專利名稱：石蒜堿用途和總堿提取物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體地涉及石蒜的提取物及其用途。本發(fā)明還涉及含石蒜提取物的組合物。
背景技術(shù)：
石蒜(Bulbus Lycoridis Radiatae)別名老鴉蒜、蒜頭草、蟑螂花，來(lái)源為石蒜科植物石蒜Lycoris radiata(L’Herit.)Herb.的鱗莖。其生于陰濕山地或叢林下，也有栽培。產(chǎn)華東、中南及西南。化學(xué)成分含石蒜堿(lycorine)、加蘭他敏(galanthamine)、石蒜胺堿(lycora-mine)等。性溫，味辛、甘。主治消腫，解毒，催吐。用于疔瘡腫毒、食物中毒、痰涎壅塞、黃疸、水腫腹水。目前對(duì)其成分主要集中在皂甙的研究和弱酸弱堿提取，也未見(jiàn)其對(duì)抗病毒的研究效果。
2003年我國(guó)和世界上許多國(guó)家遭到了一次大規(guī)模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵襲，由非典型肺炎引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已經(jīng)在22個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生。世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization，WHO)在疫情發(fā)生后迅速建立起由全球10個(gè)國(guó)家的13個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的協(xié)作研究和監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。4月16日，WHO正式確認(rèn)SARS的病原體是一種新型冠狀病毒，這是一種單鏈RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些發(fā)病區(qū)其死亡率達(dá)到15％，給人民群眾帶來(lái)了極大的恐慌。
對(duì)于石蒜的有效部位進(jìn)行了很多研究，其中一種具有下式
分子式C16H17NO4。具有CAS號(hào)476-28-8。該石蒜堿在很多文獻(xiàn)中有提到，例如江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典.(上冊(cè)).第1版.上?？茖W(xué)出版社，1977590；Haffman DG等，Biochem Pharmacol，1966，15(3)391；陳牧群，等.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1965，12(9)594；和Leven M等J Nat Prol，1982，45(5)564。但其抗SARS效果并沒(méi)有報(bào)道。
雖然已經(jīng)公布了許多據(jù)稱有抗SARS作用的中藥制劑和配方，但是，仍然缺乏對(duì)于SARS病毒有針對(duì)作用的配方和藥物。本領(lǐng)域仍然迫切需要開(kāi)發(fā)具有抗SARS病毒活性的中藥提取物。
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供石蒜堿的用途，它可用于制備抗SARS病毒的藥物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供石蒜總堿提取物，它含有石蒜堿，能夠有效抗SARS病毒。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供一種制備石蒜總堿提取物的方法。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供含石蒜總堿提取物的組合物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供石蒜堿在制備抗SARS病毒的藥物中的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種石蒜總堿提取物，該提取物含有石蒜總堿50-99％重量。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，石蒜總堿含50-90％重量的石蒜堿。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了上述石蒜總堿提取物在制備抗SARS病毒的藥物中的用途。
本發(fā)明的還有一個(gè)方面提供了制備上述石蒜總堿提取物的方法，包括步驟(a)用50-90v％的氯仿水溶液或氯仿回流提取石蒜藥材1-8個(gè)小時(shí)，獲得提取液；(b)過(guò)濾得到固體；(c)用無(wú)水乙醇或50-90v％的乙醇溶液，回流提取1-8個(gè)小時(shí)，得到藥液；(d)水浴蒸干所述藥液，然后在50-100℃烘干，獲得固態(tài)的石蒜提取物；(e)將石蒜提取物溶于酸溶液；(f)中和溶液，至pH為8-11；(g)用極性有機(jī)溶劑提取，得到溶解于有機(jī)相的石蒜總堿提取物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法還包括(h)干燥，得到粉末狀總堿提取物。
