶、泛素等的融合蛋白。
最常用于重組DNA構建的啟動子包括β-內酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)啟動子系統。盡管這些是最常用的，已發現并使用其它微生物啟動子，已發表有關它們的核苷酸序列的細節，使本領域技術人員能功能性地將它們與質粒載體連接。
下列有關細菌細胞如大腸桿菌中重組蛋白生產的細節通過一般重組蛋白生產的示范信息方式提供，對于特定重組表達系統的修改是本領域技術人員已知的。
含表達載體的細菌細胞例如大腸桿菌在任何一些合適的培養基如LB中生長。可誘導重組蛋白的表達，例如通過加入IPTG到培養基或將孵育轉換成較高溫度。進一步培養細菌一段時間后，一般在2到24小時之間，通過離心收集細胞并洗滌以去除剩余培養基。
然后裂解細菌細胞，例如通過在細胞勻漿器中破裂和離心以從可溶細胞成分中分離致密包含體和細胞膜。離心可在選擇性富集致密包含體的條件下進行，富集是通過將糖如蔗糖摻入緩沖液并以選擇性速度離心。
如果重組蛋白在包含體中表達，在許多情況中如此，重組蛋白可在任何一些溶液中洗滌以去除一些污染的宿主蛋白，然后溶于溶液，溶液含高濃度尿素(例如8M)或離液劑如鹽酸胍，存在還原劑如β-巰基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇)的情況下。
預期由發明方法產生的蛋白、多肽或肽可以“過量表達”，即表達水平相對其在細胞中的天然表達增加。這種過量表達可通過多種方法評估，包括放射性標記和/或蛋白純化。然而，優選簡單和直接的方法，例如包括SDS/PAGE和蛋白染色或蛋白質印跡的方法，接著定量分析，如光密度掃描所得凝膠或印跡。與天然細胞中的水平相比重組蛋白、多肽或肽的水平特異增加是過量表達的征兆，也是特異性蛋白、多肽或肽相對宿主細胞產生的其它蛋白的相對豐度，例如在凝膠上可見。
3.蛋白、多肽和肽本發明在較佳實施方案中也提供純化基本純化的蛋白、多肽或肽。如本文所用，術語“純化的蛋白、多肽或肽”指蛋白質組合物，從哺乳動物細胞或重組宿主細胞分離，其中至少1種蛋白、多肽或肽純化到相對其天然可獲得狀態的任何程度，即相對其在細胞提取物內的純度。因此，純化的蛋白、多肽或肽也指與其天然產生的環境無憂的野生型或突變型蛋白、多肽或肽。
先前披露了不同基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽序列，且可在本領域普通技術人員已知的計算機化數據庫中發現。一個這種數據庫是全國生物技術信息中心的Genbank和GenPept數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。這些已知基因的編碼區可用本文所示技術或本領域普通技術人員已知的任何技術來擴增和/或表達。另外，肽序列可通過本領域普通技術人員已知的方法合成，如用自動肽合成機器的肽合成，例如獲得自Applied Biosystems(Foster City，CA)的機器。
一般，“純化的”指進行分級分離以去除多種其它蛋白、多肽或肽的特異性蛋白、多肽或肽組合物，組合物基本保持其活性，所需蛋白、多肽或肽可通過例如蛋白測定評估，如下文所述或本領域普通技術人員已知。
當使用術語“基本純化的”時，指組合物中特異型蛋白、多肽或肽形成組合物的主要成分，如構成組合物中約50％的蛋白或更高。在較佳實施方案中，基本純化的蛋白構成組合物中大于60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多蛋白。
如本發明所用，“純化到均勻”的肽、多肽或蛋白指肽、多肽或蛋白具有純度水平，其中肽、多肽或蛋白基本沒有其它蛋白和生物成分。例如，純化的肽、多肽或蛋白通常基本沒有其它蛋白成分，這樣可成功地進行降解測序。
根據目前的披露，多種定量蛋白、多肽或肽純化程度的方法是本領域技術人員已知的。這些包括例如確定級分的特異蛋白活性或通過凝膠電泳評估級分內的多肽數量。
為純化所需蛋白、多肽或肽，包含至少一些特異性蛋白、多肽或肽的天然或重組組合物進行分級分離以從組合物中去除多種其它成分。除了下文詳述的技術外，多種適用于蛋白純化的其它技術是本領域技術人員熟知的。這些包括例如用硫酸銨、PEG、抗體等沉淀或熱變性，接著離心；層析步驟如離子交換、凝膠過濾、反相、羥磷灰石、外源凝集素親和及其它親和層析步驟；等電聚焦；凝膠電泳；這些和其它技術的組合。
另一個例子是用特異性結合伴侶純化特異性融合蛋白。這種純化方法是本領域常規的。由于本發明提供DNA序列用于特異性蛋白，目前能實踐任何融合蛋白純化方法。范例是產生特異性蛋白-谷胱甘肽S-轉移酶融合蛋白，在大腸桿菌中表達，用親和層析在谷胱甘肽-瓊脂糖上分離到均勻性或在蛋白的N或C末端產生聚組氨酸標記，隨后用Ni-親和層析純化。然而，許多DNA和蛋白是已知的或可用本文所述方法鑒定和擴增，現在能使用任何純化方法。
盡管優選用于某些實施方案，沒有一般要求蛋白、多肽或肽總以其最純化狀態提供。當然，考慮到相對天然狀態不太基本純化的蛋白、多肽或肽仍在所需蛋白組合物中富集，它們用于某些實施方案。
顯示相對純化程度較低的方法在總回收蛋白產物或維持表達蛋白活性上有優勢。失活產物也用于某些實施方案，例如通過抗體產生確定免疫原性。
4.抗體如本文所用，術語“抗體”泛指任何免疫結合劑，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般，優選IgG和/或IgM，因為它們是生理狀態中最常用的抗體且因為它們在實驗室環境中最容易制成。
術語“抗體”用于指任何抗體樣分子，分子具有抗原結合區且包括抗體片段如Fab′、Fab、F(ab′)2、單結構域抗體(DABs)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。制備和使用多種基于抗體的構建物和片段的技術在本領域熟知。制備和鑒定抗體特征的方法也在本領域熟知(參見例如《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；納入本文供參考)。
認識到單克隆抗體(MAbs)具有一些優勢，例如重復性和大規模生產，一般優選使用它們。因此，發明提供人、鼠、猴、大鼠、倉鼠、兔和甚至雞來源的單克隆抗體。由于制備容易且易獲得試劑，通常優選鼠單克隆抗體。
然而，“人源化”抗體也考慮作為來自小鼠、大鼠或其它種類的攜帶人恒定和/或可變區結構域的嵌合抗體、雙特異性抗體、重組和工程抗體和其片段。對患者的疾病“定制”的開發抗體的方法同樣已知，也考慮這種定制的抗體。
產生單克隆抗體(MAbs)的方法一般沿著與制備多克隆抗體相同的路線開始。簡要地，制備多克隆抗體是通過用免疫原性蛋白組合物免疫動物或根據本發明包括靶抗原表位和從免疫動物中收集抗血清。
同樣如本領域熟知，可通過使用稱為佐劑的免疫反應的非特異刺激劑增強特定免疫原組合物的免疫原性。合適的佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物，如細胞因子、毒素或合成組合物。
可使用的佐劑包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干擾素、GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物，如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂質A和單磷酰脂質A(MPL)。也考慮RIBI，它包含3種提取自細菌的成分MPL、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細胞壁骨架(CWS)于2％鯊烯/吐溫80乳劑中。甚至可使用MHC抗原。示范的且通常優選的佐劑包括完全弗氏佐劑(免疫反應的非特異刺激劑，含死結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。
除了佐劑外，需要共施用上調T細胞免疫或下調抑制細胞活性的生物反應調節劑(BRM)。這種BRMs包括但不限于西米替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；低劑量環磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)，細胞因子如γ-干擾素、IL-2或IL-12或編碼參與免疫輔助功能的蛋白的基因如B-7。
MAbs易用熟知技術制備，如納入本文供參考的美國專利4,196,265所例示。通常，此技術包括用選擇的免疫原組合物如純化或部分純化的蛋白、多肽、肽或結構域免疫合適的動物，它是野生型或突變型組合物。免疫組合物以有效刺激抗體生成細胞的方式施用。
產生單克隆抗體(MAbs)的方法一般沿著與制備多克隆抗體相同的路線開始。嚙齒動物如小鼠和大鼠是優選的動物，然而，也可能使用兔、羊或青蛙細胞。使用大鼠可提供某些優勢(Goding，1986，60-61頁)，但優選小鼠，BALB/c小鼠最優選，因為它最常使用且一般產生較高百分比的穩定融合。
動物用抗原注射，一般如上所述。如果需要，抗原可偶聯載體分子如匙孔血藍蛋白。抗原通常與佐劑混合，如弗氏完全或不完全佐劑。用相同抗原的加強注射以會在大約2周的間隔發生。
免疫后，選擇有潛力產生抗體的體細胞用于Mab產生方案，特定是B淋巴細胞(B細胞)。這些細胞可獲得自活檢的脾、扁桃體或淋巴結，或來自外周血樣品。優選脾細胞和外周血細胞，優選前者是因為它們是處于分裂漿母細胞階段的抗體生成細胞的豐富來源，后者是因為外周血易獲得。
通常，要免疫動物組且取出抗體滴度最高的動物的脾，脾淋巴細胞通過用注射器攪勻脾來獲得。一般，來自免疫小鼠的脾包含約5×107到2×108個淋巴細胞。
然后，來自免疫動物的抗體生成B淋巴細胞與無限增殖的骨髓瘤細胞融合，一般，骨髓瘤細胞來自的種類與免疫動物相同。適用于雜交瘤產生融合過程且優選非抗體生成骨髓瘤細胞系具有高融合效率和酶缺乏，酶缺乏使得然后不能在僅支持所需融合細胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養基中生長。
可使用任何一些本領域技術人員已知的骨髓瘤細胞(Goding，65-66頁，1986；Campbell，75-83頁，1984)。例如，當免疫動物是小鼠時，可使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/1.Ag 41、Sp2/0-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul；對于大鼠，可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；U-266、GMl500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6都連同人細胞融合一起使用。
一種優選的鼠骨髓瘤細胞是NS-1骨髓瘤細胞系(也稱為P3-NS-1-Ag4-1)，該細胞系易獲得自NIGMS人遺傳突變細胞貯藏室，申請細胞貯藏號GM3573。另1種可使用的小鼠骨髓瘤細胞系是8-氮鳥嘌呤抗性小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生成細胞系。
產生抗體生成脾或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜交體的方法通常包括以2∶1比例混合體細胞與骨髓瘤細胞，比例可分別從約20∶1到約1∶1不等，存在1種或幾種促進細胞膜融合的試劑(化學或電)。用仙臺病毒的融合方法已由Kohler和Milstein(1975；1976)描述，用聚乙二醇(PEG)如37％(v/v)PEG的融合方法由Gefter等，(1977)描述。使用電誘導的融合方法也合適(Goding 71-74頁，1986)。
融合過程通常以低頻率產生活雜交體，約1×10-6到1×10-8。然而，這不造成問題，因為活的融合雜交體通過在選擇性培養基中培養與親代未融合細胞(特別是正常無限地連續分裂的未融合骨髓瘤細胞)區分。選擇性培養基一般在組織培養基中包含阻斷核苷酸從頭合成的試劑。示范和優選的試劑是氨基喋呤、甲氨蝶呤和重氮絲氨酸。氨基喋呤和甲氨蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。當使用氨基喋呤或甲氨蝶呤時，培養基補充次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸來源(HAT培養基)。當使用重氮絲氨酸時，培養基補充次黃嘌呤。
