專利名稱：含有自體組織化磷灰石/膠原復合體的交聯磷灰石/膠原多孔體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及用于制造人造骨骼、細胞支架等的含有自體組織化磷灰石/膠原復合體的交聯磷灰石/膠原多孔體及其制備方法。
背景技術：
由于和人體骨骼具有極好的兼容性，用磷灰石制造的人造骨骼能夠和人體骨骼直接相連接。因此，用磷灰石制造的人造骨骼由于其有效性最近受到人們的重視，在整容手術、神經手術、整型手術、口腔手術等方面都發現它的臨床應用。但是人造陶瓷骨骼，例如磷灰石，在機械性能和生理性能方面并不完全等同于人體骨骼。例如，所謂的僅用磷灰石作為材料制造的人造陶瓷骨骼比人體骨骼堅硬且易碎。當人體骨骼重復地遭受新陳代謝(吸收和再生)，用磷灰石作為材料制造的人造骨骼沒有充分地溶解而是半永久性地殘留在人體骨骼中。殘留的人造骨骼在與人體骨骼的接觸面上折斷它，容易導致人體骨折。
在人體中可分解的人造骨骼的組分比人造磷灰石骨骼的組分更接近于人體骨骼。關于它的研究近來變得很活躍，各種各樣的建議被提出來。例如，JP 11-513590 A揭示交聯磷灰石/膠原多孔體具有網狀結構，如果必要的話，其中膠原和其它粘合劑被連接到羥磷灰石上。由于這種交聯磷灰石/膠原多孔體在人體中可以分解，人體骨骼在交聯磷灰石/膠原中成形，并且交聯磷灰石/膠原多孔體本身被人體骨骼所吸收。因此，這種交聯磷灰石/膠原多孔體能夠被用于脊椎骨的固定、填充骨缺損、骨折的修復和牙周缺損的移植等方面。然而，這種交聯磷灰石/膠原多孔體只是膠原和磷灰石的簡單混合物，其不具有有生命的人體骨骼所具有的磷灰石的C軸沿著膠原纖維取向的結構。此外，這種交聯磷灰石/膠原多孔體的機械強度不足，并且骨新生物形成較差。
發明目的因此，本發明的一個目地在于提供了一種交聯磷灰石/膠原多孔體以及它的制備方法，其能夠按照活體人體骨骼的機制被人體吸收，并且新生骨形成較快，這可以被用于人造骨骼等。
發明的揭示考慮到上述目的，發明家們通過密切的研究發現當含有磷灰石/膠原復合體和膠原的分散體在其冷凍-干燥前經過膠凝化處理，所得到的交聯磷灰石/膠原多孔體具有高強度的均質結構。本發明完全建立在這個發現的基礎上。
因此，根據本發明所述，制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法應包括冷凍-干燥含有磷灰石/膠原復合體和膠原的分散體從而形成多孔體，然后在多孔體中交聯膠原，這個分散體在凝膠化之后被冷凍-干燥等步驟。
分散體中磷灰石/膠原復合體和膠原的優選質量比為97/3到93/7。磷灰石/膠原復合體中磷灰石和膠原的優選質量比為9/1到6/4。
在凝膠化分散體過程中，優選的分散溫度保持在35℃到43℃，分散體的優選PH值為6.8到7.6，并且凝膠化前離子強度為0.2到0.8。
磷灰石/膠原復合體呈纖維形式時的優選長度從0.01到1毫米。磷灰石/膠原復合體中的磷灰石優選具有C軸沿著膠原纖維取向的結構。交聯磷灰石/膠原多孔體中的磷灰石也優選具有C軸沿著膠原纖維取向的結構。
本發明中的交聯磷灰石/膠原多孔體根據上述任意方法制備。
優選實施方式[1]磷灰石/膠原復合體的制備在制備本發明所涉及的交聯磷灰石/膠原多孔體的過程中，磷灰石/膠原復合體和膠原在原料中被用作粘合劑。優選那些具有和活體人體骨骼相似結構的磷灰石/膠原復合體，其中羥磷灰石和膠原以自體組織化方式取向。術語“自體組織化”意思為磷酸氫鈣(羥磷灰石)具有的磷灰石結構是沿著膠原纖維取向的，尤其是活體人體骨骼，即羥磷灰石的C軸和膠原纖維成一直線。
(1)原料制備磷灰石/膠原復合體是用膠原、磷酸鹽、鈣鹽作為原料。由于考慮到沒有特別的限制，膠原可以從動物等體內提取。對動物的種類、部位、年齡等沒有特別的限制。一般，膠原從哺乳動物，例如牛、豬、馬、兔、鼠和鳥類(如母雞)等的皮膚、骨骼、軟骨、腱、內臟等處都可以獲得。膠原狀蛋白質從魚，例如鱈魚、鲆魚、比目魚、鮭魚、鱒魚、金槍魚、鯖魚、紅甲魚、沙丁魚、鯊魚等的皮膚、骨骼、軟骨、鰭、鱗、內臟等處都可以獲得。膠原的提取方法只是按照通常慣例，沒有特別的限制。通過基因重組技術獲得膠原的方法也可以替代從動物組織中提取膠原的方法。
