樹突細胞前體的血中水平上升劑的制作方法

專利名稱：樹突細胞前體的血中水平上升劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及到樹突細胞的血中水平上升劑以及具有該作用的用兩親性高分子化學改性的新的激動劑(agonist)衍生物。
背景技術：
已知樹突細胞(dendritic cells；有時略記為DC)是由干細胞CD34+細胞分化，具有樹枝狀突起形態特征，廣泛分布于生物體內，通過生物體內運輸能力(移動能力)有效進行抗原的攝取和向T細胞進行抗原呈遞的細胞。即，樹突細胞與其他擔任免疫的細胞同樣都是來自骨髓干細胞，是一邊在增殖分化、成熟的過程中改變分布的組織或器官，一邊起著免疫監視細胞作用的細胞。
樹突細胞的增殖分化·成熟的過程可以分為以下5該階段。即(1)祖細胞期(DC progenitor)主要存在于骨髓，邊自我復制邊產生前體細胞。(2)前體細胞期(DC precursor)在恒定狀態下由骨髓經血液循環恒定供給到生物體的臟器，通過各個臟器的血管壁進入組織內，分布于上皮內或間質。(3)警戒期(sentinel DC)樹突細胞在該階段具有吞噬能力，攝取侵入到分布的各個臟器內的抗原。其代表性細胞有表皮的朗氏細胞、呼吸道上皮的樹突細胞、心·肝等實質性臟器的間質DC等。(4)抗原輸送期(antigen-transporting DC)樹突細胞通過整合抗原信息，進行一階段成熟后，獲得游走能力。在人扁桃體，樹突細胞從陰窩上皮直至T細胞區域(濾胞間區域)游走于扁桃體組織內，在那里誘導免疫應答。在其他臟器，很多樹突細胞進入輸入淋巴管，通過淋巴循環游走于所屬淋巴節，向T細胞區域(旁皮質)集積。(5)抗原呈遞期(mature DC)進入淋巴臟器的樹突細胞直至在最終階段成熟。然后與T細胞形成細胞群(cluster)，選出抗原特異的T細胞，進行抗原呈遞。然后，樹突細胞在T細胞區域通過凋亡結束一生(參照醫學進展Vol.200，No.6，472-476(2002))。
已知將從外周血采集的樹突細胞(前體)于體外，例如在GM-CSF和TNFα存在下使其增殖后，用疾病(相關)抗原、例如腫瘤細胞等疾病(相關)抗原刺激，然后使其返回到生物體內，可以增強對疾病的免疫療法。這種療法稱之為利用樹突細胞的免疫療法、或疫苗療法，可用于各種疾病，例如黑素瘤、腎癌、前列腺癌、白血病、轉移性惡性腫瘤等。因此樹突細胞在治療上的應用正引人注目，使用樹突細胞的免疫療法不僅應用于腫瘤，而且已經擴展到感染、移植和自身免疫領域(例如，參照Kayo Inaba，Saibo Kogaku，Vol.19，No.9，1282-1286(2000)；Hiroshi Kawamot et al.，Saibo Kogaku，Vol.19，No.9，1311-1317(2000)；和Takuya Takayama等，BunshiSaibo Chiryo，Vol.2，No.6，53-56(2001))。
作為在未成熟樹突細胞中表達的受體已知有CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR11以及CXCR4。作為針對這些受體的配體已知有MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、TARC、MDC、MIP-3α、MIP-3β、LARC、TECK、BLC、SDF-1、Exodus-1、Exodus-2等等。其中作為對CCR1以及CCR5共通的配體，已知有MIP-1α、RANTES、MARC和LCC-1(ref)(參照例如中野英樹、細胞工學Vol.19，No.9，1304-1310(2000))。
已知還存在具有與配體(激動劑)同樣生物活性的配體的功能性衍生物，例如就MIP-1α來說，已知有將MIP-1α的26位Asp置換為Ala，由氨基末端從Ser開始的69個氨基酸構成的MIP-1α突變體(BB-10010)。發現這個MIP-1α突變體不僅具有顯著改善的抗凝集能力，而且具有與野生型同等的活性，并已就作為癌癥化療的副作用的血中粒細胞減少癥的改善進行了研究(E.Marshall et al.，EuropeanJournal of Cancer，Vol.34，No.7，pp.1023-1029(1998))。
作為制癌劑(通常名稱zinostatin stimalamer)已知有通過作為兩親性高分子一種的部分丁酯化苯乙烯-馬來酸共聚物化學改性的新制癌菌素(特公平1-33119號)。已知當將它投到血中時，表現出所謂大致有選擇地積聚成固體瘤，長時間后仍維持在腫瘤內的EPR效果，所以可作為癌特異的尋靶型制癌劑使用。另外，已知還有用兩親性高分子化學改性的肽性激動劑或其功能性衍生物(WO01/83548)。另外已知用聚乙二醇修飾的黃嘌呤氧化酶對腫瘤細胞也表現出EPR效果(特開平11-060499號)。無論使用這些物質中的哪一種對腫瘤細胞具有直接攻擊性的物質，都可達到抗腫瘤效果，通過使攻擊性物質選擇性地集聚在目標患處，目的在于減少對正常細胞或組織的影響。
另外，已知通過用作為兩親性高分子一種的聚乙二醇衍生物對蛋白質進行修飾，可以使生物體內清除率延遲，或使抗原性降低(Yoshimotoet al.，Jpn.J.Cancer Res.，77，1264(1986)、Abuchowski etal.，Cancer Biochem.Biophys.，7，175(1984)、特開昭61-178926號公報、特開昭62-115280號公報、特再表WO96/28475號公報、特表平10-513187號公報、特開平11-310600號公報、特表2000-517304號公報)。另外已知聚乙二醇修飾的白介素-1、白介素-6、干擾素等(特開平5-117300號公報、特開平6-256394號公報、特開平9-25298號公報)。

發明內容
如上所述，樹突細胞在治療中的應用領域正在不斷擴大，但由于樹突細胞前體只存在于外周血中，為了獲得用于治療的量即使是在體外進行增殖也是困難的。因此，謀求提高患者外周血中樹突細胞前體的水平成為利用樹突細胞使治療實用化方面的關鍵。本發明的目的就在于提供用于實用化治療的技術手段。