優選的選擇培養基是HAT。只有能操控核苷酸補救途徑的細胞能在HAT培養基中存活。骨髓瘤細胞缺乏補救途徑的關鍵酶如次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)，它們不能存活。B細胞能操控此途徑，但它們在培養中的壽命有限且一般在大約2周內死亡。因此，唯一能在選擇性培養基中存活的細胞是從骨髓瘤和B細胞形成的雜交體。
此培養提供選擇特異性雜交瘤的雜交瘤群。通常，選擇雜交瘤是通過在微量滴定板中單克隆稀釋培養細胞進行的，接著測試單獨克隆上清(約2到3周后)的所需反應性。測定應是敏感、簡單和迅速的，如放射免疫測定、酶免疫測定、細胞毒性測定、噬菌斑測定、斑點免疫結合測定等。
然后連續稀釋選擇的雜交瘤并克隆到單獨抗體生成細胞系中，然后克隆能無限增殖以提供MAbs。細胞系可以2種基本方式用于MAb生成。首先，雜交瘤樣品能注射(通常注射入腹膜腔)入提供原始融合體細胞和骨髓瘤細胞的組織相容性動物類型(例如同系小鼠)。注射前，動物任選用碳氫化合物致敏，尤其是油如降植烷(四甲基十五烷)。注射的動物產生了分泌特異性單克隆抗體的腫瘤，抗體由融合的細胞雜交體生成。然后可抽出動物體液如血清或腹水以提供高濃度MAbs。第二，單獨細胞系能體外培養，其中MAbs天然分泌到培養基中，從培養基中能容易獲得高濃度MAbs。
如果需要，由任一方法產生的MAbs可進一步純化，使用過濾、離心和多種層析方法如HPLC或親和層析。發明的單克隆抗體片段可獲得自這些方法產生的單克隆抗體，方法包括酶消化如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通過化學還原的二硫鍵切割。另外，本發明涵蓋的單克隆抗體片段能用自動肽合成儀合成。
預期分子克隆方法可用于產生單克隆。為此，組合免疫球蛋白噬菌粒庫制備自從免疫動物的脾分離的RNA，表達適當抗體的噬菌粒通過淘選選擇，使用表達抗原的細胞和對照細胞。此方法相對常規雜交瘤技術的優勢是能在一輪中產生多約104倍的抗體并篩選，H和L鏈的組合產生新特異性，這進一步增加發現適當抗體的機會。
另外，本發明涵蓋的單克隆抗體片段可用自動肽合成儀合成，或通過在大腸桿菌中表達全長基因或基因片段。
C.ITs毒素和/或Mabs可獲得自天然來源或用重組DNA技術產生。至少1種毒素和至少1種抗體可組合形成免疫毒素(IT)。ITs結合成單一分子、配體的精致特異性和毒素的非凡毒性。盡管ITs在概念上簡單，它們是連續進行改進以獲得最佳體內活性的大和復雜的分子，因為它們的各普通成分如一個或多個結合部分、一個或多個交聯劑、1種或多種毒素引入必須解決的不同問題以使IT體內發揮最佳功能。
任何有足夠選擇性、特異性或親和性的抗體可用作IT的基礎。這種性質可評估，使用本領域技術人員已知的常規免疫學篩選方法。除了標準的抗原結合位點之外，抗體分子中結合生物活性分子的位點包括位于可變域中能結合病原體、B細胞超抗原、T細胞共同受體CD4和HIV-1包膜的位點(Sasso等，1989；Shorki等，1991；Silvermann等，1995；Cleary等，1994；Lenert等，1990；Berberian等，1993；Kreier等，1991)。此外，可變域參與抗體自身結合(Kang等，1988)且包含抗體識別的抗原表位(獨特位)(Kohler等，1989)。
用于發明的抗體或抗體片段的來源或衍生(例如Fab′、Fab或F(ab′)2)對發明實踐不重要，只要所用抗體或片段具有最終打算使用IT的所需性質。因此，當使用單克隆抗體時，它們可以是人、鼠、猴、大鼠、倉鼠、雞或甚至兔來源。發明也考慮使用人抗體，來自小鼠、大鼠或其它種類的攜帶人恒定和/或可變區結構域、單鏈抗體、Fv結構域的“人源化”或嵌合抗體，以及重組抗體和其片段。當然，由于制備容易且易獲得試劑，通常優選鼠Mabs。
在某些治療實施方案中，可使用已知抗體，如對實體瘤有高選擇性的抗體，例如用于結腸直腸瘤的B72.3、PRBC5或PR4D2；用于乳腺瘤的HMFG-2、TAG 72、SM-3或抗p185.sup.Her2；用于肺瘤的抗p185.sup.Her2；用于黑素瘤的9.2.27；用于卵巢瘤的MO v18和OV-TL3；用于淋巴瘤和白血病的抗Id、CD19、CD22、CD25、CD7和CD5。抗CD2、抗CD25、抗CD4和抗CD45R°ITs可根據發明純化并用于殺死惡性T細胞或HIV感染的細胞。同樣，CD3-特異性ITs以及CD4和CD25特異性ITs可純化并用于預防骨髓移植后的急性GVHD。
在其它實施方案中，可使用另1種免疫原和制備新Mab。制備Mabs的技術很簡單，易用本領域技術人員熟知的技術完成，如Kohler和Milstein(1975)的技術所例示。一般，免疫原腹膜內注射入小鼠。此過程以2周間隔重復3次，終免疫是通過靜脈內途徑。3天后，收集脾細胞并通過標準方案(Kohler和Milstein，1975)與SP2/0骨髓瘤細胞融合。生成具適當反應性抗體的雜交瘤然后通過極限稀釋法克隆。
用于形成ITs的毒素獲得自細菌或植物且是蛋白合成的抑制劑。它們是已知最強大的細胞毒物。如果進入細胞質，少于10個分子就會殺死細胞(盡管此許多倍數量的分子必須結合細胞表面，因為進入過程效率低)。此特別能力最初使人們擔心這種毒物太強大以致不能控制。然而，毒素可變成無害(除了當定向靶細胞時)，僅通過去除或修飾其細胞結合域或亞基。然后，毒素的剩余部分(缺乏細胞結合結構域)偶聯使毒性部分靶向靶細胞的配基(例如抗體)。通過選擇缺乏不需要交叉反應性的抗體，ITs更安全且非特異性細胞毒性作用小于最常規的抗癌藥物。毒素的另一個主要吸引力是因為它們是蛋白合成的抑制劑，它們殺死靜止細胞與分裂細胞一樣有效。因此，在治療時不處于循環的腫瘤或感染細胞不能逃脫IT的細胞毒性作用。
“毒素”在本文用于指任何抗細胞劑，包括但不限于細胞毒素和任何抗細胞劑的組合。在化療劑的情況中，可使用試劑如激素、類固醇；抗代謝物如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或氨基喋呤；蒽環霉素；絲裂霉素C；長春花生物堿；脫羰秋水仙堿；鬼臼亞乙苷；光神霉素；或抗腫瘤烷化劑如苯丁酸氮芥或美法蘭。
然而，優選毒素是獲得自植物、真菌或細菌的毒素，包括例如多種A鏈毒素，特別是RTA；RIPs如皂草素或白樹毒蛋白、α-八疊菌球、曲霉菌素或局限菌素；核糖核酸酶如胎盤核糖核酸酶；血管生成素、白喉毒素和假單胞菌外毒素，這僅例舉一些。示范毒素可突變以去除或改變誘導VLS的序列的位置，如表1所列殘基、本文所述殘基和其它蛋白中的等價殘基。
植物全毒素通常包含2條二硫鍵連接的鏈即A和B鏈。B鏈攜帶細胞結合區(其受體通常未確定特征)和易位區，易位區促進A鏈經酸性胞內區室插入細胞質。摻入后，A鏈殺死細胞。對于體內使用，配基和毒素必須偶聯，偶聯方式使它們在通過血流和組織時保持穩定且在靶細胞內仍不穩定，從而可釋放毒性部分到細胞質中。
連同發明一起使用的最優選毒素部分是RTA，特別是處理以修飾或去除碳水化合物殘基的毒素A鏈，所謂的dgRTA。可使用在大腸桿菌中表達且也缺乏碳水化合物的重組A鏈能使用。在某些實施方案中，RTA可如下文實施例3所述制成。
然而，從藥理學觀點出發，需要使用盡可能最小但仍提供適當生物反應的分子。因此，需要使用較小的A鏈肽或其它提供適當抗細胞反應的毒素。為此，其他人發現RTA可通過枯草菌蛋白酶(Sigma)去除30個N末端氨基酸來“截斷”，仍保持適當毒素活性。提議在需要時，此截斷A鏈可用于根據發明的綴合物。
另外，發現重組DNA技術應用于毒素部分會提供其它根據發明的顯著益處。其他人(O′Hare等，1987；Lamb等，1985；Halling等，1985)發表能克隆和表達生物活性RTA和其它VLS誘導毒素，現在可能鑒定和制備較小或另外仍顯示適當毒素活性的變種肽。此外，現在已克隆的RTA和其它VLS誘導毒素能應用定點誘變，通過定點突變易制備和篩選A鏈和其它VLS誘導毒素毒素衍生肽并獲得用于結合本發明的另外有用部分。一旦鑒定，這些部分可突變以產生毒素，毒素促進VLS、細胞凋亡、解聯蛋白樣活性、EC損害活性和本文所述或本領域技術人員已知這種序列的其它作用的能力減小。
ITs與PE、DT-A等以任意組合的融合通過重組DNA技術完成，此技術如本領域普通技術人員已知。抗體、細胞因子或可溶性受體DNA可用于這類制品。
綴合物的許多但不是所有毒素與結合劑區的交聯是發明的一個重要方面。在RTA的情況中，如果需要具有生物活性的綴合物，認為需要呈現二硫化物功能的交聯劑。原因不清楚，但可能是由于一旦試劑在靶細胞內“傳遞”毒素，需要易從結合劑釋放的毒素部分。各類型交聯劑以及交聯如何進行往往改變所得綴合物的藥效學。最后，希望有除了預期的作用部位，在體內各處所發現的條件下保持完整的綴合物，在預期作用部位需要綴合物有良好的“釋放”特征。因此，特定交聯方案具有一些重要性，特別包括所用特定交聯劑和交聯的結構。
交聯劑用于形成分子橋，使2種不同蛋白(如毒素和結合劑)的官能團連接一起。為以逐步方式連接2種不同蛋白，可使用消除不需要均聚物形成的異雙功能交聯劑。示范異雙功能交聯劑包含2個反應基團一個與一級胺基團(例如N-羥基琥珀酰亞胺)反應且另一個與硫醇基(例如吡啶基化二硫、馬來酰亞胺、鹵素等)反應。通過一級胺反應基團，交聯劑可與1種蛋白(例如選擇的抗體或片段)的賴氨酸殘基反應，通過硫醇反應基團，已連接第一種蛋白的交聯劑與另一種蛋白(例如dgRTA)的半胱氨酸殘基(游離巰基)反應。
任何交聯劑的這兩種反應基團間的間隔臂可具有不同長度和化學組成。較長的間隔臂允許綴合物成分靈活性更佳，而橋的某些特定成分(例如苯基)賦予反應基團額外的穩定性或增加化學鍵對不同方面的作用的抗性(例如抗還原劑的二硫鍵)。
最優選的交聯試劑是雙功能交聯劑SMPT，含由相鄰苯環和甲基“空間位阻”的二硫鍵。認為二硫鍵的空間位阻起保護鍵不受硫醇鹽陰離子攻擊的作用，如能存在于組織和血的谷胱甘肽，從而有助于防止在結合劑傳遞綴合物到作用部位前綴合物去偶聯。SMPT交聯劑與許多其它已知交聯試劑一樣，賦予交聯官能團能力，如半胱氨酸的SH或一級胺(例如賴氨酸的ε氨基)。另一種可能的交聯劑類型包括異雙功能光敏疊氮苯，它含可切割的二硫鍵如磺基琥珀酰亞胺基-2-(p-疊氮水楊酰氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。N-羥基琥珀酰亞胺基與一級氨基反應且疊氮苯(在光解時)與任何氨基酸殘基非選擇性地反應。
盡管“位阻”交聯劑一般在發明實踐中優選，可使用非位阻交聯劑且仍意識到與之相適應的優勢。不考慮包含或產生一種保護的二硫化物，其它有用的交聯劑包括SATA、SPDP和2-亞氨硫羥烷。使用這種交聯劑在本領域熟知。
1.IT綴合物本發明提供抗靶抗原表位的ITs，如在患病組織或疾病引起細胞上表達的抗原表位。在某些實施方案中，IT包含至少1種本文所述毒素。在其它實施方案中，IT或毒素進一步包含至少第2種試劑。這種試劑可以是分子或部分。這種分子或部分可包括但不限于至少1種效應或報道分子。效應分子包括具所需活性如細胞毒性的分子。附于抗體的效應分子的非限制性例子包括毒素、抗腫瘤劑、治療酶、放射性標記的核苷酸、抗病毒劑、螯合劑、細胞因子、生長因子和寡或多核苷酸。相反，受體分子定義為可用測定法檢測的任何部分。已綴合抗體的受體分子的非限制性例子包括酶、放射性標記、半抗原、熒光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、發光分子、光親和分子、有色粒子或配基如生物素。
至少第2種試劑的某些例子包括至少1種可檢測標記。“可檢測標記”是由于其特異功能性質和/或化學特征而能檢測的化合物和/或元素，使用它們能檢測其所附抗體，和/或如果需要可進一步定量。
許多適當顯像劑在本領域已知，它們附于抗體的方法也已知(參見例如美國專利號5,021,236；4,938,948和4,472,509，它們各納入本文供參考)。所用成像部分可以是順磁性離子；放射性同位素；熒光染料；NMR可檢測物質；X光成像。
含疊氮基的分子也可用于形成與蛋白的共價鍵，這是通過低強度紫外線產生的反應性氮賓中間物(Potter和Haley，1983)。嘌呤核苷酸的2-和8-疊氮類似物尤其用作定點光探針以鑒定粗細胞提取物中的核苷酸結合蛋白(Owens和Haley，1987；Atherton等，1985)。2-和8-疊氮核苷酸也用于繪制純化蛋白的核苷酸結合域(Khatoon等，1989；King等，1989；Dholakia等，1989)和可用作抗體結合劑。
