專利名稱：轉基因合成的人i型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于神經再生領域的神經基質膜仿生材料，具體關于一種用于神經損傷修復的轉基因合成的人I型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料。
背景技術：
缺損神經的修復與功能的重建是人類尚待攻克的難題之一。人工神經導管橋接術是一種很有應用前景的缺損神經修復方法，是組織工程學、材料學、生物學、醫學界共同關注的一大熱點。從目前的研究現狀看，主要通過各種生物相容性和可降解性材料，如牛膠原蛋白、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯、聚殼聚糖等，加工為中空管或再在其中內置與軸平行的纖維、海綿等，在缺損神經的近體端和遠體端搭橋，營造一個有利于再生功能發揮的微環境，阻止周圍結締組織的長入，誘導神經沿導管方向再生。在修復過程中，導管材料也逐漸降解被生物體吸收。并且以此類材料為基體通過物理吸附、微包囊、化學鍵合、使用前注射等方式在材料上結合各種神經再生促進劑，如成年蛋白(Laminin)、神經細胞粘附蛋白(NCAM)、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、腦源性神經營養因子(BDNF)等，以促進神經的再生；或進行雪旺細胞或干細胞培養，以構筑組織工程化人工神經導管。
盡管神經導管橋接術的研究已取得者多進展，但離臨床上取代自體神經移植修復周圍神經缺損還有相當的距離。其主要原因在于目前導管材料所提供的功能還不能完全滿足軸突再生這一精確復雜的生理過程的要求。如聚乳酸、聚乙交酯丙交酯等具有良好的成型加工性與可降解特性、生物相容性等，但對神經細胞缺乏明顯生長促進作用，必須以各種方式結合膠原蛋白、神經再生促進劑等，促進神經的再生。由于已知的三十多種神經再生促進劑大多為低分子量可溶蛋白，使用時存在作用時間過短、易流失擴散等問題。同時，聚乳酸、聚乙交酯丙交酯的酸性降解產物易引起炎癥反應，使再生神經纖維組織化，中空管變得狹小，影響軸突延伸生長。又如I型膠原蛋白對神經再生具有促進作用、可成型加工性與可降解特性、生物相容性等，但它主要從動物肌腱、皮膚等中提取，由于安全與免疫原性，人們對使用動物的外源膠原有一定顧慮，但從人胎盤中大量獲取膠原又不現實。而且單獨使用該材料還不能滿足應用要求，必須每次都添加昂貴的各類神經再生促進劑。因此，在推動神經導管橋接術臨床應用的過程中，非常需要研究一種類似神經基質膜功能的神經導管仿生材料，材料本身既具有良好的成型加工性能，同時又能長效地為軸突的再生提供引導與營養作用，以更好地滿足神經再生過程的要求。
發明內容
本發明提供一種轉基因合成的人I型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料，它是通過轉基因合成的人I型膠原融合蛋白或其變體。該融合蛋白或其變體可配制成0.5-10重量％的水溶液，進一步加工成纖維或其它形狀。
本發明構思是基于基因決定所生成蛋白質的功能及特性的理論。首先將能提供加工及營養功能的人I型膠原蛋白的基因通過轉基因合成與能提供粘附導向及再生促進作用的神經再生促進劑的基因構建融合基因。在這融合基因的密碼指令控制指揮下，特定種類數量的氨基酸就按照特定的順序在一合適的表達體系中組裝起來，表達生成具有人I型膠原蛋白結構域及具有神經再生促進劑結構域的融合蛋白。神經再生促進劑可以選自成年蛋白(Laminin)神經細胞粘附蛋白(NCAM)、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)或腦源性神經營養因子(BDNF)等。該融合蛋白也可通過采用基因定點突變調控融合蛋白一級結構中氨基酸的種類而構建成融合基因變體，再通過表達生成融合蛋白變體。