在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(c)中優(yōu)選用無(wú)水乙醇或70％以上的乙醇，最優(yōu)選為無(wú)水乙醇；提取2-6個(gè)小時(shí)，最優(yōu)選為4小時(shí)。
在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施例中，極性有機(jī)溶劑優(yōu)選是氯仿。
在本發(fā)明該方面的還有一個(gè)實(shí)施例中，酸溶液優(yōu)選是0.01N-0.1N的鹽酸溶液。
本發(fā)明還提供了一種石蒜提取物，該提取物含石蒜總堿50-99％重量；其中所述石蒜總堿含石蒜堿50-99％重量。
本發(fā)明的還有一個(gè)方面提供了一種抗SARS病毒的藥物組合物，它含有1-99wt％上述石蒜總堿提取物和1-99wt％藥學(xué)上可接受的載體。
圖1A-C顯示了施用本發(fā)明的石蒜提取物后VERO細(xì)胞的顯微鏡觀察結(jié)果。
圖2顯示了石蒜提取物對(duì)SARS病毒細(xì)胞病變作用的抑制作用劑量曲線。
圖3顯示了石蒜提取物藥物濃度毒性曲線。
圖4顯示了石蒜總堿的HPLC色譜圖。
圖5A-B顯示了石蒜堿和峰2的HPLC圖譜。
圖6A-6F顯示了石蒜堿對(duì)SARS病毒感染VERO細(xì)胞病變的影響。
圖7顯示了石蒜堿對(duì)SARS病毒細(xì)胞病變效果的抑制作用劑量曲線。
圖8顯示了石蒜堿藥物濃度毒性曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，石蒜中的石蒜堿單體是其主要的抗SARS有效成分，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了有效提取石蒜堿的方法，從而完成了本發(fā)明。
石蒜是常規(guī)的中藥材，可將其鱗莖曬干或研磨成粗粉使用。該藥材可從各石蒜產(chǎn)地或中藥商店購(gòu)得，例如安徽安國(guó)藥材市場(chǎng)等。
經(jīng)過(guò)藥物篩選和體外細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)，可知石蒜堿具有抗SARS病毒活性。以VERO細(xì)胞作為宿主檢測(cè)石蒜堿抵抗SARS病毒細(xì)胞病變的效果，發(fā)現(xiàn)加入石蒜堿后能在0.3×10-4mg/ml以上的濃度下，對(duì)SARS病毒對(duì)VERO細(xì)胞的攻擊有明顯抑制作用。此外，其EC50小，僅1.846×10-5mg/ml，半數(shù)有效濃度較低，而經(jīng)過(guò)毒性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其在低于0.3×10-2mg/ml的情況下都無(wú)毒性，因此可安全使用。
本發(fā)明中的“石蒜提取物”指步驟(d)中獲得的石蒜粗提物，其含有未經(jīng)提取的總堿。該步驟也可以省去，直接將步驟(c)得到的藥液濃縮后與酸混合，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般實(shí)驗(yàn)操作。
用本發(fā)明的石蒜總堿提取方法，得到的提取物中含石蒜總堿50％以上，其中石蒜堿含量為6.8％以上(重量)。
在本發(fā)明方法的步驟(c)得到的石蒜提取物中，含石蒜提取物50％以上，較佳為60-90％，石蒜堿得率為4.4％以上(基于藥材總重量)。
可用分光光度計(jì)通過(guò)紫外分光光度法或比色法在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)石蒜堿的濃度。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常用方法。
本發(fā)明的分離方法由于操作步驟簡(jiǎn)單，沒(méi)有制備TLC，電泳等昂貴步驟，可用于大批量工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明的提取物、總堿提取物和石蒜堿可直接使用，或與藥物學(xué)上可接受的載體和添加劑一起，制成藥物組合物。例如添加甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑，制備口服給藥的片劑、錠劑、水或油懸液、可分散性粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。片劑含有與適用于制造片劑的無(wú)毒的可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑及崩解劑，例如褐藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可無(wú)糖衣或用已知技術(shù)包衣，來(lái)延遲在胃腸道內(nèi)的解體和吸收，從而在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，可施用延時(shí)物質(zhì)，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯?？诜褂玫闹苿┻€可制成硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固態(tài)稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或制成軟明膠膠囊，其中活性成分和水或油性介質(zhì)，例如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油混合。