一些方法在本領域已知用于附著或綴合抗體與其綴合物部分。一些附著方法包括使用金屬螯合復合體，使用例如有機螯合劑如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺酰胺和/或四氯-3α-6α-二苯糖聯脲-3附于抗體(美國專利號4,472,509和4,938,948，各納入本文供參考)。存在偶聯劑如戊二醛或高碘酸鹽的情況下，單克隆抗體也可與酶反應。有熒光素標記的綴合物在這些偶聯劑存在時制備或通過與異硫氰酸鹽反應制備。在美國專利號4,938,948中，乳腺瘤成像用單克隆抗體完成且可檢測的成像部分結合抗體，使用接頭如甲基-p-羥基苯并亞胺酸鹽(hydroxybenzimidate)或N-磺基琥珀酰亞胺基-3-(4-羥苯基)丙酸酯。
在其它實施方案中，預期免疫球蛋白衍生是通過在免疫球蛋白Fc區中選擇性引入巰基，使用不改變抗體結合位點的反應條件。根據此方法產生的抗體綴合物顯示有改善的壽命、特異性和敏感性(美國專利號5,196,066，納入本文供參考)。文獻也公開了位點特異性附著的效應或報道分子，其中報道或效應分子綴合Fc區中的碳水化合物殘基(O′Shannessy等，1987)。已報導此方法產生目前用于臨床評估的診斷和治療上有前途的抗體。
2.IT制備方法產生和制備ITs的方法是本領域普通技術人員已知的。這種方法公開于美國專利5,686,072、美國專利5,578,706、美國專利4,792,447美國專利5,045,451美國專利4,664,911和美國專利5,767,072，各納入本文供參考。IT的毒性部分可以是多種本領域常用毒素中的任何一種。IT可以是完整毒素、毒素A鏈或天然產生的單鏈RIP。發明涵蓋的毒素包括但不限于白喉毒素(DT)和DT(CRM-45)；假單胞菌內毒素衍生的PE38；RTA和紅豆因和兩者的阻斷形式；白樹毒蛋白和皂草素。
ITs包含通過位阻二硫化物接頭共價結合dgRTA的Mabs，這種Its最近用于治療非何杰金氏(B細胞)淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤新生物或GVHD的臨床試驗。這些“第2代”ITs穩定、長壽并顯示對靶細胞有強的細胞毒性。已研制了迅速制備高產量ITs的標準化方法(Ghetie等，1991)。
制備具有例如dgRTA的ITs的方法包括用SMPT衍生Mabs和用二硫蘇糖醇(DTT)還原dgRTA，接著兩種成分反應以確立位阻鏈間二硫鍵。化學交聯反應產生抗體、毒素和ITs的混合物，混合物然后純化以去除游離抗體和游離毒素分子并隨后分離不同IT種類，IT種類包括分別與1、2、3或大于3個毒素分子綴合的一個抗體分子。去除交聯反應的未反應成分可通過在親和層析柱如活性染料/瓊脂糖上的連續層析以去除游離抗體，接著是凝膠過濾以去除高分子量物質和游離毒素。
此方法得到不同毒素/抗體比例的綴合物的混合物。本發明的一個重要實施方案是進一步純化此混合物以獲得基本包含單一毒素/抗體比例的制品，從不同毒素/抗體比例的ITs分離。此純化通過進一步層析分離完成，可伴隨親和層析如用鹽梯度以洗脫不同種類的ITs以及凝膠過濾以從較大分子分離ITs。
本發明的另一個重要實施方案是確定哪個毒素/IgG比例是用于藥物制品的最有效細胞毒性劑的能力。分離和鑒定本發明可能產生的各單一種類的IT在臨床應用中具有特別的優勢，因為這允許醫師練習對特定情形中所施用有效量IT的更精確控制。
3.凝膠過濾待用于本發明方法的凝膠是有隨機結構的三維網絡。分子篩凝膠包含不與分析或分離物質結合或反應的交聯聚合物。為了凝膠過濾目的，凝膠物質一般不帶電。凝膠內的空間充滿液體且液相構成大部分凝膠體積。凝膠過濾柱常用的物質包括葡聚糖、瓊脂糖和聚丙烯酰胺。
葡聚糖是由葡萄糖殘基組成的多糖且可商業購買，名稱為SEPHADEX(Phamacia Fine Chemicals，Inc.)。制成不同交聯程度的珠以通過多種孔大小來分離不同大小的分子。烷基葡聚糖與N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯以形成SEPHACRYL-S100到S1000，可制成分級分離范圍大于SEPHADEX的強珠。
聚丙烯酰胺也可用作凝膠過濾介質。聚丙烯酰胺是交聯丙烯酰胺的聚合物，用N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯劑制備。聚丙烯酰胺可獲得自Bio-Rad實驗室(美國)，有多種孔大小用于分離不同大小的顆粒。
凝膠物質在水和一些有機溶劑中溶脹。溶脹是孔充滿待用作洗脫液的液體的過程。由于較小的分子進入孔，它們在凝膠中的前進比不進入孔的較大分子遲滯。這是分離的基礎。有不同精細程度的珠用于不同應用。珠越粗糙，流動越快且分離越差。超細用于最大分離，但流動很慢。細用于需要較快流速的大柱中制備性工作。較粗糙的等級用于大制備，其中分離沒有時間重要，或用于分離分子量有大差異的分子。對于凝膠層析的討論，參見納入本文供參考的Freifelder，《物理生化》(Physical Biochemistry)，第2版，238-246頁。
用于本發明的最優選凝膠過濾方法使用葡聚糖凝膠如SEPHADEX，使用葡聚糖-聚丙烯酰胺凝膠如能分離180到240千道爾頓范圍分子的SEPHACRYL。
4.親和層析親和層析一般基于物質如配基或抗體識別蛋白。可通過共價偶聯結合分子如活性染料與不溶性基質合成柱物質。柱物質隨后可從溶液中吸收所需物質。其次，改變條件到不發生結合并洗脫底物的條件下。親和層析成功的要求是基質必須吸收分子，配基必須偶聯而不改變其結合活性，必須選擇結合是足夠緊的配基，且必須可能洗脫物質而不破壞它。
本發明的較佳實施方案是親和層析方法，其中基質是反應性染料-瓊脂糖基質。Blue-SEPHAROSE是由Cibacron Blue 3GA和瓊脂糖或SEPHAROSE組成的柱基質，可用作親和層析基質。最優選的基質是SEPHAROSE CL-6B，可從SigmaChemical Company作為Reactive Blue 2購買，目錄#R 8752。此基質直接結合本發明的ITs且能用鹽梯度洗脫來分離它們。
5.ELISAELISAs可結合發明使用。在ELISA測定中，結合毒素A鏈序列的蛋白或肽固定于選擇的表面上，優選顯示蛋白親和性的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的孔。沖洗以去除不完全吸收的物質后，需要與非特異性蛋白結合或包被測定平板孔，非特異性蛋白已知關于測試抗血清為抗原中性，抗血清如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。這允許在固定表面上封閉非特異性吸收位點，因而減少抗血清非特異性結合到表面引起的背景。
抗原物質結合孔后，用非反應物質包被以減少背景，且洗滌以去除未結合物質，固定表面接觸待測試的抗血清或者臨床或生物提取物，接觸方式有助于免疫復合體(抗原/抗體)形成。這種條件優選包括用稀釋劑如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸緩沖鹽水(PBS)/吐溫稀釋抗血清。這些加入的試劑也趨向有助于減少非特異背景。隨后可孵育分層抗血清2到4小時，溫度優選以25℃到37℃的順序。孵育后，洗滌接觸抗血清的表面以去除非免疫復合物質。優選的洗滌過程包括用溶液如PBS/吐溫或硼酸緩沖液洗滌。
在測試樣品和結合抗原間形成特異免疫復合體后，隨后洗滌，免疫復合體形成的發生和甚至量可通過同樣接觸對第1種抗體有特異性的第2種抗體來確定。為提供檢測方法，第2種抗體優選有相關的酶，此酶在用適當顯色底物孵育時產生顯色。因此例如，需要接觸尿素酶或過氧化物酶綴合的抗人IgG并孵育一段時間，所處條件有利于免疫復合體形成的顯色(例如在含PBS的溶液如PBS-吐溫中室溫孵育2小時)。
用第2種酶標記的抗體孵育后，隨后洗滌以去除未結合物質，標記量通過用顯色底物孵育來定量，如在過氧化物酶的情況中，尿素和溴甲酚紫或2，2′-連氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和H2O2作為酶標記。然后，通過測量顏色發生程度完成定量，例如用可見光譜分光光度計。
D.接種疫苗本發明預期疫苗用于免疫實施方案。通過改變1種或多種(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼區序列使蛋白質組合物促進VLS或其它毒性作用的效果減小，預期這種蛋白質組合物可用作抗原。在特定實施方案中，含1種或多種(x)D(y)、(x)D(y)T和/或側翼區序列的肽預期作為有用抗原。抗原物質優選充分透析以去除不需要的小分子量分子和/或凍干以更易配制在所需載體中。在其它實施方案中，也可能使用缺乏一個或多個活性部位殘基的毒素(即類毒素)作為疫苗。
1.免疫調節劑預期免疫調節劑可包括于疫苗以增強患者的反應。當細胞是組合物一部分時，免疫調節劑可作為純化蛋白包含于細胞中或其表達在細胞中改造。下列部分列出感興趣的免疫調節劑例子。
a.細胞因子白介素和細胞因子、表達白介素和細胞因子的載體預期作為可能的疫苗成分。白介素和細胞因子包括但不限于白介素1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-干擾素、α-干擾素、γ-干擾素、血管抑制、凝血細胞反應素、內皮抑制素、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、腫瘤壞死因子、TGFβ、LT和其組合。
b.趨化因子趨化因子或編碼趨化因子的基因也可用作疫苗成分。趨化因子一般作為化學吸引物以募集效應分子到趨化因子表達的位點。可有利于表達特定趨化因子基因結合例如細胞因子基因，以增強募集其它免疫系統成分到治療部位。這種趨化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。技術人員認識到某些細胞因子也已知具有化學吸引作用且也能在術語趨化因子中下分類。
多價疫苗的制備一般在本領域熟知，如美國專利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770所例示，它們都納入本文供參考。通常，這種疫苗制備為可注射的。作為液體溶液或懸浮液也可制備適用于液體中溶液或懸浮液中的固體形式，然后注射液體。制品也能乳化。活性免疫原性成分通常混合藥學上可接受且與活性成分相容的賦形劑。合適的賦形劑是例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等或其組合。此外，如果需要，疫苗可包含少量輔助物質如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、或提高疫苗效力的佐劑。
疫苗可常規腸胃外施用，通過注射，例如皮下、皮內或肌肉內。適用于其它施用方式的另外制劑包括栓劑，在一些情況中是口服或鼻制劑。對于栓劑，常規結合劑和載體可包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯這種栓劑可形成自混合物，混合物含約0.5％到約10％范圍的活性成分，優選約1％到約2％。口服制劑包括一般使用的賦形劑如藥物等級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉劑的形式，包含約10到約95％的活性成分，優選約25％到約70％。
疫苗施用方式與劑型相容，施用量在治療上有效且是免疫原性。待施用量取決于待治療受試者，包括例如單獨免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度。需施用的精確活性成分的量取決于醫師的判斷。然而，合適的劑量范圍等級為幾百微克活性成分每疫苗接種。初始施用和加強注射的合適方案也是可變的，但典型是初始施用，接著隨后接種或其它施用。肌肉內途徑在體內半衰期短的毒素的情況中優選。
多種實現疫苗輔助作用的方法包括使用試劑如氫氧化鋁或磷酸鋁(明礬)，它通常用作磷酸緩沖鹽水中約0.05到約0.1％溶液，以約0.25％溶液用于混合合成的糖聚合物(Carbopol)，通過熱處理聚集疫苗中的蛋白，溫度范圍分別在約70到約101℃間，時間為30秒到2分鐘。也可通過用胃蛋白酶處理的(Fab)抗體再活化白蛋白的聚集作用，混合細菌細胞如微小隱孢子蟲(C.parvum)或革蘭氏陰性細菌的內毒素或脂多糖成分，在生理上可接受的油載體如二縮甘露醇單油酸酯(Arecel A)中乳化或用20％全氟化碳溶液(Fluosol-DA)乳化，全氟化碳用作封閉代用品。
