專利名稱：寡聚表兒茶素及兒茶素衍生的矢車菊苷配質的合成的制作方法
相關申請的交叉參考本申請書是延續2003年9月9日提交的系列號10/658241的部分繼續申請，其為基于2002年10月2日提交的系列號60/415616的臨時申請的用途申請。
背景技術：
縮聚鞣酸類(原花青素(proanthocyanidins))廣泛分布于植物界，構成人類食物的一部分，并且呈現出其對健康具有重要性的多重生物學活性。近來矢車菊苷配質由于其廣泛的顯著有效的生物學活性而受到營養、醫藥及健康領域的極大關注。越來越多的證據提示這些化合物在試管內、體外和體內充當強效抗氧化劑并且可能由此在改變病理生理學的不平衡或干擾多種疾病中的自由基和/或氧化驅動過程或直接干擾多種細胞過程。見Nijveldt，R.J.等，Am.J.Clin.Nutr.2001，74，418。最初的觀察還發現從脫脂可可豆中提取的富含矢車菊苷配質部分顯示出試管內抑制多種人類癌細胞系生長的作用。見1996年9月10日公開的授權于L.J.Romanczyk，Jr.等的美國專利5554645，其公開通過參考結合到本文中。
針對試管內和體內生物學活性比較評價的一系列矢車菊苷配質低聚物回收的提取、分離、純化以及鑒定方法已經建立，并且目前部分低聚物可以采用耗時方法合成。例如，早先試圖在含水介質中采用無機酸作為催化劑偶合游離酚形式的單體單位已經取得有限成功。其產率低，反應進行的選擇性差，且其低聚物分離困難。見Steynberg，P.J.等，Tetrahedron，1998，54，8153-8158。下文敘述這些缺陷的概況。
芐基化單體是聯合采用芐基溴以及碳酸鉀(K2CO3)和二甲基甲酰胺(DMF)而由游離單體制備。見Kawamoto，H.等，Mokuzai Gakkashi，1991，37，741-747。然而，其產率僅約40％。此外，競爭性的C-芐基化導致混和產物，這使得芐基保護的目標單體的分離更加困難。此外，還發現了(+)-兒茶素在C-2和C-3兩個位置上的部分外消旋化(見Pierre，M.-C.等，Tetrahedron Letters，1997，38，5639-5642)。
最初的兩種氧化功能化方法在文獻中有描述。見Betts，M.J.等，J.Chem.Soc.，C，1969，1178以及Steenkamp，J.A.，等，tetrahedron Lett.，1985，3045-3048。在此舊方法中，保護的(+)-兒茶素在苯中用四乙酸鉛(LTA)處理產生4β-乙酰氧基衍生物，其隨后被成功地水解為3，4-二酚。黃烷(Flavan)-3，4-二醇是矢車菊苷配質仿生合成中的初始親電子體。這種前手性芐基位點的氧化功能化的主要缺點是四乙酸鉛(LTA)氧化過程中乙酸鹽的產率低(30-36％)。新近的C-4位氧化功能化方法依賴采用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)。在這種方法中，其保護的單體在甲醇中以DDQ處理。這使得以立體選擇性方式將甲氧基引入到C-4位。其產率約為40-50％。
關于單體與它們的3，4-二醇之間在酸水溶液中的偶合反應的報道有很多。這些方法由于其低產率、缺乏選擇性以及難以從水相介質中純化而不能令人滿意。見Kawamoto，H.等，J.Wood Chem.Technol.1989，9，35-52，該作者報道了四氯化鈦(TiCl4)介導的4-羥基-四-O-芐基-(+)-兒茶素與5當量(eq.)的四-O-芐基-(+)-兒茶素之間偶合而產生3∶2的4α，8和4β，8兒茶素二聚體的混合物。這種偶合導致了產物中的4β，8-二聚體以及隨低聚物分子量增加而減少的高級低聚物。
采用2，3-順-3，4-反-黃烷-3，4-二醇，合成矢車菊苷配質B2和B5衍生物。這種二醇是在苯溶液中通過用四乙酸鉛使(-)-表兒茶素四甲基醚的C-4芐基官能團酰氧化而制備的。在甲醇中采用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)在C-4位引入甲氧基改進了甲基保護的表兒茶素單體的C-4位的氧化功能化。這種保護的C-4甲氧基單體被用于合成4，8-鍵合的線性矢車菊苷配質低聚物直至三聚體。見Steenkamp等，Tetrahedron.Lett.1985，26，3045-3048。
矢車菊苷配質低聚物采用具有作為C-4取代基的、具有末端羥基如2-羥基乙氧基的C2-C6烷氧基的保護的表兒茶素或兒茶素單體來制備。所采用的保護基是那些不使單體的A環失活的基團，例如，芐基保護基。見Kozikowski，A.P.等，J.Org.Chem.2000，65，5371-5381及美國專利No.6207842(2001年3月27日授權于Romanczyk，L.J.等)。這種C-4衍生化的、保護的單體與保護的兒茶素單體或保護的表兒茶素單體偶合形成保護的4，8-二聚體，其然后去保擴或用于進一步與其他保護的、C-4衍生化的表兒茶素單體偶合而形成保護的高級4，8-低聚物。如果需要4，6-鍵合，則在與C-4衍生化的、保護的表兒茶素單體或低聚物偶合之前用鹵素基團封閉保護的兒茶素或表兒茶素單體的C-8位。同時具有4，8和4，6-鍵合的更高級低聚物也被制備。保護的二聚體或低聚物被去保護，并且如果必要的話，則被去封閉。這種偶合在質子酸或Lewis酸如四氯化鈦(TiCl4)存在下進行。黃烷內鍵(interflavan)的立體化學性質通過特異性保護的衍生物的合成并參照其隨后的降解所確認。遺憾的是，四氯化鈦介導的表兒茶素二聚體鏈的進一步延伸導致區域異構體的形成。這是一種嚴重缺陷，不僅是在產率方面，也包括純度方面。即使4β，8-三聚體和4β，8-四聚體以純凈體形式被分離，但對于高級低聚物自然不能有同樣的期望，因為作為污染物，其可能的異構體數量在迅速增加。
處理該問題的一種有效途徑是在每一步之后嚴格純化鏈延伸的低聚物，以確保全部的鏈延伸的低聚物至少衍生自單一異構體形式的起始低聚物。然而，對于四氯化鈦介導的保護的三聚體(2eq.)與C-4衍生化的、保護的單體的鏈延伸反應，不僅有保護的四聚體、五聚體以及少量的高級低聚物形成，也有保護的三聚體被降解為單體和二聚體，其隨后參與到鏈延伸反應中，產生區域異構的低聚物例如少量保護的4β，64β，8-三聚體。當反應條件(二氯甲烷/四氫呋喃(9∶11)，0℃，15分鐘，然后室溫下140分鐘)不是最佳時，所觀察到的這些有害副反應要求研究更好的合成方法。
因此，需要改進表兒茶素低聚物、尤其是高級低聚物的合成方法，以及采用保護的高級表兒茶素低聚物作為鏈節而使鏈延長至更高級低聚物的方法步驟。
發明概述在一種實施方案中，雙(5，7，3’，4’-四-O-保護的)-表兒茶素或兒茶素(4，8)-二聚體以及高級(4，8)-低聚物的制備是在酸性粘土存在下使(5，7，3’，4’-四-O-保護的)-表兒茶素或-兒茶素單體與5，7，3’，4’-四-O-保護的-4-(烷氧基)-表兒茶素或-兒茶素單體偶合。所采用的保護基團應當不使被保護的單體的A環或被保護的低聚物的前體單位(upperunit)(即基體)的A環失活。優選的保護基是芐基。合適的4-烷氧基是具有末端羥基的C2-C6烷氧基，優選2-羥基乙氧基。當單體為芐基保護時，所產生的保護的表兒茶素(4β，8)-二聚體的產率顯著增加。在相同條件下，芐基保護的表兒茶素(4，8)-三聚體、-四聚體以及-五聚體區域選擇性地得自低一級的5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素和/或兒茶素(4，8)-低聚物。優選的酸性粘土是蒙脫土。保護的單體和保護的低聚物用柱層析分離，然后用氫原子置換其保護基。
用具有硫醇C-4活化基團的四-O-芐基-保護的-表兒茶素或-兒茶素單體延伸四-O-芐基-保護的-表兒茶素或-兒茶素單體或低聚物的方法也被提供。C-4活化的單體是用C-4活化的、四-O-保護的-表兒茶素或-兒茶素單體(例如5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素)與巰基衍生化試劑例如由2-巰基苯并噻唑或其它雜環硫醇，例如，2-吡啶硫醇、4-吡啶硫醇、或4-苯基-1H-四唑-5-硫醇生成的有機鋁硫醇鹽反應而制備的。為避免不希望的C-3羥基的干擾，優選以乙酰化保護親電以及親核反應配體中的該基團。此乙酰化反應在通過引入4-巰基而活化四-O-芐基保護的單體之后進行。鏈延長反應在二甲基(甲硫基)四氟硼酸锍或優選在四氟硼酸銀存在下進行。四氟硼酸銀優選在反應前被干燥。干燥更優選在臨反應前進行真空干燥。所得混合物包括保護的三聚體至保護的八聚體。這些保護的低聚物通過反相高壓液相層析分離。如果存在的話，優選采用含水四-正-丁基氫氧化銨除去乙酰基保護基。芐基保護基通過氫解除去，如果這樣的基團存在，則優選在除去乙酰基保護基之后進行。對于表兒茶素，其產物近于定量。所述低聚物以其過乙酸化物進行鑒定。
在另一個實施方案中，鏈延長反應是在四氟硼酸銀存在下，通過分別含有C-4硫代活化基團(例如，C-4-(2-苯并噻唑基)硫代)的5，7，3’，4’-四-O-芐基-保護的-表兒茶素或-兒茶素(4β，8)-低聚物交聯偶合而進行。
制備5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-烷氧基-8-溴-表兒茶素或-兒茶素單體的一種改進的方法也被提供。在現有技術領域中，制備C-8封閉的、C-4烷氧基單體的四步方法的產率約為51％。其步驟包括(i)5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素在2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)存在下與乙二醇反應的C-4活化反應(產率63％)，(ii)在4-二甲基-氨基吡啶(DMAP)存在下，使C-4-(2-羥基乙氧基)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素在咪唑中與叔丁基二甲基甲硅烷基氯反應，以引入叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基團而保護其3-羥基位點(產率88％)，(iii)在-40℃下，在二氯甲烷中與N-溴代琥珀酰亞胺反應引入8-溴基團(100％)，以及(iv)在四氫呋喃中與四丁基氟化銨(TBAF)反應除去TBDMS基團(92％)。在改進的兩步方法中，5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素或-兒茶素(i)通過在DDQ存在下與乙二醇反應被活化以及(ii)與N-溴代琥珀酰亞胺反應而被溴化封閉，或者(i)5，7，3’，4’-(四-O-芐基)-表兒茶素或-兒茶素被溴化封閉，然后(ii)被活化。當單體為表兒茶素并且首先進行治化時此兩步方法的總產率約為63％，而當單體為表兒茶素并且首先進行封閉時則總產率約為67％。
合成的矢車菊苷配質低聚物與通過正相HPLC從可可豆中分離的矢車菊苷配質低聚物相同。黃烷間鍵合的區域-和立體化學已經通過部分硫醇解而確認(見Hr，M等，Phytochemistry 1996，42，109)。對于四聚體，所述黃烷間鍵合為4β，8而其分子的低聚部分與三聚體相同，其兩個鍵合也已通過部分硫醇解而鑒定為4β，8(見Hr等)。由于在本發明之鏈延伸方法中首先形成的三個黃烷間鍵合為絕對的4β，8鍵合，存在于高級低聚物中的黃烷間其它鍵合必然相同。
在幾種乳房癌細胞系中檢測時，合成和天然矢車菊苷配質五聚體，以及程度較低的四聚體，均可抑制細胞生長。采用MDAMB-231細胞系，證實此結果的基礎是細胞周期被誘導阻滯于G0/G1期。隨后的細胞死亡更可能是壞死而非凋亡。對照試驗證明矢車菊苷配質自身(而非過氧化氫)就是效應劑(causative agent)。
優選實施方案的描述A.酸性粘土介導的保護的表兒茶素二聚體和三聚體鏈延伸酸性粘土如蒙脫土(例如膨潤土K-10)介導的5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素和5，7，3’，4’-四-O-芐基兒茶素的鏈延伸導致幾乎全部形成保護的(4β，8)-二聚體。當保護的單體是表兒茶素時，其分離產率為90％并且發現少量保護的(4β，8)2-三聚體，但未發現4，6-鍵合的低聚物。在這些條件下，單體與二聚體之間特別大的活性差異使得大多數二聚體不會進入進一步的鏈延伸而被保存下來。采用這種鏈延伸方案，雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體與C-4位用2-羥基乙氧基活化的5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素反應，得到40％的(4β，8)2-三聚體以及13％的(4β，8)3-四聚體。該反應的純凈性首次使之能夠通過柱層析法，至少部分地從二聚體中分離單體，甚至從三聚體中分離二聚體。這顯著減少了需要通過HPLC純化的物質的量。
