專利名稱：高效融合小泡,其制備方法和含有該小泡的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于向細胞和組織輸送所選物質，如核酸、蛋白質、肽、抗原、藥物和美容劑的作為高效和通用性包裹系統的新型融合小泡。
醫學治療的首要目的之一是向患病部位有效輸送治療物質。雖然某些治療物質可以游離形式輸送，但其它物質由于它們可能被從導入部位快速清除或不能通過生物屏障，或由于它們的全身毒性，需要運載體或載體以到達和進入它們的目的地。向細胞和組織輸送物質需要的載體應是有效的、柔韌的、易于制備和安全的。目前向真核細胞輸送物質的現有方法包括采用病毒或非病毒載體。病毒載體是復制缺陷性病毒，其部分編碼序列被治療基因的序列置換，雖然重組病毒是高效的基因輸送和表達載體，但它們目前限于輸送核酸且它們在人類醫學上應用的安全性問題尚未確定。
大多數非病毒輸送系統運作水平如下就基因輸送而言，輸送載體負載的感興趣物質(如蛋白質、核酸、藥物或其它治療藥物)經胞吞作用靶向細胞核并進入。非病毒系統如脂質體的主要缺點是它們向細胞輸送物質的效率低(Chu等編；Legendre和Szoka，1992，Pharmaceut.Res.第9卷，1235頁)，推測是由于脂質體表面缺少融合介導分子。一種雜交類型的輸送系統病毒體(virosome)，將病毒的有效輸送機制與非病毒輸送系統的通用性和安全性聯合起來。病毒體重建了無傳染性核衣殼的包膜和可從各種病毒衍生的遺傳物質。這些病毒體的功能在于，它們的膜融合活性密切模擬了完整病毒已明確的只通過病毒融合蛋白質所介導的低pH依賴性膜融合活性。象病毒那樣，病毒體可被受體介導的胞吞作用迅速內化。與病毒系統相反，病毒體安全，因為病毒的傳染性核衣殼已被去除。因此病毒草體提供了可輸送廣泛的各種不同物質的有良好前景的運載系統，這類物質或包裹在其內部水相中或共同重建在其膜中。在病毒體膜中共同重建不同的受體還使得病毒體可靶向不同的細胞和組織。迄今病毒體通過在其表面加入抗原主要用作疫苗。
目前用于制備病毒體的方案主要限制在于其不能產生高的包裹效率。對于產生平均直徑約200nm的病毒體，其脂質濃度(約1mM)不到該病毒體所包裹水相的1％(Schoen等，J.Liposome Res.3767-792，1993)。這種低包裹率降低了病毒體介導的向細胞輸送藥物或基因的效率。因此，開發新的/新穎的能保留病毒體優良融合性能的更有效負載載體，及制備、負載和輸送它們的方法是治療性藥物、蛋白質和基因輸送領域的非常需要的目標。
當前病毒體技術的問題之一是缺少有效包裹溶質，如蛋白質、核酸或藥物的方法。本發明提供了解決病毒體包裹效率低問題的一種新穎方法。
因此，本發明提供由病毒體和脂質體脂質組成的融合小泡，其能包裹至少一種治療性或免疫活性物質，所述融合小泡可包含融合蛋白，優選至少兩種不同的融合蛋白或其片段，所述片段具有該完整融合蛋白的能與靶細胞生物膜融合的融合活性和特征，及不同的融合特征。優選該小泡是單室性的。該小泡的直徑通常在100-600nm范圍內，優選直徑在100-300nm之間，或直徑在200-400nm之間，這取決于具體的小泡。
本發明的優點是以極高脂濃度制備的脂質體具有高包裹效率。因此本發明提供了將脂質體的高負載容量與病毒體的有效細胞融合和輸送能力相組合的方法，導致大大提高了對溶質如蛋白質、核酸和藥物在可控大小的功能性嵌合病毒體內的包裹，從而能有效地向細胞輸送治療性或免疫活性物質。
因此在本發明的一個優選的實施方案中，將感興趣的物質首先加載或包裹在脂質體中。本發明所用脂質體的脂質宜選自陽離子脂質、合成的脂質、糖脂、磷脂、膽固醇及它們的衍生物。磷脂宜包括磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰肌醇及各種脂肪酰基組合物。陽離子脂質宜選自DOTMA(N-[(1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-氯化三甲基銨)、DOTMA(N-[(1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-氯化三甲基銨)、DOTAP(N-[(1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-氯化三甲基銨)、DODAC(N，N-二油酰基-N，N，-氯化二甲基銨)、DDAB(溴化二十二酰基二甲基銨)和硬脂酰胺或其它脂肪簇胺等。它們通常與DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)混合配制成小的單室脂質體，DOPE廣泛用作“輔助”脂質來促進其在核內體膜上的分布。脂質體的最優選脂質包括POPC/DDAB。
在第二步驟中，含感興趣物質的脂質體將與膜上具有不同類型融合蛋白的嵌合性病毒體融合。術語“融合蛋白及其片段”指能誘導和/或促進融合小泡膜與靶細胞的生物膜之間發生融合反應的蛋白質或其片段。
調整大小后，脂質體-病毒體融合產物成為病毒體樣顆粒，或脂蛋白體，其內腔中含有該感興趣物質，仍能在不同條件下與生物膜進行第二次融合步驟，以輸送治療性或免疫活性物質。
本發明的融合小泡可包裹至少一種物質，優選治療性或免疫活性物質，它們宜選自DNA、RNA、siRNA、蛋白質、肽、氨基酸和藥物活性物質或它們的衍生物。至少一種物質是美容劑、藥物、抗原或其混合物。
美容化妝物質的例子選自皮膚病學所用的治牛皮癬藥物和抗真菌藥。治療性物質和藥物的例子選自麻醉劑、血管生成抑制劑、抗痤瘡制品、抗變態反應藥、抗生素和局部用的化療藥、抗組氨藥、抗炎癥/抗感染藥、抗癌制劑、抗原、抗原生動物藥、抗風濕藥、抗病毒疫苗、抗病毒藥、凋亡藥、細菌疫苗、化療藥、細胞靜止藥、免疫抑制劑、輕瀉藥、精神抑制劑。
美容劑的優選例子是焦油制霉菌素和具有免疫學活性物質的藥物阿霉素、長春堿、順鉑、甲氨喋呤、環孢素、布洛芬、HCV的T-細胞抗原和腫瘤相關抗原。
將至少一種治療性物質，如蛋白質、肽、核酸、藥物、化療或美容劑包裹入脂質體可采用本領域已知的任何方法，包括Monnard等，Biochim Biophys Acta.132939-50，1997；Wanerg等，J Lipsome Res.12(3)271-283，2002或Oberholzer等，Biochim Biophys Acta.141657-68，1999中所述的方法，及諸多其它熟知的方法。在本發明一優選實施方案中，通過用于制備純脂質小泡的凍/融技術實現了脂質體高效包裹。用此法可將3kb以上的線性化質粒最初量的大約50％包裹在宜由1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC)/溴化二十二酰基二甲基銨(DDAB)組成的大單室小泡(LUV)中(Monnard等，Biochim Biophys Acta.132939-50，1997)。
在一優選實施方案中，本發明提供含顯示不同融合特征的病毒性融合分子二元混合物的病毒體制品。在本發明另一優選實施方案中，采用不同的病毒血凝素(HA)融合蛋白質來構建嵌合性病毒體。如前所示(Tsurudome等，J Biol Chem.26720225-20232，1992)不同病毒毒株的HA融合蛋白質可顯示融合和滅活的顯著不同溫度特征。例如，大約在pH5.0，X-31 HA在低溫可有效引起融合，而在相同pH時，PR8/34或A/Singapore病毒的HA要求提高溫度(＞25℃)。因此，在本發明一優選實施方案中，在其膜上含有蛋白質的嵌合性病毒體在兩種不同溫度下介導融合。不同的溫度敏感性是這些融合蛋白的特別有利特征，因為它得以方便簡單地控制融合反應。作為一個例子，本發明證明含X-31和PR8/34病毒粒子二者的HA分子的病毒體，能在pH5.0時催化兩種不同的融合反應在低溫(0-4-10℃)催化第一種，在提高溫度(＞25℃)時催化第兩種。然而具有不同融合特征，包括對溫度、離子濃度、酸性、細胞類型和組織類型特異性等的其它融合蛋白質是本領域熟知的，可用于本發明的目的。具有不同融合特征的融合蛋白質可衍生自不同的流感病毒株，如MRC-11、X-97、NIB24、NIB26、X-47、A/Johannesburg/33和A/Singapore等。此外，可采用其它已知的病毒融合蛋白質，如泡疹性口炎病毒(VSV)G蛋白、Semliki森林病毒(SFV)E1蛋白或仙臺病毒F蛋白，和諸多其它蛋白來構建能產生后續和分別的融合活動的嵌合性病毒體。因此，負載有感興趣治療治療物質的該嵌合性病毒體和產生的病毒體樣脂蛋白體，可含有使該病毒體樣脂蛋白體靶向特定細胞和組織的融合蛋白。因此，例如對某些細胞表面受體，如HIV的gp41/gp120蛋白(gp120能結合CD4+T淋巴細胞和單核細胞/巨噬細胞系細胞上的CD4)具有特異性的融合蛋白，可用于向特異性細胞類型或組織靶向輸送治療性物質。這類細胞或組織特異性的其它融合蛋白是本領域熟知的，可常規摻入到本發明小泡中。