首先，如以下參考例1所示那樣，本發明人通過將痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes，以下稱P.acnes)的死菌注入小鼠，發現樹突細胞前體(F4/80抗原陰性、B220抗原陰性、CD11c抗原陽性細胞)被誘導到血液中。通過隨后的研究，發現這種樹突細胞前體誘導作用被抗巨噬細胞炎性蛋白-1α(Macrophage inflammatoryprotein-1α，MIP-1α)抗體抑制，推斷MIP-1α，以及針對未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑參與樹突細胞前體的誘導機制，再進一步研究，發現通過由生物體外給予上述激動劑、例如MIP-1α，存在于血中的樹突細胞前體的濃度水平至少上升了數十倍數量級的意料之外的現象，直至完成本發明。在本說明書的記述中，只要沒有特別指出，「樹突細胞」用語可用作各種各樣的處于成熟階段的細胞的總稱。
然而，象天然型MIP-1α那樣的許多配體在生理條件下，形成凝集體沉淀，經常出現活性喪失的問題。為了解決這一問題，又進行了目的在于進一步提高上述配體使樹突細胞前體的血中濃度水平上升作用以及改善在血中的穩定性的研究。
即，本發明人等著眼于作為針對未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑的代表例MIP-1α以及其功能性衍生物的一個例子BB10010，嘗試上述配體用兩親性高分子進行化學改性，發現化學改性的配體不抑制其活性，活性反而提高了，直至發明新的激動劑衍生物。
所以本發明涉及(1)一種以針對在未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑或其功能性衍生物作為有效成分的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(2)一種以針對受體CCR1或CCR5的激動劑或其功能性衍生物作為有效成分的樹突細胞前體的血中水平上升劑。
更具體講，涉及(3)激動劑是選自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3和MCP-4的樹突細胞前體的血中水平上升劑，或(4)激動劑是選自MIP-1α、RANTES、MARC以及LCC-1(ref)的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(5)激動劑或其功能性衍生物為MIP-1α或其功能性衍生物的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(6)MIP-1α的功能性衍生物為BB-10010的樹突細胞前體的血中水平上升劑。
更具體講，涉及(7)激動劑的功能性衍生物為用兩親性高分子化學改性的針對在未成熟樹突細胞表達的受體的激動劑的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(8)激動劑的功能性衍生物為用兩親性高分子化學改性的針對受體CCR1或CCR5的激動劑的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(9)激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的MIP-1α、BB-10010、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3或MCP-4的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(10)激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的MIP-1α、BB-10010、RANTES、MARC或LCC-1(ref)的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(11)激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的MIP-1α或BB-10010的樹突細胞前體的血中水平上升劑，(12)激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的BB-10010的樹突細胞前體的血中水平上升劑，以及(13)兩親性高分子是部分烷基酯化的苯乙烯-馬來酸共聚物的(7)至(12)所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑。
另外本發明還涉及(14)用兩親性高分子化學改性的針對在未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑，(15)用兩親性高分子化學改性的針對受體CCR1或CCR5的激動劑。
更具體講，還涉及(16)用兩親性高分子化學改性的MIP-1α、BB-10010、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3或MCP-4，(17)用兩親性高分子化學改性的MIP-1α，(18)用兩親性高分子化學改性的BB-10010，(19)(14)至(18)的激動劑，其中兩親性高分子是部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物或聚乙二醇衍生物。


圖1表示抗MIP-1α抗體在將P.acnes給予B6小鼠引起的向外周血誘導樹突細胞前體的效果。
圖2表示通過給予B6小鼠MIP-1α引起的向外周血誘導樹突細胞前體的誘導活性隨時間的變化。
圖3表示在將對MIP-1α誘導的樹突細胞前體進行抗原致敏后與T淋巴細胞共培養進行的混合淋巴細胞反應中的T淋巴細胞的增殖效果。
圖4表示在小鼠接種的腫瘤細胞的增殖中，使用MIP-1α誘導的樹突細胞前體的疫苗療法的效果。
圖5表示用MIP-1α誘導的樹突細胞前體在體外腫瘤特異的殺傷性T細胞的誘導中的效果。
圖6表示通過用MIP-1α誘導的樹突細胞前體誘導的腫瘤特異的殺傷性T細胞的MHC classI限制性的確認實驗的結果。
圖7表示使用MIP-1α誘導的樹突細胞前體的疫苗療法對腫瘤細胞在小鼠肺轉移中的效果。
圖8表示每個Bu-SMA-BB10010級分的280nm的吸光度。
圖9表示Bu-SMA-BB10010以及作為原料的BB10010的Native-PAGE電泳結果。
