專利名稱：靈芝甾醇類提取物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有機有效成份的醫藥配制品，特別涉及一種靈芝甾醇(Sterols)類提取物及其制備方法與應用。
背景技術：
靈芝具有較強的藥用價值，傳統的服用方法為煎服或煮食，被提取的活性藥物成份較少，一般只有多糖成份被提取，即藥物活性物質的利用率低。
現有技術中也有從靈芝中分離提取藥物有效成份的作法，例如中國專利93101870.6(授權公告日1995年5月17日)就公開了一種復方靈芝營養液及其制備方法，但該專利技術只是將靈芝的粗提液作為一種組分與何首烏及絞股蘭的有效萃取物組合而成為一種藥物，用于提高免疫力及延緩衰老，該專利技術并未對靈芝的該提取成份及藥理藥效作進一步的深入研究。
從靈芝中分離提取得到的甾醇有近20余種，其中因骨架不同而分為麥角甾醇和膽甾醇兩種類型，檢索發現未見從靈芝中分離提取而獲得的甾醇類提取物的藥理活性報道及將其應用于臨床。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從靈芝中精確提取而獲得的活性物質靈芝甾醇類提取物；提供該提取物的制備方法；及該提取物在制備具有抗各種病因引起的腦缺血作用的藥物中的應用。
本發明的目的可經如下方案實現。
靈芝甾醇類提取物，其要點在于，其由靈芝提取而獲得，其主要成分為白色片狀結晶，其名稱為24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇，分子式C28H46O，其化學結構式如下 這種從靈芝中提取而獲得的物質為一種甾醇類化合物，本化合物存在28個碳，其中6個CH38個CH2，11個CH，以及3個季碳。利用一維(1H、13C、DEPT)和二維核磁共振技術[1H-1H、1H-13C相關譜，1H-13C異核多量子相關譜(HMBC)以及NOESY譜]對化合物進行了結構鑒定，確定其結構為24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇。
采用該靈芝甾醇類提取物對大鼠的腦皮層神經元缺氧再氧化損傷(簡稱H/R)進行治療，具體為采用體外原代培養SD大鼠大腦皮層細胞，通過缺氧(12h)再氧化(24h)損傷建立腦缺血再灌注體外模型，觀察發現靈芝甾醇類提取物(用量組0.01；0.1；1ug/ml)對受損細胞均有明顯保護作用。
用PI和Hoechst33258雙標的方法鑒定神經元的生命狀態，在激光共聚焦顯微鏡下觀察標記情況。PI和Hoechst33258雙染的細胞為死細胞，Hoechst33258單染為活細胞。結果可見H/R模型組細胞中PI和Hoechst33258雙染的死細胞明顯增多，而應用靈芝甾醇類提取物后可明顯增加活細胞的比例(詳見圖1)。
應用MTT法測定細胞的存活率和細胞代謝情況。結果H/R使神經元的存活率明顯下降，而靈芝甾醇類提取物對受損細胞有顯著的保護作用。
應用熒光探針DCF-DA特異性標記細胞內自由基，在激光共聚焦顯微鏡下測定細胞內自由基含量。可見H/R可顯著誘導自由基的產生，鏡下可見熒光探針強度明顯增強，靈芝甾醇類提取物治療組熒光強度則明顯降低，也就是靈芝甾醇類提取物可顯著抑制細胞內增高的自由基水平。
以裂解液制備細胞裂解物，用bradford方法鑒定蛋白含量。應用南京建成生物工程研究所生產試劑盒，比色法測定脂質過氧化產物戊二醛(MDA)水平。結果可見，靈芝甾醇類提取物也可降低受損神經元內異常升高的MDA，說明抗氧化作用可能是靈芝甾醇類提取物對神經細胞保護作用的機制之一。
同時，應用南京建成生物工程研究所生產試劑盒，我們還檢測了神經元內總超氧化物歧化酶(SOD)及Mn-SOD活性。我們發現靈芝甾醇類提取物可明顯增加神經元內SOD及Mn-SOD活性，而對Cu-ZnSOD活性并沒有明顯作用，這證明Mn-SOD可能是靈芝甾醇類提取物發揮其抗氧化作用的關鍵酶，通過增加Mn-SOD的活性而增強神經細胞的抗氧化能力(詳見圖2)。