B.具有C-4硫代基團的5，7，3’，4’-保護的或3，5，7，3’，4’-保護的表兒茶素或兒茶素單體的鏈延伸在另一種鏈延伸反應中，5，7，3’，4’-保護的表兒茶素或兒茶素在C-4位用巰基例如2-(苯并噻唑基)硫代活化。這種鏈延伸由四氟硼酸銀介導。這種用于在表兒茶素或兒茶素單體的C-4位引入2-(苯并噻唑基)硫代基團的試劑是一種為非揮發性的、沒有氣味的雜環硫醇的2-巰基苯并噻唑。對于這種鏈延伸，優選C-4衍生化的-C-5，7，3’，4’-芐基保護的單體，而非未保護的單體，因為它們容易處理、更加穩定并且比未保護的、C-4衍生化的單體容易獲得。這種硫代基團也可以通過與2-吡啶硫醇、4-吡啶硫醇或1-苯基-1H-四唑-5-硫醇反應而引入。
具有2-(苯并噻唑基)硫代活化基團的單體通過使具有C-4位2-羥基乙氧基的保護的表兒茶素或兒茶素與由2-巰基苯并噻唑和三甲基鋁原位制備的硫醇化有機鋁反應來制備。見Dzhemilev U.M.等，Izv.Akad.Nauk SSSR，Ser.Khim.，1988，2645。所得4-硫醚是兩種立體異構體的混合物，其通過分步結晶以及柱層析分離。僅主要立體異構體被用于隨后的偶合，但是次要立體異構體也可以被使用。
向5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素或5，7，3’，4’-四-O-芐基兒茶素以及主要立體異構體的溶液中加入四氟硼酸銀(AgBF4)進行鏈延伸。結果是形成保護的矢車菊苷配質(4β，8)-二聚體和(4β，8)2-三聚體。正相HPLC分離后，回收保護的二聚體、三聚體以及單體。作為副產物，進一步通過反相HPLC分離獲得保護的3-O-4二聚體。為避免這種鏈延伸方法步驟中的不希望的3-羥基的反應，芐基保護的單體和芐基保護的二聚體均通過乙酰化作用保護其3-羥基。其產率近于定量。當四氟硼酸銀加入到乙酰基-和芐基-保護的二聚體以及乙酰基-和芐基-保護的單體溶液時，形成了期望的乙酰基-和芐基-保護的三聚體和四聚體，但其產率較低。其鏈延伸進程如此緩慢的原因是伴隨的(adventitious)水成功地與黃烷類(flavanoid)親核試劑競爭，其主要的偶合產物是4-羥基單體3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素。此外，少量的4-羥基二聚體，3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4β，8-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)也被分離到，表明繼鏈延伸或水解之后存在硫醚的自身縮合。
為改善產率，在加入四氟硼酸銀之前其保護的二聚體和保護的單體通過與粉狀分子篩攪拌而被干燥。然而，其產率仍無改善。如果AgBF4首先用分子篩干燥，并且加入其余的反應物，則無反應發生。問題的解決是在偶合反應之前立刻真空干燥四氟硼酸銀而將3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)巰基]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的水解減少至可接受的水平。
采用干燥四氟硼酸銀與摩爾比為1∶2.5的保護的單體和保護的二聚體，可以分離到總產率為91％的從三聚體，三(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體延伸至八(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)7-八聚體的一系列保護的低聚物。該反應非常純凈，并且沒有發現4，6-低聚物。
在C-4衍生化的、芐基-和乙酰基-保護的單體與芐基-和乙酰基-保護的三聚體和四聚體的偶合中獲得了類似的結果。在這些反應中，如果最后一步梯度中的乙酸乙酯(一種非極性溶劑)與乙腈混合則通過反相HPLC可以分離高達保護的十一聚體的低聚物。采用乙酸乙酯使之能夠獲得高回收率的高級低聚物；然而，它也洗脫了顯著量的脂肪族雜質，其隨后必須通過另外的HPLC步驟去除，由此降低了總產物回收率。
高達九聚體的全部保護的低聚物(例如芐基醚-乙酸酯)在四氫呋喃用40％的四-正丁基氫氧化銨水溶液以近于定量的產率去乙酰化。采用這種堿是因為它在親脂性起始原料所需要的相對非極性的反應介質中有良好的溶解性。所得芐基醚的1H NMR譜圖中呈現出兩種主要旋轉異構體以及的痕量的隨低聚物鏈延長而增強的其它旋轉異構體的信號。相信這些次要成分是旋轉異構體而不是區域異構體，因為前體乙酸酯譜圖中沒有類似的信號。以呈現良好溶解性的CDCl3制備芐基醚樣品，羥基(OH)質子的特征信號位于δ1.8-1.1區域。
芐基醚(三聚體至八聚體)用Pearlman’s催化劑通過氫解去保護而形成無保護的低聚物。這種去保護優選在碳酸氫鹽洗滌的玻璃容器中進行，因為無此措施時偶爾可見部分降解的低級低聚物，這很可能是反應燒瓶的酸性玻璃表面所致的結果。為獲得易溶性的矢車菊苷配質，與其它報道類似，過濾的粗產物溶液有必要用水稀釋，僅部分蒸發以除去大部分的有機溶劑，并且凍干剩余溶液。如果將粗產物溶液直接蒸發至干燥，所產生的部分不溶性物質表明已經發生了一定程度的降解。燃燒分析表明凍干產物中每個表兒茶素部分含有1.3-2當量的水。
正相HPLC分析進行表兒茶素(4β，8)2-三聚體、表兒茶素(4β，8)3-四聚體和表兒茶素(4β，8)4-五聚體與從可可樹(Theobroma cacao)中純化的天然三聚體、四聚體和五聚體的比較。發現合成矢車菊苷配質的純度范圍從94％至96％，這比天然衍生的寡聚矢車菊苷配質純度高2-4％。觀察到合成矢車菊苷配質的tR’s與天然低聚物相符，由此證實天然可可豆矢車菊苷配質的表兒茶素4β，8區域-和立體化學。從可可豆中純化的全部天然矢車菊苷配質在主峰之前和之后均出現雜質峰，其四聚體和五聚體顯示出更多的雜質峰。以HPLC/MS掃描這些區域揭示[M+]或[M+Na]+離子沒有變化，表明這些微量雜質是主要低聚物的異構體。這些微量雜質可能分擔了文獻報道的試管內和活體內活性并且可能會混淆僅以天然低聚物為依據的結構-活性關系。因此，作為預防措施，在后述實施例報告的生物學試驗中同時采用了天然和合成矢車菊苷配質。
雜質的性質以及導致它們的副反應的性質尚未確定但是所存在的痕量雜質有數種而不是主要一種。然而這是不夠理想的；比較所報道的旋光度例如游離的(4β，8)-二聚體或四聚體的旋光度可見很大變化，這不可能僅僅是水合程度不同的結果，而顯然說明在一些這樣的樣品中也存在未知雜質。
因為游離的多酚由于其固有的對氧和酸敏感而不易純化(HPLC期間需要在溶劑種加入酸以減少峰尾)，并且其NMR譜圖由于譜線明顯增寬而無法進行特征鑒定，這些化合物以其過乙酸酯而鑒定。高達七聚體或八聚體的過乙酸酯的1H NMR譜圖顯示出兩種旋轉異構體的尖銳信號(其比值在三聚體中為2∶1而全部高級同系物中為3∶2)而非常適合于化合物鑒定，因為其乙酸酯區域可作為有用的“指紋”。隨著低聚物鏈的增長，300MHz下鏈內位置的表兒茶素單元上的類似質子間的化學位移差最終變得不充分，導致非特征性的信號束增加而出現分離較好的新信號。這些譜圖可以用作進一步參考。可以獲得多至六聚體的寡聚體的13C NMR譜圖，超過此范圍的物質沒有獲得足夠的量。三聚體和四聚體的1H NMR譜圖與公開的譜圖非常一致。見Hr，M.等，Phytochemistry，1996，42的三聚體和四聚體以及Sticher，O.F.，Chromatogr.A，1999，835，59的三聚體。在四聚體情況下，部分硫醇解(見Hr等)確認了“高級”黃烷間鍵合的(4β，8)-區域-和-立體化學，而分子中的“低級”部分與三聚體相同。依次對該化合物進行部分硫醇解，而黃烷之間的兩種鍵合均被鑒定為(4β，8)(見Hr等)。因此，由于在這種鏈延伸方法中首先形成的三個黃烷間鍵合全部是4β，8類型，對于其它存在于高級低聚物中的黃烷間鍵合也必然是相同的。
C.具有C-4(2-苯并噻唑基)硫代基團的3，5，7，3’，4’-保護的單體與具有C-4(2-苯并噻唑基)硫代基團的3，5，7，3’，4’-保護的低聚物以及3，5，7，3’，4’-保護的低聚物的交聯偶合C-4位具有2-(苯并噻唑基)硫代基團的5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素單體在四氟硼酸銀存在下自身縮合，產生相當復雜的混合物，從中可以分離到少量的芐基保護的4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-二聚體、三聚體以及預測的四聚體。還分離到重排的芐基保護的單體和二聚體，其中C-4位基團與噻唑環的氮原子而非硫原子連接。這種由硫至氮的基團遷移的單體由所觀察到的位于δ190.3的歸屬于硫羰基碳原子的13NMR信號所證實。上述反應混合物的復雜性部分歸因于類似于5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素4-O-3-(5，7，3，4-四-O-芐基表兒茶素)的4-O-3-鍵合的低聚物的形成。AgBF4誘導的3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的自身縮合導致低產率地得到4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-取代的低聚物，即二聚體、三聚體和四聚體。與這些產物一起，由于反應規模小，也有相當量的4-羥基副產物形成。這些副產物是3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)，3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)，以及3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-雙[(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)]-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)。
3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-(2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]在四氟硼酸銀存在下與四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8)3-四聚體反應導致以12％的產率形成預期的六聚體，即六(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8)5-六聚體以及副產物八(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8)7-八聚體，3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-4β，8-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素，以及3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素4β，8-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-4β，8-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)。
因此，鏈延伸可以按兩個黃烷醇單位的增加而進行。這種步驟對于較大的保護的表兒茶素低聚物的鏈延伸應當有用，因為這些化合物的值遠遠超過單體的5，7，3’，4’-保護的、C-4衍生化的鏈節單元。