圖10表示BB10010以及Bu-SMA-BB10010靜脈注入24小時后的血中樹突細胞占有率。斜線柱圖表示B220-CD11c+，而無斜線柱圖表示B220+CD11c+。
具體實施例方式
由使用了MIP-1α的本發明人等的研究結果預料針對在未成熟樹突細胞中表達的受體CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR11以及CXCR4等的配體、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、TARC、MDC、MIP-3α、MIP-3β、LARC、TECK、BLC、SDF-1、Exodus-1、Exodus-2等有使樹突細胞前體的血中濃度水平上升的作用。預料其中在本發明人等研究中認為與樹突細胞在末梢臟器游走有關系的作為對CCR1以及CCR5共通的配體已知的MIP-1α、RANTES、MARC、LCC-1(ref)等在使樹突細胞前體的血中濃度水平上升的作用中更優秀。
作為本發明中有效成分代表例的MIP-1α已知是屬于CC亞家族的趨化因子，是受體CCR-1和CCR-5的配體(激動劑)。已知人成熟型MIP-1α是由70個氨基酸構成的，而由CD8+T細胞或HTLV-1感染細胞MT4培養上清中得到的MIP-1α含有66個氨基酸。在人MIP-1α中，已知由于個體差異，存在著基因拷貝數不同的非等位基因LD78β，與70氨基酸型MIP-1α在序列上有3個殘基不同。上述這些MIP-1α，無論哪一個都可以在本發明中使用。
所謂在本發明中能夠使用的激動劑的功能性衍生物指的是針對在未成熟樹突細胞中表達的受體的配體的衍生物，具有激動劑作用的物質。例如，所謂MIP-1α的功能性衍生物是MIP-1α的衍生物，作為激動劑表現出與MIP-1α同樣生物活性，作為這樣的生物學同等物的代表例子，如BB-10010(已出版，European Journal of Cancer，Vol.14，No.7，pp.1023-1029(1998))。
在本發明中作為樹突細胞前體的血中水平上升劑使用的激動劑如果用部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物或聚乙二醇衍生物為代表的兩親性高分子進行化學改性，確認不但可以維持其活性，而且能改善血中的穩定性，使水平上升作用維持以及由于EPR效果產生向癌部位集聚。激動劑向癌部位的集聚引起在外周血中增加的樹突細胞向癌部位集聚，進一步提高了癌免疫療法的效果。因此，本發明中使用的激動劑的功能性衍生物優選用兩親性高分子化學改性，這樣一來，用兩親性高分子化學改性的激動劑以及其生物學同等物在本說明書中也稱為「激動劑的功能性衍生物」。
作為在本發明中用于對肽性激動劑或其生物學同等物進行化學改性的兩親性高分子的優選例子，可以列舉部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物，另外，作為其中的烷基部分的例子，可以列舉直鏈或有分支的碳數為1至5的烷基，這樣的烷基也可以用低級的烷氧基取代。更具體地，可以列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、2，3-二甲基-1-丙基、2-戊基、3-甲基-2-丁基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、甲基乙二醇乙醚、乙基乙二醇乙醚等。
優選的部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物的例子為特公平1-33119號中記載的部分丁基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物，選擇平均分子量為1000～10000，聚合度為1～100、優選3～35的共聚物。
在本發明中用于對激動劑或其生物學同等物進行化學改性的兩親性高分子的其他優選例子，可以列舉聚乙二醇(以下有時也記為PEG)的衍生物。這里，所謂聚乙二醇衍生物指的是-O-(CH2CH2O)n-所示的PEG部分(n為20至280的整數)具有可與激動劑或其生物學同等物的肽鏈結合的殘基的化合物。作為聚乙二醇衍生物的例子，可以列舉具有可與肽鏈的氨基(N末端氨基、賴氨酸殘基的氨基)結合的殘基的化合物。作為聚乙二醇衍生物的其他例子，可以列舉具有可與肽鏈的羧基(C末端羧基、天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基的羧基)結合的殘基的化合物。
另外，作為可用于本發明的兩親性高分子的其他例子，可以列舉聚乙烯基吡咯烷酮等。
本發明涉及到的用兩親性高分子化學改性的激動劑及其生物學同等物可以通過使兩親性高分子與激動劑及其生物學同等物因場合不同借助于連接臂進行化學結合，經部分純化獲得。即，在緩沖液中使兩親性高分子與激動劑及其生物學同等物反應，然后使用柱色譜進行純化，對洗脫出的各個級分進行分離。
以兩親性高分子為部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物的情況為例，如果更具體說明，首先，使苯乙烯與馬來酸酐的自由基共聚合得到的苯乙烯-馬來酸共聚物(SMA)的酸酐溶解于枯烯等有機溶劑，在攪拌下向該溶液中滴加正丁醇，使其反應，通過對無水環進行部分丁基酯化，可以獲得部分丁基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物(Bu-SMA)。這樣獲得的Bu-SMA與激動劑或其生物學同等物的結合可以通過使兩者在pH8.5的碳酸氫鈉0.3M溶液中反應，在Bu-SMA中的酸酐與激動劑或其生物學同等物中的氨基之間形成酰胺鍵進行。Bu-SMA對激動劑或其生物學同等物的鍵數可以為1以上，優選3至10，更優選6至8。
當作為兩親性高分子使用PEG，對激動劑或其生物學同等物的肽鏈的氨基進行改性時，優選在PEG的末端導入可與氨基反應的官能團，例如羧基。為了使其能與激動劑或其生物學同等物的肽中的氨基結合，優選是將該官能團變換為反應性基團，對于羧基，優選活性酯法、混合酸酐法等。