在許多情況中，需要多重施用疫苗，通常不超過6次疫苗接種，更通常不超過4次疫苗接種且優選1次或多次，通常至少約3次疫苗接種。這些技術熟知并可在多種專利中發現，如闡述這些測定類型的美國專利號3,791,932；4,174,384和3,949,064。
2.佐劑免疫方案使用佐劑刺激反應多年。一些佐劑影響呈遞抗原的方式。例如，當蛋白抗原由明礬沉淀時，免疫反應增加。抗原乳化也延長抗原呈遞的持續時間。其它佐劑如一些獲得自細菌的有機分子，作用于宿主而不是抗原。一個例子是胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺[MDP])，它是細菌肽聚糖。與大部分佐劑一樣，MDP的效果沒有充分了解。MDP刺激巨噬細胞，但似乎也直接刺激B細胞。因此，佐劑的作用不是抗原特異性。然而，如果它們與純化抗原一起施用，它們能用于選擇性促進對抗原的反應。
佐劑在實驗上用于促進抗未知抗原的免疫性普遍增加(例如美國專利4,877,611)。這特別已在癌癥治療中嘗試。對于許多癌癥，有令人信服的證據表明免疫系統參與宿主抗腫瘤細胞防御，但認為迄今僅鑒定腫瘤特異性抗原可能總量的一部分。
本發明考慮到多種佐劑可用于細胞如腫瘤細胞的膜，產生改進的免疫原性組合物。唯一的要求一般是佐劑能攝入、物理聯合、或綴合正在討論中的細胞的細胞膜。
本領域技術人員知道可綴合根據此發明的細胞疫苗的不同種類的佐劑，這些包括烷基溶血磷脂(ALP)；BCG和生物素(包括生物素酰化的衍生物)。特別考慮使用的某些佐劑是來自革蘭氏陰性-細胞的磷壁酸。這些包括脂磷壁酸(LTA)、核醣醇磷壁酸(RTA)和甘油磷壁酸(GTA)。其合成對應物的活性形式也可結合發明使用(Takada等，1995)。
血藍蛋白和血赤蘚素也可用于發明。特別優選使用匙孔血藍蛋白(KLH)，盡管可使用其它軟體動物和節肢動物血藍蛋白和血赤蘚素。
也能使用各種多糖佐劑。例如，Yin等，(1989)描述在小鼠的抗體反應中使用多種肺炎球菌多糖佐劑。特別優選多糖的聚胺種類，如幾丁質和殼聚糖，包括脫乙酰幾丁質。
另一個優選佐劑組是細菌肽聚糖的胞壁酰二肽(MDP，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺)組。也考慮胞壁酰二肽的衍生物，如氨基酸衍生物蘇氨酰-MDP和脂肪酸衍生物MTPPE。
美國專利4,950,645描述胞壁酰二肽的親脂性二糖-三肽衍生物，建議它用于從磷脂酰膽堿和磷脂酰甘油形成的人工脂質體。美國專利4,950,645和PCT專利申請WO 91/16347的化合物以前沒有建議用于細胞載體，現在建議用于本發明。
本發明的優選佐劑是BCG。BCG(卡介苗桿菌，分枝桿菌的減毒株)和BCG-細胞壁骨架(CWS)也可用作發明的佐劑，有或沒有海藻糖二霉菌酸。海藻糖二霉菌酸可如美國專利4,579,945所述制備。
BCG的細胞壁提取物證明有極好的免疫佐劑活性。近來發展的用于分枝桿菌的分子遺傳工具和方法提供將外源基因導入BCG的方法(Jacobs等，1987；Snapper等，1988；Husson等，1990；Martin等，1990)。BCG和其它分枝桿菌是非常有效的佐劑，已廣泛研究對分枝桿菌的免疫反應(Luelmo，1982；Lotte等，1984)。示范BCG疫苗以TICEBCG出售(Organon Inc.，West Orange，NJ)。在一個典型的本發明實踐中，牛分枝桿菌-BCG的細胞通過本領域已知方法生長和收集(例如Dubos等，1947；Rosenthal，1937)。
兩親性和表面活性劑如皂草素和衍生物如QS21(Cambridge Biotech)形成另一組用于本發明免疫原的優選佐劑。也可使用非離子嵌段共聚物表面活性劑(Rabinovich等，1994；Hunter等，1991)。如Yamamoto等(1988)所述，寡核苷酸是另一有用的佐劑組。Quil A和香菇多糖完善了目前優選的佐劑列表。盡管各試劑和下述內毒素作為佐劑是眾所周知的，這些化合物以前沒有摻入到靶細胞的膜中，如本文所示。
一組特別優選用于本發明的佐劑是去毒內毒素，如美國專利4,866,034的精制的去毒內毒素。這些精制的去毒內毒素在哺乳動物中有效產生佐劑反應。
去毒內毒素可結合其它佐劑以制備多佐劑摻入的細胞。考慮到去毒內毒素與海藻糖二霉菌酸的組合，如美國專利4,435,386所述。也考慮到去毒內毒素與海藻糖二霉菌酸和內毒素糖脂的組合(美國專利4,505,899)，同樣考慮到去毒內毒素與細胞壁骨架(CWS)或CWS和海藻糖二霉菌酸的組合，如美國專利4,436,727、4,436,728和4,505,900所述。沒有去毒內毒素的僅CWS和海藻糖二霉菌酸的組合也預期是有用的，如美國專利4,520,019所述。
當例如需要產生抗體或隨后獲得活化細胞T時，多種佐劑甚至是不常用于人的佐劑仍可用于動物。佐劑或細胞產生的毒性或其它副作用例如用非輻射腫瘤細胞可能發生的，在這種環境中不相關。
E.藥物制品本發明的藥物含水組合物包含有效量的1種或多種IT、VLS抑制肽或多肽、VLS刺激肽或多肽和/或細胞因子，溶于或分散于藥學上可接受載體或水介質。短語“藥學上或藥理學上可接受”指施用給人時不產生有害、過敏或其它不適當反應的分子實體和組合物。如本文所用，“藥學上可接受載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。使用這種用于藥物活性物質的介質和試劑在本領域熟知。除了在任何常規介質或試劑與活性成分不相容的范圍，考慮其用于治療組合物。輔助活性成分也能摻入組合物。
下列緩沖液和試劑特別考慮用于制備本發明藥物制品dgRTA，去糖基化篦麻蛋白A鏈；DMF，二甲基甲酰胺(Pierce，Rockford，Ill.)；DTT(Pierce)；PBE，0.05M磷酸鈉，pH7.5，1mM EDTA；PBES，0.05M磷酸鈉，pH7.5，不同NaCl濃度(如0.1M，0.2M、0.3M、0.4M和0.5M NaCl)和1mM EDTA；PBSE，0.01M磷酸鈉，pH7.5，0.17M NaCl和1mM EDTA；SMPT，N-琥珀酰亞胺基-氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫代)甲苯(N-succinimidyl-oxycarbonyl-α-methyl-α(2-pyridyldithio)toluene)(Pierce)。所有緩沖液也可用無內毒素的蒸餾水制備，使用酶等級鹽(Fisher Biotec，Springfield，N.J.)。
可配制ITs、肽或多肽和/或細胞因子用于腸胃外施用，例如配制用于經靜脈內、肌肉內或皮下途徑注射，盡管可使用其它途徑如氣霧劑施用。制備含至少1種IT、蛋白質物質和/或細胞因子作為活性成分的含水組合物通過本說明書對本領域技術人員已知，如納入本文供參考的《雷明頓藥物科學》(Remington′s PharmaceuticalSciences)，第16版，Mack Publishing Company，1980所例示。此外，對于人施用，要理解制品應符合FDA生物標準辦公室要求的無菌、熱原性、綜合安全和純化標準。
通常，這種組合物可制備為注射劑，作為液體溶液或懸浮液；也可制備固體形式，固體形式適用于在注射前加入液體時制備溶液或懸浮液；制品也可乳化。組合物無菌，流動到易存在可注射性(syringability)的程度，在生產和貯存條件下穩定，保持抗微生物如細菌和真菌的污染作用。理解內毒素污染最低限度應保持在安全水平，例如小于0.5ng/mg蛋白。
盡管ITs、肽或多肽和/或細胞因子最優選在含其它非活性成分的無菌水中制備，適合注射，如果需要，這種活性成分的溶液也可在適當混合表面活性劑如羥丙基纖維素的水中制備。分散體也可在液體聚乙二醇和其混合物和油中制備。載體也可以是溶劑或分散介質，含例如水、乙醇、多元醇(如丙二醇、液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。可維持適當流動性，例如通過使用包衣如卵磷脂，在分散體的情況中通過維持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑。
預防微生物作用可通過多種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撤等。在許多情況中，優選包括等滲試劑，例如糖或氯化鈉。延長吸收可注射組合物可通過使用延遲吸收的試劑的組合物，例如單硬脂酸鋁和明膠。
配制成時，溶液施用方式與劑型相容且量在治療上有效。對于例如在水溶液中腸胃外施用，如果需要應適當緩沖溶液且液體稀釋劑首先用足夠的鹽水或葡萄糖變成等滲。這些特定水溶液尤其適合靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內施用。就此而論，可使用的無菌水介質通過本說明書對本領域技術人員已知。一些劑量變化必然發生，這取決于被治療受試者的狀況。無論如何，負責施用的人決定單獨受試者的適當劑量。
特別考慮到合適的藥物IT、肽或多肽組合物一般包括但不限于約10到約100mg所需IT綴合物、肽或多肽，混合可接受的藥物稀釋劑或賦形劑如無菌水溶液，以在例如pH7.5到9.0的0.15M NaCl水溶液中產生相對綴合物約0.25到約2.5mg/ml的終濃度。制品可在-10℃到-70℃保存至少1年。
F.試劑盒在更進一步的實施方案中，本發明涉及用于IT或上述疫苗接種方法的試劑盒。試劑盒可提供VLS促進或毒性作用降低的毒素、細胞因子或抗原組合物。這種試劑盒可用于在準備使用和可貯存的容器中結合毒素與特異性抗體以產生IT，提供毒性減小的細胞因子，或提供疫苗接種的抗原。另外，試劑盒可包括VLS產生序列的肽抑制劑或外滲的蛋白質增強物。然而，可提供包括這種成分組合的試劑盒。因此，試劑盒以合適容器方式包括VLS促進活性減小或提高的蛋白質組合物。試劑盒可以合適容器方式包括抗體或IT。
試劑盒的容器方式一般包括至少1種小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其它容器方式，其中可放置至少1種蛋白、多肽或肽，和/或優選適當的等分。本發明試劑盒可包括含至少1種抗體、IT和/或任何其它試劑容器的方式，封閉限制用于商業出售。這種容器可包括注射和/或吹模塑料容器，其中保留所需小瓶。
實施例以下例子用于證明發明的較佳實施方案。本領域技術人員應理解以下例子所公開的技術代表發明者發現在發明實踐中作用良好的技術，因此可認為是構成其實踐的優選方式。然而，本領域技術人員根據本說明書應理解可對公開的特定實施方案進行許多改變且仍獲得相似或類似結果，而不北離發明的精神和范圍。
實施例1起始血管裂隙綜合征的結構基序此例子證明毒素和IL-2中的三個氨基酸序列基序(x)D(y)導致破壞血管ECs。產生來自RTA或IL-2的含短(＜20個氨基酸)(x)D(y)基序的肽，肽含側翼甘氨酸和半胱氨酸，以及具有序列缺失或突變的肽。這些肽經半胱氨酸附著不與HUVECs反應的小鼠IgG1 Mab(RFB4)。比較此IgG-肽綴合物(IgG-RTA)在3個VLS模型系統中的VLS誘導能力。第一個是對人臍帶內皮細胞(HUVECs)的體外損害(Soler-Rodriguez等，1993)；第2個是小鼠肺中的體內流體積聚(Baluna和Vitetta，1996)；第3個是SCID小鼠中的體內人皮膚異種移植物(Baluna和Vitetta，1999)。
肽合成。合成的肽有來自RTA的13個氨基酸(殘基69-81，SEQ ID NO1)，加入N和C末端甘氨酸殘基以提高溶解度(表6)。含(x)D(y)基序的肽難以溶解，即使肽各末端上有另外3個側翼甘氨酸。為此，它們綴合可溶性載體蛋白。選擇MAbRFB4，因為RFB4-dgRTA是原型的IT，因此RFB4-肽應“模擬”ITs。
加入N末端半胱氨酸以偶聯肽與RFB4MAb。合成2種RTA對照肽(表6)。也合成有來自IL-2殘基15-23的9個氨基酸的肽以及對照肽(表6)。同樣，加入側翼甘氨酸和半胱氨酸。所有肽在Applied Biosystems型號430A固相肽合成儀上合成。
肽綴合RFB4。所有肽包含N末端半胱氨酸殘基以促進與馬來酰亞胺衍生的RFB4綴合。RFB4用25倍摩爾過量的琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環己胺-1-羧酸酯處理并通過凝膠過濾去除過量試劑。引入各RFB4分子的馬來酰亞胺基團數通過反滴定2-巰基乙胺確定，使用Ellman試劑(Husain和Bieniarz，1994)。衍生的RFB4與10倍過量的SH-肽在室溫反應4小時且過量肽通過相對PBS透析來去除。馬來酰亞胺反應可形成IgG1-C-S-肽綴合物，其中附著的肽基團數量與游離的馬來酰亞胺基團類似。