用抗p65單克隆抗體標記細胞內核轉錄因子NF-κB，用免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下對NF-κB進行定位觀察。可見在正常情況下NF-κB基本定位于細胞漿內，而在缺氧12小時復氧45分鐘時，NF-κB則大量向細胞核內轉位，應用靈芝甾醇類提取物則明顯拮抗了NF-κB的活化及核轉位。
制備細胞裂解液，用Western blot的方法檢測NF-κB特異性抑制物I-κB的表達水平。特異性一抗應用濃度為1∶100，二抗應用濃度用1∶1000。實驗發現H(12h)/R(45min)可增加I-κB的降解，而靈芝甾醇類提取物可抑制此變化。因此我們認為靈芝甾醇類提取物通過抑制I-κB的降解進而抑制了NF-κB的活化和核轉位。
制備細胞裂解液，并應用ELISA試劑盒，按照試劑盒說明方法檢測炎性細胞因子TNFα和IL-1β在細胞內的表達水平，發現H/R可顯著升高TNFα和IL-1β的水平，而靈芝甾醇類提取物可抑制此變化。
因為NF-κB是多種細胞因子表達的關鍵調控因子，所以我們推測靈芝甾醇類提取物可能通過抑制NF-κB的活化而影響TNFα和IL-1β的表達，從而抑制了炎性細胞因子對神經元的免疫損傷。又因為有實驗證明SOD可抑制NF-κB的活化，所以我們推測Mn-SOD可能是靈芝甾醇類提取物對H/R損傷細胞發揮保護作用的關鍵作用位點，進而從抗氧化和抗免疫兩個機制對抗H/R損傷。
醫學上稱腦缺氧是因為腦供血不足而引起的，因而本靈芝甾醇類提取物對大腦皮層神經元缺氧具有保護作用，故而同樣對腦缺血具有保護作用。
一系列的研究均表明，發明人從靈芝中提取的新的甾醇類提取物對治療由各種病因引起的腦缺血(特別是對大腦皮層神經元缺氧)具有突出的有益效果，而且因其具有的準確的分子結構式使其治病作用機理較為明確，藥理作用突出，藥物活性物質的利用率高。
靈芝甾醇類提取物，其要點在于，還包括次要成分白色結晶膽甾-5，7-二烯-3β醇，其化學結構式如下 該化合物同樣是通過一維(1H、13C、DEPT)和二維核磁共振技術[1H-1H、1H-13C相關譜，1H-13C異核多量子相關譜(HMBC)以及NOESY譜]對提取物進行鑒定而獲得。
本發明的另一目的提供一種靈芝甾醇類提取物的制備方法，其要點在于，包括如下依序進行的步驟(1)提供一種靈芝作為原料母體；(2)破碎該原料母體而得破碎物；(3)用乙醇對破碎物進行回流提取4～10h、離心而得提取液；(4)將提取液濃縮至濃縮液中含生藥量0.5～1.5g/ml，靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗提物；(5)將粗提物用熱乙醇溶解，提取溶解液并靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗結晶；(6)將粗結晶用乙醇稀堿溶液處理16～48小時，收集不溶物，(7)將不溶物用濃堿溶液堿化24h，過濾，收集濾液；(8)用等量乙醚對濾液進行萃取并收集乙醚層；(9)將乙醚層用水洗至中性，進行干燥，待乙醚揮發完全后所得固體物即為靈芝甾醇類提取物。
對工藝步驟可作如下解釋作為原料母體的靈芝可以是袋料栽培而獲得的靈芝子實體，也可以是段木栽培的靈芝的子實體，甚至還可以是經微生物發酵而獲得靈芝菌絲體。
采用常用破碎裝置對靈芝原料母體進行破碎，破碎后的靈芝狀態可以為片狀或煙絲狀，只要滿足可以獲得細胞壁已被粉碎的母體即可。
因為欲提取的靈芝甾醇類化合物溶于乙醇，所以采用乙醇對破碎物進行回流提取，并通過離心去渣而獲得純清的提取液。回流提取的時間越長，提取率越高，但耗時長，成本高，經驗表明采用乙醇回流提取甾醇化合物的最佳時間為5～6小時。而乙醇與破碎物的重量比可為10∶1。