本發(fā)明的藥物組合物還可含有其他抗SARS成分，例如目前可得的抗SARS藥物等或其它中藥制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以用各種途徑施用，例如口服、注射、透皮吸收，優(yōu)選是口服或靜脈滴注。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1石蒜提取物的提取和檢測(cè)1.材料和儀器材料于2001年11月購(gòu)于安徽安國(guó)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)閻玉凝教授鑒定并編號(hào)入庫(kù)。
儀器索式提取器(中式普通型)；粉碎機(jī)(北京光明儀器廠FZ-102)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝儀器公司)；四孔水浴鍋(北京儀器廠)；無(wú)水乙醇(分析純，化學(xué)試劑廠)；氯仿(分析純，北京化學(xué)試劑廠)；電子天平(精確0.1g，北京醫(yī)用天平廠DT-500)；實(shí)驗(yàn)濾紙。
2.步驟取143g石蒜藥材，用粉碎機(jī)粉碎，裝入紙筒。
將索式提取器中平底燒瓶裝入800ml的氯仿，將準(zhǔn)備好的石蒜藥材放入索氏提取器中，上面裝上冷凝管，下面裝上平底燒瓶，置于電熱套上。整個(gè)提取裝置用鐵架臺(tái)固定。
電熱套加熱大約在50℃，讓氯仿回流提取石蒜粉末大約4h。提取結(jié)束后將紙筒取出，通風(fēng)櫥晾干，備無(wú)水乙醇提取用。
取另一個(gè)平底燒瓶，裝上大約800ml的無(wú)水乙醇，將裝有氯仿提取后濾渣的紙筒放入索式提取器中。電熱套加熱大約在50℃，回流提取大約4h。
留在平底燒瓶的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，除掉約90％溶劑后，倒入小的瓷玻璃中，水浴鍋低溫慢慢蒸發(fā)至干。可得到石蒜的提取物約6.3g。
所得到的提取物6.3g放在同位素瓶(15ml)中，并放置在-20℃保存。
經(jīng)檢測(cè)，主要有效部位石蒜提取物的石蒜堿得率為4.0％重量(相對(duì)藥材投入量)。
實(shí)施例2石蒜提取物抗SARS活性試驗(yàn)材料和方法受試藥物實(shí)施例1所制得的石蒜提取物。
細(xì)胞非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(Vero)。
病毒SARS病毒北京一號(hào)(BJ-01)。
試劑DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品)，鏈霉素，L-谷氨酰胺(美國(guó)Invitrogen公司)，新生胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，Hepes，MTS(美國(guó)Promega公司)，PMS，青霉素(Sigma公司)，碳酸氫鈉(購(gòu)自京科化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝)。
細(xì)胞培養(yǎng)液及試劑配制DMEM培養(yǎng)液含10％新生胎牛血清、3％L-谷氨酰胺、1％青霉素、鏈霉素、7.5％碳酸氫鈉，10mM Hepes；MTS/PMS染色液按Promega公司的操作指南配制。
MTS甲臢化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(鎓)PMS吩嗪硫酸二甲酯試驗(yàn)方法藥物對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)按4,000細(xì)胞/孔密度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入培養(yǎng)液100ul，37℃，5％CO2孵育細(xì)胞24小時(shí)后加入受試藥物。石蒜提取物以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后最終濃度分別為2、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.0003mg/ml，共9個(gè)濃度。每個(gè)濃度加2孔。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。37℃5％CO2孵育細(xì)胞96小時(shí)后，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小時(shí)，然后加50ul 10％SDS終止反應(yīng)，紫外分光光度儀檢測(cè)O.D(490nm)值，以樣品讀數(shù)不小于細(xì)胞對(duì)照的90％作為無(wú)毒性指標(biāo)。