具體來說，活性酯的情況下，可以列舉對硝基苯酯、五氟苯酯等苯酯類，N-羥基苯二甲酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯等二羧酰亞胺酯，N-羥基哌啶酯等羥基系活性酯等。這些活性酯的制備可以按照常規方法進行，例如使用二環己基碳二亞胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺等縮合劑在-20℃至室溫使PEG衍生物的羧基與對應于上述活性酯的醇體反應1至24小時進行。或也可以在三乙胺等堿存在下在0℃至80℃使PEG衍生物的羧基與對應于上述活性酯的鹵化物反應1至72小時進行制備。運用混合酸酐法時，可以通過在N-甲基嗎啉、N-乙基哌啶等堿存在下，與氯甲酸異丁酯、氯甲酸乙酯、異戊酰氯等于-20℃至0℃反應1至30分鐘進行制備。
也可以將PEG衍生物直接導入激動劑或其生物學同等物的肽鏈，也可以借助于連接臂導入。例如將含有賴氨酸的短的氨基酸序列導入目的肽鏈，該賴氨酸的氨基用PEG衍生物進行修飾。在修飾反應中，相對于被修飾肽鏈中含有的氨基數，優選使用10至30倍摩爾的PEG衍生物。
當作為兩親性高分子使用PEG，對激動劑或其生物學同等物的肽鏈的羧基進行修飾時，優選在PEG的末端導入可與羧基反應的官能團，例如導入氨基。
這樣獲得的用兩親性高分子化學改性的肽性激動劑或其生物學同等物預期可以由于EPR效果有選擇地向固體腫瘤等目標患處集聚。
本發明涉及到的樹突細胞的血中水平上升劑優選是非口服給予作為有效成分的激動劑或其功能性衍生物、即蛋白質，優選是以與例如水、或其他藥學上容許的液體的無菌溶液或懸浮液等注射劑形式給藥。用于注射的無菌組成物可以按照使用象注射用水那樣的媒液、天然植物油等，使有效成分溶解或懸浮等通常的制劑手段處方。作為注射用的水性液體，例如生理鹽水、葡萄糖或含有其他輔助藥的等滲液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化鈉等)等，也可以與適當的溶解輔助劑，例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性表面活性劑(例如，聚山梨酸酯80TM、HCO-50等)等并用。作為油性液可以使用例如芝麻油、椰子油、大豆油等，作為溶解輔助劑也可以與苯甲酸芐酯、芐醇等并用。另外也可以與緩沖劑(例如、磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等)、安慰劑(例如，烷基二甲基芐基氯化銨、鹽酸普魯卡因等)、穩定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如，芐醇、苯酚等)、抗氧化劑等配合。
在本發明中得到的結合了Bu-SMA的激動劑或其生物學同等物可以使用水溶性或油性注射用劑的形式。水溶性注射用劑主要用于靜脈給藥。油性注射劑通過固定在腫瘤營養動脈上游的導管將使均一分散于例如碘化罌粟油等油劑的結合了Bu-SMA的激動劑或其生物學同等物投到腫瘤組織等的目標患部。本發明人等發現結合了Bu-SMA的激動劑或其生物學同等物在血中與清蛋白結合后以高分子化合物起作用以及Bu-SMA結合物可溶于油劑，其結果，如果將油劑化的結合了Bu-SMA的激動劑或其生物學同等物注射到局部動脈，預期通過所謂EPR效果可有選擇地集聚于固體腫瘤等目標患部。
象上述那樣獲得的制劑可以給予例如人或哺乳動物。本發明的有效成分的給藥量因對象疾病、給藥對象、給藥路徑等不同而有所差異，非口服給藥時的該有效成分的一次給藥量，例如給予成人(體重為60kg)時，一次約0.01～10mg左右，優選約0.1～5mg左右。對于其他動物也可以給予換算為每60kg的量。
參考例1利用P.acnes進行血中樹突細胞前體的誘導和利用抗MIP-1α抗體抑制誘導由尾靜脈向B6小鼠(雌、8-10周齡、CLEA公司生產)注入P.acnes(1mg/只；American Type Culture Coleection 118289)，向血中誘導樹突細胞前體。在注入P.acnes的6小時前，由尾靜脈向其中的一組注入具有功能抑制活性的抗MIP-1α抗體(山羊多克隆抗體；100μg/μl；Genzyme/Techne公司生產)。作為陰性對照同樣注入山羊IgG(Sigma-Aldrich公司生產)。
用NycoPrep(Axis-Shield公司生產)從注入P.acnes 3日后各個小鼠采集的肝素采血液進行分離，采集外周血單核細胞。使該外周血單核細胞與FITC標記抗CD11c抗體(Clone HL3，PharMingen公司生產)和PE(Phycoerythrin)標記抗B220抗體(Clone RA3-6B2；PharMingen公司生產)于4℃下反應后，通過流式細胞儀(EPICS-Elite，Coulter公司生產)進行解析。以B220抗原陰性、CD11c抗原陽性細胞作為樹突細胞前體，算出外周血單核細胞中樹突細胞前體的比例。結果如圖1所示。圖1中「PBS」是作為對照只注入PBS的組的結果。
注入P.acnes與沒有注入組相比，外周血單核細胞中的樹突細胞前體的比例急劇上升。這表明樹突細胞前體已經被誘導到血液中。在注入抗MIP-1α抗體組中，確認由于注入P.acnes外周血單核細胞中的樹突細胞前體的出現頻率的上升約一半都被抑制了。
參考例2MIP-1α法制法利用PCR法獲得人MIP-1α基因。將該人MIP-1α基因整合到表達穿棱載體·pNCMO2，通過大腸桿菌進行擴增。將該人MIP-1α基因表達載體導入Brevibacillus choshinensis(B.choshinensis)HPD31S5。對導入該人MIP-1α基因的B.choshinensis進行培養，采集培養上清。向該培養上清加終濃度為40％的硫酸銨，沉淀生成后進行離心，分離上清，然后再加使終濃度為60％的硫酸銨，沉淀生成后進行離心，回收該沉淀物。將該沉淀物溶解于Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，通過陰離子交換色譜(Q Sepharose；Amersham公司生產)對該溶解物進行分級。收集各個級分中含有MIP-1α的級分，加硫酸銨溶解(終濃度1.5M)。通過疏水性色譜(RESOURCE PHE；Amersham公司生產)對該溶解物進行分級。收集各個級分中含有MIP-1α的級分(非吸附級分)，加硫酸銨進行硫酸銨沉淀(終濃度60％飽和)。將沉淀物溶解于Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，再通過陰離子交換色譜(RESOURCE Q；Amersham公司生產)對該溶解物進行分級。收集各個級分中含有MIP-1α的級分，為了除去Tris-HCl，對20mM NH4HCO3(pH8.5)進行透析。對通過上述處理生成的沉淀進行離心，得到純化的人MIP-1α。將它進行冷凍干燥后溶解于PBS，用于以下實驗。