D.制備C-8位具有溴封閉基團的5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素和-兒茶素單體的改進的方法5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素和-兒茶素單體的C-4位通過引入烷氧基(例如2-羥基乙氧基)而活化并且C-8位以溴代基團封閉。此活化和封閉步驟按順序進行，其產率變化為約63％至67％。在DDQ存在下，通過使保護的單體或封閉保護的單體與乙二醇反應進行活化。在-40℃下，在二氯甲烷中，通過使保護的單體或活化的、保護的單體與N-溴代琥珀酰亞胺反應進行保護。
E.制備矢車菊苷配質(4，8)-二聚體二沒食子酸酯用羥基保護的沒食子酸，優選羥基-沒食子酰氯，酯化八-O-保護的(4，8)-二聚體制備表兒茶素-和/或兒茶素-(4，8)二聚體二沒食子酸酯。對于二聚體和酸或酰鹵而言，優選的保護基均為芐基。可以制備的二聚體二沒食子酸酯包括表兒茶素-(4β，8)-表兒茶素二沒食子酸酯，表兒茶素-(4β，8)-兒茶素-(4α，8)-兒茶素二沒食子酸酯，兒茶素-(4β，8)-兒茶素二沒食子酸酯，兒茶素-(4α，8)-表兒茶素二沒食子酸酯，以及兒茶素-(4β，8)-表兒茶素二沒食子酸酯。
四-O-保護的(4，8)-表兒茶素和/或-兒茶素二聚體(例如5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)用三-O-芐基沒食子酰鹵酯化。三-O-芐基沒食子酸可以原位轉化為鹵化物，例如氯化物。酯化反應在4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在下，在吡啶溶液中進行。經20％Pd(OH)2/C氫解得到去保護的二沒食子酸酯。當二聚體是表兒茶素-(4β，8)-表兒茶素時，回收的去保護的二沒食子酸酯水合物的產率為90％而不需要柱層析純化(每個二沒食子酸酯分子5.3當量水)表兒茶素-(4β，8)-表兒茶素二沒食子酸酯的制備公開于“多酚化學與生物活性研究。1.制備(+)-兒茶素鏈節。矢車菊苷配質形成。癌細胞生長抑制劑，3-O-沒食子酰基-(2R，3R)-表兒茶素-(4β，8)-[3-O-沒食子酰基-(2R，3R)-表兒茶素]的合成(Studies in Polyphenol Chemistryand Bioactivity.1.preparation of Building Blocks from(+)-catechin.Procyanidin Formation.Synthesis of the Cancer Cell Growth Inhibitor，3-O-Galloyl-(2R，3R)-epicatechin-(4α，8)-[3-O-Galloyl-(2R，3R)-epicatechin])”W.Tückmantel等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，12073-12081。表兒茶素-(4α，8)-表兒茶素雙沒食子酸酯的沒食子酸酯的制備公開于“多酚化學與生物活性研究。3.β-型矢車菊苷配質的非天然異構體，表兒茶素-4α，8-表兒茶素的立體控制合成(Studies inPolyphenol Chemistry and Biology.3.Stereocontrolled Synthesis ofEpicatechin-4α，8-epicatechin，an Unnatural Isomer of the β-TypeProcyanidin”，Alan P.Kozikowski等，J.Org.Chem.，2001，66，1287-1295.
試劑、檢驗步驟以及分析步驟試劑Pearlman’s催化劑(20％Pd(OH)2/C)得自Aldrich并且含有高達50％的H2O。膨潤土K-10購自Acros。對于其它化合物，見TückmantelW.等J.Am.Chem.Soc.，1999，121，12073。
乙酰化由于游離矢車菊苷配質因其對氧和酸的敏感性而很難純化，且它們的NMR譜圖因譜線明顯增寬而難以鑒定，因此將這些化合物作為其過乙酸酯來鑒定。所述過乙酸酯的1H NMR譜圖顯示出兩個旋轉異構體的尖銳信號(其比率對三聚體為2∶1，而對所有的高級低聚物均為3∶2)。此譜圖非常適合于多至八聚體的化合物鑒定。所述乙酸酯區域充當了有用的“指紋”。已經獲得多至六聚體的低聚物13C NMR譜圖。
三聚體和四聚體的1H NMR譜圖與已經公開的譜圖非常一致。
譜圖如無特別說明，則分別在常規頻率300和75MHz下于CDCl3中獲得1H和13C NMR譜圖。1H NMR譜圖以TMS內標作參照；13C NMR譜圖如有標示則參照內標TMS，否則參照CDCl3信號(δ77.00)。燃燒分析用Micro-Analysis，Inc.(Wilmington，DE)進行。
柱層析柱層析(CC)用粒徑63-200μm的Merck硅膠60(No.7734-7)進行。TLCMerck硅膠60F254(7734-7)，薄層厚度250μm；UV光線下觀察或用堿性KMnO4溶液顯色。
矢車菊苷配質的高壓液相層析(用PLC)分析游離矢車菊苷配質低聚物的層析分析在HP 1100 HPLC系統上進行(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)，該系統配備了自動進樣器、四元HPLC泵、柱加熱器、二極管陣列監測器、熒光監測器以及用于采集數據和樣品處理的HP ChemStation。正相分離在250×4.6mmPhenomenex(Torrance，CA)5μm Prodigy柱上進行。檢測器是在λex＝276nm和λem＝316nm下工作的熒光檢測器。三元流動相由(A)二氯甲烷，(B)甲醇和(C)乙酸∶水(1∶1v/v)組成。如下在1mL/min的流速下，使一系列線性梯度的B進入含有恒定4％C的A進行有效分離0-30min，14.0-28.4％B在A中，30-50min，28.4-38.0％B在A中，50-51min，38.0-86.0％B在A中；51-56min，86.0％B在A中。
其它HPLC柱柱A，Hewlett-Packard RP-8，200×4.6mm，1.0mL/min；柱B，WatersμBondapak C18，300×7.8mm，2.8mL/min；柱C，Waters μBondapak C18，300×19mm；柱D，Waters μBondapak C18，300×30mm，42mL/min；柱E，Whatman Partisil 10，500×9.4mm，5.0mL/min；柱F，Whatman Partisil 10，500×22mm，26mL/min。檢測280nm處的UV吸收。保留時間的變化基本上取決于柱歷史以及其它細微環境。它們僅引用于指導而在沒有可靠參照樣品比較時不可用于產物鑒定。進一步細節見實施例。
矢車菊苷配質的高壓液相層析/質譜(HPLC/MS)分析天然和合成矢車菊苷配質的HPLC/MS分析在HPLC系統(如上文所述)上進行，該系統與配備了API-ES電離室的HP Series 1100質譜選擇性檢測器(型號G1946A)接口。在洗脫液流臨進入質譜儀之前通過三通接頭加入電離試劑。陽離子模式的分析條件包括在0.05mL/min流速下引入0.05M氯化鈉以輔助離子化，3.5kV的毛細管電壓，100V的碎片器電壓，25psig的霧化壓，以及350℃的干燥氣體溫度。以每個周期1.96s在質量數m/z 100-3000范圍內進行掃描。
細胞系人乳腺癌細胞系MCF-7、SKBR-3、MDA 435和MDA MB-231得自Georgetown University Medical Center的Lombardi Cancer CenterCell Culture Core Facility。MDA MB-231細胞系缺失P53、ER陰性并且結構性表達K-ras。細胞在37℃下，在濕潤的5％CO2氣體中，于添加10％FBS(Gibco BRL Life Techonologies)的含T-75s的IMEM培養基(BioFluids Inc.)中培養。
細胞毒性分析細胞毒性分析是采用改進的用結晶紫而非MTT的微量培養四氮唑分析28在96孔微量滴定格式板中用試驗化合物處理幾種人乳腺癌細胞系來進行的。簡要地說，每孔加入1-2×103細胞并且使之培養于濕潤的5％CO2氣體中直至它們達到約50％的融合。加入各種濃度的無菌過濾的化合物，并使各板再繼續培養12-36小時。然后去除生長介質，每孔以200μL的pH 7.4PBS洗滌2次。洗滌后，加入50μL過濾的結晶紫溶液(2.5g/125mL甲醇+375mL H2O)。5分鐘末，去除結晶紫，并且用水將滴定板洗滌3遍。使滴定板干燥并將結晶紫染色細胞重新溶于100μL的0.1M檸檬酸鈉的甲醇/水(1∶1，v/v)溶液。1小時末，滴定板用Molecular Devices Corporation微量滴定板閱讀器在570nm(405nm參照)掃描，而其數據用SOFTMAX軟件程序記錄。空白、對照、溶媒以及各檢測濃度分別采用3個讀數的平均值進行統計數據處理。
流式細胞儀如上培養MDA MB-231細胞直至它們達到約50％的融合。然后加入無菌過濾的試驗化合物或調配至100U/mL的過氧化氫酶(Sigma#C9322)或熱滅活的過氧化氫酶(溶液浸入沸水15min)或過氧化氫(H2O2)，并且使細胞再培養24h。然后細胞用胰蛋白酶消化并計數，并且取1.5×106細胞用Vindelov法分析細胞周期。見Vindelov，L等，“ADetergent Trypsin Method for the Preparation of Flow Cytometric DNAAhalysis”，Cytometry，1983，3，323-327。此分析在GeorgetownUniversity Medical Center的Lombardi Cancer Center Flow CytometryCore Facility上進行。
膜聯蛋白V(annexin V)-FITC按照制造商說明書步驟采用TACSTM膜聯蛋白V-FITC試劑盒(Trevigen Inc.)對矢車菊苷配質處理的MDA MB-231細胞進行膜聯蛋白V-FITC分析。
實施例實施例1-制備四-O-保護的、C-4活化單體A部分-制備5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素室溫下將11.0mL(198mmol)乙二醇加入到21.5g(33.0mmol)5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的220mL無水二氯甲烷(CH2Cl2)溶液中，然后在充分攪拌下一次性全部加入15.0g(66mmol)的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)。在氯化鈣(CaCl2)管條件下，于室溫下劇烈攪拌110分鐘后，加入8.5g(69.5mmol)的4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)的50mL無水二氯甲烷溶液，隨后出現大量深色沉淀。室溫下再攪拌10分鐘后，混合物用粗玻璃粉過濾，其沉淀用50ml二氯甲烷洗滌，將溶液蒸發至近于干燥。剩余物用乙酸乙酯/環己烷1∶1進行硅膠過濾(17×9cm)，收集含有全部產物的流分。蒸發至約75mL后，結晶開始出現(可能需要晶種)。加入等體積己烷并使之在室溫下過夜進行結晶。抽濾、以25mL乙酸乙酯/己烷(1∶2)洗滌2次，真空干燥(開始在室溫下，然后在40℃下)，得到10.6g(45％)5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素，為灰白色固體。經過HPLC分析發現其為97％純度的AKA乙腈(柱B；0-20分鐘，50至100％甲基氰(CH3CN)的水溶液，而后為CH3CN；tR17.9min)。其余產物用硅膠柱(SiO2)(33×5cm)層析，以乙酸乙酯/己烷(1∶2)(先用)，然后2∶3(產物)洗脫從母液中獲得。蒸發后，所得琥珀色玻璃樣物質(1.0g，純度69％)在乙酸乙酯/己烷中結晶兩次，得到另外0.5g(2％)的5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素(純度98％)。
B部分-制備5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素采用上述步驟制備5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素。