藥物對(duì)SARS病毒感染VERO細(xì)胞病變(CPE)的影響按4,000細(xì)胞/孔密度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液100ul，37℃5％CO2孵育24小時(shí)，細(xì)胞融合成單層后加入受試藥物，藥物終濃度0.3、0.1、0.05、0.03、0.02、0.01、0.003、0.0001、0.0001、0.00001mg/ml的濃度梯度加入，共10個(gè)濃度，每個(gè)濃度加2孔，隨后每孔加入2ul SARS-BJ-01病毒。設(shè)置無(wú)細(xì)胞對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃，5％CO2培養(yǎng)96小時(shí)。期間，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，96小時(shí)后以MTS法檢測(cè)(方法見(jiàn)Promega公司的操作指南)細(xì)胞存活狀況。
結(jié)果石蒜提取物對(duì)SARS病毒的作用我們以VERO細(xì)胞作為宿主檢測(cè)了藥物對(duì)SARS病毒的作用。
1.細(xì)胞形態(tài)觀察采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，見(jiàn)圖1。
觀察細(xì)胞形態(tài)可以看出，病毒對(duì)照B在感染病毒48小時(shí)即可出現(xiàn)明顯CPE，即細(xì)胞圓縮、裂解。而石蒜提取物0.003～0.3mg/ml濃度下，對(duì)SARS病毒對(duì)VERO細(xì)胞的攻擊有顯著的抑制作用。0.00001～0.003mg/ml濃度范圍則抑制作用降低。細(xì)胞對(duì)照生長(zhǎng)良好。
2.MTS檢測(cè)表1石蒜提取物藥物濃度藥效實(shí)驗(yàn)(OD＝492nm)藥名 劑量(mg/ml) OD(X±SD)0.30000 2.0350±0.01060.03000 2.2060±0.01060.02000 2.2370±0.0467石蒜提取物濃度0.01000 2.2850±0.09120.00300 1.7250±0.01060.00100 1.6340±0.00490.00001 1.6780±0.0410病毒對(duì)照 1.4550±0.1800細(xì)胞對(duì)照 2.4110±0.0424空白對(duì)照 0.4820±0.0092X為平均值；SD表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖2顯示了石蒜提取物對(duì)SARS病毒細(xì)胞病變作用的抑制作用劑量曲線。由圖可見(jiàn)，石蒜提取物抗病毒活性隨濃度增加而增強(qiáng)，在0.01mg/ml濃度有最強(qiáng)抑制效果，當(dāng)濃度達(dá)到一定高度(0.02mg/ml)后，達(dá)到平臺(tái)期，無(wú)毒范圍內(nèi)的有效濃度范圍廣。EC50為0.003571mg/ml，半數(shù)有效濃度相對(duì)較低。
3.石蒜提取物對(duì)VERO細(xì)胞的毒性檢測(cè)結(jié)果表2石蒜提取物在VERO細(xì)胞上的毒性作用藥名 劑量(mg/ml) OD(X±SD)2.0000 1.2450±0.00801.0000 1.3125±0.06650.3000 1.7590±0.05100.1000 1.8240±0.0170石蒜提取物濃度 0.0300 1.8455±0.03050.0100 2.0730±0.04900.0030 2.2135±0.02250.0010 2.2850±0.00000.0003 2.2430±0.0080細(xì)胞對(duì)照2.1998±0.0562空白對(duì)照0.1352±0.0070圖3顯示了石蒜提取物藥物濃度毒性曲線。半數(shù)致死濃度(CC50)1.109mg/ml。從圖3中可見(jiàn)，石蒜提取物濃度在≤0.3mg/ml時(shí)，對(duì)VERO細(xì)胞無(wú)毒性。CC50為1.109mg/ml。
結(jié)論如上所述，石蒜提取物在體外具有較強(qiáng)的抗SARS病毒作用，且其毒性較小，CC501.109mg/ml，抑制病毒活性高，EC50為0.003571mg/ml，有效濃度范圍廣，可作為抗SARS藥物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
實(shí)施例3石蒜總堿提取物的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟取一定量的實(shí)施例1得到的石蒜提取物溶解在0.1mol/LHCl溶液中，震蕩使其充分溶解。
真空泵抽濾上含酸溶液，去掉殘?jiān)?br>
濾液用NaHCO3調(diào)節(jié)上酸性溶液，使PH＝9-10。并用CHCL3提取三次。得到含CHCL3的溶液。
回收CHCL3并旋干得到總堿粉末，不經(jīng)純化用于下一步的有效部位測(cè)定。
實(shí)施例4石蒜總堿提取物抗SARS有效部位的鑒定1.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑島津半制備液相色譜儀、YWG250×10，10um的色譜柱、LC-MS(Agilient)、甲醇(4L，F(xiàn)isher)，純水(millipore)天平(beckman，精度0.1mg)，藥匙，移液槍(pipet.lite U.S.A 10ul、20ul、100ul、1ml)濾器(millipore，PTFE膜，0.22um)國(guó)產(chǎn)震蕩器石蒜堿株洲大有生物科技有限公司。
一.實(shí)驗(yàn)環(huán)境室溫干凈的操作實(shí)驗(yàn)臺(tái)通風(fēng)櫥二.實(shí)驗(yàn)步驟1.稱取一定量的石蒜堿粉末溶解在甲醇的溶液里，震蕩，并過(guò)0.22um的濾膜，濾液轉(zhuǎn)到進(jìn)樣瓶中。