對提取液進行濃縮獲取藥物活性成份濃度較高的濃縮液，同時也回收乙醇，因為乙醇易揮發，因而通常采用加熱蒸發方式回收乙醇。濃縮液中含生藥量的濃度會對接下來的純化工藝產生一定的影響，但對整個提取工藝的效果不會產生太大的影響，因而只需合理控制便可，但盡量控制在濃度為1g/ml最佳。因為低溫下甾醇類化合物會結晶析出，因而采用靜置10小時以上(或稱靜置過夜)，溫度4～5℃，即可收集到較為粗糙的甾醇類提取物的粗提物，收集的方式可以為離心過濾。
將粗提物用熱乙醇溶解，進行甾醇類提取物的純化，乙醇的溫度可以控制為高于常溫但不高于乙醇的揮發溫度，具體的溫度設定本技術領域技術人員可根據當地實際氣溫及所掌握的知識進行準確的設置，放棄乙醇不溶物，而收集熱乙醇溶解物的溶解液并靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集進一步純化的粗結晶。
將粗結晶用乙醇稀堿溶液處理16～48小時，收集不溶于該乙醇稀堿溶液的中性物質甾醇類提取物而去除不需要的酸性物質。
將不溶物用濃堿溶液堿化24h，過濾，此時所需的甾醇類提取物已溶于該濃堿溶液，收集濾液。該處的堿溶液可以為12％KOH。
采用常用萃取設備對濾液進行萃取，萃取劑為與濾液等量的乙醚，待混合液分層，收集溶有甾醇類化合物的乙醚層。
對乙醚層進行干燥，去除乙醚，所得固體物即為靈芝甾醇類提取物。
所獲得的靈芝甾醇類提取物包含有多種成份，其中包含有主要成份24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份膽甾-5，7-二烯-3β醇。該甾醇提取物的藥用效果所前如述。
上述工藝中用以溶解甾醇類化合物的乙醇的濃度可以采用現有技術中的常用濃度，例如可以采用95％的乙醇。當然，在實際操作中乙醇或用氯仿，或用甲醇，或用苯等有機溶劑代替。
本發明進一步還在于對提取液進行濃縮的步驟為(1)提供一種旋轉蒸發儀，(2)將提取液導入旋轉蒸發儀中，轉速98r/min，(3)直至濃縮液含生藥量0.5～1.5g/ml，靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗提物。
而對將粗提物用熱乙醇溶解的步驟還可以細化為(1)用熱乙醇溶解粗提物，(2)分別收集溶解液及不溶物，(3)將不溶物用熱乙醇溶解，(4)重復(2)～(3)步驟多次，(5)收集所有溶解液并靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗結晶。
上述步驟可以增加甾醇類化合物的提取率，避免了藥物活性物質的浪費。
乙醇稀堿溶液的提供可以為在乙醇溶液中加入1％KOH或NaOH溶液。
對乙醚層干燥的具體步驟可以為(1)將乙醚層用水洗至中性，(2)用無水Na2SO4將水份吸干并使乙醚揮發完全后得固體物。
下面對所獲得的靈芝甾醇類提取物進一步純化，以獲得更為精確的物質。
具體步驟如下(1)提供一種層析柱，固定相硅膠，流動相石油醚與乙酸乙酯混合液，(2)先用石油醚將硅膠填入層析柱，(3)將溶解液加少量硅膠混合，常溫去除溶劑而得固體物，(4)將固體物裝入層析柱頂，滴加石油醚與乙酸乙酯混合液梯度洗脫而使各組份分離，(5)用自動分段收集器分段收集分離液，(6)對各種分離液進行薄層分析、跟蹤檢測，合并同類，所用展開劑石油醚與乙酸乙酯的重量比為7∶3，顯色劑1％香蘭醛-硫酸；(7)對同類分離液進行濃縮；(8)提供一種乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液；(9)在濃縮液中加入等量混合液，靜置，收集析出的白色片狀結晶分別為主要成份靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份膽甾-5，7-二烯-3β醇。