實施例2-使用酸性粘土催化四-O-保護的兒茶素或表兒茶素與四-O-保護的、C-4活化的兒茶素或表兒茶素單體的縮合A部分-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素與5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素的縮合在冰冷卻、攪拌和排除濕氣下，在2.5小時內向9.26g(14.2mmol，4當量)5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素和5.0g膨潤土K-10粘土的115mL無水二氯甲烷(CH2Cl2)溶液/懸液中加入溶于35mL無水二氯甲烷的2.53g(3.56mmol)5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素。加料末期浴溫升至+6℃。冰浴中繼續攪拌1小時，期間溫度升至12℃。經硅藻土抽濾去粘土，而固體以50mL二氯甲烷洗滌兩次。加入20mL甲苯，并將溶液蒸發至小體積。剩余物用乙酸乙酯/氯仿/己烷(1∶14∶14)經硅膠層析(60×5cm)。起初，5.95g未反應的5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素被洗脫，隨后是401g單體/二聚體混合流份以及1.15g純凈(98％，HPLC)的雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8))-二聚體。最后洗脫的是溶劑比為1∶7∶7的痕量二聚體以及三聚體的混合流份(0.27g)。
使各混合組分分別溶解于甲基氰(CH3CN)并且用制備型HPLC分離(柱D；0-30分鐘，80至100％(CH3CN)的水溶液，然后CH3CN；二聚體和三聚體的保留時間分別為23.3和30.1分鐘)。合并適當流份后，蒸發并真空干燥，獲得下列產物5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素，6.89g(回收率74％)；雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體，4.26g(92％)；三(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體，74mg(2％)。雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)-表兒茶素(4β，8)-二聚體。
13C NMR(CDCl3，TMS)δ158.34，158.07，157.91，157.07，156.83，156.56，156.49，155.89，155.53，155.07，154.44，152.83，149.17，149.01，148.92，148.66，148.60，148.40，148.18，137.40，137.38，137.30，137.28，137.22，137.17，137.01，136.97，132.61，132.43，131.18，131.14，128.6-126.6，119.96，119.79，118.79，118.65，115.02，114.89，114.35，114.05，113.52，112.93，112.46，111.58，111.17，104.45，102.29，101.76，94.34，93.96，93.33，93.15，92.93，91.52，78.84，78.07，75.63，72.41，72.14，71.48，71.35，71.22，70.81，70.48，69.92，69.86，69.78，69.47，69.05，66.50，65.15，35.90，35.78，28.74，28.61.其它數據已被分開(見第1部分，Tückmantel，W.等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，12073).
另一批次(run)中(3.17mmol的5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)-表兒茶素)，通過柱層析實現了單體與二聚體以及二聚體與三聚體的基本完全分離，僅三聚體與非常稀少的二聚體需要通過HPLC純化。獲得如下產物5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素，6.20g(回收率75％)；雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體，3.63g(88％)以及三(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體，0.15g(5％)。
B部分-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素與5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素的縮合采用上述步驟，制備表兒茶素-(4β，8)-兒茶素二聚體。其純度范圍是89-98％。
C部分-5，7，3’，4’-四-O-芐基兒茶素與5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素的縮合采用上述步驟，制備兒茶素-(4β，8)-兒茶素二聚體。其純度范圍是93-98％。
D部分-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素與5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素的縮合采用上述步驟，制備表兒茶素-(4α，8)-兒茶素二聚體。其純度范圍是97-98％。
E部分-(5，7，3’，4’-四-O-芐基)-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素的縮合采用上述步驟，通過(5，7，3’，4’-四-O-芐基)兒茶素與5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素反應，制備兒茶素-(4β，8)-表兒茶素。
F部分-(5，7，3’，4’-四-O-芐基)兒茶素與5，7，3’，4’-(四-O-芐基)-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素的縮合采用上述步驟，通過(5，7，3’，4’-四-O-芐基)兒茶素與(5，7，3’，4’-四-O-芐基)-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素的縮合，可制備兒茶素-(4α，8)-表兒茶素。
實施例3-用酸性粘土催化雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體與5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素的縮合在冰冷卻、攪拌和排除濕氣下，在110分鐘內，向5.60g(4.31mmol，3當量)雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體和2.04g膨潤土K-10粘土的45mL無水二氯甲烷(CH2Cl2)溶液/懸液中加入1.02g(1.44mmol)5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)-表兒茶素的15mL無水二氯甲烷(CH2Cl2)溶液。加料末期浴溫升至+6℃。浴器中繼續攪拌1h，期間溫度升至+12℃。經硅藻土抽濾去粘土，并以每次25mL的乙酸乙酯將固體洗滌四遍。蒸發合并的溶液。試圖用乙酸乙酯/己烷/氯仿(1∶10∶10)通過硅膠柱層析(56×5cm)分離而未能分開二聚體和三聚體。隨后用1∶7∶7比例的溶劑洗脫，得到0.5g主要為四聚體以及殘余三聚體組成的流份。二聚體/三聚體流份再次經過硅膠柱層析(55×5cm)，這次從乙酸乙酯/氯仿/己烷(1∶14∶14)開始。用20L混合液洗脫后，其溶劑比改為1∶12∶12(5L)，然后是1∶10∶10，結果回收4.40g的二聚體。進一步以混合比1∶8∶8洗脫，得到1.04g三聚體粗品(HPLC檢測純度為90％)。
粗品三聚體和三聚體/四聚體混合物分別溶解于甲基氰(CH3CN)中，并以制備型HPLC分離(柱D；0-30分鐘，80至100％CH3CN的水溶液，而后CH3CN)。對二聚體、三聚體以及四聚體的保留時間分別為22.5(22.7)、30.1(30.8)以及33.9分鐘。合并適當流份后，蒸發并真空干燥，獲得如下產物雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體，4.43g(回收率79％)、三(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體，1.13g(40％)；四-(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3四聚體，0.24g(13％)。
實施例4-制備4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素在氮氣、冰冷卻以及攪拌下，在10分鐘內向6.5g(39mmol)的2-巰基苯并噻唑的40mL 1，2-二氯乙烷[HPLC級，臨用前即可用堿性氧化鋁(活性I)過濾]溶液中滴加19.5mL三甲銨溶液(2.0M的甲苯溶液)。所得琥珀色溶液在0℃下攪拌15分鐘，然后在20分鐘內滴加5.56g(7.82mmol)的5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素的60mL 1，2-二氯乙烷溶液(同上制備)。將橙色反應混合物在室溫下攪拌5小時，然后在冰浴中冷卻，然后滴加22.6g(80mmol)酒石酸鈉鉀四水合物的90mL水和100mL 2.5M氫氧化鈉水溶液(最初由于氣體生成而十分謹慎)。加入二氯甲烷(100mL)，并且分離各相。有機相用100mL 2.5M氫氧化鈉水溶液洗滌兩遍并且用硫酸鈉干燥。蒸發至小體積后，剩余物在短硅膠柱上層析，用乙酸乙酯/甲苯1∶19(直至開始洗脫出產物)然后1∶9洗脫。蒸發洗脫液得到油狀物，其很快轉變為淺黃色固體。將此物質溶于30mL熱乙酸乙酯，加入90mL 1-氯丁烷，在溶液中加入晶種并且先在室溫下，然后在-20C下放置使結晶。抽濾分離沉淀，用20mL冷的1-氯丁烷洗兩遍，并且真空干燥，得到3.50g的占優勢的非對映異構體。母液層析(硅膠，乙酸乙酯/二氯甲烷/己烷1∶18∶11至2∶18∶11)，繼而從乙酸乙酯/1-氯丁烷中結晶，得到另外0.78g的主要的異構體(共計4.28g，67％)和0.16g(2.5％)極性較低的次要異構體。
主要異構體mp 160-161℃(自乙酸乙酯/1-氯丁烷)；[α]D+106°，[α]546+133°(EtOAc，c10.6gL-1)；1H NMR(CDCl3)δ7.89(ddd，1H，J＝8，1.2，0.7Hz)，7.78(ddd，1H，J＝8，1.2，0.7Hz)，7.47-7.20(m，19H)，7.17(d，1H，J＝2Hz)，7.12-7.00(m，4H)，6.95(B 部分ABq，1H，J＝8.5Hz)，6.30，6.29(ABq，2H，J＝2Hz)，5.46(d，1H，J＝2Hz)，5.42(s，1H)，5.17(s，2H)，5.16(s，2H)，5.10，5.05(ABq，2H，J＝12Hz)，5.03(s，2H)，4.40(ddd，1H，J＝6，2.5，1Hz)，2.00(d，1H，J＝5.5Hz)；13CNMR(CDCl3)δ165.00，160.67，158.76，155.95，153.16，148.96，148.88，137.17，137.07，136.53，136.47，135.29，130.76，128.61，128.45，128.37，128.16，128.09，127.75，127.56，127.49，127.46，127.21，126.57，126.06，124.41，121.83，120.97，119.65，114.91，113.58，98.34，94.48，75.13，71.32，71.22，70.78，70.13，69.86，44.43；IR(膜)3554(br)，1617，1591，1177，1152，1114，735，696cm-1.分析計算值C50H41NO6S2C，73.60；H，5.06；N，1.72.實測值C，73.92；H，4.75；N，1.74.