磷酸或磷酸鹽[下文簡稱“磷酸(鹽)”]包括磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等。鈣鹽包括碳酸鈣、乙酸鈣、氫化鈣等。磷酸鹽和鈣鹽優選以均衡水溶液或懸浮液的形式加入。
產物磷灰石/膠原復合體的纖維長度可以通過原料磷灰石[磷酸(鹽)和鈣鹽]和膠原的質量比來控制。因此，原料中所采用的磷灰石和膠原的質量比完全依賴于磷灰石/膠原復合體的目標組合物比所決定。在本發明所采用的方法中，磷灰石/膠原復合體中的磷灰石和膠原的優選比例為9/1到6/4，例如8/2。
(2)溶液的制備首先，制備出磷酸(鹽)水溶液和鈣鹽水溶液或懸浮液。盡管對磷酸(鹽)水溶液和鈣鹽水溶液的濃度或懸浮液沒有特別限制，只要磷酸(鹽)和鈣鹽為所期望的比例。下文所描述的方便的滴加操作優選磷酸(鹽)水溶液的濃度為15到240mM，例如，120mM左右；鈣鹽水溶液或懸浮液的濃度為15到800mM，例如400mM左右。膠原通常以磷酸水溶液的形式加入到上述磷酸(鹽)水溶液中。磷酸中的膠原水溶液可能含有質量濃度為0.1到1％的膠原，例如0.85％左右。磷酸質量濃度為1到40％，例如，20mM左右。
(3)制備磷灰石/膠原復合體首先將與要加入的鈣鹽水溶液或懸浮液等當量的水充分地加入到反應器中并加熱到40℃左右。含有膠原的磷酸(鹽)水溶液和鈣鹽水溶液或懸浮液同時滴加到里面。所合成的磷灰石/膠原復合體的纖維長度通過控制滴加條件來控制。滴加速度優選為1到60毫升/分鐘，例如，30毫升/分鐘左右。攪拌速度優選為1到400轉數/分鐘，例如，200轉數/分鐘左右。
反應溶液優選PH值保持在8.9到9.1。如果鈣離子濃度和/或磷酸離子超過上述范圍，復合體的自體組織化將被阻礙。在上述滴加條件下所供給的磷灰石/膠原復合體纖維長度為小于或等于1毫米，適于作為制備交聯磷灰石/膠原多孔體的原料。磷灰石/膠原復合體為自體組織化的。
滴加結束后，冷凍-干燥泥漿狀的磷灰石/膠原復合體和水的混合物。冷凍-干燥在低于或等于-10℃的真空冷凝狀態下進行快速干燥。[2]交聯磷灰石/膠原多孔體的制備磷灰石/膠原復合體和液體混合，例如水、磷酸水溶液等，并攪拌得到漿糊狀分散體。以磷灰石/膠原復合體的體積為100％，液體的加入量優選為80到99％體積比，更優選為90到97％體積比。產物交聯磷灰石/膠原多孔體的多孔性P，依賴于分散體中磷灰石/膠原復合體和液體的體積比，正如下式所表達(1)P＝A/(A+B)…(1)其中A代表分散體中磷灰石/膠原復合體的體積，B代表分散體中液體的體積。因此，可以通過調節加入液體的量來控制交聯磷灰石/膠原多孔體的多孔性P。加入液體后，含有纖維的磷灰石/膠原復合體通過攪拌分散體而被切斷，得到了長度分布范圍大的纖維，因此提供了改良長度的產物交聯磷灰石/膠原多孔體。
復合體分散體和膠原相混合作為粘合劑并進一步攪拌。以磷灰石/膠原復合體的質量為100％，加入的膠原的量優選為1到10％質量比，更優選為3到6％質量比。類似于在組合物中，膠原優選以磷酸水溶液的形式加入。盡管對膠原磷酸水溶液的濃度等沒有特別限制，從實際角度來看，膠原濃度應為0.85％質量比左右，并且磷酸濃度為20mM。
(2)分散體的凝膠化因為磷酸(鹽)中加入了膠原水溶液，使分散體轉變為酸性。于是加入堿性溶液如氫氧化鈉等直到分散體的PH值變為7左右。分散體的PH值優選為6.8到7.6，更優選為7.0到7.4。通過調整分散體的PH值到6.8、7.6，很可能阻礙作為粘合劑加入的膠原在下文所述的凝膠化過程中形成凝膠。
分散體和10倍濃度的磷酸的生理緩沖鹽水(PBS)溶液相混合并通過攪拌來調整分散體的離子強度為0.2至0.8。更優選的離子強度為0.8左右，和PBS同一標準。提高分散體的離子強度可以加快作為粘合劑加入的膠原形成纖維。
加入到模壓模具中的分散體的凝膠化溫度保持在35到43℃。加熱溫度更優選為35、40℃。為了使分散體充分凝膠化，加熱時間優選為0.5到3.5小時，更優選為1到3小時。隨著分散體保持在35到43℃，作為粘合劑加入的膠原形成纖維，分散體從而轉變為凝膠體。由于膠狀分散體能夠阻礙那些磷灰石/膠原復合體形成沉淀，所以形成均衡的多孔體。遭受凝膠化的分散體呈果凍狀。