采用層析柱對溶解液進行分離溶解液中的不同化合物，自動分段收集器分段收集該不同的化合物且分別濃縮。層析柱可以分離性質極近似的物質，早在幾十年前就已廣泛應用于化學、化工、生化等領域。
柱層析分析時，固定相為表面具有一定活性的吸附劑，而流動相的作用是對試樣(固體物)進行洗脫分離。
該分離方式是基于固體吸附劑(固定相)對固體物中各組分的吸附能力的不同而進行的。
其分離過程是這樣的流動相將固體物攜帶進入層析柱，與固定相接觸時，固體物很快被固定相溶解或吸附，隨著流動相的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中洗脫下來，洗脫下來的組分隨著流動相的向前移動時又再次被固定相溶解或吸附。隨著流動相的不斷涌入，溶解-洗脫的過程反復進行。顯然，因為組分性質的差異，固定相對它們的溶解或吸附的能力不同，在層析柱內停留的時間也不同，因而，經過一定的時間間隔(一定柱長)后性質不同的組分24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和膽甾-5，7-二烯-3β醇或其它成分便彼此分離。
自動分段收集器的收集口與層析柱分離液出口連接。
提供一種乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液，在濃縮液中加入等量混合液使濃縮液中的甾醇類提純物重結晶，靜置一段時間后，收集析出的白色片狀結晶即為靈芝甾醇類提純物。
本發明的目的之一提供甾醇類提取物在制備具有抗各種病因引起的腦缺血作用，特別是具有抗大腦皮層神經元缺氧作用的藥物可通過如下方式實現。
具有抗腦缺血作用的藥物，其包含有效劑量的靈芝甾醇類提取物。
本發明還在于，該藥物中包含有效劑量的靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇。
本發明進-步還在于，該藥物中包含有效劑量的靈芝甾醇類提純物膽甾-5，7-二烯-3β醇。
或該藥物同時包含有效劑量的靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和膽甾-5，7-二烯-3β醇的混合物。
靈芝甾醇類提取物、靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇及膽甾-5，7-二烯-3β醇對各種病因引起的腦缺血的治療效果同上文及下述具體實施方式
中的實施例3。而至于有效劑量的定義則依據現有醫藥領域中根據實驗藥量而轉換獲得的用藥量而定。
而該藥物的劑型可以是現有技術中的常用的，例針劑，片劑，口服液等等。
綜上所述，本發明較之現有技術具有如下優點本發明從靈芝中提取的新的甾醇類化合物對各種病因引起的腦缺血具有突出的療效，而且因其具有的準確的分子結構式使其治病作用機理較為明確，藥效突出，藥物活性物質的利用率高。
圖1為靈芝甾醇類提取物(1μg/ml)對H/R損傷的皮層神經元的保護作用。應用熒光探針Hoechst dye 33258和PI雙標技術區別培養體系內的活細胞與死細胞，其中Hoechst dye 33258(藍色)標記所有活細胞胞核，PI(紅色)標記死細胞胞核。
a.正常對照組細胞b.H(12h)/R(24h)損傷細胞c.GS(1μg/ml)處理細胞圖2為靈芝甾醇類提取物對H/R損傷的神經元內總SOD、Mn-SOD及Cu-Zn SOD活性的影響。數據代表平均值±標準差。*P＜0.05，**P＜0.01與H/R模型組對照。
圖3采用MTT法檢測甾醇提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇對H/R損傷皮層細胞的保護作用，數據代表平均值±標準差。**P＜0.01與H/R模型組對照。
圖4為靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇(1μg/ml)對H/R損傷的皮層神經元的保護作用。