除了融合蛋白外，還可將本發明的小泡摻入膜中或附著于膜上、細胞表面受體、細胞因子、生長因子、抗體或抗體片段以改進該融合小泡對不同細胞或組織的靶向能力。
如本發明所示，一旦構建了這種嵌合性病毒體，可在第一特定條件下，即引發第一種病毒融合蛋白或肽與含有包裹的感興趣物質，如蛋白質、肽、核酸或藥物的脂質體相融合的條件下，使它們融合。本發明第一次證明嵌合性病毒體與負載物質的脂質體融合可產生病毒體樣脂蛋白體，其不僅包裹有感興趣的物質，而且仍能在不同條件下，如在不同的溫度、離子濃度等條件下，介導另一種融合活性。在適當操縱控制它們的大小后，可將這些含物質的脂蛋白體輸送給細胞而被有效攝取。在核內體環境中，該第二融合分子可引起病毒體與核內體膜之間的第二次融合反應。如
圖1所示，這種多步方法可導致脂質體包裹的物質轉移到細胞的胞質腔室中。
制備病毒體(本申請書中也稱為免疫活性重建流感病毒體，IRIV)的方法是本領域技術人員熟知的(Bron等，Methods Enzymol.220313-331，1993)。例如，可從用八亞乙基二醇單十二烷基醚溶解完整流感病毒，沉降核衣殼(病毒的糖蛋白和脂質保留在上清液中)，用疏水性樹脂(Bio-Beads SM2)去除上清液中的洗滌劑后得到的原病毒膜脂質和突起糖蛋白，重建流感病毒體(Stegmann等，Traffic 1598-604，1987)。對于制備含X-31和PR8/34病毒株HA的嵌合性病毒體，作為一個例子，用非離子洗滌劑C12E8溶解二病毒的等量蛋白質。分離其它病毒融合性蛋白是本領域技術人員的常規工作。在用Bio-Beads SM2去除洗滌劑后，即形成新的含二和類型融合蛋白的包膜。圖2含兩種不同類型HA融合蛋白的示范性嵌合病毒體的SDS-PAGE顯示，已將極相似量的融合蛋白PR8和X-31HA重建在嵌合性病毒體中。HA/磷脂的比例約為1.4mg/μmol。
為了確定它們的形態學，用cryo-TEM特征分析了構建的嵌合性病毒體。重建的顆粒是直徑在150-250nm之間的單室小泡；也可見某些較小的小泡(圖3)血凝素峰的密度顯著低于通常在完整病毒顆粒中所見的密度。這與測定的嵌合病毒體的HA/磷脂比例1.4mg/μmol(有時低于完整病毒粒子的約2mg/μmol)相一致。另外，HA突起以大約相等的密度存在于膜的兩側。嵌合性病毒體與脂質體相融合的性能，例如融合活性取決于一定的溫度、pH或其它參數，體外可用脂質混合試驗測定(Struck等，Biochemistry.204093-4099，1981)。該試驗依據熒光共振能量轉移(FRET)，采用兩種膜(如脂質體)之一中存在的N-NBD-PE(能量供體)和N-RH-PE(能量受體)兩種熒光團。也可采用該試驗的一種變化，即采用相同的供體N-NBD-PE但不同的受體膽固醇-蒽-9-羧酸酯(CAC)。也可采用該試驗的另一種變化，即用相同的受體N-RH-PE但不同的供體Bodipy 530/550-DHPE。融合時兩種熒光團分離，供體發出的熒光增強(或受體發出的熒光減弱)。作為一個例子，將X-31/PR8/34嵌合性病毒體的熒光活性與X-31和PR8/34病毒以及相應的病毒體的熒光作比較(圖4)。作為靶膜，采用POPC/POPG(4∶1)和兩種熒光團(各0.6％)制備的單室性脂質體。如圖4.1a所示，在4℃和pH5.0時X-31病毒和X-31病毒體均能與脂質體有效融合。因為X-31和PR8/34HA融合蛋白均要求酸性Ph，在中性pH時不發生融合。預先在低溫和低pH下培育X-31-HA幾乎完全消除了其融合活性(圖4.1b)。
相反，在4℃和pH5.0時，PR8/34病毒和病毒體既不融合，重要的是也不被滅活(圖4.2a)。然而，在37℃它們能引起融合(圖4.2b)。根據這些資料，可設計嵌合性病毒體來進行兩種不同的融合反應，這取決于各融合蛋白的特異性參數。例如，PR8/34/X-31嵌合病毒體可在低溫下(4℃，圖4.3a)進行第一融合反應，并在較高溫度(37℃，圖4.3b)下進行第二融合反應。本發明令人驚奇和重要的發現是在低溫和低pH下預先培育嵌合性病毒體與靶膜，不會消除升高溫度時的融合活性(圖4.3b)。因此，本發明提供了一種可控制的融合反應，其可導致形成能在不同條件下融合的裝有負載的病毒體。
制備的脂質體是單室性的這一事實，對于后續與嵌合性病毒體融合的步驟極其重要，因為負載的物質應釋放到新形成小泡的內腔中而非被留在膜層之間。為了檢測負載物質與所用脂質可能的相互反應和對脂質體形態的影響。對含有質粒的小泡進行了cryo-TEM。圖6中的電鏡圖顯示陽離子小泡是單室性的，大小為100-150nm。與形成的其它含陽離子脂質和DNA的多室性管狀結構制品(Gershon等，Biochemistry.327143-7151，1993)相反，本發明方法的優點是產生均勻的單室性小泡。
為了證明此法的可行性，以6.5kb模型質粒為例，測定了所選治療性或免疫活性物質的包裹效率。用DNA酶I/外切核酸酶III消化游離的質粒-DNA，凝膠過濾分離后測定，達到的包裹效率約40％為環形的6.5kb模型質粒。如圖5中所述，可根據DNA的放射標記或用溴乙錠染色后與瓊脂糖凝膠上的標準量作觀察比較，來定量測定殘留的完整DNA。為了確定被降解所得到的DNA量，在可得到的所有DNA(即用洗滌劑溶解的脂質體)(圖5，泳道9和10)或外部的DNA(圖5。泳道11和12)中進行了對照實驗。這些結果證明，DNA酶I/外切核酸酶III-耐受性組分被有效包裹在脂質體的內腔中，因為與陽離子脂質的(保護性)相互反應而不能接觸DNA酶I和核酸外切酶III。達到的(35-40％)包裹相當重要，可使此法適合于治療性應用。
成功制備了嵌合性病毒體和負載有感興趣物質的脂質體后，本發明提供了這兩種小泡系統的融合方法。然而在獲得理想的融合性和負載的病毒體之前，有幾個主要的障礙必須克服。因為病毒體與脂質體和其它病毒體及融合的主要產物均能融合，在混合加載的脂質體與嵌合性病毒體時可發生多輪融合。這些不受控制的融合可產生高比例的大的不明確結構。對于向細胞輸送治療性物質，這些大的結構是不適合的，因為預計細胞對它們的胞吞作用將嚴重受損。此外，多輪融合將導致病毒體樣終末產物(脂蛋白體)群具有各種各樣不同的大小。這種大小不均勻的顆粒群治療上不理想，因為不能控制包裹的治療性物質的量和給藥劑量。此外，先前未曾證明所得到的嵌合性病毒體樣脂蛋白體內腔中，包裹了原先被脂質體包裹的感興趣治療性或免疫活性物質。因此懷疑是否成功實現了包裹或是否融合可能導致感興趣治療性物質的部分或全部釋放。最后尚未能確定融合的小泡是否能在第二組條件下，如升高溫度下保留融合能力。
為了研究脂質體與含有不同融合蛋白質的病毒體之間的融合產物，用冷凍透射電鏡(cryo-TEM)特征分析了融合小泡的樣品。脂質體-病毒體融合產物顯示小泡的大小分布在450-900nm之間(圖7，上圖)。檢測到某些可能起源于病毒體的較小小泡(圖7，上左圖)。另一方面，看來所有的脂質體經歷了至少一輪融合。存在非常大的小泡(＞900nm)證明在病毒體-脂質體融合步驟中發生過多輪融合。為了解決不受控制融合的問題和產生大小均勻的小泡從而控制所給藥物或物質的輸送劑量，必須使制備小泡時能產生均勻大小的小泡。理想的是，必須減少不適合胞吞的大直徑小泡而不會引起包裹成分或融合性能的喪失。因此，本發明還包括在使包裹有至少一種治療性或免疫活性物質的脂質體與含有不同融合特性融合蛋白的病毒體融合后，再給所得融合小泡確定大小。根據本發明，所述調整大小可通過擠壓小泡進行。