(3)冷凍-干燥分散體凝膠化后將被冷凍。冷凍溫度優選為-80℃到-10℃，更優選為-80℃到-20℃。多孔體中的毛孔的大小和形狀可以通過冷凍速度來控制。例如，高速冷凍所得到的多孔體毛孔較小。
分散體然后經過冷凍-干燥形成多孔體。和對組合物的操作相類似，在等于或低于-10℃的冷凍狀態下，通過抽氣和快速干燥來進行冷凍-干燥。冷凍-干燥的要求僅通過傳導實現，直到分散體被充分的干燥。考慮到沒有特別的限制，冷凍-干燥時間一般為24到72小時。
(4)膠原的交聯膠原的交聯可以通過以下任何一種方法進行，例如物理交聯方法，使用γ-射線、紫外線、電子束、加熱脫水等或化學交聯方法使用交聯劑、冷凝劑等。在化學交聯方法中，浸沒在交聯劑溶液中的冷凍-干燥多孔體和多孔體中的膠原交聯。
可以作為交聯劑有醛如戊二醛，甲醛等；異氰酸鹽如六亞甲基二異氰酸鹽等；碳化二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽；環氧化物如乙二醇二乙醚等；轉谷氨酰胺酶等。在這些交聯劑中，考慮到容易控制交聯度以及所得到的交聯磷灰石/膠原多孔體和人體的兼容性優選戊二醛。
當戊二醛作為交聯劑時，戊二醛濃度優選為0.005到0.015％質量比，更優選為0.005到0.01％質量比。交聯磷灰石/膠原多孔體應該經過脫水操作。當醇如乙醇等用作戊二醛溶液的溶劑，交聯膠原同時可以控制交聯磷灰石/膠原多孔體的脫水。通過同時傳導脫水和交聯，磷灰石/膠原復合體在收縮的狀態下發生交聯反應，所以所得到的交聯磷灰石/膠原多孔體具有改良的彈性。
交聯后，交聯磷灰石/膠原多孔體浸沒在2％左右質量比的甘氨酸水溶液中除掉沒有反應的戊二醛，然后水洗。交聯磷灰石/膠原多孔體進一步浸沒在乙醇中脫水，然后室溫干燥。
交聯磷灰石/膠原多孔體的性能和應用本發明中的含有自體組織化的磷灰石/膠原復合體的交聯磷灰石/膠原多孔體比那些常規磷灰石交聯磷灰石/膠原多孔體具有更強的吸水性和彈性。它在含水狀態下也顯示彈性，因此與人體骨骼具有極好的兼容性和極佳的骨骼傳導性。
由于具有上述的特性，本發明中的交聯磷灰石/膠原多孔體作為一種優選生物材料，可以用作活體人體骨骼的骨骼-再生材料的替代品等，其經過γ-射線、電子束、干熱等殺菌。特別地，它適合成為人造骨骼、人造關節、腱和骨骼的連接材料、牙齒移植等。
本發明將用下面所提及的例子更加詳細地解釋，但其沒有限制本實施例1(A)合成磷灰石/膠原復合體168ml 120-mM磷酸水溶液加入到235克膠原的磷酸水溶液中(膠原濃度0.85％質量比，磷酸濃度20mM)并攪拌，來制備稀釋的膠原磷酸水溶液。還需要制備200毫升400mM氫氧化鈣懸浮液。將200ml純水裝入反應器，加熱至40℃。將稀釋的膠原磷酸水溶液和氫化鈣懸浮液同時以30毫升/分鐘的速度滴加到反應器中，200轉數/分鐘的速度攪拌所得到的反應溶液，來制備含有組合物的磷灰石/膠原纖維的漿。在滴加過程中反應溶液PH值保持在8.9到9.1。所得到的組合物磷灰石/膠原纖維長度小于或等于1毫米。冷凍-干燥含有磷灰石/膠原復合體的淤漿。磷灰石/膠原復合體中磷灰石和膠原的質量比為8/2。
(B)制備交聯磷灰石/膠原多孔體
1克冷凍-干燥過的磷灰石/膠原復合體加入到3.6毫升純水中并攪拌，形成漿糊狀分散體。這種漿糊狀分散體和4克膠原的磷酸水溶液相混合并攪拌，然后加入1-N氫氧化鈉水溶液直到PH值達到7。磷灰石/膠原復合體和膠原的質量比為97/3。然后在分散體中加入十倍濃度的PBS直到分散體的離子強度達到0.8。加入的液體量(純水+稀釋的磷酸膠原水溶液+氫氧化鈉水溶液+PBS)與磷灰石/膠原復合體的體積比為95％。
所得到的分散體加入到模壓模具中并在37℃下凝膠化2小時，獲得果凍狀成形體。這種成形體在-20℃下冷凍，然后用冷干器干燥。干燥過的成形體浸沒在0.01％質量比的戊二醛的乙醇(濃度99.5％)溶液中，在25℃下交聯1小時，獲得交聯磷灰石/膠原多孔體。水洗后，這種交聯磷灰石/膠原多孔體浸沒在2％質量比的甘氨酸溶液中除掉沒有反應的戊二醛，然后再次水洗。將其進一步浸沒在乙醇(濃度99.5％)中脫水，然后室溫干燥。