A.正常對照組細胞B.H(12h)/R(24h)損傷細胞C.GSP(1μg/ml)處理細胞具體實施方式
下面結合附圖對本發明進行更詳細的描述。
實施例1靈芝甾醇類提取物的制備方法，包括如下依序進行的步驟1、提供袋料栽培靈芝子實體作為原料母體，并將原料母體清洗、干燥；2、采用破碎機將該原料母體進行破碎而得破碎物；3、用95％乙醇對破碎物進行回流提取5～6h，乙醇與破碎物的重量比為10∶1，3000r/min15分鐘離心，棄渣而得提取液；4、對提取液進行濃縮，步驟為(1)提供一種薄膜旋轉蒸發儀，(2)將提取液導入薄膜旋轉蒸發儀中，轉速98r/min，(3)直至濃縮液含生藥量約1g/ml，靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗提物。
5、將粗提物作如下處理(1)用95％熱乙醇溶解粗提物，(2)分別收集溶解液及不溶物，(3)將不溶物用95％熱乙醇溶解，(4)重復(2)～(3)步驟多次，(5)棄乙醇熱不溶物，收集所有溶解液并靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗結晶。
6、將粗結晶用1％KOH乙醇溶液處理16～24小時，收集不溶物，7、將不溶物用12％KOH堿溶液堿化24h，過濾，收集濾液；8、用與濾液等量的乙醚對濾液進行萃取并收集乙醚層；9、將乙醚層用水洗至中性，用無水Na2SO4將水份吸干并使乙醚揮發完全后得固體物靈芝甾類提取物。
將靈芝甾醇類提取物進一步純化，以獲得更為精確的物質。
具體步驟如下(1)提供一種層析柱，固定相硅膠，流動相石油醚與乙酸乙酯混合液，(2)先用石油醚將硅膠填入層析柱，(3)將溶解液加少量硅膠混合，常溫去除溶劑而得固體物，(4)將固體物裝入層析柱頂，滴加石油醚與乙酸乙酯混合液梯度洗脫而使各組份分離，(5)用自動分段收集器分段收集分離液，(6)對各種分離液進行薄層分析、跟蹤檢測，合并同類，所用展開劑石油醚與乙酸乙酯的重量比為7∶3，顯色劑1％香蘭醛-硫酸；(7)對同類分離液進行濃縮；
(8)提供一種乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液；(9)在濃縮液中加入等量混合液，靜置，收集析出的白色片狀結晶分別為主要成份靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份為膽甾-5，7-二烯-3β醇。
實施例2提供實施例1獲得的比例最多的甾醇類提純物，即主要成份進行如下實驗實驗條件化合物約20mg溶解于氘代氯仿中，然后裝入5mm核磁管中，在Bruker DRX-400型超導核磁共振譜儀進行氯仿一維和二維核磁共振譜的檢測，測試溫度為298k，TMS作為氫譜和碳譜的化學位移內標。
實驗結果由13CNMR和DEPT譜可以確定分子中存在28個碳，其中6個CH3，8個CH2，11個CH，以及3個季碳。利用一維(1H、13C、DEPT)和二維核磁共振技術1H-1H、1H-13C相關譜，1H-13C異核多量子相關譜(HMBC)以及NOESY譜可以確定化合物X的氫原子和碳原子的化學位移(見表1和表2)表1化合物的1H NMR數據
表2化合物的13C NMR數據
該主要化合物的結構式為
同理獲得該靈芝甾醇類提取物的次要成份為及膽甾-5，7-二烯-3β醇，其結構式為
實施例3靈芝甾醇類提取物及其提純物對大鼠大腦皮層神經元缺氧再氧化損傷的保護作用觀察靈芝甾醇類提取物(Ganoderma Sterols，GS)及其提純物(即主要成分24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇，purification ofGanoderma Sterols，GSP)對大鼠大腦皮層神經元缺氧再氧化損傷(H/R)的保護作用，為將靈芝甾醇提取物應用于腦缺血再灌注的預防保護提供實驗依據。