參考例3BB10010的制法(表達與純化)BB10010的cDNA以人MIP-1αcDNA作為模板，使用Quik ChangeKit(Stratagene公司)通過定點特異突變進行制備。即，向在125ng突變引物RQ15’-CCAGCGAAGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCAG-3’(序列編號1)、RQ25’-CTGGGGTCAGCACAGACCTGCCGGCTTCGCTTGG-3’(序列編號2)、模板質粒DNA10ng中含有50μMdNTP的50μl反應體系中添加Pfuturbo(2.5U/μl)，于95℃下變性30秒鐘，然后進行每一循環為95℃30秒鐘、55℃1分鐘、68℃7分鐘的12次循環后，向反應體系中添加1μl限制酶DpnI，于37℃下反應1小時，切斷模板DNA，只回收突變質粒。通過DNA序列解析確認突變部位正確置換后，使用MIPM2引物5’-CATGCCATGGCTTTCGCTTCACTTGCTGCTGACAC(序列編號3)以及MIPRV引物5’-CGCGGATCCTCAGGCACTCAGCTCTAG(序列編號4)，進行通常的PCR，用限制酶Ncol和BamHl切斷后，插入到短芽孢桿菌表達載體pNCMO2的同樣限制酶切位點。然后用該重組質粒轉化Brevibacillus chonshinensis HPD31株，于30℃下，用TMN培養基在發酵灌培養3天、20L，使其分泌表達。將該培養基上清用0.45um的濾膜過濾除菌，作為純化的初始材料。向該培養基上清中添加10倍濃度的磷酸緩沖液(0.1M磷酸鈉)，最終為pH7.0，利用AKTA-prime系統(Amersham Biosciens公司)以5ml/min速度向用10mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的肝素柱(5ml大小、Amersham Biosciens公司)送液，使BB10010吸附。洗脫以按照梯度添加含有1M氯化鈉的磷酸緩沖液(pH6.5)進行。峰級分對于50mM甲酸緩沖液(pH4.0)進行透析。接著以1ml/min送入陽離子交換色譜SP-FF(1ml大小、AmershamBiosciens公司)，使BB10010吸附。洗脫以按照梯度添加含有1M氯化鈉的甲酸緩沖液(pH3.8)進行。BB10010洗脫級分通過SDS-聚丙烯酰胺電泳確認。峰級分經凝膠過濾色譜(充填劑BioRad公司生產Bio-GelP60，移動相20mM碳酸氫銨溶液(pH8.5)、柱尺寸1.6×83cm)純化BB10010。對該峰級分進行冷凍干燥。
實施例1MIP-1α向小鼠血中誘導樹突細胞前體的活性由尾靜脈向B6小鼠(雌、8-10周令、C1EA公司生產)注入通過參考例2制法得到的純化MIP-1α(5μg/只)，向血中誘導樹突細胞前體。就注入MIP-1α后的4，8，16，24，48，72小時后由該小鼠采集的肝素采血液與參考例1一樣用流式細胞儀進行解析，算出外周血單核細胞中樹突細胞前體的比例。
結果如圖2所示。就象圖中□破折線圖表示的那樣，由于注入MIP-1α，在短時間內，外周血單核細胞中的樹突細胞前體(B220-CD11c+細胞)的比例急劇上升，在注入后8小時，達到峰值(12.45％±0.49)，該峰一直持續到24個小時后。由于在注入MIP-1α前(圖2的時間為零時)的樹突細胞前體的濃度為0.5至1％，顯然血中水平上升了12至24倍數量級。
另外，就象圖2中◇破折線圖表示的那樣，由于注入MIP-1α，外周血單核細胞中的樹突細胞前體(B220+CD11c+細胞)的比例上升，在注入后8小時，達到峰值、該峰一直持續到24個小時后。通過最近本發明人等的研究，確認作為血漿細胞系的樹突細胞前體的B220+CD11c+細胞依賴于E選凝素以及CXCL9與炎癥淋巴節高內皮性細靜脈(high endothelial venules)直接結合，并一起游出，支持作為骨髓性樹突細胞的B220+CD11c+細胞的功能。而B220+CD11c+細胞產生干擾素γ，促進殺傷細胞的活化也被本發明人等闡明。由這些見解，外周血中B220+CD11c+細胞水平的上升在利用樹突細胞進行的免疫療法中帶來了重要的意義。
實施例2通過MIP-1α誘導到小鼠血中的樹突細胞前體的功能解析以解析通過MIP-1α誘導到小鼠血中的樹突細胞前體是否具有與P.acnes誘導的樹突細胞前體同樣性狀為目的進行以下實驗。
<1>來自外周血樹突細胞前體的制備由尾靜脈向B6小鼠(雌、8-10周令、C1EA公司生產)注入P.acnes死菌(1mg/只)或用參考例2的制法得到的純化MIP-1α(5μg/只)。P.acnes死菌注入后第3天或MIP-1α注入后第16小時在麻醉下從該小鼠心臟進行肝素采血(0.8ml/只)。用NycoPrep對該肝素采血液進行分離，采集外周血單核細胞。使該外周血單核細胞與FITC標記抗CD11c抗體和PE標記抗B220抗體于4℃下反應30分鐘后，用細胞分選器(EPICS-Elite、Coulter公司生產)分離B220抗原陰性、CD11c抗原陽性細胞。將該分離細胞在GM-CSF(4ng/ml；Kirin Brewery公司生產)和IL-4(10ng/ml；Genzyme/Thech公司生產)存在下培養5天后作為來自外周血的樹突細胞前體。
<2>來自骨髓的樹突細胞前體的制備由B6小鼠的大腿骨和脛骨采取骨髓細胞。用NycoPrep對該骨髓細胞進行分離，采集外周血單核細胞。將該骨髓單核細胞于培養皿培養10-12小時，回收非附著骨髓單核細胞。將該非附著骨髓單核細胞與磁珠標記c-kit抗體混合培養，通過磁細胞分選器(MACS；MiltenyiBiotec公司生產)分離c-kit陽性細胞。將該c-kit陽性細胞調整到2.5×105cells/ml濃度，于SCF(須藤先生(Toray公司)提供)、Flt3L(Immunex公司生產)、GM-CSF(4ng/ml)和IL-4(10ng/ml)存在下，培養7-9天的細胞作為來自骨髓的樹突細胞前體。