因此，本發明提供通過使嵌合性病毒體與負載脂質體相融合，而降低所得病毒體樣蛋白體尺寸的步驟，該步驟不會使小泡所包裹的物質顯著丟失，也不會使剩余的功能性融合蛋白伴隨喪失其融合性能。這樣，在本發明的一優選實施方案中，使病毒體-脂質體融合反應的反應產物經受核孔擠壓步驟以減少它們的大小。如圖7下圖所示，通過200nm孔擠壓，產生的小泡如cryo-TEM所示大小為原先的大約一半。大多數顆粒在100-300nm之間，偶爾也可測到較大小泡(500-600nm)。擠壓步驟能產生調整大小的融合性病毒體樣小泡而不會顯著丟失包裹物質這一事實，是相當出乎意料的和高度有利的結果，因為擠壓時施加的剪切力預計會破裂大部分膜，引起包裹物質的丟失和融合蛋白的失活。通過測定擠壓得到的脂蛋白體的融合性能和DNA含量，驗證了該擠壓步驟既不會導致包裹質粒DNA的顯著丟失，也不會使第二融合蛋白(PR8-血凝素)失活。PRET-測定顯示擠壓前后加載的脂蛋白體的融合性能相同(圖8)。此外，測定了擠壓脂蛋白體的質粒含量。至此，制備了含放射活性質粒DNA的脂質體(用DNA酶消化游離DNA，凝膠過濾去除核苷酸；包裹的DNA＝100％)。然后，使這些脂質體與病毒體融合。用DNA酶I直接處理一等份的融合產物，其余的擠壓通過核孔膜。去除游離核苷酸后，測定脂蛋白體中所包裹的放射活性。從這些結果中可得出結論在最初融合步驟中，不到15％(±5％s.d；n＝2)的原先被包裹的DNA丟失，而在融合和擠壓過程中，丟失不到25％(±3％s.d；n＝2)。因此，擠壓后脂蛋白體中發現的放射活性量只比擠壓前略微降低。當考慮到報道說HA-介導的膜融合是一種滴漏過程(Shangguan等，Biochemistry.354956-4965，1996)時，這種脂質體-病毒體融合可保留大部分包裹物質甚至更令人驚奇。
因此，本發明提供一種制備能有效包裹向細胞和組織輸送的感興趣物質的融合活性脂蛋白體小泡的方法。可用穩定插入在膜雙層中的熒光脂質羅丹明磷脂酰乙醇胺(Rh-PE)追蹤觀察這些新型脂蛋白體小泡的細胞攝取。將標記的脂蛋白體加入到24孔板中蓋玻片上培養的MDCK或Hela-細胞(約1×105個細胞)。4℃培育1小時使其結合細胞，除去未結合顆粒，37℃再培育細胞15分鐘。甲醛固定后，用熒光顯微鏡分析細胞。
37℃短暫培育后，可見清晰的斑點狀核周染色(圖9B)，表明羅丹明標記的脂蛋白體已迅速被內化。此過程是溫度依賴性的，因為在4℃所有的顆粒都停留在細胞表面(圖9A)。另外，此過程也依賴于小泡膜中的融合蛋白，因為無蛋白的Rh脂質體在2小時內不能被內化到可檢測水平。這些結果顯示，在所有可能的受體介導胞吞過程中，嵌合性脂蛋白體被迅速內化，作為流感病毒的例子。同樣，可在脂質體中加入高濃度的葡聚糖，因為它的尺寸較小，估計可在一個脂蛋白體中摻入幾種標記分子。事實上，從理論上講所用葡聚糖的濃度(37.5mg/ml)可在一個脂質體中摻入170個葡聚糖分子。每個葡聚糖分子被6個熒光團置換，每個脂質體應得到1000個Texas紅分子。預計如果包裹的物質被釋放入胞質中，熒光顯微鏡應看見彌漫的胞漿染色，如果該物質仍被包裹應看見斑點狀核周染色。實施例中描述了將葡聚糖包裹入POPC/DDAB-脂質體中。脂質體與嵌合性病毒體融合，并將融合產物加入蓋玻片上培養的細胞。4℃培養細胞1小時，然后洗去未結合物質，在37℃培養細胞不同時間。用3.7％(v/v)甲醛固定后，以熒光顯微鏡分析細胞。37℃培育細胞15分鐘后檢測葡聚糖-脂蛋白體的攝取情況，如羅丹明標記的脂蛋白體所見那樣。此階段細胞表面有大量的染料(圖10B)。然后可見更多的核周染色(圖10C和D)。
為了進一步證明此法的可行性，測定了其它所選治療性物質的包裹率。采用了疏水性及親水性肽、蛋白質(如重組的綠熒光蛋白，GFP)和小分子(如PicoGreen)。表1提供了這些結果的小結。采用常規制備方法(Schoen等，J Liposome Res.3767-792，1993)，獲得的包裹率低于5％。然而，該新方法得到的包裹率每例至少高于15％(表1)。
表1在IRIV制備的后續步驟中不同分子的包裹效率
1，2實施例6中詳述的脂質體制品和脂質體與IRIV融合的制品(脂蛋白體)3實施例3中詳述的“常規”IRIV制品4GFP綠熒光蛋白5PicoGreenDNA嵌入劑。
因此，本發明提供向細胞輸送治療性物質，包括巨分子物質的改進的病毒體為基礎的運載體系統。因為其完全性和其細胞攝取的快速性，本發明的病毒體樣融合性脂蛋白體提供了一種有前景的系統，也可用于制備治療或預防病毒、細菌和真菌感染，退行性病變、增殖過度性疾病和其它激酶相關疾病，包括癌癥、傳染性疾病、慢性傳染性疾病、慢性病、變態反應疾病、心血管疾病、炎性疾病(包括皮膚炎性疾病如牛皮癬)、免疫疾病、癌免疫疾病、哮喘或關節炎的藥物制劑。
本文提供的小泡的另一優點是它們可通過共同構建在小泡膜中的受體、抗體或抗體片段，能靶向特定的細胞或組織(Mastrobattista等，FEBS Lett.50971-76，2001)此外，由于病毒體已顯示具有優良的佐劑功能(Gluck，Vaccine 171782-1787，1999)，本發明的病毒體樣脂蛋白體除藥物輸送外，可能適合用于疫苗中。通過提供對物質包括大分子的有效包裹，本發明滿足了本領域的迫切需要。模型質粒所顯示的25-30％包裹效率使單室融合性脂蛋白體遠遠超過先前所用技術測定的低于1％的包裹率(Schoen等，J Liposome Res.3767-792，1993)。此外，發現制備的示范性脂蛋白體在低pH和升高的溫度下能與模型膜有效融合。能被培養的細胞迅速內化，其程度與病毒和病毒體相同(Bron等，Biochemistry.339110-9117.1994；Nunes-Correia等，Biochemistry.381095-1101，1999)。
提供以下實施例來更好闡明本發明而不應認為是限制本發明的范圍。當提到具體的材料內容時，目的只是說明而不是限制本發明。本領域技術人員可能開發出相等的方法或反應試劑而不須實施本發明的能力，但這不脫離本發明的范圍。
附圖的簡要說明圖1此圖顯示代表本發明整體策略的簡圖。在第一步融合中，于4℃(pH5.0)嵌合性病毒體與含有待輸送物質(此例中為DNA)的脂質體經X-31介導而融合。隨后將產生的中和融合產物與細胞一起培育。經受體介導的胞吞作用后，現含有待輸送物質的病毒體樣脂蛋白體在內體中經歷了低pH引發的由PR8/34HA介導的第二輪融合，將包裹的物質釋放到胞質中。
圖2此圖顯示在嵌合性病毒體的膜中存在兩種類型的融合蛋白質。X-31和PR8病毒和病毒體的SDS-PAGE。在非還原條件下加載約10微克病毒和3微克病毒體到SDS-Tris/Tricine 10％(v/v)聚丙烯酰胺凝膠上(Schagger等，Anal Biochem.166368-379，1987)。用考馬斯蘭染色聚丙酰胺凝膠。泳道1X-31病毒。泳道2X-31病毒體。泳道3嵌合性病毒體。泳道4PR8病毒體。泳道5PR8病毒。
圖3此圖顯示用cryo-TEM觀察的嵌合性病毒體的形態。它們是單室小泡，直徑范圍在150-250nm。標尺桿為100nm。
圖4此圖顯示X-31、PR8病毒、病毒體和X-31/PR8嵌合性病毒體與脂質體融合的活性分別連續記錄465nm激發波長和530nm發射波長的熒光。用配備有恒溫杯座和磁力攪拌裝置的SPEX-熒光-2-熒光儀(SPEX Industries，Inc，Edison，NJ，USA)進行測定。為校正熒光標尺，將脂質體最初的殘留熒光設為零，而無限稀釋探針的熒光設為100％。加入Triton X-100(0.5％v/v)測定后一數值。1)與POPC/POPG-LUV融合的X-31病毒和病毒體。2)與POPC/POPG-LUV一起培育的PR8/34病毒和病毒體。3)與POPC/POPG-LUV一起培育的嵌合性病毒體。a)4℃時的融合測定值；b)病毒和病毒體在4℃和pH5.0與POPC/POPG-LUV一起培育1小時，37℃測定融合值。