(一)靈芝甾醇類提取物(GS)對大鼠大腦皮層神經元缺氧再氧化損傷的保護作用首先我們研究了靈芝甾醇類提取物(GS)對腦缺血再灌注體外模型的保護作用，并對其機制進行了初步探討。
體外原代培養SD大鼠大腦皮層細胞，通過缺氧(12h)再氧化(24h)損傷建立腦缺血再灌注體外模型。培養器皿預先用12mg/l多聚賴氨酸處理，自然晾干備用。取出生1天的SD大鼠，無菌分離乳鼠大腦皮層，0.25％胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，用含10％胎牛血清、10％馬血清的DMEM稀釋，以1×106/ml細胞密度接種于培養器皿中，置于孵育箱(CO2濃度為5％)，于37℃孵育。體外培養72小時加10μmol/L阿糖胞苷抑制非神經元的生長。以烯醇化酶(NSE)作為神經元特異性標志物檢驗神經元的純度，結果證明在我們的培養體系中，神經元所占比例為83-92％。
神經元體外培養8天后除去原DMEM培養液，換以低糖、無血清培養液，放入37℃，5％CO2，95％N2的缺氧罐中，于缺氧12h后即刻將細胞移至37℃，5％CO2，95％空氣孵箱中復氧24h，取出進行實驗。
用PI和Hoechst33258雙標的方法鑒定神經元的生命狀態，在激光共聚焦顯微鏡下觀察標記情況。PI和Hoechst33258雙染的細胞為死細胞，Hoechst33258單染為活細胞。結果可見H/R模型組細胞中PI和Hoechst33258雙染的死細胞明顯增多，而應用GS后可明顯增加活細胞的比例(詳見圖1)。
應用MTT法測定細胞的存活率和細胞代謝情況。于終止培養前4h向96孔板的每孔中加入MTT(終濃度為0.5mg/m1)，培養4h后吸出培養液，每孔加100μl二甲基亞楓(DMSO)，使結晶充分溶解，分光光度儀上讀取波長570nm的A值。結果H/R使神經元的存活率明顯下降，而GS對受損細胞有顯著的保護作用。
應用熒光探針DCF-DA特異性標記細胞內自由基，在細胞中DCF-DA被H2O2氧化為二氯熒光黃(DCF)，DCF產生綠色熒光，通過測定細胞內DCF的熒光強度，即可相對定量細胞內H2O2水平。DCF-DA(10μmol/L)與細胞在37℃條件下反應30分鐘，在激光共聚焦顯微鏡下測定細胞內自由基含量。可見H/R可顯著誘導自由基的產生，鏡下可見熒光探針強度明顯增強，GS治療組熒光強度則明顯降低，也就是GS可顯著抑制細胞內增高的自由基水平。
以裂解液制備細胞裂解物，用bradford方法鑒定蛋白含量。應用南京建成生物工程研究所生產試劑盒，比色法測定脂質過氧化產物戊二醛(MDA)水平。結果可見，GS也可降低受損神經元內異常升高的MDA，說明抗氧化作用可能是GS對神經細胞保護作用的機制之一。
同時，應用南京建成生物工程研究所生產試劑盒，我們還檢測了神經元內總超氧化物歧化酶(SOD)及Mn-SOD活性。我們發現GS可明顯增加神經元內SOD及Mn-SOD活性，而對Cu-Zn SOD活性并沒有明顯作用，這證明Mn-SOD可能是GS發揮其抗氧化作用的關鍵酶，通過增加Mn-SOD的活性而增強神經細胞的抗氧化能力(詳見圖2)。
用抗p65單克隆抗體標記細胞內核轉錄因子NF-κB，用免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下對NF-κB進行定位觀察。可見在正常情況下NF-κB基本定位于細胞漿內，而在缺氧12小時復氧45分鐘時，NF-κB則大量向細胞核內轉位，應用GS則明顯拮抗了NF-κB的活化及核轉位。
制備細胞裂解液，用Western blot的方法檢測NF-κB特異性抑制物I-κB的表達水平。特異性一抗應用濃度為1∶100，二抗應用濃度用1∶1000。實驗發現H(12h)/R(45min)可增加I-κB的降解，而GS可抑制此變化。因此我們認為GS通過抑制I-κB的降解進而抑制了NF-κB的活化和核轉位。