2.HPLC處理樣品的基本條件儀器class-vp系列島津(shimadzu)半制備液相色譜儀基本的配置自動(dòng)進(jìn)樣器、6A泵二個(gè)、LCD、自動(dòng)收集器，DAD檢測(cè)儀色譜柱YWG C18 250×10 10um(Beijing Shuntu Technology Co.Ltd.)流動(dòng)相甲醇(Fisher，HPLC級(jí))H2O(Millipore0.22um過(guò)濾)檢測(cè)器DAD二極管陣列檢測(cè)器梯度 5％-----95％ 甲醇H2O 0----35min95％---5％甲醇H2O 35----42min上樣量500ul流速4ml/min收集方式按時(shí)間收集并且每份按8ml一個(gè)收集單位見(jiàn)圖4，在HPLC中出現(xiàn)三個(gè)峰，分別為峰1、峰2和峰3。從圖5A和5B看，峰2在288nm處有豐度接近100％的單峰。用MS分析峰2，其分子量和市售的石蒜堿的分子量相同。在相同條件下，HPLC分析石蒜堿其出峰時(shí)間大致和峰2吻合。見(jiàn)圖5A和圖5B。
因此可以認(rèn)為，峰2是石蒜堿峰。280nm下，HPLC根據(jù)面積歸一法得出石蒜堿占總堿含量的6.8％。
以下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了石蒜堿的抗SARS活性。
實(shí)施例5石蒜堿抗SARS活性試驗(yàn)材料和方法a)受試藥物實(shí)施例4制得的峰2的石蒜堿。
細(xì)胞非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(Vero)。
病毒SARS病毒北京一號(hào)(BJ-01)。
試劑DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品)，鏈霉素，L-谷氨酰胺(美國(guó)Invitrogen公司)，新生胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，Hepes，MTS(美國(guó)Promega公司)，PMS，青霉素(Sigma公司)，碳酸氫鈉(購(gòu)自京科化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝)。
細(xì)胞培養(yǎng)液及試劑配制DMEM培養(yǎng)液含10％新生胎牛血清、3％L-谷氨酰胺、1％青霉素、鏈霉素、7.5％碳酸氫鈉，10mM Hepes；MTS/PMS染色液按Promega公司的操作指南配制。
b)試驗(yàn)方法藥物對(duì)SARS病毒感染VERO細(xì)胞病變的影響按4,000細(xì)胞/孔密度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液100ul，37℃5％CO2孵育24小時(shí)，細(xì)胞融合成單層后加入受試藥物，藥物終濃度0.1×10-2、0.3×10-3、0.1×10-3、0.3×10-4、0.1×10-4、0.3×10-5、0.3×10-6mg/ml的濃度梯度加入，共10個(gè)濃度，每個(gè)濃度加2孔，隨后每孔加入2ul SARS-BJ-01病毒。設(shè)置MTS對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃5％CO2培養(yǎng)96小時(shí)。期間，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，96小時(shí)后以MTS法檢測(cè)(方法見(jiàn)Promega公司的操作指南)細(xì)胞存活狀況。
藥物對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)按4,000細(xì)胞/孔密度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入培養(yǎng)液100ul，37℃5％CO2孵育細(xì)胞24小時(shí)后加入受試藥物。石蒜堿以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后最終濃度分別為0.3、0.2、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003、0.0001、0.00003、0.00001mg/ml，共11個(gè)濃度。每個(gè)濃度加2孔。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，MTS對(duì)照。37℃5％CO2孵育細(xì)胞96小時(shí)后，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小時(shí)，加50ul 10％SDS，紫外分光光度儀檢測(cè)O.D(490nm)，以樣品讀數(shù)不小于細(xì)胞對(duì)照的90％作為無(wú)毒性指標(biāo)。
結(jié)果a)石蒜堿對(duì)SARS病毒的作用以VERO細(xì)胞作為宿主檢測(cè)了藥物對(duì)SARS病毒的作用。
1.細(xì)胞形態(tài)觀察采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖6A-6F。