圖5此圖顯示DNA包裹在POPC/DDAB-脂質體中的效率。用實施例中所述凍/融法和用DNA酶I/外切核酸酶III 37℃消化3小時，制備含DNA的脂質體。此后，用酚/氯仿抽提包裹的DNA，在1％瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳。泳道M中加載1kb遞增的梯標記物。在凝膠上直接加入作為對照的100ng(泳道1)和200ng(泳道2)質粒DNA。酚/氯仿抽提對應于20ng(泳道3)、50ng泳道4)、100ng(泳道5)和200ng(泳道6)質粒的DNA-脂質體，作為其它未處理對照(DNA酶I不消化)。將水相加到凝膠上。類似上述樣品用DNA酶I消化處理對應于初始DNA量50ng(泳道7)和100ng(泳道8)的脂質體。泳道9和泳道10對應于相同量的脂質體，除用1％(v/v)Triton x-100溶解脂質體然后用DNA酶I處理外。泳道11和泳道12中DNA沒有包裹，但加到空脂質體中。這些脂質體也如上所述處理。
圖6此圖顯示用cryo-TEM觀察加載脂質體的形態。它們是單室性，直徑測定在100-150nm之間。標尺桿為100nm。
圖7此圖顯示擠壓前(上圖)后(下圖)用cryo-TEM觀察到嵌合性病毒體與加載脂質體之間融合的產物。擠壓前，小泡大小變化大，某些小泡超過900nm。此結果表明有多輪融合。上圖標尺桿500nm；下圖標尺桿左100nm，右200nm。
圖8此圖顯示嵌合性病毒體與脂質體融合產生的擠壓小泡的融合性能。顯然，小泡保持了它們的融合活性。將脂蛋白體擠壓通過核孔膜。分別連續記錄465nm激發波長和530nm發射波長的熒光。用配備有恒溫杯座和磁力攪拌裝置的SPEX-熒光-2-熒光儀進行測定。加入Triton X-1D0(0.5％v/v)后測定對應于無限稀釋的探針為100％。融合測定在37℃和pH5.0時用含0.6％N-NBD-PE和N-Rh-PE的POPC/POPG(41)-LUV進行。
圖9；此圖顯示脂蛋白體被細胞迅速內化。在MDCK和HeLa細胞中檢測到羅丹標記的脂蛋白體。使融合的病毒體在4℃與HeLa和MDCK細胞結合1小時。此后洗去未結合的物質。立即37℃固定(A)細胞或37℃再培育15分鐘，用3.7％(v/v)甲醛固定，熒光顯微鏡分析(B)。
科10此圖顯示載有Texas紅葡聚糖的脂蛋白體被HeLa細胞迅速攝取。4℃培育HeLa細胞與含Texas紅葡聚糖的脂蛋白體1小時。此后洗去未結合的物質，用3.7％(v/v)甲醛固定(A)。細胞37℃再培育15分鐘(B)、2小時(C)或5小時(D)。固定后用熒光顯微鏡分析細胞。物鏡放大(A)63倍；(B)、(C)、(D)100倍。
實施例實施例1-材料和方法化學物質八亞乙基二醇-單-(n-十二烷基)醚(OEG，C12E8)和溴化二十二酰基二甲基銨(DDAB)購自Fluka，氫溴酸聚-L-賴氨酸(MW29，300)、硫酸魚精蛋白、α-纖維素、微晶纖維素和1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸-rac-(1-甘油)(PE)購自Sigma(Buchs，Switzerland)。雞蛋磷脂酰膽堿(PG)購自Lipoid(Cham Switzerland)。
磷脂酰乙醇胺(PE)獲自R.Berchtold(Biochemical Laboratory，University ofBern，Switzerland)。Bio-beads SM2和Bio-Gel A-15m購自Bio-Rad Laboratories(Glattbrugg，Switzerland)。POPC、N-NBD-PE和N-Rh-PE購自Avanti Polar Lipids(Birmingham.AL，USA)。胰腺DNA酶I(獲自牛胰腺)的比活性為2000Kunitz單位/mg，外切核酸酶III(大腸桿菌，100單位/微升)購自Roche Diagnostics(BaselSwitzerland)和New England BioLabs(BioConcept，Allschwil，Switzerland)。TaqDNA聚合酶購自Promega(Catalys，Wallisellen，Switzerland)。N-(4，4-二氟-5.7-二苯基-4-硼酸-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酰基)-1，2-二十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(Bodipy 530/550-DHPE)、單疊氮溴化乙錠(EMA)、Texas紅葡聚糖(MW 70,000)和PicoGreen試劑購自Molecular Probes Europe(Leiden，TheNetherlands)。聚合酶鏈反應和反義實驗所用的寡核苷酸購自Microsynth(Balgach，Switzerland)。質粒pT7-EGFP、VR1012、EGFP-VR1012和35S-標記質粒是KarinMoelling(Institute of Medical Virology，University of Zurich，Switzerland)的禮物。
病毒流感病毒X-31重組株和A/PR/8/34(PR8)株在胚蛋的尿囊腔中增殖(Gerhard，J Exp Med.144985-995，1976)，獲自Berna Biotech(Bern，Switzerland)。重組痘苗病毒vTF7-3是Karin Moelling(Institute of Medical Virology，University of Zurich，Switzerland)的禮物。
細胞培養MDCK和HeLa細胞維持在加有10％FCS、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的MEM(Life Technologies.Basel，Switzerland)中。
實施例2制備免疫活性重建流感病毒體(IRIV)用Bron及其同事所述的方法制備病毒體(Bron等，Methods Enzymol.220313-331，1993)。簡而言之，超離心沉降病毒(1.5μmol磷脂或5mg病毒蛋白)，溶解在0.7ml用磷酸緩沖鹽水(PBS，150mM NaCl，5mM磷酸鈉pH7.4)配的100mM OEG中。超離心(100,000xg，30分鐘)去除核衣殼。室溫下用180mg濕的Bio-Beads SM2振搖(1200rpm)上清液(含有病毒脂質和包膜蛋白)1小時，并用90mg Bio-Beads在1400rpm振蕩兩次，每次10以去除洗滌劑。
然后，將該病毒體制品在PBS中以10-40％(w/v)不連續蔗糖密度梯度，130,000xg離心90分鐘。收集蔗糖層之間介面的病毒體。
類似方法制備含X-31和PR8的HA的病毒體。混合二病毒株的等量病毒蛋白質然后溶解。
按Bottcher(Bottcher等，Anal Chim Acta.24202-203，1961)的磷脂測定法測定血凝素/磷脂比例，并按Ball(Ball，Anal Biochem.15523-27，1986)的考馬斯-抽提法作SDS-PAGE后定量HA。