<3>樹突細胞前體的抗原致敏作為抗原的癌細胞株的裂解物通過對癌細胞反復進行3次冷凍·溶解制備。將該來自外周血的樹突細胞前體(來自注入P.acnes死菌或純化MIP-1α的小鼠)和來自該骨髓的樹突細胞前體與該癌細胞株裂解物按照樹突細胞前體∶癌細胞＝1∶3混合，培養20小時。回收該癌細胞株裂解物致敏樹突細胞前體，通過絲裂霉素C(10μg/ml)進行處理后，將清洗2次的細胞作為抗原致敏樹突細胞前體。
<4>抗原致敏樹突細胞前體引起的T淋巴細胞增殖反應測定由B6小鼠脾細胞通過磁細胞分選器(MACS；MiltenyiBiotec公司生產)制備CD3陽性T淋巴細胞。將T淋巴細胞與該抗原致敏樹突細胞前體(來自用B16癌細胞株裂解物致敏的骨髓的樹突細胞前體)的比按照1∶20混合，在IL-2、IL-7存在下用24孔培養板培養。對該培養T淋巴細胞培養5天后，每隔2-3日將50％的培養基與新鮮的培養基交換對該細胞繼續培養。在第7和第14天通過重新加入該抗原致敏樹突細胞前體，對該培養T淋巴細胞進行再致敏。在培養第21天回收該培養T淋巴細胞。然后，使用96孔圓底培養板(Nunc公司制造)，將該培養T淋巴細胞分別與來自經MMC處理的B16癌細胞株裂解物致敏的該外周血的樹突細胞前體(來自注入P.acnes死菌或純化MIP-1α的小鼠)、來自B16癌細胞株裂解物致敏的該骨髓的樹突細胞前體、用EL4癌細胞株裂解物致敏的該樹突細胞前體、未致敏該樹突細胞前體或只有癌細胞株裂解物混合，于37℃下培養4-5天。培養后，按照15μl/孔加5mg/ml的MMT(3-(4，5-dimethylthiazolyl-2yl-2，5-diphenyl tetrazolium bromide))溶液，于37℃下培養4小時。培養后，通過測定各個孔的550nm吸光度，測定該T淋巴細胞的增殖。
結果如圖3所示。來自B16癌細胞株裂解物致敏的注入純化MIP-1α的小鼠的該外周血的樹突細胞前體與來自注入P.acnes死菌小鼠外周血樹突細胞前體或來自骨髓的樹突細胞前體同樣增強該培養T淋巴細胞的增殖。另外，如果只是用EL4癌細胞株裂解物致敏的該樹突細胞前體、未致敏該樹突細胞前體或癌細胞株裂解物則沒有看到該培養T淋巴細胞增殖的增強活性。
<5>在小鼠的腫瘤增殖中的免疫效果的研究對B6小鼠的各個組(8只/組)于第0天、第7天兩次通過腹側皮下分別注入用B16癌細胞株裂解物致敏的該外周血樹突細胞前體(來自注入P.acnes死菌或純化MIP-1α的小鼠)、B16癌細胞株裂解物致敏的該骨髓樹突細胞前體、用EL4癌細胞株裂解物致敏的該樹突細胞前體、未致敏的該樹突細胞前體(各1×106/鼠)、癌細胞株裂解物或PBS。14天后向該小鼠的腹側皮下接種B16癌細胞(2×105/鼠)。接種后每隔3天，測定腫瘤面積，判定腫瘤的增殖。同時觀察小鼠的存活天數。
結果如圖4所示。通過用來自B16癌細胞株裂解物致敏的注入純化MIP-1α的小鼠的外周血樹突細胞前體進行免疫，可顯著抑制接種于皮下的B16癌細胞的增殖。另外，在50％(5/10)的小鼠中，觀察到腫瘤消失，確認存活可延長到60天以上。這一效果與來自注入P.acnes死菌小鼠外周血樹突細胞前體或來自骨髓的樹突細胞前體同等。另外，只是用EL4癌細胞株裂解物致敏的該樹突細胞前體、未致敏該樹突細胞前體或癌細胞株裂解物免疫的小鼠癌接種后20天內全部死亡。
<6>腫瘤特異的細胞傷害活性的測定通過與上述<4>同樣的方法，由B6小鼠脾細胞制備CD3陽性T淋巴細胞，通過分別與來自B16癌細胞株裂解物致敏的該外周血樹突細胞前體(來自注入P.acnes死菌或純化MIP-1α的小鼠)、B16癌細胞株裂解物致敏的該骨髓樹突細胞前體、或只是癌細胞株裂解物混合培養，制備培養T淋巴細胞。將該T淋巴細胞連續稀釋后按照100μl/孔加到96孔板中。然后按照100μl/孔加B16癌細胞株的細胞浮游液。將該培養板于37℃下培養10小時。對該培養板離心后，將上清100μl/孔移至新的96孔板。按照100μl/孔向各個孔加CytotoxicityDetection Kit(LDH；Boehringer Mannheim公司生產)。使該反應板于室溫下反應30分鐘后，通過培養板吸光度測定儀器測定490nm的吸光度。
結果如圖5所示。與來自B16癌細胞株裂解物致敏的注入純化MIP-1α的小鼠的外周血樹突細胞前體混合培養的T淋巴細胞可有效地傷害B16癌細胞，但不傷害EL4癌細胞。通過與來自B16癌細胞株裂解物致敏的注入P.acnes死菌小鼠外周血樹突細胞前體或來自骨髓樹突細胞前體混合培養的T淋巴細胞液同樣傷害B16癌細胞。然而只與癌細胞株裂解物混合培養的T淋巴細胞不傷害B16癌細胞。
<7>在上述<5>中，在來自B16癌細胞株裂解物致敏的該外周血樹突細胞前體(來自注入MIP-1α的小鼠)或來自該骨髓的樹突細胞前體免疫的小鼠中，對于B16癌細胞株接種后第60天癌細胞消失了的小鼠，由該小鼠采取脾細胞。分離該脾細胞的CD8陽性T淋巴細胞(1×106)后，與MMC處理的B16癌細胞株(1×105)培養5天。將該培養T淋巴細胞連續稀釋后按照100μl/孔加到96孔板中。然后按照100μl/孔加B16癌細胞株的細胞懸浮液。將該培養板于37℃下培養10小時。對該板離心后，將上清100μl/孔移至新的96孔板。按照100μl/孔向各個孔加Cytotoxicity Detection Kit(LDH；Boehringer Mannheim公司生產)。使該反應板于室溫下反應30分鐘后，通過培養板吸光度測定儀器測定490nm的吸光度，測定細胞傷害活性。對于MHC classI功能抑制實驗，對B16癌細胞在添加前用MHC classI抗體(抗H2Kb/H2Db抗體)或對照抗體(抗H2Dd抗體)于37℃下處理30分鐘。