次要異構體mp 144-146℃(自乙酸乙酯/1-氯丁烷)；D-48.9°，[α]546-64.6°(EtOAc，c7.6gL-1)；1H NMR(CDCl3)δ7.79(ddd，1H，J＝8，1.2，0.7Hz)，7.66(ddd，1H，J＝8，1.2，0.7Hz)，7.47-7.25(m，14H)，7.17-7.11(m，2H)，7.08-6.89(m，5H)，6.84-6.77(m，4H)，6.27，6.25(ABq，2H，J＝2Hz)，5.45-5.40(m，2H)，5.16(窄ABq，2H)，5.11，5.07(ABq，2H，J＝13Hz)，5.07，5.03(ABq，2H，J＝11.5Hz)，4.94，4.87(ABq，2H，J＝11.5Hz)，4.78(q，1H，J＝5Hz)，4.39(d，1H，J＝5Hz)；1HNMR(C6D6)δ7.68(d，1H，J＝8Hz)，7.38(d，1H，J＝2Hz)，7.32-6.96(m，19H)，6.90-6.68(m，6H)，6.48(d，1H，J＝2Hz)，6.22(d，1H，J＝2.5Hz)，5.82(dd，1H，J＝5，1.2Hz)，5.57(d，1H，J＝4.5Hz)，4.95(s，2H)，4.82(q，1H，J＝4.5Hz)，4.80(s，2H)，4.71(s，2H)，4.70(d，1H，部分隱藏)，4.58，4.51(ABq，2H，J＝12Hz)；13C NMR(CDCl3)δ169.70，160.84，158.13，155.45，152.30，148.53，148.14，137.14，137.02，136.41，135.88，135.44，129.67，128.58，128.36，128.16，128.08，127.87，127.65，127.55，127.35，127.31，127.22，127.00，126.70，125.89，124.15，121.23，120.85，119.74，114.41，114.31，100.87，93.80，93.76，76.46，71.01，70.73，70.06，70.00，68.02，46.51；IR(膜)3440(br)，1614，1584，1154，1122，752，732，696cm-1.分析計算值C50H41NO6S2C，73.60；H，5.06；N，1.72.實測值C，73.22；H，4.64；N，1.71.
上述反應應當在充分通風的通風櫥中進行，因為盡管2-巰基苯并噻唑沒有氣味，但少量惡臭(但不是非常強烈)的2-(芐硫基)苯并噻唑在該反應中形成。
實施例5-制備3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素向3.50g(4.29mmol)的4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(實施例4中的主要異構體)和53mg(0.43mmol)4-(二甲氨基)吡啶的12mL無水吡啶溶液中一次性全部加入2.0mL(21.5mmol)醋酸酐。在室溫下，于密閉的燒瓶中保持反應混合物50小時。加入冰以及150mL 5％鹽酸水溶液。將產物萃取到100+20mL的二氯甲烷中。合并的有機相用100mL水洗滌，用50mL 10％氫氧化鈉水溶液洗滌兩遍；每次洗滌后，水相用20mL二氯甲烷反萃取。合并的有機相用硫酸鎂干燥并蒸發，使剩余物溶于小體積甲苯并用乙酸乙酯/己烷(1∶3)經硅膠過濾。蒸發并真空干燥，得到3.58g(97％-？)黃色泡沫狀3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素[α]D+91.7°，[α]546+115°(EtOAc，c 13.2gL-1)；1H NMR(CDCl3)δ7.90(d，1H，J＝8Hz)，7.77(d，1H，J＝8Hz)，7.46-7.22(m，19H)，7.11(d，1H，J＝2Hz)，7.09-7.00(m，3H)，6.99，6.91(ABq，2H，J＝8.5Hz，部分d具有J＝2Hz)，6.31，6.30(ABq，2H，J＝2.5Hz)，5.63(dd，1H，J＝2.5，1.2Hz)，5.55(s，1H)，5.31(d，1H，J＝2Hz)，5.17，5.12(ABq，2H，J＝12Hz)，5.14(s，2H)，5.10，5.05(ABq，2H，J由于疊加未測得J)，5.07，5.02(ABq，2H，J＝11.5Hz)，1.84(s，3H)；13C NMR(CDCl3，TM8)δ169.08，164.07，160.69，158.31，156.03，153.22，148.92，148.89，137.18，137.16，136.53，136.31，135.62，130.29，128.67，128.45，128.24，128.19，127.78，127.65，127.43，127.31，126.87，126.10，124.50，122.16，121.01，119.80，114.97，113.51，98.50，94.46，94.30，74.13，71.44，71.23，70.74，70.19，70.13，42.59，20.84；IR 1750，1616，1591，1217，1152，1117，734，696cm-1.分析計算值C52H43NO7S2C，72.79；H，5.05；N，1.63.實測值C，73.01；H，4.79；N，1.61.