實施例3制備含包裹分子的常規IRIV基本上如Zurbriggen等，(Zurbriggen等，ProgLipid Res.393-18，2000)所述制備該IRIV。簡而言之，將32mg蛋PC和8mg PE溶解在2ml含100mM OEG的PBS(PBS/OEG)中。如所述(Skehel Schild，Viology 44396-408，1971)純化流感病毒A/Singapore。在100,000xg離心相當于4mg血凝素(HA)的流感病毒30分鐘，將沉淀溶于1ml的PBS/OEG中。為制備肽-IRIV，將4mg肽溶于1ml PBS/OEG中。混合磷脂、溶解的病毒液和肽溶液并超聲處理1分鐘。100,000xg離心該混合物1小時，過濾(0.22μm)除菌上清液。用180mg濕的Bio-Beads SM2室溫振搖1小時和用90mg SM2Bio-Beads振搖30分鐘三次去除洗滌劑形成病毒體。用Zetasizer 1000HS(Malvern Instrument，UK)進行光散射以測定IRIV的大小。為了定量包裹的肽，將一組分勻質IRIV加到Sephadex G50Coarse(AmershamBiosciences，Switzerland)凝膠過濾柱上，與未被包裹的肽相分離。在AkutaExplorer 10(Amersham Biosciences，Switzerland)上用CC 125/4.6Nucleosil 100-5C8反相柱(Macherey-Nagel，Switzerland)進行肽定量。
為制備蛋白質-IRIV(如GFP-IRIV)，將10μg蛋白質溶解在1ml PBS/OEG中，并如上所述繼續。為制備PicoGreen-IRIV，將20μl貯存液溶于1ml PBS/OEG中并如上所述繼續。在LS 55發光分光光度計(Perkin Elmer Instruments，USA)上進行GFP和PicoGreen的定量分析。
制備含有流感X-31和流感A/Singapore的HA的嵌合性病毒體，但肽溶液用1mlOEG/PBS代替。混合二病毒株的等量HA蛋白然后溶解。
實施例4制備大單室小泡(LUV)將12mg的POPC/DDAB(98∶2，摩爾比)溶于氯仿/甲醇中。然后蒸發去除溶劑，再在10-2mm Hg下干燥過夜。將干燥的脂質混合物分散在50μlTris緩沖液(50mM Tris，pH8.0)中，在水浴超聲儀中超聲處理15分鐘。加入待包裹物質后，將脂質濃度調整至120-160mM。在液氮中凍結該分散液并室溫融化共10次。擠壓前用Tris緩沖液稀釋脂質體分散液至脂質濃度為40Mm，用家制擠壓器(類似于Avestin Inc.的LiposoFast)擠壓通過0.2μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(NucleporeTrack-Etch膜，Sterico，Switzerland)10次。
按Monnard及其同事(Monnard等，Biochim Biophys Acta.132939-50，1997)所述原理包裹質粒DNA。為了超聲處理脂質體，加入10μg DNA(對于某些實驗還含有35S-標記的質粒-DNA)并如上所述處理。加入700-800單位的胰DNA酶I、200單位的外切核酸酶III、5mM MgCl20.1mM DTT到含DNA的脂質體中消化未包裹的DNA(對于較高量的DNA，按比例調整加入的酶量)。37℃培育3小時后，加入最終濃度7mM的EDTA停止反應。用凝膠過濾旋轉柱層析(Bio-Gel A-15m，預先用Tris-HCl緩沖液pH8.0平衡)將化質體與大量外部培養液相分離。通常以165xg離心此柱2分鐘。收集各約50μl的10-15個組分。組分2-7常常混濁(其它組分無可見的混濁，表明它們不含有顯著量的脂質體)。
定量包裹在LUV中的DNA為了測定包裹有質粒-DNA的組分，將35S-標記的DNA共同包裹在脂質體中。經廣泛的DNA酶I/外切核酸酶III消化和凝膠過濾層析后，可通過液閃計數從最初加入的放射活性量和仍與脂質體結合的放射活性量，確定包裹DNA的比例。
定量也可通過觀察消化前后質粒-DNA在1％瓊脂糖凝膠上的電泳情況進行。對于這些實驗，用酚/氯仿抽提未處理脂質體或DNA酶I/外切核酸酶III消化的脂質體的質-DNA。對含該DNA的水溶液進行凝膠電泳。用溴乙錠染色該凝膠，根據已知的質粒量觀察定量對應于質粒-DNA的條帶。
實施例5制備大單室小泡(LUV)將36.5μmol(27.95mg)PC和15.6μmol(10.75mg)PG(摩爾比70∶30)溶于甲醇/氯仿(2∶1)中。40℃時用旋轉蒸發儀在30-10kPa梯度真空下去除溶劑。對于含疏水性肽的肽-脂質體，將2-3.5mg肽溶于甲醇中，加到磷脂混合物中然后去除溶劑。將干燥的脂膜用500μl PBS水合。對于含親水性肽的肽-脂質體，將干燥的脂膜用含2-3.5mg待包裹肽的350μl PBS水合。對于GFP-脂質體，將干燥的脂膜用含10μgGFP的350μl PBS水合。對于PicoGreen-脂質體，將干燥的脂膜用含1.75μl PicoGreen貯存液的350μl PBS水合。擠壓前，用PBS將體積校準至500μl。用1.5ml Lipex擠壓器(Northern Lipids，Canada)擠壓脂質體分散液通過聚碳酸酯膜(Nucleopore Track-Etch膜，分別為0.1μm或0.2μm Whatman，UK)10次。用Zetasizer 1000HS儀(Malvern Instrument，UK)光散射進行擠壓脂質體的尺寸測定。為了定量包裹的肽，將一組分勻質脂質體加到Sephadex G50 Coarse(AmershamBiosciences，Switzerland)凝膠過濾柱上，與未被包裹的肽相分離。在AkutaExplorer 10(Amersham Biosciences，Switzerland)上用CC 125/4.6 Nucleosil 100-5C8反相柱(Macherey-Nagel，Switzerland)進行肽定量。在LS 55發光分光光度計(Perkin Elmer Instruments，USA)上進行GFP和PicoGreen的定量分析。
實施例6制備嵌合性脂蛋白體4℃用5μl檸檬酸(150mM，調pH至3.5)調PBS的pH至5.0，將嵌合性病毒體(50μl)與PBS(最終體積200μl)配的2μl POPC/DDAB LUV一起培育。用1.4μl的1MNaOH中和后，將融合產物擠壓通過0.2μm聚碳酸酯膜10次。為各次實驗新鮮制備融合的脂蛋白體，因為發現它們易于凝聚。
為了分析擠壓是否會導致丟失DNA，將含35S-標記的DNA的脂質體與嵌合性病毒體融合，并如上所述擠壓。如上所述用DNA酶I/外切核酸酶III消化消化脂蛋白體。通過液閃計數測定凝膠過濾層析后與脂蛋白體結合的有放射活性的組分。對照探針同樣處理，除了它們不經擠壓，或經擠壓但不經消化外。
以FRET作融合測定對于體外融合實驗，將N-NBD-PE和N-Rh-PE各0.6％摻入到POPC/DDAB(98∶2)組成的LUV中(1mg/ml)。于4℃和37℃在最終最終體積2ml的PBS(5mM磷酸鈉，pH7.4和150mM NaCl)中進行熒光測定。將化質體(19μl)和30-50μl的病毒體置于測量杯中。加入48μl檸檬酸(150mM，用NaOH調pH至3.5)后，分別連續記錄465nm激發波長和530nm發射波長熒光的增加。用配備有恒溫杯座和磁力攪拌裝置的SPEX-熒光-2-熒光儀(SPEX Industries，Edison，NJ，USA)進行測定。為校正熒光標尺，將脂質體最初的殘留熒光設為零，而加入Triton X-100(0.5％v/v最終體積)測定的無限稀釋探針的熒光設為100％。
Cryo透射電鏡(Cryo-TEM)將小滴含病毒體或脂質體的分散液加到涂有碳的銅格柵上，立即在受控環境玻璃系統的液態乙烷中凍結(Egelhaaf等，J Microsc.200128-139，2000)。用改良的冷凍夾(Gatan，Pleasanton，CA，USA)將玻璃化的標本轉移到透射電鏡(Zeiss EM9120MEGA)中，在120keV和“zero loss”條件下操作。經5分鐘時間平衡后，在-170℃檢查標本。電鏡采用受SYS成象分析系統版本2.1(SYS，Munster，Germany)控制下的冷卻的1024×1024CCD照相機(Proscan，Germering，Germany)進行數字化記錄不作平視野糾正。