從所得到的交聯磷灰石/膠原多孔體中切出一塊5毫米×5毫米×10毫米的矩形-棱柱狀測試塊，以0.1毫米/秒的速度拉伸來測試它的斷裂強度。結果交聯磷灰石/膠原多孔體的斷裂強度為0.8N左右。
實施例2除了改變凝膠化溫度為40℃，按照例1方法制備交聯磷灰石/膠原多孔體并測試相關的斷裂強度，結果斷裂強度為0.8N左右。
例1對比實驗除了沒有凝膠化的傳導，按照例1方法制備交聯磷灰石/膠原多孔體并測試相關的斷裂強度，結果斷裂強度為0.4N左右。
工業應用正如上文詳述，本發明的方法可以制備含有自體組織化磷灰石/膠原復合體的交聯磷灰石/膠原多孔體，其和人體骨骼具有極好的兼容性、極佳的骨骼傳導性、高機械強度例如斷裂強度等。交聯磷灰石/膠原多孔體具有的特性使其適合作為人造骨骼、人造關節等的生物材料。
權利要求
1.一種制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其包括以下步驟冷凍—干燥含有磷灰石/膠原復合體和膠原的分散體以形成多孔體，然后在所述的多孔體中交聯膠原，所述分散體在凝膠化之后被冷凍—干燥。
2.根據權利要求1所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中通過同時滴加含有膠原的磷酸或磷酸鹽的水溶液和鈣鹽水溶液或懸浮液來制備所述的磷灰石/膠原復合體。
3.根據權利要求1或2所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的分散體中所述磷灰石/膠原復合體和所述膠原的質量比為97/3到93/7。
4.根據權利要求1到3任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的磷灰石/膠原復合體中磷灰石和膠原的質量比為9/1到6/4。
5.根據權利要求1到4任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的分散體在凝膠化過程中溫度保持在35到43℃。
6.根據權利要求1到5任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的分散體在PH值調整為6.8到7.6后膠凝化。
7.根據權利要求1到6任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的分散體在離子強度調整為0.2到0.8后膠凝化。
8.根據權利要求1到7任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的磷灰石/膠原復合體形成的纖維長度小于或等于1mm。
9.根據權利要求1到8任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的磷灰石/膠原復合體中的磷灰石的C軸沿著膠原纖維取向。
10.根據權利要求1到9任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體中的磷灰石的C軸沿著膠原纖維取向。
11.根據權利要求1到10任一項所述的制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法，其中所述的磷灰石/膠原復合體中的磷灰石為羥磷灰石。
12.根據權利要求1到11任一項所述的方法制備的交聯磷灰石/膠原多孔體。
全文摘要
制備交聯磷灰石/膠原多孔體的方法包括凝膠作用和冷凍—干燥含有磷灰石/膠原復合體和膠原的分散體從而形成多孔體，在多孔體中進一步交聯膠原，按照此方法制備交聯磷灰石/膠原多孔體。
文檔編號A61L27/56GK1711113SQ20038010276
公開日2005年12月21日 申請日期2003年10月27日 優先權日2002年11月6日
發明者菊池正紀, 田中順三, 小林尚俊, 莊司大助 申請人:獨立行政法人物質·材料研究機構, 賓得株式會社