1各肽如所述綴合小鼠Mab，RFB4。
通過HPLC和放射性標記確定，RFB4-肽綴合物(表6)包含6到9個馬來酰亞胺基團每IgG1分子，這些基團通過與含半胱氨酸的肽反應形成穩定的硫醚鍵。
RFB4-肽對HUVEC單層形態的影響。為確定RTA中的LDV序列和IL-2中的LDL序列是否損害HUVECs，單層用不同濃度的RFB4-RTA-肽、RFB4-IL-2-肽或對照孵育。分離HUVECs，培養并顯微鏡研究(Baluna等，1996；Soler-Rodriguez等，1993)。
HUVEC單層用10-6M RFB4-LDV+、RFB4-LDV-、RFB4-GQT、RFB4-LDL+、RFB4-LDL-或僅培養基37℃孵育18小時，然后通過相差顯微鏡(放大20x)檢測。正常的單層由具形狀伸長的高度壓緊的細胞組成，而損害的細胞圍攏且與平板分離。未處理的HUVECs由緊密壓緊的伸長細胞組成。用10-6M RFB4-LDV+或RFB4-LDL+處理導致細胞在孵育2小時后圍攏并在18小時后在單層中形成缺口。用RFB4-LDV-、RFB4-GQT或RFB4-LDL-沒有觀察到對HUVECs的毒性作用。含LDV或LDL的RFB4-肽的毒性作用是劑量依賴性且可與用RFB4-dgRTA觀察到的作用相比較(表7)。這些結果表明，RTA中的LDV序列和其在IL-2中的LDL同系物參與這些試劑的EC毒性。
1HUVECs在96孔組織培養板中生長到鋪滿，在有2％FCS的M199中，用不同濃度RTA衍生的肽構建物處理細胞18小時。
2形態變化記號為“-”沒有變化，“+”細胞圍攏，“++”細胞破裂和與細胞單層分離。
RFB4-肽的體內作用。盡管在實驗動物中觀察到IL-2的血管毒性(Orucevic和Lala，1995；Puri等，1989；Puri和Rosenberg，1989；Rosenstein等，1986)，難以在小鼠、大鼠或猴中誘導dgRTA-IT介導的VLS的全身性征象(Soler-Rodriguez，1992)。研制了一種模型研究ITs體內對人內皮的作用，通過移植血管化人皮膚到SCID小鼠上，用dgRTA-ITs注射小鼠且移植物中的流體積聚測量為濕/干重比例(Baluna等，1998)。測量人皮膚中的流體積聚是通過在冷凍干燥之前和之后稱重皮膚移植物的鉆取活檢。此模型用于評估RFB4-LDV+、RFB4-GQT+和RFB4-dgRTA的體內作用(圖1A)。
也評估正常SCID小鼠肺中的流體積聚，因為IL-2誘導小鼠肺中的流體積聚(Orucevic和Lala，1995)。肺或皮膚移植物的水含量計算為濕/干重比例。
盡管難以在注射RTA-ITs的小鼠中證明VLS的全身性征，血管裂隙在SCID小鼠的人皮膚異種移植物中發生。注射RFB4-LDV+和RFB4-dgRTA后發現人皮膚異種移植物的濕/干重比例增加，但注射RFB4-GQT+后則沒有。這些異種移植物中的流體積聚可比較，使用RFB4-dgRTA或RFB4-LDV+。用SCID小鼠肺獲得可比較結果(圖1B)。應指出盡管圖中的差異好像，它們在統計上顯著并與用IL-2的報導一致(Orucevic和Lala，1995)。
流式細胞儀分析dgRTA和RFB4-肽與HUVECs的結合。RFB4-LDV+和RFB4-LDL+損害HUVECs，暗示這些肽與HUVECs上的結合位點相互作用，盡管在完整IL-2或RTA分子中，(x)D(y)基序可能不是主要的ECs結合位點。針對毒素的這些問題，進行了一系列結合和結合/抑制研究。
蛋白偶聯異硫氰酸熒光素(FITC)(Sigma，St.Louis，MO)。105HUVECs在含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.01％疊氮化鈉(PBS/BSA/AZ)的冷PBS中洗2次，重懸于100μl相同緩沖液并用FITC-試劑在冰上黑暗中孵育30分鐘，用PBS/BSA/AZ洗3次，在0.5ml 1％低聚甲醛PBS/AZ中固定，用FACScan(Becton Dickinson，Mountain View，CA)和CytoQuest軟件分析。
檢測了dgRTA、PE38-lys和RFB4-肽與HUVECs的結合。105HUVECs用100μl PBS/BSA/AZ中的FITC試劑以不同濃度在冰上孵育30分鐘，洗滌，在1％低聚甲醛中固定，流式細胞儀分析。值代表3次實驗的平均數±SD，用FITC-dgRTA、FITC-PE38-lys和FITC-碳酸酐酶作為對照。作出dgRTA、PE38-lys和碳酸酐酶與HUVECs結合的流式細胞儀分析的柱形圖。也評估了FITC-RFB4-LDV+(-)、FITC-RFB4-LDV-、FITC-RFB4-GQT+、FITC-RFB4、FITC-RFB4-LDL+和FITC-RFB4-LDL-的結合。也作出RFB4-LDV+、RFB4-LDL+和RFB4的柱形圖。此研究結果證明50％的最大結合FITC-dgRTA和FITC-PE38-lys分別需要0.035μg和＞100μg/105細胞，證明dgRTA對HUVECs的相對結合親和性比PE38-lys高＞3對數。這可能是由于HUVECs上的LDV受體對PE38-lys中的同源序列親和性較低和/或RTA中的LDV更暴露。也可能RTA中的其它非同源序列(但不在PE38-lys中)結合HUVECs。如果在摩爾基礎上計算，FITC-dgRTA(0.035μg/105細胞/100μl)與FITC-RFB4-LDV+(0.5μg/105細胞/100μl)的相對結合親和性間的差異僅為2倍。由于具有缺失或突變的LDV序列的RFB4-肽綴合物不結合HUVECs，(x)D(y)基序顯然參與結合。
抑制dgRTA和RFB4-肽與HUVECs的結合。為進一步提供關于(x)D(y)基序在RTA結合HUVECs中的作用的證據，進行了一系列結合抑制研究。代表20-50％最大結合的濃度FITC-dgRTA或FITC-RFB4-LDV+(0.035μg/105細胞用于dgRTA且1.0μg/105細胞用于RFB4-LDV+)用HUVECs在冰上黑暗中孵育30分鐘，存在或缺乏10倍過量的dgRTA(Inland Laboratories，Austin，Texas)、RFB4-LDV+、RFB4、Fn(GIBCO Laboratories，Grand Island，NY)或PE38-lys(NCI，Bethesda)。洗過的細胞在1％低聚甲醛中固定并在FACS上分析。
發現FITC-dgRTA與HUVECs的結合被dgRTA抑制＞90％且被RFB4-LDV+抑制＞60％，表明dgRTA結合是特異的且它至少部分包括LDV序列(圖2A)。含同系物的PE38-lys不能抑制dgRTA的結合(圖2A)可能是由于它對HUVECs的相對親和性低超過3對數。此外，RFB4-LDV+抑制60％的結合而不是100％提示dgRTA可能有另外的HUVECs非同系結合位點。此外，在反向研究中，dgRTA和RFB4-LDV+都抑制FITC-RFB4-LDV+與HUVECs的結合，抑制程度類似(圖2B)，進一步表明RTA中的LDV序列參與結合HUVECs。令人驚訝的是，PE38-lys很有效地抑制FITC-LDV+與HUVECs的結合(圖2B)，表明一個或多個其LDV同系序列可與LDV基序競爭結合含LDV的肽。預期PE38-lys中的一個或多個同系序列(GDL-348-350；GDV-430-432或GDL-605-607)結合并損害HUVEC。Fn也抑制FITC-dgRTA(圖2A)和FITC-RFB4-LDV+(圖2B)與HUVECs的結合，但它效率更低。在此方面，盡管Fn也含LDV基序，它有不同的側翼殘基，可在其LDV基序的有效性中發揮作用。
上述數據證明，當附于RFB4 MAb時，含RTA中LDV基序和IL-2中LDL基序的肽體外特異地結合并損害HUVECs。在所有3個模型中，IgG-肽綴合物和IgG-RTA IT在誘導內皮細胞損害中同樣有效并增加血管滲透性。
RTA中的LDV序列可起始導致體內VLS樣癥狀的事件，因為注射含天然LDV序列但沒有突變或缺失的LDV序列的RFB4-RTA-肽引起肺和人皮膚異種移植物中的血管裂隙，方式與RFB4-dgRTA IT類似。dgRTA至少部分利用其LDV序列結合HUVECs，因為含此基序的肽或蛋白抑制RTA與HUVECs的劑量依賴性、可飽和結合。
RTA中LDV和IL-2中LDL的立體視圖表明，這些基序部分暴露且應與細胞相互作用。對于RTA，這由其體外劑量依賴性、可飽和結合HUVECs來支持。由于RFB4-LDV+與HUVECs的結合不僅部分受dgRTA抑制，也部分受含LDV或LDV-同系物的蛋白即Fn和PE38-lys抑制，這進一步表明一些趨異分子中(x)D(y)基序的功能性保存。此序列中的缺失或突變或使用非損害性阻斷肽可增加IL-2以及ITs的治療指數，ITs用多種植物或細菌毒素制備。
實施例2dgRTA的產生和純化國內實驗室產生了dgRTA。然而，以下例子描述產生用于本發明的dgRTA的方法。
蓖麻籽的粉狀丙酮提取物是原料。篦麻蛋白從此粉末中提取，篦麻蛋白去糖基化，分成A和B鏈，純化dgRTA。
大批原料、蓖麻粉的粉狀丙酮粉末提取物可購自Sigma Bulk Chemical Sales。材料在有1.0L容量的塑料瓶中且包含200克粉末。瓶保存于密封櫥內直到方法開始。
表8列出方法所需緩沖液和溶液的組成，表9列出緩沖液和溶液的規格。表10列出用于產生和純化dgRTA的設備，表11提供方法中所用步驟和柱的概括。
*所有柱在負壓冰箱中4℃保存提取大批篦麻蛋白各提取批可由2瓶蓖麻婁粉末組成。它們在生物學安全柜(通風柜)中打開，加入1.0L PBS到各瓶。各瓶蓋上原始蓋，置于通風柜中的循環搖床，以200個循環/分鐘室溫振蕩1小時。瓶在4℃放置30分鐘以沉淀顆粒狀物。各瓶的上清傾入有蓋和噴管的中間容器，液體從此容器中倒入750ml塑料離心瓶，2個步驟都在通風柜中進行。離心瓶加蓋并用濕紙毛巾擦干凈，然后從通風柜中取出它們。離心瓶置于離心機中的載體，以3,700rpm、4℃離心20分鐘。取出離心瓶，拿至通風柜中，輕輕倒出上清并經Technicloth TX609紙過濾到6L錐瓶中。
進行第2次提取。2個廠瓶中的沉淀用1.0L PBS重懸浮，提取過程包括室溫振蕩1小時，接著重復離心和過濾。
純化篦麻蛋白所有下列過程在負壓層析箱中4℃進行。
合并第1次和第2次提取物并經Whatman 90377A(1.0pm)膜盒濾器過濾。確定280nm的吸光度，計算并記錄從粉末提取的總蛋白。
澄清的上清然后從燒瓶抽吸到酸處理的Sepharose 4B柱上。收集未結合部分，高壓滅菌并丟棄。結合部分用BB+0.2M半乳糖洗脫(圖3)。洗脫物直接收集到CH2 Amicon濃縮器中并濃縮到1.5L。濃縮物轉移到燒瓶中并測量體積。等分樣品用于測量280nm的吸光度，以ODU(光密度單位)記錄總蛋白。
蛋白從燒瓶抽吸到Sephacryl S-200柱上，用AA平衡。峰1(RCAl＝篦麻蛋白外源凝集素)和峰2(RCA2＝篦麻蛋白毒素)的分離通過峰1和峰2間在280nm的最低吸光度確定(見圖4)。
第一個峰包含篦麻蛋白外源凝集素并丟棄。第2個峰包含篦麻蛋白，它直接收集到Amicon濃縮器中并濃縮到2.5mg/ml。記錄體積、OD 280和蛋白總量(mg)。篦麻蛋白從濃縮器抽吸到加蓋容器中，容器然后用濕紙毛巾擦且從層析冰箱中取出。
篦麻蛋白的去糖基化含篦麻蛋白溶液的容器在通風柜中打開。加入等體積的去糖基化緩沖液。容器加蓋，擦凈，置于層析冰箱4℃孵育4小時。然后，容器置于通風柜中，打開，加入甘油到1％終濃度以終止反應。容器再次加蓋，擦凈，置于層析冰箱且4℃保存過夜。
分離篦麻蛋白A和B鏈并純化dgRTA過夜孵育后，容器從冰箱中取出且置于通風柜中。容器打開，加入Tris直到pH達到8.0。中和的篦麻蛋白溶液在層析電冰箱中抽吸到2個串聯連接一起的柱中。第一個柱包含DEAE-Sepharose且第2個包含酸處理的Sepharose 4B。2個柱都用BB平衡。DEAE-Sepharose柱的目的是結合內毒素。一旦來自酸處理的Sepharose 413柱的流出物在280nm的吸光度下降到0.05ODU(峰1末端，圖5)，篦麻蛋白通過DEAE Sepharose柱且進入它在其中結合的酸處理的Sepharose 4B柱。