實施例7制備嵌合性脂蛋白體在15℃PBS中持續攪拌下，培育嵌合性病毒體(600μl，PBS中)與200μl的PC/PG LUV。為觸發融合，用19μl 1M HCl將pH調至4.5。培育30分鐘后用15μl 1M NaOH中和混合物，如實施例4中所述將融合產物擠壓通過0.2μm聚碳酸酯膜10次。為了用FRET作融合測定，發展了另一種試驗將0.75mol％的Bodipy530/550-DHPE和0.25mol％的Rh-DHPE摻入到由PC/PG(70∶30)組成的LUV中。Bodipy530/550-DHPE優于N-NBD-PE，因為它的熄滅系數高三倍對溶劑較不敏感。在4℃和42℃之間的不同溫度下持續攪拌的5mM磷酸鈉緩沖液pH7.5，100mM NaCl，2.5ml微量吸收池(VWR，Switzerland)最終體積0.8ml進行熒光測定。通常將1μl的標記脂質體(0.3μmol磷脂)與5-50μl的病毒體相混合，加入3.75-7μl的1M HCl使pH至4.5左右來引發融合。分別連續記錄465nm激發波長和530nm發射波長熒光的增加。激發狹縫2.5nm發射狹縫15.0nm。用配備有恒溫杯座和磁力攪拌裝置的LS 55V發光分光光度儀(Perkin Elmer Instruments，USA)進行測定。加入TritonX-100(0.5％v/v最終濃度)后無限稀釋的探針液熒光達到最強。
實施例8
轉染實驗轉染前天將MDCK或HeLa(1×105)細胞接種在24孔平板上，然后按制造商方案用SuperFect試劑(Qiagen，Basel，Switzerland)，每孔用1μg質粒DNA(EGFP-VR1012)轉染細胞。
制備羅丹明標記的嵌合性脂蛋白體將1mg脂質(POPC/DDAB/N-Rh-PE98∶2∶0.5)溶于氯仿/甲醇中。然后通過蒸發和10-2mm Hg干燥過夜去除溶劑。將干燥的脂質分散在200μl PBS中。在液氮中凍結分散液和室溫融化共10次。此后擠壓脂質體通過0.2μm和0.1μm聚碳酸酯膜10次。
從如上所述50μl的羅丹明-LUV和100μl嵌合性病毒體，總體積200μl制備羅丹明標記的脂蛋白體。簡而言之，酸化該分散液并4℃培育10分鐘。用1M NaOH中和后，將脂蛋白體擠壓通過0.2μm聚碳酸酯膜10次。
為了用含DNA的脂蛋白體轉染，接種同樣數量的細胞。將含EGFP-VR1012質粒的嵌合性脂蛋白體(10-20μl)與細胞在200μl培養液(MEM或添加有10％FCS的MEM，或含0.2％BSA的RPMI)中4℃培養1小時或37℃2.5-4小時，除去培養液。然后在5％CO2和37℃下完全生長培養液中培養細胞48-70小時。
用Zeiss Axiovert寬視野顯微鏡檢查轉染細胞的EGFP表達。
實施例9羅丹明標記脂蛋白體的細胞攝取研究將MDCK或HeLa(1×105)細胞在12mmAlcian blue涂層的蓋玻片上培養至60-80％鋪滿，與10μl羅丹明標記的脂蛋白體在100μl添加有20Mm HEPES和0.2％BSA的RPMI培養液中4℃避光培育1小時。然后用冰冷的PBS徹底洗滌細胞，用完全生長培養液(MEM，10％FCS)在5％CO2和37℃下培育。在標明的時間點，用3.7％(v/v)甲醛固定細胞。將蓋玻片固定在Moviol中，用Zeiss Axiovert寬視野顯微鏡檢查。用CCD照象機(Hamamatsu)和標準濾片收集圖象。
單疊氮溴化乙錠(EMA)-標記的DNA的細胞定位研究基本如Zabner等，J BiolChem.27018997-19001，1995；；Serikawa等，Biochim Biophys Acta.1467419-430，2000)所述制備EMA-標記的質粒DNA。在溶于100μl水中的200μg EGFP-VR1012中加入5μg EMA(5mg/ml，用EtOH溶解)。冰上培育15分鐘后，光照活化該溶液(SUSS LH1000Lamphouse(KARL SUSS，Waterbury Center，VY，USA)配備OSRAM HBO 350 W高壓汞燈)102分鐘。為除去游離試劑，用3倍體積乙醇和0.1倍體積3M乙酸鈉(pH5.2)沉淀DNA三次。標記的DNA重懸在70-100μl水中。
然后將EM4標記的DNA包裹在LUV中用于脂蛋白體的轉染試驗，或用上述SuoerFect配制。對于EMA-標記的DNA細胞內定位研究，采用Zeiss Axiovert寬視野顯微鏡。
含Texas紅-葡聚糖脂蛋白體的細胞攝取研究在溶于50μl Tris-HCl緩沖液(50Mm Tris-HCl，pH8.0)的6mg干燥脂質(POPC/DDAB 98∶2)中加入溶于30μl Tris緩沖液中的3mg Texas紅-葡聚糖(70,000MW)。如上所述制備脂質體。用蔗糖密度梯度離心分離游離葡聚糖與脂質體。簡而言之，將100μl擠壓的脂質體與900μl 60％蔗糖Tris-HCl緩沖液混合，然后各取1ml 39％、20％T和10％蔗糖疊層在上部。最高一層為500μl Tris-HCl緩沖液。20℃用SM 55轉頭(Beckman)以35,000rpm離心梯度液3小時。含葡聚糖的脂質體在該梯度液上部區域中的細帶中收集。用Tris-HCl緩沖液稀釋收集的組分，并用超離心過濾裝置(Millipore，Volketswil，Switzerland)濃縮至ca.200μl.。
在冷卻中如上所述使含Texas紅-葡聚糖的脂質體與嵌合性病毒體相融合。將融合產物如上所述與細胞一起培育。固定細胞后用Zeiss Axiovert寬視野顯微鏡作熒光顯微觀察分析Texas紅-葡聚糖攝入胞質和釋放。
實施例10采用T7-胞質表達系統的轉染實驗用vTF7-3(MOI＝5)感染生長在蓋玻片上的HeLa細胞(3×105)。1小時后棄去培養液，用含pT7-EGFP的脂蛋白體或用Lipofectamin按制造商方案(Invitrogen AG，Basel，Switzerland)轉染細胞。轉染4小時后更換培養液，細胞再培養40-60小時，然后用熒光顯微鏡分析GFP表達。
分離轉染細胞的質粒并用聚合酶鏈反應擴增在60mm平板上培養MDCK和HeLa至60-80％鋪滿。將包裹在脂蛋白體中的EGFP-VR1012或作為SuperFect-復合物加入上述細胞中。Bodipy530/550-DHPE。37℃培養細胞不同時間后，裂解細胞用Hirt提取法(Hirt，J Mol Biol.26365-369，1967)分離得到質粒。簡而言之，各平板加入0.4ml的0.6％(w/v)SDS，10mM EDTA溶液，室溫培育20分鐘。用橡皮擦刮下細胞。將粘性混合液轉移到Eppendroff管中，加入100μl 5M NaCl液，冰上冷卻該混合液至少5小時。4℃14,000rpm離心4分鐘后，小心取出上清液用酚抽提二次，用氯仿抽提一次。用3倍體積乙醇和0.1倍體積3M乙酸鈉(pH5.2)其所長-20℃沉淀水相過夜。用70％乙醇洗滌沉淀重懸于20μl水中。
對于聚合酶鏈反應(PCR)，總體積20μl中含有以下試劑
1-2μl分離的質粒DNA1x Taq DNA聚合酶緩沖液1.5-2mM MgCl220μM dNTP(各5μM)1μM的各引物1U Taq DNA聚合酶。
所用引物是VS1012-正向5’-GCCACCAGACATAATAGCTG-3’EGFP-反向5’-GGCTGTTGTAGTTGTACTCC-3’循環參數1輪94℃ 45秒19-24輪94℃ 45秒52℃ 45秒72℃ 45秒1輪72℃ 10分鐘然后在1mm厚的8％(/v)聚丙烯酰胺凝膠上分析得到的產物凝膠配方1ml 40％(v/v)丙烯酰胺1ml 5xTBE2.625ml水375μl甘油30μl 10％(w/v)APS6μl TEMED用聚-L-賴氨酸或硫酸魚精蛋白凝縮DNA在總量0.5ml的水或PBS中緩慢加入不同量的聚陽離子(12.5-100μg)到50μg質粒DNA和2.5μmol脂質(POPC/DDAB 98∶2)中，制備DNA-聚-賴氨酸/DNA-魚精蛋白復合物。