制備細胞裂解液，并應用ELISA試劑盒，按照試劑盒說明方法檢測炎性細胞因子TNFα和IL-1β在細胞內的表達水平，發現H/R可顯著升高TNFα和IL-1β的水平，而GS可抑制此變化。
因為NF-κB是多種細胞因子表達的關鍵調控因子，所以我們推測GS可能通過抑制NF-κB的活化而影響TNFα和IL-1β的表達，從而抑制了炎性細胞因子對神經元的免疫損傷。又因為有實驗證明SOD可抑制NF-κB的活化，所以我們推測Mn-SOD可能是GS對H/R損傷細胞發揮保護作用的關鍵作用位點，進而從抗氧化和抗免疫兩個機制對抗H/R損傷。
(二)靈芝甾醇提純物(24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇，GSP)對大鼠大腦皮層神經元缺氧再氧化損傷的保護作用采用進一步純化的甾醇類提純物(24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇，GSP)代替上述(一)實驗中的靈芝甾醇提取物進行試驗，得出如下結果。
應用H/R損傷建立的腦缺血再灌注體外模型，我們對此提純物的藥效學及藥理學進行了初步探討。
應用MTT法測定細胞的存活率和細胞代謝情況(詳見圖3)，可以發現GSP對受損細胞有明顯保護作用，可明顯增加神經元的存活率(詳見圖4)。應用熒光探針DCF-DA特異性標記細胞內自由基，在激光共聚焦顯微鏡下測定細胞內自由基含量，可見GSP可顯著抑制H/R模型組細胞內增高的自由基水平，證明抗氧化作用可能是GSP對神經細胞保護作用的機制之一。
我們發現與相同質量的GS相比，GSP對神經元的保護作用及抑制自由基產生作用均具有更加顯著的效果。說明從GS中純化GSP的方法有效地保護了其中具有神經保護作用的成分，并可以因此減少用藥劑量和可能的副作用。
權利要求
1.靈芝甾醇類提取物，其特征在于，其由靈芝提取而獲得，其主要成分為白色片狀結晶24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇，分子式C28H46O，其化學結構式如下
2.根據權利要求1所述的靈芝甾醇類提取物，其特征在于，還包括次要成分白色結晶膽甾-5，7-二烯-3β醇，其化學結構式如下
3.靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，包括如下依序進行的步驟(1) 提供一種靈芝作為原料母體；(2) 破碎該原料母體而得破碎物；(3) 用乙醇對破碎物進行回流提取4～10h、離心而得提取液；(4) 將提取液濃縮至濃縮液中含生藥量0.5～1.5g/ml，靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗提物；(5) 將粗提物用熱乙醇溶解，提取溶解液并靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗結晶；(6) 將粗結晶用乙醇稀堿溶液處理16～48小時，收集不溶物，(7) 將不溶物用濃堿溶液堿化24h，過濾，收集濾液；(8) 用等量乙醚對濾液進行萃取并收集乙醚層；(9) 將乙醚層用水洗至中性，進行干燥，待乙醚揮發完全后所得固體物即為甾醇類提取物。
4.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，乙醇對破碎物進行回流提取甾醇化合物的最佳時間為5～6小時。
5.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，乙醇與破碎物的重量比為10∶1。
6.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，乙醇堿性溶液的提供為在乙醇溶液中加入1％KOH或NaOH溶液。