實施例6-制備雙(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體將1.5mL(16mmol)醋酸酐的4mL無水吡啶溶液一次性全部加入到3.69g(2.84mmol)的雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體中。不時攪動該混合物直至起始物全部溶解，然后使之在密閉燒瓶中于室溫下放置99小時。加入30mL乙酸乙酯和2mL甲醇終止反應并使之在室溫下放置1.5小時。另加入20mL乙酸乙酯。然后用200mL0.5M磷酸(H3PO4)水溶液洗滌。水層用50mL乙酸乙酯反萃取。合并的有機相用硫酸鎂干燥。蒸發后，剩余物以少量甲苯收集，并以乙酸乙酯/己烷(1∶9，然后1∶3，最后1∶1)在短硅膠柱上層析。蒸發并真空干燥后，得到3.82g(97％)無色泡沫狀的雙(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體。
實施例7-3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素與雙(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體的反應將0.80g(4.1mmol)四氟硼酸銀(AgBF4)樣品在避光的反應燒瓶中于100℃下用油泵真空干燥1.5小時。冷卻后，用氮氣中斷真空，并且一次性全部加入5.66g(4.09mmol)的雙(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體的60mL無水四氫呋喃溶液。將燒瓶置于光線黯淡的冰浴中，并在攪拌下在70分鐘內滴加1.40g(1.64mmol)的3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的30mL無水四氫呋喃溶液。反應混合物轉變成黃色，并且最終出現渾濁。0℃下持續攪拌40分鐘，在此時間段中反應混合物轉變成乳狀、近白色的懸液。加入三乙胺(1.1mL，8mmol)，蒸發混合物至接近干燥，其剩余物用乙酸乙酯/己烷1∶1進行短硅膠柱層析過濾。蒸發洗脫液并對粗產物進行HPLC分析(柱A；0-30分鐘，80-100％甲基氰(CH3CN)的水溶液，然后CH3CN)。下列峰被觀察到(歸屬/面積％)tR5.0(4-OH-單體，0.15)，12.6(4-OH-二聚體，0.25)，15.6(二聚體，59.4)，24.8(三聚體，23.4)，30.3(四聚體，12.5)，33.3(五聚體，3.2)，35.4(六聚體，0.8)，37.3(七聚體，0.1)，39.1分鐘(八聚體，0.02)。硅膠柱層析(38×9cm)實現部分分離。起先用25L乙酸乙酯/氯仿/己烷(1∶10∶9)洗脫導致未回收到產物(然而此階段對于實現分離是必要的)。另外25L乙酸乙酯/氯仿/己烷(1∶11∶8)洗脫了4.01g二聚體(回收率71％，HPLC純)。20L乙酸乙酯/氯仿/己烷(1∶12∶7)洗脫由三聚體、四聚體和部分五聚體組成的流分(1.72g)。最后，用乙酸乙酯/氯仿/己烷(2∶12∶7)洗柱，得到0.87g主要由高級低聚物組成的流份。將后兩個流份收集于甲基氰(CH3CN)中，并用制備型HPLC分離為幾個部分(柱D；0-30分鐘，80-100％CH3CN的水溶液，然后CH3CN)，合并合適流分并真空干燥，獲得無色薄膜或泡沫狀低聚物。3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素相關的三聚體至八聚體的保留時間和產率分別為31.9分鐘(1.46g，43％)，36.0分鐘(755mg，33％)，39.6分鐘(204g，11％)，45.0分鐘(45mg，2.6％)，52.8分鐘(13.8mg，0.9％)和64.1分鐘(5.2mg，0.3％)；而3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β3，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)為22分鐘(13.4mg，1.2％)。由于極性高的原因，硅膠柱上未能回收到4-OH單體(即，3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)。相對于3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的平衡總質量為92％。
實施例8-3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素與三-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體的偶合采用0.41g(2.1mmol)四氟硼酸銀(AgBF4)、4.40g(2.12mmol)三(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8)2-三聚體以及729mg(850μmol)3-O-乙酰基-4-[2-(苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素進行類似于實施例7的偶合的反應。用乙酸乙酯/己烷(1∶1)進行硅膠過濾后，粗產物收集于甲基氰(CH3CN)中，并同上用制備型HPLC分成幾個部分而得到下列產物3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素(31mg，5％)；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)(34mg，6％)；三聚體(3.07g，回收率70％)；四聚體(1.47g，62％)；五聚體(221mg，15％)；六聚體(57mg，5％)；七聚體(25.2mg，2％)；八聚體(10.8mg，1％)。相對于3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的平衡總質量為96％。
實施例9-3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素與四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體的偶合類似于實施例7和8，采用0.34g(1.75mmol)四氟硼酸銀(AgBF4)，4.77g(1.73mmol)的四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體以及592mg(690μmol)的3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素進行該反應。用乙酸乙酯/己烷1∶1進行硅膠過濾后，粗產物經制備型HPLC初步分離為幾個部分(柱D；0-30分鐘，80至100％甲基氰(CH3CN)的水溶液，30-38分鐘，CH3CN；38-65分鐘，10％乙酸乙酯于CH3CN中)，獲得下列產物3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基-表兒茶素(tR11.0min；19mg，4％)；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)3-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)(22.2min；47mg，10％)；四聚體(36.0min；3.56g，回收率74％)；五聚體(39.4min；1.03g)；六聚體(43.6min；260mg)；七聚體(46.0min；86mg)；八聚體(48.9min；41mg)；九聚體(52.2min；22mg)；十聚體(56.2min；13.5mg)；十一聚體(61.4min；8.2mg)。由于峰形拖尾來自五聚體的全部產物均需要進一步純化，這是由于夾雜了隨寡聚程度而增加的低級低聚物所致，并且由于增加了污染有來源于非極性溶劑和/或柱的未能鑒定的脂肪族物質。對于樣品制備，由于七聚體在單獨CH3CN中的溶解度有限而必須向CH3CN中加入少量百分比的四氫呋喃。從五聚體到九聚體，用柱D再進行純化(0-30分鐘，80-100％CH3CN的水溶液，然后CH3CN)。對于十聚體和十一聚體，則采用柱B以及相同的梯度。如此處理后的九聚體、十聚體和十一聚體仍然含有過量脂肪族雜質并且采用相同梯度在柱A上第三次進行HPLC純化。獲得下列產率的純化產物(97％或更高，HPLC)五聚體，987mg(41％)；六聚體，226mg(16％)；七聚體，68mg(6.1％)；八聚體，26mg(2.7％)；九聚體，11.5mg(1.3％)；十聚體，6.5mg(0.8％)；十一聚體，2.5mg(0.3％)。相對于3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的平衡總質量82％。
實施例10-水解乙酰基-和芐基保護的低聚物上的乙酰基保護基部分A-三(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體將1.54g(742μmol)的三(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體的30mL四氫呋喃溶液中一次性全部加入5.8mL(8.9mmol)的40％四-正丁基氫氧化銨水溶液。使反應混合物在密封的燒瓶中于室溫下放置94小時，然后部分蒸發除去四氫呋喃。剩余物用20mL水稀釋，其產物用20mL乙酸乙酯萃取兩遍，而合并的有機相用10mL鹽水洗滌并蒸發。用乙酸乙酯經短硅膠柱過濾，蒸發并真空干燥后獲得1.44g(99％)無色泡沫狀的三(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)2-三聚體。
部分B-四(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體使1.59g(573μmol)的四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體與5.6mL(8.6mmol)40％四-正丁基-氫氧化銨水溶液在29mL四氫呋喃溶液中反應96小時(如對三聚體中的描述)，得到1.45g(97％)無色泡沫狀的四(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體。
部分C-五(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)4-五聚體如對三聚體中的描述，使1.81g(524μmol)的五(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)-表兒茶素(4β，8)4-五聚體與6.9mL(10.5mmol)40％四-正丁基-氫氧化銨水溶液在35mL四氫呋喃溶液中反應118小時，得到1.45g(97％)無色泡沫狀的五(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)4-五聚體。分析樣品經制備型HPLC(柱B，0-30min，80-100％CH3CN/H2O，然后CH3CN)進一步純化。
部分D-六(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)5-六聚體使486mg(117μmol)的六(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)-表兒茶素(4β，8)5-六聚體與1.5mL(2.3mmol)40％四-正丁基-氫氧化銨水溶液在8mL四氫呋喃溶液中反應101小時(如對三聚體中的描述)，得到455mg(100％)無色玻璃樣的六(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)5-六聚體。
部分E-七(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)6-七聚體使126mg(26.1μmol)的七(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)-表兒茶素(4β，8)6-七聚體與0.34mL(0.52mmol)40％四-正丁基-氫氧化銨水溶液在1.8mL四氫呋喃溶液中反應94小時(如對三聚體中的描述)，得到118mg(100％)無色泡沫狀的七(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)6-七聚體。
部分F-八(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)7-八聚體使41.2mg(26.1μmol)的八(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)-表兒茶素(4β，8)7-八聚體與0.10mL(0.15mmol)40％四-正丁基-氫氧化銨水溶液在0.5mL四氫呋喃溶液中反應126小時(如對三聚體中的描述)，得到39.4mg(102％)無色泡沫狀的八(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)7-八聚體。
部分G-九(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)8-九聚體使17.9mg(2.88μmol)的九(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)8-九聚體與47μL(72μmol)40％四-正丁基-氫氧化銨水溶液在0.3mL四氫呋喃溶液中反應134小時(如對三聚體中的描述)，得到16.8mg(100％)無色泡沫狀的九(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)8-九聚體。
實施例11-由芐基保護的低聚物制備表兒茶素(4β，8)-低聚物A.表兒茶素(4β，8)2-三聚體的制備向64.3mg(33.0μmol)雙(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)-二聚體的5mL四氫呋喃溶液中加入5mL甲醇、0.25mL水和57mg 20％Pearlman’s催化劑(Pd(OH)2/C)。該混合液在1bar氫氣下攪拌80分鐘并用棉花過濾。濾渣用10mL甲醇洗滌兩遍。蒸發合并的濾液，而剩余物收集于10mL HPLC級的水中。過濾溶液并凍干，得到32.4mg(101％)表兒茶素(4β，8)2-三聚體·6H2O的蓬松、無定形、近白色固體[α]D+70.4°，[α]546+84.4°(MeOH，c 2.2gL-1)；(參照4c[α]D+75.2°，丙酮，c 8.7gL-1；參照4d[α]578+90°，MeOH，c 2gL-1；參照6[α]D+76.4°，丙酮，c 8.6gL-1；參照19b[α]578+92°，H2O，c 1.9gL-1；參照19k[α]D+80°，MeOH，c 1.6gL-1)；13C NMR(CD3OD，TMS；僅δ60-85區域)δ79.73，77.08，73.47，72.94，66.84；MS(API/ES)m/z 865.0(計算值[M-H]-865.2)，577.0(6％)，288.9(4％)。元素分析C45H38O18·6H2O計算值C，55.44；H，5.17.實測值C，55.71；H，5.07.
B.表兒茶素(4β，8)3-四聚體的制備向56mg(21.6μmol)三(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體的4mL四氫呋喃溶液中加入4mL甲醇、0.2mL水和47mg 20％Pearlman’s催化劑(Pd(OH)2/C)。該混合液在1bar氫氣下攪拌75分鐘并用棉花過濾。濾渣用5mL甲醇洗滌兩遍。用5mL HPLC級水稀釋合并的濾液并部分蒸發以去除有機溶劑。另以10mL HPLC級水稀釋后，將溶液過濾并凍干，得到24.4mg(89％)表兒茶素(4β，8)3-四聚體·6H2O的蓬松、無定形、近白色固體[α]D+93.3°，[α]546+114°(MeOH，c 9.3gL-1)；(參照4d[α]578+73.2°，MeOH，c 3.7gL-1；參照4j[α]D+59.8°，丙酮，c 12gL-1；參照6[α]D+109.5°，丙酮，c 12.3gL-1；參照19i[α]D+89.2°，丙酮，c 9gL-1；參照191[α]D+81°，MeOH，c1.1gL-1)；MS(API/ES)m/z 1153.3(55％，計算值[M-H]-1153.3)，865.1(25％)，576.9(100％)，500.1(30％)，288.9(4％)。元素分析C60H50O24·6H2O計算值C，56.96；H，5.10.實測值C，56.98；H，4.83.
C.表兒茶素(4β，8)4-五聚體向76mg(23.4μmol)五(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)4-五聚體的4mL四氫呋喃溶液中加入4mL甲醇、0.2mL水和60mg 20％Pearlman’s催化劑(Pd(OH)2/C)。該混合液在1bar氫氣下攪拌2小時并用棉花過濾。濾渣用甲醇洗滌，而合并的濾液被部分蒸發以除去有機溶劑。剩余物用10mL HPLC級水稀釋、過濾并凍干，得到34.8mg表兒茶素(4β，8)4-五聚體的蓬松、無定形、近白色固體[α]D+116°，[α]546+140°(甲醇，c 8.3gL-1)；(參照4d[α]578+96°，MeOH，c 1gL-1；參照19i[α]D+102.1°，丙酮，c 10gL-1；參照191[α]D+102°，MeOH，c 1.2gL-1)；元素分析C75H62O30·7.5H2O計算值C，57.07；H，4.92.實測值C，56.99；H，4.79.