結果如圖6所示。該培養T淋巴細胞可有效地傷害B16癌細胞，但不傷害EL4癌細胞。而該活性，通過用抗MHC classI抗體處理該培養T淋巴細胞，完全被抑制。而用對照抗體沒有看到這樣的效果。<8>對B6小鼠的各個組于第0天、第7天兩次通過腹側皮下分別注入用B16癌細胞株裂解物致敏的該外周血樹突細胞前體(來自注入P.acnes死菌或純化MIP-1α的小鼠)、B16癌細胞株裂解物致敏的該骨髓樹突細胞前體、用EL4癌細胞株裂解物致敏的該樹突細胞前體、未致敏該樹突細胞前體(各1×106/鼠)、癌細胞株裂解物或PBS。第二次免疫后第7天從該免疫小鼠采取脾細胞。用細胞分選器從該脾細胞分離分離CD4陽性細胞和CD8陽性細胞T細胞。將該T細胞與進行了MMC處理的B16癌細胞混合，使用24孔板培養48小時。使用該培養細胞，測定細胞傷害活性。另外使用IFNγELISA系統(Endogen公司生產)測定該培養細胞的上清中的IFNγ濃度。
<9>肺轉移中效果的確認由B6小鼠的尾靜脈注入B16癌細胞(1×106/鼠)。在癌細胞注入后第3天，第7天由尾靜脈分別用B16癌細胞株裂解物致敏的該外周血樹突細胞前體(來自注入MIP-1α的小鼠)、B16癌細胞株裂解物致敏的該骨髓樹突細胞前體、用EL4癌細胞株裂解物致敏的該樹突細胞前體、未致敏的該樹突細胞前體(各1×106/鼠)、癌細胞株裂解物或PBS。癌細胞注入后第21天摘出小鼠肺，測定癌轉移巢數，判定轉移的程度。
結果如圖7所示。數據用各組3只鼠的平均值表示。在用來自用B16癌細胞株裂解物致敏的注入純化MIP-1α的小鼠的外周血樹突細胞前體以及來自骨髓的樹突細胞前體進行癌接種后免疫的小鼠中，B16癌細胞向肺轉移被明顯抑制。而且，混合培養的T淋巴細胞液同樣傷害B16癌細胞。但在用未致敏的該樹突細胞前體免疫的小鼠中看不到這樣的轉移抑制效果。
實施例3Bu-SMA結合BB10010的制法將參考例3得到的BB10010按照終濃度為2mg/ml那樣溶解于0.8M的碳酸氫鈉緩沖液(pH8.5)中。向該溶液1ml慢慢加溶解在二乙基甲酰胺的Bu-SMA 2.6mg(換成摩爾比，Bu-SMA∶BB10010＝10∶1)，于27℃反應過夜。反應結束后，用凝膠過濾層析(充填劑Bio-Gel P60、移動相20mM的碳酸氫鈉緩沖液(pH8.5)，柱尺寸1.6×83cm)對反應混合物進行分離。分離到90根試管(每管2ml)(圖8)。然后根據280nm的吸光度將洗脫到試管16～18的級分(6ml)進行冷凍干燥，獲得白色粉末狀的Bu-SMA結合BB10010(以下表示為「Bu-SMA-BB10010」)。
圖9給出了得到的Bu-SMA-BB10010和作為原料的BB10010的Native-PAGE(未變性的10-20梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳)的結果。兩者的電泳距離明顯不同。認為這是由于BB10010的賴氨酸的氨基被SMA稀釋減少了表面的正電荷，更容易向陽極一側泳動的緣故。兩者泳動距離差以及級分No.16～18的Bu-SMA-BB10010與未反應的Bu-SMA和BB10010的氨基與熒光試劑Fluorescamine(0.3mg/ml inacetone)反應，通過分光熒光計用激發波長390nm、熒光波長475nm進行測定、定量，估計1分子結合2～3個SMA。
實施例4從健康人采血80ml，與Polymorphprep(第一科學)一起以1600rpm在20℃下離心35分鐘，分離單核細胞層。為了除去淋巴細胞、中性白細胞，利用塑料吸附法。即，將單核細胞層用10％FCS的RPMI 1640調整到2×105cells/cm2，懸浮在預先用含有10％FCS的RPMI 1640(SIGMA)于37℃下包被30分鐘的細胞培養皿中，在37℃ CO2分壓下，放置1小時，使單核細胞附著在培養皿。除去培養液后，與預先加溫到37℃的含有1％FCS的RPMI 1640將培養皿清洗2次，于4℃加含有1％FCS的RPMI 1640，于冰上靜置30分鐘。然后用移液管回收單核細胞，對單核細胞懸浮液在1600rpm 4℃下進行離心分離。除去上清后，用含有1％FCS的RPMI 1640調整到1×106個/ml。將其中的50ul置于46孔趨化室(家田貿易)的上室，下室放置趨化因子，于CO2分壓下放置90分鐘。邊界的濾膜使用孔徑5um。用Diff Quick(國際試劑株式會社)I液染色10秒鐘，用II液染色10秒鐘，在顯微鏡下對染色細胞進行計數。結果，含有Bu-SMA-BB10010的級分表現出的單細胞趨化活性與其濃度有關，其活性當其濃度為未修飾BB10010的約100分之一濃度下表現出2倍以上的活性。由此可確認BB10010即使用Bu-SMA進行化學改性也保持生物活性，而且其活性比未修飾的更高。
實施例5Bu-SMA-BB10010的血中樹突細胞起因作用和BB10010的比較實驗如下進行。由BALB/c小鼠(9周令，雄Seac吉富)的尾靜脈注入200ug/200ul Bu-SMA-BB10010(級分No.16～18)，或200ug/200ul未修飾BB10010，24小時后，從腸間膜靜脈采取靜脈血。將得到的單核細胞用PBS(-)+2％FCS調整到5×105cells/50μl，將FITC標記抗CD11c抗體(FITC CONJUGATED HAMSTER ANTIMOUSE CD11cPharmingen)和PRE標記抗B220抗體(R-PE CONJUGATEI)都分別稀釋25倍、200倍，于冰上，在避光條件下反應1小時后，用FACS(BECTONDICKINSON公司生產)對表面抗原倍熒光標記的細胞數的比例進行測定，并數值化(圖10)。
結果，在單核細胞中CD11c(+)B220(-)細胞組占有的比例當對照組為2.52±0.34％時，在Bu-SMA-BB10010組為11.45±2.59％，上升到4.5倍，與未修飾BB10010注入組的6.65±0.78％比較，上升到1.7倍，用SMA修飾具有使血中穩定性增大等影響，確認對樹突細胞向血中的移動作用有增強效果。另外CD11c(+)B220(+)細胞組的比例相對于對照組1.19±0.13％，在Bu-SMA-BB10010組為5.14±2.12％，上升到4.3倍，與未修飾BB10010注入組的2.12±0.69％比較，上升到2.4倍，同樣可確認對這些細胞群向血中的移動作用有增強效果。
在肝中Kupffer cell產生MIP-1α，以及DC前體細胞表達對應于MIP-1α的受體CCR5已有報道(J.Exp.Med.，19335-49(2001))。根據這些事實，推定一旦產生炎癥，樹突細胞的前體細胞不管有無免疫應答的必要性，以與中性白細胞同樣的速度趕忙進行抗原的探查，有抗原存在時在最短時間引起免疫應答，使生物體的危險減少(醫學進展Vol.200，No.6472-476(2002))。