7.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，堿溶液可以為12％KOH。
8.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，乙醇或用氯仿，或用甲醇，或用苯等有機溶劑代替。
9.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，對提取液進行濃縮的步驟為(1)提供一種旋轉蒸發儀，(2)將提取液導入旋轉蒸發儀中，轉速98r/min，(3)直至濃縮液含生藥量0.5～1.5g/ml，靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗提物。
10.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，將粗提物用熱乙醇溶解的步驟細化為(1) 用熱乙醇溶解粗提物，(2) 分別收集溶解液及不溶物，(3) 將不溶物用熱乙醇溶解，(4) 重復(2)～(3)步驟多次，(5) 收集所有溶解液并靜置10小時以上，溫度4～5℃，收集粗結晶。
11.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，對乙醚層干燥的具體步驟為(1) 將乙醚層用水洗至中性，(2)用無水Na2SO4將水份吸干并使乙醚揮發完全后得固體物。
12.根據權利要求3所述的靈芝甾醇類提取物的制備方法，其特征在于，分離甾醇類提取物的不同成份的具體步驟如下(1)提供一種層析柱，固定相硅膠，流動相石油醚與乙酸乙酯混合液，(2)先用石油醚將硅膠填入層析柱，(3)將溶解液加少量硅膠混合，常溫去除溶劑而得固體物，(4)將固體物裝入色層析頂，滴加石油醚與乙酸乙酯混合液梯度洗脫而使各組份分離，(5)用自動分段收集器分段收集分離液，(6)對各種分離液進行薄層分析、跟蹤檢測，合并同類，所用展開劑石油醚與乙酸乙酯的重量比為7∶3，顯色劑1％香蘭醛-硫酸；(7)對同類分離液進行濃縮。(8)提供一種乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液；(9)在濃縮液中加入等量混合液，靜置，收集析出的白色片狀結晶分別為主要成份靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份膽甾-5，7-二烯-3β醇。
13.具有抗腦缺血作用的藥物，其特征在于，其包含有效劑量的靈芝甾醇類提取物。
14.根據權利要求13所述的具有抗腦缺血作用的藥物，其特征在于，其包含有效劑量的靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇。
15.根據權利要求13所述的具有抗腦缺血作用的藥物，其特征在于，其包含有效劑量的靈芝甾醇類提純物膽甾-5，7-二烯-3β醇。
16.根據權利要求13所述的具有抗腦缺血作用的藥物，其特征在于，其包含有效劑量的靈芝甾醇類提純物24-甲基-膽甾-5，22-二烯-3β醇和膽甾-5，7-二烯-3β醇的混合物。
全文摘要
本發明涉及一種含有機有效成份的醫藥配制品，特別涉及一種靈芝甾醇(Sterols)類提取物，其由靈芝提取而獲得，其主要成分為白色片狀結晶，其名稱為24－甲基－膽甾－5，22－二烯－3β醇，分子式C
文檔編號A61P9/10GK1629179SQ20031011284
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月30日 優先權日2003年12月30日
發明者林志彬, 王賽貞, 呂松濤, 林樹錢, 趙洪波 申請人:福州綠谷生物藥業技術研究所, 林志彬, 王賽貞, 呂松濤, 林樹錢, 趙洪波