D.表兒茶素(4β，8)5-六聚體的制備向92.3mg(23.7μmol)六(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)5-六聚體的8mL四氫呋喃溶液中加入8mL甲醇、0.4mL水和169mg 20％Pearlman’s催化劑(Pd(OH)2/C)。將該混合液在1bar氫氣下攪拌50分鐘并用棉花過濾。濾渣用甲醇洗滌，加入10mL HPLC級水后，合并的濾液被部分蒸發，剩余物用另外20mL HPLC級水稀釋，過濾并凍干，得到47.4mg表兒茶素(4β，8)-六聚體的蓬松、無定形、近白色固體[α]D+123°，[α]546+149°(甲醇，c 8.6gL-1)。元素分析C90H74O36·9.2H2O計算值C，56.98；H，4.91.實測值C，56.89；H，4.61E.表兒茶素(4β，8)6-七聚體的制備向87.5mg(19.3μmol)七(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)6-七聚體的8mL四氫呋喃溶液中加入8mL甲醇、0.4mL水和111mg 20％Pearlman’s催化劑(Pd(OH)2/C)。將該混合液在1bar氫氣(H2)下攪拌1小時并用棉花過濾。濾渣用MeOH洗滌，加入10mL HPLC級水后，合并的濾液被部分蒸發，剩余物用另外10mL HPLC級水稀釋，過濾并凍干，得到39.3mg表兒茶素(4β，8)6-七聚體的蓬松、無定形、近白色固體[α]D+134°，[α]546+164°(MeOH，c 9.6gL-1)。元素分析C105H86O42·10H2O計算值C，57.33；H，4.86.實測值C，57.49；H，4.80.
F.表兒茶素(4β，8)7-八聚體的制備向35.7mg(6.88μmol)八(5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)7-八聚體的3mL四氫呋喃溶液中加入3mL甲醇、0.15mL水和57mg 20％Pearlman’s催化劑(Pd(OH)2/C)。將該混合液在1bar氫氣下攪拌55分鐘并用棉花過濾。濾渣用甲醇洗滌，而合并的濾液加入10mL HPLC級水后被部分蒸發。剩余液再用10mL HPLC級水稀釋，過濾并凍干，得到17.1mg表兒茶素(4β，8)7-八聚體的蓬松、無定形、近白色固體[α]D+148°，[α]546+180°(甲醇，c 5.2gL-1)。元素分析C120H98O48·10.7H2O計算值C，57.66；H，4.77.實測值C，57.68；H，4.79.
純化的天然和合成低聚物的HPLC比較分析。純化的天然低聚物全部出現額外峰，其額外峰的數量隨低聚物大小的增加而增加。
實施例12-四氟硼酸銀引起的4-[(2·苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的自身縮合在黯淡光線中在30分鐘內向445mg(545μmol)的4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(實施例4中的主要非對映異構體)的5mL無水四氫呋喃溶液中滴加48mg(247μmol)四氟硼酸銀的磁力攪拌的冰冷溶液(臨用前避光下油泵真空100℃干燥110分鐘)。0℃下繼續攪拌5分鐘，然后加入0.2mL三乙胺。蒸發后，剩余物用乙酸乙酯/己烷(1∶1)經短硅膠柱過濾純化，得到414mg無色泡沫。用制備型HPLC分離這種五種低極性主要組分的復雜混合物(柱D；0-30分鐘，80-100％甲基氰(CH3CN)的水溶液，然后CH3CN)。觀察到的保留時間和產率如下2-巰基苯并噻唑，tR4.4分鐘，19mg；5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-硫代苯并噻唑-3-基)表兒茶素，15.4分鐘，18mg(4％)；起始物單體，21.4分鐘，14mg(回收率3％)；5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-硫代苯并噻唑-3-基)表兒茶素]，23.5分鐘，7mg(2％)；5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]，27.0分鐘，15mg(4％)。
實施例13-酸性粘土引起的4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素的自身縮合向18.0mg(21.0μmol)的4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(實施例4中的優勢非對映異構體)的1mL無水二氯甲烷(CH2Cl2)溶液中加入38mg商標名為膨潤土K-10的蒙脫土。將該混合物在室溫下攪拌160分鐘，過濾并蒸發。剩余物用制備型HPLC分離(柱B；0-30分鐘，80-100％CH3CN的水溶液，然后CH3CN)。觀察到的保留時間和產率如下2-巰基苯并噻唑，tR4.6分鐘，0.6mg；5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-硫代苯并噻唑-3-基)表兒茶素，13.2分鐘，2.0mg(11％)；起始物單體，19.2分鐘，2.7mg(回收率15％)；5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-硫代苯并噻唑-3-基)表兒茶素]，21.5分鐘，0.6mg(4％)；5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]，25.9分鐘，1.4mg(9％)；5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-[4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-雙四-O-芐基表兒茶素]，30.8分鐘，1.2mg(8％)；5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-雙(4β，8)-(5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-[4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]，34.2分鐘，0.3mg(2％)。
實施例14-四氟硼酸銀引起的3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的自身縮合在黯淡光線中，在磁力攪拌及冰冷下，在40分鐘內向355mg(414μmol)3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素的4mL無水四氫呋喃溶液中滴加臨用前在避光下用油泵真空90℃干燥1小時的20mg(103μmol)四氟硼酸銀的溶液。0℃下繼續攪拌10分鐘，然后加入0.2mL三乙胺。蒸發后，剩余物用乙酸乙酯/己烷(1∶1)經短硅膠柱過濾純化，得到331mg無色泡沫。該混合物用制備型HPLC分離(柱D；0-30分鐘，80-100％甲基氰(CH3CN)的水溶液，然后CH3CN)。觀察到的保留時間和產率如下2-巰基苯并噻唑，tR4.6分鐘，6.4mg；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素，11.1分鐘，13.2mg(4.5％)；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)，16.9分鐘，38.3mg(13％)；起始物單體，22.4分鐘，156mg(44％)；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]和3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)的混合物29.7分鐘，54.3mg；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]和3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-雙[(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)]-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)的混合物34.6分鐘，11.9mg；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-雙[(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素]-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]的混合物38.9分鐘，6.3mg(2.1％)。3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]和3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)的混合物用正相HPLC分離(柱F；0-40分鐘，20-50％乙酸乙酯(EtOAc)的己烷溶液，然后50％)，得到43mg(14％)3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素](tR22.1min)和6.4mg(2.2％)3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)(tR32.8min)。3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]和3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-雙[(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)]-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)的混合物采用柱E以相同的梯度分離，得到5.4mg(1.8％)3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素](tR34.8min)和5.0mg(1.7％)3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素-雙[(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)]-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)(tR42.8min)。對于鑒定，所得產物經過柱B正相HPLC再純化(0-30分鐘，80-100％甲基氰(CH3CN)的水溶液然后CH3CN)。
實施例15-3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素-4β，8-[3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]與四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素)(4β，8)3-四聚體的反應反應瓶中的21mg(0.11mmol)四氟硼酸銀樣品在避光和100℃下油泵真空干燥1小時。冷卻后，氮氣中斷真空，一次性全部加入190mg(68.8μmol)的四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)-表兒茶素(4β，8)3-四聚體的1mL無水四氫呋喃溶液。將燒瓶置于黯淡光線下的冰浴中，并于攪拌中在12分鐘內逐滴加入35.5mg(22.9μmol)的3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素-(4β，8)-[3-O-乙酰基-4-((2-苯并噻唑基)硫代)-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素]的0.5mL無水四氫呋喃溶液。繼續在0℃下攪拌5分鐘并在室溫下攪拌10分鐘。加入三乙胺(0.1mL)，蒸發混合物，而剩余物以乙酸乙酯/己烷(1∶1)經短硅膠柱過濾。蒸發洗脫液，其粗產物之混合物(230mg)經制備型HPLC分離(柱D，280nm；0-30分鐘，80-100％甲基氰(CH3CN)的水溶液，然后CH3CN)。觀察到的保留時間和產率如下3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)，tR22.7分鐘，21.0mg(65％)；3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素-雙[(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素)]-(4β，8)-(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-羥基表兒茶素)，34.6分鐘，0.8mg(2.5％)；四(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)3-四聚體，36.3分鐘，176mg(回收率92.5％)；六(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)5-六聚體，45.6分鐘，11.7mg(12％)；八(3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基)表兒茶素(4β，8)7-八聚體，1.4mg(2.2％)；矢車菊苷配質處理的MDA MB-231人乳腺癌細胞的細胞周期分析表明五聚體使之阻滯于G0/G1期，二聚體和三聚體無影響，而四聚體只有微弱影響(見表1)。