另外，在外周血中存在作為分化為樹突細胞的干細胞CD34+細胞，他可被MIP-1α動員也有報道。另外，已知為了在體外對CD34+細胞進行培養，使其增殖，抗原使用MIP-1α(USP5922597(1999))。
而由生物體外注入的MIP-1α對前體細胞向血中的動員有直接貢獻還不清楚，然而血中存在的樹突細胞前體的濃度水平至少以數十倍數量級上升是本發明人等初次發現。
另外，本發明對于血中水平上升的樹突細胞前體在生物體內起到充分的疫苗效果就象在實施例2中詳細敘述的那樣。
通過用兩親性高分子對MIP-1α進行化學改性，樹突細胞前體的動員活性效果顯著增加。由此預期其他的激動劑以及其生物學同等物也有同樣效果。
因此，利用本發明可以從患者采取足夠量的樹突細胞前體，可以說開拓了利用樹突細胞向免疫療法的實用化道路。
序列表<110>Effector Cell InstituteMATSUSHIMA，Kouji<120>樹突細胞前體的血中水平上升劑<130>NTK03-1564W0<140>
<141>
<150>JP2002-310090<151>2002-10-24<150>JP2003-170091<151>2003-06-13<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人類<400>1ccagcgaagc cggcaggtct gtgctgaccc ag 32<210>2<211>34<212>DNA<213>人類<400>2ctggggtcag cacagacctg ccggcttcgc ttgg34<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>結合到Brevibacillus choshinensis序列上的人類序列<400>3catgccatgg ctttcgcttc acttgctgct gacac 35<210>4<211>27<212>DNA<213>人類<400>4cgcggatcct caggcactca gctctag2權利要求
1.一種樹突細胞前體的血中水平上升劑，其以針對在未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑或其功能性衍生物作為有效成分。
2.一種樹突細胞前體的血中水平上升劑，其以針對受體CCR1或CCR5的激動劑或其功能性衍生物作為有效成分。
3.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑選自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3以及MCP-4。
4.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑選自MIP-1α、RANTES、MARC以及LCC-1(ref)。
5.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑或其功能性衍生物是MIP-1α或其功能性衍生物。
6.權利要求5所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，MIP-1α的功能性衍生物是BB-10010。
7.權利要求1所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的針對在未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑。
8.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的針對受體CCR1或CCR5的激動劑。
9.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3或MCP-4。
10.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的MIP-1α、BB-10010、RANTES、MARC或LCC-1(ref)。
11.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的MIP-1α或BB-10010。
12.權利要求2所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中，激動劑的功能性衍生物是用兩親性高分子化學改性的BB-10010。
13.權利要求7至12的任一項所述的樹突細胞前體的血中水平上升劑，其中兩親性高分子是部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物。
14.一種用兩親性高分子化學改性的針對在未成熟樹突細胞表達的受體的激動劑。
15.一種用兩親性高分子化學改性的針對受體CCR1或CCR5的激動劑。
16.權利要求15所述激動劑，其為用兩親性高分子化學改性的MIP-1α、BB-10010、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3或MCP-4。
17.權利要求15所述激動劑，其為用兩親性高分子化學改性的MIP-1α。
18.權利要求15所述激動劑，其為用兩親性高分子化學改性的BB-10010。
19.權利要求14至18任一項所述激動劑，其中，兩親性高分子是部分烷基酯化苯乙烯-馬來酸共聚物或聚乙二醇衍生物。
全文摘要
樹突細胞在治療中的應用雖然正在不斷擴大，但由于樹突細胞前體只存在于外周血中，為了獲得用于治療的量，只是在體外進行增殖是困難的。因此，謀求提高患者血中的樹突細胞前體水平成為利用樹突細胞使治療實用化方面的關鍵。本發明是一種以針對在未成熟樹突細胞中表達的受體的激動劑或其功能性衍生物作為有效成分的樹突細胞前體的血中水平上升劑。
文檔編號A61K45/00GK1705493SQ200380101870
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月21日 優先權日2002年10月24日
發明者松島綱治, 米山博之, 張雁云, 金崎士朗, 芥照夫 申請人:艾菲克特細胞研究所股份有限公司, 松島綱治