觀察細(xì)胞形態(tài)可以看出，病毒對(duì)照E在感染病毒48小時(shí)即可出現(xiàn)明顯CPE，即細(xì)胞圓縮、裂解。而石蒜堿濃度在大于0.3×10-4mg/ml濃度下，對(duì)SARS病毒對(duì)VERO細(xì)胞的攻擊有顯著的抑制作用。細(xì)胞對(duì)照生長(zhǎng)良好。
2.MTS檢測(cè)由圖7可見(jiàn)，石蒜堿抗病毒活性隨濃度增加而增強(qiáng)，在0.1×10-3mg/ml濃度有最強(qiáng)抑制效果，當(dāng)濃度達(dá)到一定高度(0.3×10-3mg/ml)后，達(dá)到平臺(tái)期，無(wú)毒范圍內(nèi)的有效濃度范圍廣。EC50為1.846×10-5mg/ml，半數(shù)有效濃度較低。
3.石蒜堿對(duì)VERO細(xì)胞的毒性檢測(cè)結(jié)果表3石蒜堿對(duì)VERO細(xì)胞的毒性檢測(cè)結(jié)果藥名 劑量(mg/ml) OD(X±SD)0.300000.5530±0.01270.200000.5880±0.00570.100000.6665±0.00490.030000.7645±0.00920.010001.0570±0.0014石蒜堿濃度 0.003001.6005±0.02190.001001.9125±0.04450.000301.9065±0.09550.000101.7920±0.06650.000031.8570±0.00990.000012.0545±0.0672細(xì)胞對(duì)照2.1768±0.0873MTS對(duì)照 0.5395±0.0475圖8顯示了石蒜堿毒性測(cè)試的OD對(duì)濃度作圖。可見(jiàn)石蒜堿濃度在低于0.3×10-2mg/ml時(shí)，對(duì)VERO細(xì)胞無(wú)毒性。IC50為7.644×10-3mg/ml。
結(jié)論1.如上所述，石蒜提取物在體外具有較強(qiáng)的抗SARS病毒作用，且其毒性較小，CC501.109mg/ml，抑制病毒活性高，EC50為0.003571mg/ml，有效濃度范圍廣，可作為抗SARS藥物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
2.如上所述，石蒜堿具有很強(qiáng)的抗SARS作用，其毒性較小，半抑制濃度僅為7.644×10-3mg/ml，而抗病毒活性的ED50達(dá)到1.846×10-5mg/ml。其有效濃度范圍廣。對(duì)于抗SARS藥物的開(kāi)發(fā)有重要意義。
如上描述了本發(fā)明所公開(kāi)的石蒜提取物、石蒜總堿的制備方法，制得的產(chǎn)品及其用途。但需理解其中包含了本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的變化和改變。這些變化和改變也包含在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.石蒜堿的用途，其特征在于，該石蒜堿用于制備抗SARS病毒的藥物。
2.一種石蒜總堿提取物，其特征在于，該提取物含有石蒜總堿50-99％重量。
3.如權(quán)利要求2所述的提取物，其特征在于，所述石蒜總堿含50-90％重量的石蒜堿。
4.權(quán)利要求2所述的石蒜總堿提取物的用途，其特征在于，該總堿提取物用于制備抗SARS病毒的藥物。
5.一種制備權(quán)利要求2所述的石蒜總堿提取物的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)用50-90v％的氯仿水溶液或氯仿回流提取石蒜藥材1-8個(gè)小時(shí)，獲得提取液；(b)過(guò)濾得到固體；(c)用無(wú)水乙醇或50-90v％的乙醇溶液，回流提取1-8個(gè)小時(shí)，得到藥液；(d)水浴蒸干所述藥液，然后在50-100℃烘干，獲得固態(tài)的石蒜提取物；(e)將石蒜提取物溶于酸溶液；(f)中和溶液，至pH為8-11；(g)用極性有機(jī)溶劑提取，得到溶解于有機(jī)相的石蒜總堿提取物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法還包括(h)干燥，得到粉末狀總堿提取物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(c)中用無(wú)水乙醇提取4小時(shí)。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述極性有機(jī)溶劑是氯仿。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酸溶液是0.01N-0.1N的鹽酸溶液。
10.一種抗SARS病毒的藥物組合物，其特征在于，它含有1-99wt％權(quán)利要求2所述的石蒜總堿提取物和1-99wt％藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
公開(kāi)了石蒜堿制備抗SARS病毒的藥物的用途；以及含有石蒜堿的石蒜總堿提取物，其制備方法，其用于制備抗SARS病毒的藥物的用途和含有它的組合物。
文檔編號(hào)A61K31/407GK1621038SQ200310108800
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者王慧, 郭海燕, 栗世鈾, 王麗娟, 張以琳, 馬良會(huì), 談學(xué)海 申請(qǐng)人:上海華大天源生物科技有限公司