峰1代表少量不結合酸處理的Sepharose 4B的dgRTA。柱然后分離且還原性BB抽吸到酸處理的Sepharose 4B柱，直到280nm的吸光度與還原性BB的吸光度(0.12ODU)相等。然后停止泵，柱在4℃孵育4小時。在此期間，篦麻蛋白A和B鏈間的S-S鍵還原，導致2條鏈分開。
篦麻蛋白B鏈保持結合酸處理的Sepharose 413柱。柱然后用還原性BB洗并收集游離的dgRTA(峰2，圖5)。當280nm的吸光度回到還原性BB的吸光度時，停止收集。測量收集的流出物(dgRTA溶液)的OD 280，記錄體積且以ODU記錄蛋白濃度。
酸處理的Sepharose 4B柱用BB+0.2M半乳糖洗脫，棄去洗脫的篦麻蛋白B鏈。
然后，還原性BB中的dgRTA溶液抽吸到BB平衡的Blue-Sepharose CL-4B柱并4℃保存。柱用BB洗，直到280nm的吸光度下降到基線。柱然后用BB+0.2M半乳糖洗，直到小峰洗脫(峰2)且280nm的吸光度回到基線值。應用此過程以去除可與Sepharose基質相互作用的總篦麻蛋白毒素(RCA2)或B鏈的所有痕量。如圖6，峰3所示，dgRTA用BB+1M NaCl從Blue-Sepharose柱洗脫，測量并記錄體積和280nm的吸光度。
洗脫物然后抽吸到用BB平衡的脫唾液酸胎球蛋白-Sepharose柱并4℃保存。如圖7所示，在吸光度超過0.05ODU時起始且在吸光率回到0.05ODU時結束，未結合部分在Amicon濃縮器中滲濾以使NaCl濃度減少到0.25M且增加蛋白濃度到2mg/ml。然后加入DTT到10mM終濃度，溶液經0.22μm濾器過濾。還原的dgRTA溶液混合等體積甘油并在-20℃保存。柱用BB+0.2M半乳糖洗脫，棄去洗脫物。
測試和規格表12列出用于dgRTA的測試和規格。
實施例3在減少或去除VLS的側翼區改變產生了重組(r)RTA突變體組，其三維結構中在LDV序列或與此序列相鄰的2個殘基之一有單殘基變化(例如R48或N97)。候選者通常必須符合下列標準1)高產量生成和長期穩定性；2)在無細胞測定中的充分酶活性；3)作為IT的良好細胞毒性；4)當在SCID小鼠中用作IT時不能誘導肺血管裂隙(PVL)；5)LD50高于野生型(wt)rRTA；6)小鼠中的藥物動力學(PK)與含wt rRTA的ITs類似；7)RFB4-rRTA IT在我們SCID/Daudi腫瘤模型中的功效。一般，此例子中所用材料和方法如上所述。
質粒和誘變。在IPTG誘導控制下具有wt rRTA的pKK223質粒由J.MichaelLord，Department of Biology Sciences，University of Warwick，Coventry，U.K.友情提供(O′Hare等，1987和Simpson等，1995)。所有DNA操作用標準技術(Sambrook等，1989)進行。突變用QuikChange(Stratagene，LaJolla，California)引入且誘變引物對如下(僅列出1種引物每互補對，突變加下劃線)表13誘變引物
肺血管裂隙。SCID小鼠(Taconic，Germantown，New York)在3天進程中i.p.注射總共15μg IT/g體重。終IT注射后，小鼠i.v.注射5-7μCi/小鼠的125I-標記白蛋白，24小時后，測量右肺的125I含量并與鹽水處理的對照比較。確定整體和血液中的放射性水平，然后殺死小鼠(數據未顯示)。
治療方案。有彌散性Daudi淋巴瘤的SCID小鼠用100μg/小鼠的各IT、Mab或用PBS如前所述處理。監控小鼠且當后腿出現癱瘓時殺死。存活曲線的比較用對數一等級或Wilcoxon檢驗(Shah等，1993)完成。小鼠的平均存活時間通過對數一等級檢驗以5％顯著水平計算。
藥物動力學。在整個實驗中，將甜飲用水中0.05％魯戈氏溶液給予18到22g的SCID小鼠。放射性標記的蛋白以100μL的最大體積在尾靜脈i.v.注射，放射性負荷為1-5×107cpm且劑量為5μg。注射后立即計算全身放射性，在每天基礎上進行6天，使用AtomLab 100劑量校準器(Atomic Products Corporation，Shirley，NewYork)。結果相對初始全身放射性(％)表示。藥物動力學參數用具有PKCALC程序的非隔室模型確定(Schumaker，1986)。
rRTAs和用突變rRTAs制備的ITs的體外活性。含wt rRTA的質粒(在載體pKK233中)用作起始材料。產生的一些突變體在LDV序列中有保守性變化，包括L74A、L74M、D75N、D75A、D75E、V76A和V76M，以及與LDV序列相鄰和遠離活性部位的表面殘基有保守性變化的R48A和N97A(圖8)。純化的rRTA制品純度90％(數據未顯示)。然后，在無細胞的兔網織紅細胞測定(Press等，1986)中分析這些突變體rRTAs、wt rRTA和dgRTA的酶活性。它們也綴合小鼠IgG1抗人CD22MAb，RFB4(Shen等，1988)，還原后再次在無細胞的網織紅細胞測定中評估。最后，如本文所述，在標準體外細胞毒性測定中，在CD22-陽性Daudi細胞上測試ITs。
如表14所示，當在網織紅細胞測定中測試時，wt rRTA和dgRTA有很類似的活性，盡管wt rRTA稍更有活性。偶聯RFB4 MAb后，它們在網織紅細胞測定中都保持活性且它們在Daudi細胞細胞毒性測定中具有相同的相對活性。在網織紅細胞測定中，6個RTA突變體R48A、L74A、L74M、V76A、V76M和N97A的活性與dgRTA一樣或經dgRTA更有活性。偶聯RFB4后，它們保持此活性，還原并再測試。除了L74A，相同ITs在Daudi細胞細胞毒性測定中活性高。
表14rRTAs和用這些rRTAs制備的ITs的酶活性RTA 無細胞網織紅細胞測定 Daudi細胞細胞毒性測定偶聯RFB4前的RTA偶聯RFB4后的RTA RFB4-RTADgRTA1.7±0.6×10-11a1.3±0.5×10-11b8.7±8.6×10-13c(IC50)還原倍數 還原倍數還原倍數WT 0.7±0.6d，e0.3±0.10.7±0.6L74A 0.8±0.3 0.4±0.218±14M0.6±0.2 0.2±0.11.3±0.6D75A 1.6±1.3 1.7±1.1210±150E2.5±1.1 4.1±3.4390±310N8.8±5.3 1.8±0.5480±190V76A 2.7±1.9 0.8±0.56.1±4.5M1.0±0.4 0.4±0.12.0±1.7R48A 3.8±1.7 0.7±0.23.4±0.8N97A 0.8±0.1 0.2±0.10.9±0.6a12次實驗b6次實驗c＞20次實驗d＜1表示活性增加e3到12次實驗每突變體與這6個突變體相反，含D75A、D75E和D75N的rRTA突變體在網織紅細胞測定中活性比ITs小2到9倍且在Daudi細胞細胞毒性測定中活性小＞200倍。基于這些結果，選擇R48A、L74M、V76A、V76M和N97A突變體用于進一步測試。
含RTAs的ITs體內誘導PVL的能力。與人不同，注射含RTA的ITs的小鼠不表現出全身性VLS，但它們表現PVL(Baluna等，1999和Soler-Rodriguez等，1992)。因此，SCID小鼠注射ITs并監控PVL，ITs用“通過”Daudi細胞篩選測定的突變體rRTAs制備(Rosenstein等，1986)。當小鼠注射15μg IT/g體重的ITs時，觀察到PVL，ITs含wt rRTA、dgRTA、L74M、V76A或V76M。相反，含R48A或N97A的ITs不誘導PVL。根據發明者以前的觀察先有放療可惡化病人中的VLS(Schindler等，2001)，小鼠在IT治療前用150cGy預輻射，但用R48A或N97A制備的ITs沒有觀察到PVL(數據未顯示)。
RFB4-ITs的LD50。確定2個RFB4-偶聯的突變體rRTAs，R48A和N97A是否對小鼠有毒。10只小鼠的組用不同劑量的各IT i.p.注射。動物每日稱重1周。當動物失去20％體重時，殺死它們，因為此重量損失量常導致死亡。RFB4-dgRTA和RFB4-wt rRTA的LD50是10μg/g，而RFB4-R48A或RFB4-N97A的LD50＞100是＞100μg/g(測試的最高劑量)。因此，R48A和N97A ITs在Daudi細胞上的體外活性與RFB4-dgRTA一樣，但對小鼠的毒性至少小10倍且在與RFB4-dgRTA相同的劑量不引起PVL。
突變體rRTA的PK。檢測了RFB4-偶聯突變體和wt rRTA-IT的PK和體內穩定性。比較用N97A和R48A制備的ITs的多種PK參數與含wt rRTA的IT所觀察到的參數(表15)。在實驗結束時收集這些動物的血清，通過SDS-PAGE和放射自顯影檢測。在小鼠中7天后，ITs完整而沒有明顯聚集(數據未顯示)。
表15用rRTAs構建的ITs的小鼠中的藥物動力學rRTA- 小鼠數T AUC1FCR2MRT3IT(h) (μg·h/mL) (天-1) (h)Wt860.9±1.5 182.6±22.80.272±0.00785.6±2.1R48A 570.3±1.6 238.0±6.5 0.236±0.00599.8±2.4N97A 556.4±1.3 191.8±6.5 0.293±0.00678.2±2.01曲線下面積；2分部分解速度；3平均滯留時間體內突變體rRTAs。由于含N97A和R48A的ITs有實質上充分的活性、良好PK、低體內毒性且不誘導PVL，它們作為彌散性SCID/Daudi模型中的RFB4-IT體內評估(Ghetie等，1990)。SCID/Daudi小鼠注射用R48A或N97A制備的ITs，平均癱瘓時間(MPTs)分別為60和72天(圖10)。因此，RFB4-N97A與以前研究所用的RFB4-dgRTA(MPT為73天)一樣有效(O′Hare等，1987)且RFB4-R48A相對RFB4在統計上顯著改善。然而，兩者都沒有RFB4-wt rRTA(MPT為90天)有效(圖10)。由于用N97A和R48A制備的ITs的LD50高＞10倍，它們在較高劑量應勝過dgRTA-ITs(和wt rRTA-ITs)。
本文公開的和權利要求的全部組合物和/或方法可根據本說明書產生和完成，不需要過度的實驗。盡管本發明的組合物和方法已根據較佳實施方案描述，對本領域技術人員顯然的是可改變組合物和/或方法和本文所述方法的步驟或步驟的順序，而不北離發明的概念、精神和范圍。更具體的是，顯然一些化學和生理學相關試劑可取代本文所述試劑，同時獲得相同或類似結果。認為對本領域技術人員顯而易見的所有這種相似的取代和修改在發明的精神、范圍和概念內，如所附權利要求所限定的。
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序列表<110>E.S.維特塔(VITETTA，ELLEN S.)V.F.蓋蒂(GHETIE，VICTOR F.)J.斯莫爾肖(SMALLSHAW，JOAN)R.巴盧納(BALUNA，ROXANA G.)<120>修飾蛋白質化合物毒性作用的組合物和方法<130>UTFD884WO<140>未知<141>2003-10-29<150>10/282,935<151>2002-10-29<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>267<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>1Met Val Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr Ala Gly Ala1 5 10 15Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg Gly Arg Leu20 25 30Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu Pro Asn Arg35 40 45Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu Leu Ser Asn50 55 60His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr65 70 75 80
Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe His Pro Asp85 90 95Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr Asp Val Gln100 105 110Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Leu Glu Gln115 120 125Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn Gly Pro Leu130 135 140Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Gln145 150 155 160Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln Met Ile Ser165 170 175Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg Thr Arg Ile180 185 190Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile Thr Leu Glu195 200 205Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser Asn Gln Gly210 215 220Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly Ser Lys Phe225 230 235 240Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala Leu Met Val245 250 255Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe260 265<210>2<211>133<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys20 25 30Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys35 40 45Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys50 55 60Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu65 70 75 80Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu85 90 95Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala100 105 110Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile115 120 125Ile Ser Thr Leu Thr130<210>3<211>251<212>PRT<213>相思子(Abrus precatorius)<400>3Glu Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser1 5 10 15Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu20 25 30Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg35 40 45Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile50 55 60Glu Val Gly Ile Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala
65 70 75 80Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp85 90 95Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr100 105 110Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro115 120 125Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly130 135 140Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln145 150 155 160Met Val Ala Ala Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg165 170 175Val Ser Ile Gln Thr Gly Thr Ala Phe Gln Pro Asp Ala Ala Met Ile180 185 190Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Asn Leu Ser Arg Gly Val Gln Glu Ser195 200 205Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn Gln Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn210 215 220Glu Pro Val Ile Val Asp Ser Leu Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu225 230 235 240Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn Pro Pro Asn245 250<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>4
Cys Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr1 5 10 15Val Gly Gly Gly20<210>5<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>5Cys Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Ala Thr Asn Ala Tyr Val Gly Gly1 5 10 15Gly<210>6<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>6Cys Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Ala Gly Gln Thr Thr Asn Ala Tyr1 5 10 15Val Gly Gly Gly20<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>7Cys Gly Gly Gly Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Gly Gly Gly1 5 10 15<210>8<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>8Cys Gly Gly Gly Glu His Leu Leu Gln Met Gly Gly Gly1 5 10<210>9<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>9Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>10Leu Ala Ala Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val1 5 10
<210>11<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>11Leu Ala Leu Ala Val Thr Asn Ala Tyr Val Val1 5 10<210>12<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>12Leu Ala Leu Glu Val Thr Asn Ala Tyr Val Val1 5 10<210>13<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>13Leu Ala Leu Asn Val Thr Asn Ala Tyr Val Val1 5 10<210>14<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>14Leu Ala Leu Asp Ala Thr Asn Ala Tyr Val Val1 5 10<210>15<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>15gttacattag ccctggctgt caccaatgca tatg 34<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>16ctgttacatt agccctggaa gtcaccaatg catatg36<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>17ctttctgtta cattagccgc ggatgtcacc aatgcatatg40<210>18
<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>18ctgttacatt agccctgaac gtcaccaatg catatgtgg 39<210>19<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>19gttacattag ccctggatgc taccaatgca tatgtggtc 39<210>20<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>20agtgttgcca aacgcagttg gtttgcctat aaacc 35<210>21<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>21gctttctgtt acattagcca tggatgtcac caatgc 36
<210>22<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>22gttacattag ccctggatat gaccaatgca tatgtggtc 39<210>23<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>23tctttcatcc tgacgctcag gaagatgcag aagc3權利要求
1.一種修飾的蛋白質組合物，其特征在于，所述組合物包括有(x)D(y)序列和至少一個氨基酸突變的蛋白，突變改變(x)D(y)序列誘導血管裂隙綜合征的能力。
2.如權利要求1所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白包括至少2個氨基酸突變。
3.如權利要求1所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個氨基酸突變在天然蛋白構象的(x)D(y)序列中天冬氨酸的約10埃內。
4.如權利要求1所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個突變氨基酸位于離天然蛋白構象的活性部位殘基的距離大于約6埃。
5.如權利要求1所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個突變氨基酸至少部分暴露于天然蛋白構象的表面。
6.如權利要求1所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白是毒素、細胞因子或病毒蛋白。