表1用從可可豆中純化的低聚矢車菊苷配質處理MDA MB-231人乳腺癌細胞的細胞周期分析
G0/G1的增加伴隨著S期和G2/M期細胞數量的減少。
細胞死亡方式(凋亡或壞死)采用Trevigen’s TACSTM膜聯蛋白V-FITC試劑盒進行膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)分析檢測。以天然和合成矢車菊苷配質三聚體、四聚體和五聚體處理的MDA MB-231細胞的細胞周期分析如下所示。采用膜聯蛋白V-FITC和碘化丙啶(對照組與200μg/mL低聚物處理24小時比較)的矢車菊苷配質-試驗的MDA MD-231人乳腺癌細胞的流式細胞計量如下所示。A是表兒茶素(4β，8)2-三聚體，B是表兒茶素(4β，8)3-四聚體，C是表兒茶素(4β，8)4-五聚體。左下象限顯示活細胞。右下象限顯示早期凋亡事件。右上象限顯示晚期凋亡事件。左上象限顯示無活性細胞。
天然和合成矢車菊苷配質處理的細胞均顯示相似的特性，隨著低聚物大小的增加可觀察到其右上象限的細胞數量增加。此象限表示膜聯蛋白V陽性細胞攝取碘化丙啶，所述細胞被認為或者是凋亡晚期或者是壞死細胞。在五聚體處理下的細胞其右下象限沒有明顯數量的細胞群體存在(與早期凋亡事件相關的細胞)提示細胞死亡的壞死途徑可能是由于與細胞膜的直接的相互作用導致損傷、細胞危象以及最終死亡。
五聚體所致G0/G1期阻滯在細胞處理長達8小時時是可逆的，而24小時處理后是不可逆的。未發現天然和合成矢車菊苷配質三聚體之間的活性差異。與天然矢車菊苷配質四聚體相比，發現合成矢車菊苷配質使G0/G1期阻滯增加約15％。顯示合成的比天然的矢車菊苷配質五聚體增加約30％。見下表2。
表2天然和合成低聚物矢車菊苷配質處理MDA MB-231人乳腺癌細胞的細胞周期分析比較
新近報道表明幾種不同的多酚類化合物在試管內人為產生過氧化氫(H2O2)并且由此產生各種生物學活性。見Long，L H.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，273，50.表3的結果表明，如果過氧化氫以文獻報道的水平存在，其將使細胞周期移至G2/M而減少了G0/G1。加入過氧化氫酶取消這種作用，致使細胞周期回到對照水平。將過氧化氫酶單獨加入五聚體處理的細胞中未產生明確的由過氧化氫引起的細胞周期的改變，即，由五聚體所致的典型的G0/G1阻滯基本上保持沒有變化。
為排除表兒茶素(4β，8)4-五聚體可能抑制過氧化氫酶活性的可能性，向存在或不存在過氧化氫酶的五聚體處理的細胞中加入過氧化氫。向五聚體處理細胞中加入過氧化氫導致G0/G1和G2/M的阻滯增加而S期細胞減少，而熱滅活過氧化氫酶沒有影響。由此，G0/G1阻滯由五聚體直接導致，而非通過過氧化氫。這些差異可能歸因于合成矢車菊苷配質的純度更高。
表3五聚體處理的MDA MB-231細胞周期分析
總體上，上述結果證實，無論是純化的可可豆多酚提取物還是合成制備的表兒茶素五聚體對人乳腺癌細胞的都有細胞毒作用。矢車菊苷配質五聚體導致MDA-MB-231細胞的G0/G1期阻滯獨立于過氧化氫所致的任何影響。膜聯蛋白V和碘化丙啶陽性細胞的增加提示五聚體處理的細胞很快進入細胞死亡的壞死期。
上述實施例僅僅是說明性的而不限制優選實施例的意思。熟練技術人員能夠識別不脫離本發明精神和范圍的多種變化。
權利要求
1.一種制備5，7，3’，4’-四-O-保護的-矢車菊苷配質(4，8)-二聚體以及其它(4，8)-低聚物的混合物的方法，該方法包括在酸性粘土的存在下，使5，7，3’，4’-四-O-保護的-表兒茶素或-兒茶素單體與5，7，3’，4’-四-O-保護的-4-烷氧基-表兒茶素或-兒茶素單體偶合的步驟。
2.權利要求1的方法，其中所述矢車菊苷配質二聚體選自表兒茶素-(4β，8)-表兒茶素、表兒茶素-(4β，8)-兒茶素，兒茶素-(4α，8)-兒茶素、兒茶素-(4β，8)-兒茶素，兒茶素-(4α，8)-表兒茶素和兒茶素-(4β，8)-表兒茶素。
3.一種制備5，7，3’，4’-四-O-保護的-矢車菊苷配質(4，8)-低聚物的方法，該方法包括在酸性粘土存在下，使5，7，3’，4’-四-O-保護的-表兒茶素或-兒茶素(4，8)-二聚體或高級低聚物與5，7，3’，4’-四-O-保護的-4-烷氧基-表兒茶素或-兒茶素單體偶合的步驟。
4.權利要求1或3的方法，其中所述保護基是不使被保護單體、二聚體或低聚物的A環失活的基團；其中4-烷氧基是具有末端羥基的C2-C6烷氧基；并且其中所述酸性粘土是蒙脫土。
5.權利要求4的方法，其中所述保護基是芐基；其中具有末端羥基的C2-C6烷氧基是2-羥基乙氧基并且其中所述蒙脫土是膨潤土粘土。
6.權利要求1的方法，其中所述單體是5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素和5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素，以及所述混合物包含5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8)-二聚體和5，7，3’，4’-四-O-表兒茶素(4β，8)2-三聚體。
7.權利要求3的方法，其中所述二聚體是5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素(4β，8)-二聚體，所述單體是5，7，3’，4’-四-O-芐基-(2-羥基乙氧基)表兒茶素，以及所述混合物包含5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素，(4β，8)2-三聚體和(4β，8)3-四聚體。
8.權利要求1或3的方法，該方法還包括通過柱層析分離保護的單體和保護的二聚體或高級低聚物以及用氫原子置換二聚體或低聚物上的保護基的步驟。
9.一種制備四-O-保護的或五-O-保護的(4β，8)-矢車菊苷配質混合物的方法，該方法包括在四氟硼酸銀或酸性粘土存在下，使選自四-O-保護的表兒茶素或-兒茶素單體和五-O-保護的表兒茶素或-兒茶素單體的保護的單體與選自4-硫代-四-O-保護的表兒茶素或-兒茶素單體和4-硫代-五-O-保護的表兒茶素或-兒茶素單體的C-4硫代活化的、保護的單體反應。
10.權利要求9的方法，其中四-O-保護的-表兒茶素單體是5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素或-兒茶素；其中所述五-O-保護的-表兒茶素或-兒茶素單體是3-O-乙酰基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素；其中所述4-硫代-四-O-保護的表兒茶素或-兒茶素單體是4-芐硫基-或4-2-(苯并噻唑基)硫代-表兒茶素或-兒茶素；而其中4-硫代-五-O-保護的表兒茶素或-兒茶素單體是3-O-乙酰基-4-芐硫基-表兒茶素或-兒茶素或3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素或-兒茶素。
11.權利要求9的方法，其中所述保護的單體是3，5，7，3’，4’-五-O-芐基-表兒茶素而其中活化的、保護的單體是3-O-乙酰基-4-(2-苯并噻唑基)硫代-3，5，7，3’，4’-五-O-芐基-表兒茶素。
12.權利要求9的方法，該方法還包括通過反相高壓液相層析分離保護的低聚物以及除去乙酰基和/或芐基保護基的步驟。
13.4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素或4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基兒茶素。
14.一種制備權利要求13的化合物的方法，該方法包括使5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素或5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素與由2-巰基苯并噻唑和三甲基鋁產生的有機硫醇鋁反應。
15.3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基表兒茶素或3-O-乙酰基-4-[(2-苯并噻唑基)硫代]-5，7，3’，4’-四-O-芐基兒茶素。
16.一種制備權利要求15的化合物的方法，該方法包括使5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)表兒茶素或5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)兒茶素與由2-巰基苯并噻唑和三甲基鋁產生的有機硫醇鋁反應。
17.一種制備矢車菊苷配質(4，8)二聚體二沒食子酸酯的方法，該方法包括以下步驟(a)在酸性粘土存在下，使5，7，3’，4’-四-O-保護的-表兒茶素或-兒茶素單體與活化的5，7，3’，4’-四-O-保護的-4-烷氧基-表兒茶素或-兒茶素單體偶合；(b)通過柱層析從其它保護的4，8)矢車菊苷配質低聚物中分離保護的(4，8)矢車菊苷配質二聚體；和(c)以羥基保護的沒食子酸或活化的沒食子酸酯化保護的(4，8)矢車菊苷配質二聚體。
18.權利要求17之方法，其中保護的單體是5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素或-兒茶素；其中活化的單體是5，7，3’，4’-四-O-芐基-4-(2-羥基乙氧基)-表兒茶素或-兒茶素；其中所述酸性粘土是蒙脫土；且其中所述羥基保護的活化沒食子酸是三-O-沒食子酰氯。
19.權利要求17之方法，其中所述矢車菊苷配質二聚體二沒食子酸酯選自表兒茶素-(4β，8)-表兒茶素二沒食子酸酯，表兒茶素-(4β，8)-兒茶素二沒食子酸酯，兒茶素-(4α，8)-兒茶素二沒食子酸酯，兒茶素-(4β，8)-兒茶素二沒食子酸酯，兒茶素-(4α，8)-表兒茶素二沒食子酸酯，及兒茶素-(4β，8)-表兒茶素二沒食子酸酯。
20.一種制備C-4烷氧基-5，7，3’，4’-四-O-芐基-8-溴-表兒茶素或-兒茶素的方法，該方法包括通過引入烷氧基而活化5，7，3’，4’-四-O-芐基-表兒茶素或-兒茶素的C-4位并且通過引入溴代基而封閉其C-8位。
21.權利要求20之方法，其中4-烷氧基是2-羥基乙氧基，其中所述活化步驟在封閉步驟之前進行；且其中所述封閉步驟在-40℃下，在二氯甲烷中，用N-溴代琥珀酰亞胺進行。
22.權利要求20之方法，其中所述4-烷氧基是2-羥基乙氧基；其中所述封閉步驟在活化步驟之前進行；且其中所述封閉步驟在-40℃下，在二氯甲烷中，用N-溴代琥珀酰亞胺進行。
23.一種在需要此種治療的哺乳動物中治療乳腺癌的方法，所述治療是通過在G0/G1期阻滯細胞生長周期而抑制癌細胞生長，且該方法包括給予所述哺乳動物表兒茶素(4β，8)4-五聚體。
全文摘要
公開制備具有(4，8)黃烷間鍵合的矢車菊苷配質低聚物的各種方法。在一種改進的方法中，在酸性粘土取代Lewis酸存在下，使四－O－保護的－表兒茶素或－兒茶素單體或低聚物與保護的、C－4烷氧基活化的－表兒茶素或－兒茶素單體偶合。在第二種方法中，使5，7，3’，4’－四－O－保護的－或優選五－O－保護的－表兒茶素或－兒茶素單體或低聚物與C－4位具有硫代活化基團的四－O－保護的－或優選五－O－保護的－表兒茶素或－兒茶素單體反應；此偶合在四氟硼酸銀存在下進行。在第三種方法中，在四氟硼酸銀存在下，用2－(苯并噻唑基)硫代基團在C－4位活化的兩個五－O－保護的－表兒茶素或－兒茶素單體分子自身縮合。還提供了一種改進的兩步驟制備C－4烷氧基活化的四－O－芐基－保護的、8－溴－封閉的－表兒茶素或－兒茶素單體的方法。還公開了天然來源和合成制備的矢車菊苷配質(4β，8)
文檔編號A61K31/352GK1878547SQ200380104551
公開日2006年12月13日 申請日期2003年10月2日 優先權日2002年10月2日
發明者A·P·科茲科夫斯基, W·塔克曼特爾, L·J·小羅曼茨克, X·馬 申請人:馬爾斯公司