實施例11反義實驗制備含c-myc寡核苷酸的脂蛋白體將100μl 15mM c-myc寡核苷酸貯存液(最終濃度1.5μmol)加入經超聲處理的脂質分散液中，如上處理制備LUV。用上述包裹質粒DNA(不消化)的凝膠過濾法去除未包裹的寡核苷酸。將含有脂質體的前4份洗脫物合并，用超離心過濾裝置(Millipore，Volketawil，Switzerland)濃縮至原先體積(50μl)。
所用寡脫氧核糖核苷酸(硫代磷酸酯)的序列如下反義的5’-AACGTTGAGGGGCAT-3’不規則的5’-GAACGGAGACGGTTT-3’使含寡脫氧核糖核苷酸的LUV與嵌合性病毒體融合然后擠壓。
將c-myc寡脫氧核糖核苷酸包裹到PR8-病毒體中為將c-myc寡脫氧核糖核苷酸直接包裹到PR8-病毒體中，將溶于100μl水中的1.5μmol寡脫氧核糖核苷酸加入到溶解的病毒組分中。然后如上所述制備PR8-病毒體。
寡脫氧核糖核苷酸的細胞輸送在轉染前天將HeLa細胞(4-6×103每孔)接種在96孔板中。為了用oligofectamine(Invitrogen AG，Basel Switzerland)轉染，細胞保持在無青霉素/鏈霉素的生長培養液中。用oligofectamine按制造商方案以c-myc反義和不規則的硫代磷酸酯寡核苷酸處理細胞。
為用含ODN的脂蛋白體轉染，在37℃和5％CO2下，將2-3μl融合的病毒體與細胞培養3天，培養液(RPMI含0.2％BSA或MEM或含10％FCS的MEM)總體積100μl。對于某些實驗，脂蛋白體先4℃培育1小時。洗去未結合的顆粒，如上所述加入生長培養液37℃培養。70小時后用“CellTiter 96Aqueous一號溶液細胞增殖試驗”按制造商(Promega，Catalys，Switzerland)所述測定細胞增殖情況。每孔加入20μl夫子試劑后37℃5％CO2下培育1-3小時，用Benchmark微孔板讀數儀(Bio-RadLaboratories，Glattbrugg，Switzerland)記錄450nm吸光值。
FITC-標記寡脫氧核糖核苷酸的細胞攝取研究用上述oligofectamine和FITC-標記的寡脫氧核糖核苷酸處理接種在12mm蓋玻片上的HeLa細節(1×105)。
接種同樣數量的細胞用嵌合性脂蛋白體或PR8-病毒體處理。將含FITC-標記寡脫氧核糖核苷酸的20μl脂蛋白體或10μl PR8-病毒體與200μl培養液(RPMI含0.2％BSA)中的細胞4℃培育1小時。棄去培養液細胞用完全生長培養液37℃和5％CO2下培養。
在標明的時間點，用3.7％(v/v)甲醛固定細胞。蓋玻片固定在Moviol中用ZeissAxiovert寬視野顯微鏡檢查。用CCD照相機(Hamamatsu)和標準FITC-濾片收集圖象。
實施例12用紅細胞作融合實驗在PBS+(7mM Na2HPO4，5mM KH2PO4，138mM NaCl，3mM KCl 1mMMgCl2，pH7.2)中新鮮洗滌從Berna Biotech(Bern，Switzerland)收到的雞紅細胞(0.8％)。
每次實驗前，830xg離心紅細胞5分鐘，重懸于PBS(150mM NaCl，5mM磷酸鈉pH7.4)或雙蒸水中至同樣體積(500μl)。加入不同量的病毒(1-20μg蛋白)和相應量的病毒體(PR8，X-31)、嵌合性病毒體和脂蛋白體，37℃輕輕振蕩下分別在pH5.0、pH5.5、pH6.0和pH7.3培育15分鐘。然后用1M NaOH中和樣品。830xg沉降紅細胞5分鐘。測定在541nm下上清液的吸光值以確定溶血活性。以100×(A-A0)/A100-A0)測定溶血百分率，其中A100是用蒸餾水使紅細胞100％溶血測得的吸光值，A0是無病毒/病毒體時測得的基線吸光值。
將細胞沉淀重懸于500μl PBS中。取幾滴懸液加到蓋玻片上準備光學顯微鏡檢查。
為滅活嵌合性病毒體，取50μl病毒體在總體積200μl中37℃培育。用5μl檸檬酸(150mM，pH3.5)酸化后，37℃培育該懸液另30分鐘，用1M NaOH 1.4μl再中和。每次溶血反應采用20μl此混合液。
光標記實驗如上所述制備含生物素化-TID-PE/16的PR8-病毒體，例外的是用C12E8溶解步驟后，加入300nmol(10％病毒磷脂)的干燥生物素化-TID-PE/16。
為制備含生物素化-TID-PE/16的脂蛋白體，使POPC/DDAB/生物素化-TID-PE/16(98∶2∶20)制備的LUV與嵌合性病毒體相融合。將生物素化-TID-PE/16-LUV(20μl)與50μl嵌合性病毒體在總體積200μl中pH5.0，4℃培育10分鐘。然后中和該混合液，擠壓脂蛋白體通過200nm孔10次。
制備人紅細胞的血影新鮮的人血液獲自Stiftung ZurcherBlutspendedienst(SRK)，Blutspendezentrum Zurich(Switzerland)。為分離血紅細胞，如Beutler先前所述(Beutler等，J Lab Clin Med.88328-333，1976)，使20ml血過濾通過PBS(138mM NaCl，10mM磷酸鈉，pH7.3)中的α-纖維素和微晶纖維素(各1克)床。濾出液通過用SS-34轉頭(Sorvall)2500rpm 4℃沉降細胞7分鐘，洗滌4次，細胞重懸于PBS中。最后洗滌后，細胞重懸于20ml PBS中準備在SysmexMicrocellcounter F-800(TOA Medical Electronics，Inc.，Hamburg，Germany)中計數(按制造商說明)。
血影基本上按Steck(Steck和Kant，methods Enzymol.31172-180，1974)所述制備。
將壓積紅細胞(1ml)與40ml溶血緩沖液(5mM磷酸鹽pH7.4，1mM EDTA，15μg/mlPMSF)混合。22,000xg離心10分鐘沉淀血影。小心吸出上清液和小的富有成效含蛋白酶的硬底層。用溶血緩沖液重懸膜，不規則洗3次直到呈奶白色。最后將血影重懸于1ml溶血緩沖液中。
光標記實驗如前所述制備含生物素化-TID-PE/16的PR8-病毒體，例外的是C12E8溶解步驟后，加入300nmol(10％病毒磷脂)干燥的生物素化-TID-PE/16。為制備含生物素化-TID-PE/16的脂蛋白體，使POPC/DDAB/生物素化-TID-PE/16(98∶2∶20)制備的LUV與嵌合性病毒體相融合。將生物素化-TID-PE/16-LUV(20μl)與50μl嵌合性病毒體在總體積200μl中pH5.0，4℃培育10分鐘。然后中和該混合液，擠壓脂蛋白體通過200nm孔10次。取生物素化-TID-PE/16-脂蛋白體(20μl)或5μl的生物素化-TID-PE/16-PR8-病毒體與20μl血影在總體積50μl中37℃培育20分鐘。用檸檬本緩沖液酸化至pH5.0后在所述條件下培育低pH探針。用1M NaOH中和后將反應樣品置于離配備有OSRAM HBO 350Watt短弧光高壓汞燈的SUSS LH 1000Lamphouse(KARL SUSS，Waterbury Center，VT)10cm光裂解90秒。用3倍體積的氯仿/甲醇(1∶2)沉淀蛋白去除未結合標記物。此后樣品準備在SDS8％(v/v)聚丙烯酰胺凝膠上作電泳分離。
用Western印跡法檢測生物素化蛋白質將SDS-PAGE分離得到的蛋白質電泳轉移到Immobilon-P PVDF膜(Millipore，Volketswil，Switzerland)上。在含20％甲醇、20mM Tris-HCl、200mM甘氨酸的轉移緩沖液中，110mA凝膠印制2小時。用Kaleidoscope預染蛋白質標準品(Bio-Rad Laboratories，Glattbrugg，Switzerland)核查印跡效率并用考馬斯蘭染色印制凝膠。