7.如權利要求6所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白是毒素。
8.如權利要求7所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白是篦麻蛋白A鏈毒素、紅豆因A鏈、白喉毒素(DT)A鏈、假單胞菌外毒素(PE)、志賀氏菌毒素A鏈、白樹毒蛋白、木鱉子皂苷、商陸抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麥毒素。
9.如權利要求8所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，毒素是篦麻蛋白A鏈毒素。
10.如權利要求9所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個突變氨基酸是R48。
11.如權利要求10所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，R48用丙氨酸殘基取代。
12.如權利要求9所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個突變氨基酸是N97。
13.如權利要求12所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，N97用丙氨酸殘基取代。
14.如權利要求9所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少2個突變氨基酸是R48和N97。
15.如權利要求1所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白質組合物是藥物組合物。
16.一種修飾的蛋白質組合物，其特征在于，所述組合物包括有(x)D(y)序列和至少一個在側翼序列中氨基酸突變的蛋白，突變改變蛋白的毒性。
17.如權利要求16所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括(x)D(y)序列中的突變。
18.如權利要求16所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個氨基酸突變在天然蛋白構象的(x)D(y)中天冬氨酸的約10埃內。
19.如權利要求16所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個氨基酸突變位于離天然蛋白構象的活性部位殘基的距離大于約6埃。
20.如權利要求16所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個氨基酸突變至少部分暴露于天然蛋白構象的表面。
21.如權利要求16所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白是毒素、細胞因子或病毒蛋白。
22.如權利要求21所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白是毒素。
23.如權利要求22所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白是篦麻蛋白A鏈毒素、紅豆因A鏈、白喉毒素(DT)A鏈、假單胞菌外毒素(PE)、志賀氏菌毒素A鏈、白樹毒蛋白、木鱉子皂苷、商陸抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麥毒素。
24.如權利要求23所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，毒素是篦麻蛋白A鏈毒素。
25.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括(x)D(y)序列中的突變。
26.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，篦麻蛋白A鏈毒素是酶活性的。
27.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，篦麻蛋白A鏈毒素不是酶活性的。
28.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，(x)D(y)序列是LDV。
29.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個氨基酸突變是R48。
30.如權利要求29所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，R48用丙氨酸殘基取代。
31.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個氨基酸突變是N97。
32.如權利要求31所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，N97用丙氨酸殘基取代。
33.如權利要求24所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，氨基酸突變是R48和N97。
34.如權利要求16所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，蛋白質組合物是藥物組合物。
35.一種促進病人中毒性能力減小的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸改變。
36.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，病人中的毒性進一步定義為血管裂隙綜合征、失語癥、肌痛、疲勞、低血壓或橫紋肌溶解。
37.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，病人中的毒性進一步定義為血管裂隙綜合征。
38.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸在天然蛋白構象的(x)D(y)中天冬氨酸的約10埃內。
39.如權利要求36所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸位于離天然蛋白構象的活性部位殘基的距離大于約6埃。
40.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸位于離天然蛋白構象的活性部位殘基的距離大于約6埃。
41.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸至少部分暴露于天然蛋白構象的表面。
42.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸是R48。
43.如權利要求42所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，R48用丙氨酸殘基取代。
44.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，突變氨基酸是N97。
45.如權利要求44所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，N97用丙氨酸殘基取代。
46.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，突變氨基酸是R48和N97。
47.如權利要求41所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，(x)D(y)序列是LDV。
48.如權利要求35所述的篦麻蛋白A鏈毒素，其特征在于，蛋白質組合物是藥物組合物。
49.一種減小蛋白質組合物誘導VLS能力的方法，其特征在于，所述方法包括步驟a)鑒定包含至少1種(x)D(y)的氨基酸序列的蛋白，其中(x)選自亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸，(y)選自纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸；和b)改變至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基，其中誘導VLS的能力降低。
50.如權利要求49所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基在天然蛋白構象的(x)D(y)序列中天冬氨酸的約10埃內。
51.如權利要求49所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基位于離天然蛋白構象的活性部位殘基的距離大于約6埃。
52.如權利要求49所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基至少部分暴露于天然蛋白構象的表面。
53.如權利要求49所述的方法，其特征在于，蛋白是篦麻蛋白A鏈毒素。
54.如權利要求53所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基是R48。
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，R48用丙氨酸殘基取代。
56.如權利要求53所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基是N97。
57.如權利要求56所述的方法，其特征在于，N97用丙氨酸殘基取代。
58.如權利要求53所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基是R48和N97。
59.一種制備誘導VLS能力減小的免疫毒素的方法，其特征在于，所述方法包括步驟a)鑒定包含至少1種(x)D(y)的氨基酸序列的毒素，其中(x)選自亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸，其中(y)選自纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸；b)改變至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基，其中誘導VLS的能力降低；c)所述毒素綴合包含至少1種抗體的組合物以產生免疫毒素，與類似的免疫毒素相比時，其中產生的免疫毒素促進VLS的能力，其中側翼氨基酸序列不同于毒素。
60.如權利要求59所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基在天然蛋白構象的(x)D(y)序列中天冬氨酸的約10埃內。
61.如權利要求59所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基位于離天然蛋白構象的活性部位殘基的距離大于約6埃。
62.如權利要求59所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基至少部分暴露于天然蛋白構象的表面。
63.如權利要求59所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基是R48。
64.如權利要求63所述的方法，其特征在于，R48用丙氨酸殘基取代。
65.如權利要求59所述的方法，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基是N97。
66.如權利要求65所述的方法，其特征在于，N97用丙氨酸殘基取代。
67.如權利要求59所述的修飾蛋白質組合物，其特征在于，至少一個在(x)D(y)序列側翼的氨基酸殘基是R48和N97。
全文摘要
本發明提供產生免疫毒素(ITs)和細胞因子的方法，它們促進血管裂隙綜合征(VLS)的能力降低。發明也提供已突變的ITs和細胞因子，以缺乏誘導VLS的氨基酸序列。
文檔編號A61K39/02GK1723032SQ200380104893
公開日2006年1月18日 申請日期2003年10月29日 優先權日2002年10月29日
發明者E·S·維特塔, V·F·蓋蒂, J·斯莫爾肖, R·G·巴盧納 申請人:得克薩斯州大學系統董事會