用含5％BSA的TBS-T(137mM NaCl，20mM Tris-HCl，0.1％(v/v)Tween20，pH7.6)室溫封閉印跡至少1小時。加入用含5％BSA的TBS-T 1∶1000稀釋第一抗體(抗生物素，Bethyl Laboratories，Montgomery，TX，USA)，使其結合1小時。用TBS-T洗膜15分鐘，然后用TBS-T二次短暫(5分鐘)洗滌和用TBS-T(137mM NaCl，20mMTris-HCl，pH7.6)洗一次。加入用含5％BSA的TBS-T稀釋1∶20,000的第二抗體(辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔，Pierce，Socochim，Lausanne，Switzerland)室溫結合1小時。再如上述徹底洗滌膜。
用ECL+Plus檢測液(Amersham Biosciences，Dubendorf，Switzerland)按制造商所述顯影濕的印跡。
溶血和與人紅細胞的細胞-細胞融合如以上雞紅細胞所述進行溶血和與人紅細胞的細胞-細胞融合實驗。每份樣品采用6×107洗過的血紅細胞。
權利要求
1.一種融合小泡，所述融合小泡由病毒體和脂質體脂質構成，并包裹有至少一種治療性或免疫活性物質，所述融合小泡包含具有不同融合特征的融合蛋白或所述融合蛋白的片段，所述片段具有完整融合蛋白的融合活性和特征，其程度至少能與靶細胞的生物膜相融合。
2.如權利要求1所述的融合小泡，其特征在于，所述小泡是單室性的。
3.如權利要求1或2所述的融合小泡，其特征在于，所述包裹的治療性或免疫活性物質選自DNA、RNA、siRNA、蛋白質、肽、氨基酸和藥物活性物質。
4.如權利要求3所述的融合小泡，其特征在于，所述包裹的治療性或免疫活性物質選自美容劑、藥物、抗原或它們的混合物。
5.如上述權利要求中任一項所述的融合小泡，其特征在于，所述獨特的融合特征選自溫度、離子濃度、酸性、細胞類型和組織類型特異性。
6.如權利要求5所述的融合小泡，其特征在于，所述融合蛋白的獨特融合特征是溫度特異性。
7.如上述權利要求中任一項所述的融合小泡，其特征在于，所述融合蛋白或其片段衍生自病毒。
8.如權利要求7所述的融合小泡，其特征在于，所述融合蛋白或其片段衍生自流感病毒、VSV、SFV、仙臺病毒和HIV病毒。
9.如權利要求8所述的融合小泡，其特征在于，所述融合蛋白或其片段衍生自流感病毒。
10.如權利要求9所述的融合小泡，其特征在于，所述融合蛋白或其片段是X-31HA、PR8/34或A/Singapore HA或它們的片段。
11.如上述權利要求中任一項所述的融合小泡，其特征在于，所述脂質體脂質衍生自糖脂、磷脂、陽離子脂質、合成性脂質和膽固醇。
12.如權利要求11所述的融合小泡，其特征在于，所述脂質體脂質包括POPC和DDAB。
13.如上述權利要求中任一項所述的融合小泡，其特征在于，所述病毒體脂質衍生自流感病毒、VSV、SFV、仙臺病毒和HIV病毒。
14.如權利要求13所述的融合小泡，其特征在于，所述病毒體脂質衍生自流感病毒。
15.如上述權利要求中任一項所述的融合小泡，其特征在于，所述小泡的直徑在100-300nm之間。
16.如上述權利要求中任一項所述的融合小泡，該小泡還含有摻入到膜中或附著于所述膜的細胞表面受體、細胞因子、生長因子、抗體或抗體片段。
17.一種制備包裹有至少一種治療性或免疫活性物質的融合小泡的方法，其特征在于，所述方法包括使包裹有至少一種治療性或免疫活性物質的脂質體與含有獨特融合特征的融合蛋白或所述融合蛋白的片段相融合，所述片段具有完整融合蛋白的融合活性和特征，其程度至少能與靶細胞的生物膜相融合。
18.一種在融合小泡中包裹至少一種治療性或免疫活性物質的方法，其特征在于，所述方法包括使包裹有至少一種治療性或免疫活性物質的脂質體與含有獨特融合特征的融合蛋白或所述融合蛋白的片段相融合，所述片段具有完整融合蛋白的融合活性和特征，其程度至少能與靶細胞的生物膜相融合。
19.如權利要求17或18所述的融合小泡，其特征在于，所述小泡是單室性的。
20.如權利要求17-19中任一項所述的方法，其特征在于，所述包裹的至少一種治療性或免疫活性物質選自DNA、RNA、siRNA、蛋白質、肽、氨基酸和藥物活性物質。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述包裹的至少一種治療性或免疫活性物質選自美容劑、藥物、抗原或它們的混合物。
22.如權利要求17-21中任一項所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白或其片段的獨特融合特征選自溫度、離子濃度、酸性、細胞類型和組織類型特異性。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白或其片段的獨特融合特征是溫度特異性。
24.如權利要求17-23中任一項所述的方法，其特征在于，所用的融合蛋白或其片段衍生自病毒。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所用的融合蛋白或其片段衍生自流感病毒、VSV、SFV、仙臺病毒和HIV病毒。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所用的融合蛋白或其片段衍生自流感病毒。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白或其片段是X-31HA、PR8/34或A/Singapore HA或它們的片段。
28.如權利要求17-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述脂質體所含有脂質選自糖脂、磷脂、陽離子脂質、合成性脂質和膽固醇。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述脂質體包含POPC和DDAB。
30.如權利要求17-29中任一項所述的方法，其特征在于，所述病毒體衍生自流感病毒、VSV、SFV、仙臺病毒和HIV病毒。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述病毒體衍生自流感病毒。
32，如權利要求17-31中任一項所述的方法，該方法還包括在使包裹有至少一種治療性或免疫活性物質的脂質體與含有獨特融合特征的融合蛋白或所述融合蛋白的片段相融合后調整該融合小泡的大小，所述片段具有完整融合蛋白的融合活性和特征，其程度至少能與靶細胞的生物膜相融合。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述調整小泡的大小通過擠壓這些小泡來進行。
34.如權利要求17-33中任一項所述的方法，其特征在于，所述調整大小后產生的融合小泡直徑在100-300nm之間。
35.如權利要求17-33中任一項所述的方法，其特征在于，至少一種細胞表面受體、細胞因子、生長因子、抗體或抗體片段附著于或摻入到所述融合小泡的膜中。
36.如權利要求1-16中任一項所述的融合小泡在制備藥物制劑中的應用，所述藥物制劑用于治療或預防病毒、細菌和真菌感染、退行性病變、過度增殖性疾病和其它激酶相關性疾病，包括癌癥、傳染性疾病、慢性傳染性疾病、慢性病、變態反應疾病、心血管疾病、炎性疾病(包括皮膚炎性疾病如牛皮癬)、免疫疾病、癌免疫疾病、哮喘、關節炎。
37.一種含如權利要求1-16中任一項所述融合小泡的藥物制劑。
全文摘要
本發明涉及用于向細胞和組織輸送所選物質，如核酸、蛋白質、肽、抗原、藥物和美容劑的作為高效和通用性包裹系統的新型融合小泡。
文檔編號A61K9/127GK1713892SQ200380103905
公開日2005年12月28日 申請日期2003年11月19日 優先權日2002年11月21日
發明者J·布魯納, S·瓦德魯西, R·澤布里根 申請人:派維翁生物技術有限公司