通過改變特定位置氨基酸的極性、電荷數，可對人I型膠原蛋白某些不盡如人意的性能進行調控，進而可改善其加工性能，包括增加粘度，流變性、穩定性、降解性、溶脹性等。該融合蛋白或其變體是一種具有極高生物活性的新型轉基因人I型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料。它可配制成0.5-10重量％的水溶液，進一步通過紡絲加工成纖維，或凍干成纖維狀，或澆鑄成管形、平板膜等其它形狀。該材料既具有神經細胞生長所需的特定引導識別，再生促進及營養功能，又具有可成形加工特性。
本發明人I型膠原融合蛋白的轉基因合成方法，下面以人I型膠原蛋白基因與神經細胞粘附蛋白基因為例，通過轉基因合成方法，構建成具有人I型膠原蛋白結構域及神經細胞粘附蛋白結構域的融合蛋白。方法包括如下步驟1、構建融合質粒采用PCR方法，將人I型膠原蛋白基因片段克隆到載體上或將人I型膠原蛋白基因及NCAM基因克隆到載體上，并采用后修飾酶方法插入某種酶基因(例如脯氨酰-4-羥化酶基因、二氫葉酸還原酶基因、甲基化酶基因)，以克服表達產物生物活性可能較低的缺陷，構建成重組質粒1(圖1)或融合質粒2(圖2)。也可采用基因定點突變方法，調控對應的融合蛋白一級結構中氨基酸的種類，構建成重組質粒1變體或融合質粒2變體。
2、融合蛋白的表達及分離純化選取傳代迅速、操作簡便的一種表達體系(例如E.coli體系、Sf9表達體系、酵母表達體系等)，在該體系中高效表達融合蛋白或其變體。表達產物經過電泳分離后，通過Western Blotting鑒定，再通過層析柱進行分離純化，冷凍干燥，得凍干粉產物人I型膠原蛋白(a)或其變體(b)，人I型膠原蛋白基因與NCAM基因的融合蛋白(c)或其變體(d)。
融合蛋白仿生材料的應用將上述所得蛋白(融合蛋白)或其變體的凍干粉產物(a)、(b)、(c)和(d)分別配制成0.5-10重量％的水溶液，可進一步通過紡絲加工成纖維，或凍干成纖維狀，或澆鑄成管形、平板膜等其它形狀。例如通過紡絲加工制成纖度0.8-2.8克/袋長絲的纖維，凝固液為乙醇與丙酮的混合溶液(乙醇∶丙酮＝10-90∶100)，凝固浴液浸長0.5-3m，浴溫25℃左右，噴絲頭孔數2000-15000，孔徑0.07-0.15mm，紡絲速度3-30m/min，成型后經過水洗工序，去掉凝固液與可溶性雜質，即得纖維。纖維線密度為1.0-10dtex，斷裂強度為1.0-3.0CN/dtex，斷裂伸長率為2％-30％。
本發明仿生材料加工成的纖維，可進一步通過圓編法編織成管，外管徑0.8-5.0mm，管壁厚度0.05-0.5mm，可作為缺損神經修復的人工神經導管應用，以模擬神經基質膜的功能與作用，引導軸突的粘附、延伸、生長、促進神經的再生及功能的恢復。或直接通過中空濕法成型獲得中空導管。纖維或平板膜還可應用于矯形、整形等醫學美容方面，促進創面愈合、創面止血或作為手術殘腔填充物。
分別測定(a)、(b)、(c)和(d)四種凍干粉產物的營養特性及加工特性。營養特性以細胞增殖度為指標，測定值為50-99％。凍干粉的營養特性越高，神經細胞軸突生長錐的活性受其影響也會相應提高，因而使細胞增殖度增加。加工性能主要以表觀粘度為指標，測定值為0.4-1.0PaS，在一定范圍內，表觀粘度越大，加工性能越好。測定結果參見實施例6。
本發明轉基因合成的人I型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料的優點由于其中神經再生促進劑通過生物合成方法結合進人I型膠原結構中，解決了添加神經再生促進劑方法造成的擴散流失、容易降解等問題；同時具有極高生物活性與粘附引導、營養功能，具有更多的綜合仿生功能，更能模擬神經軸突再生過程中基質膜的功能與作用，滿足生物體的復雜需要；生物相容性更好，安全隱患大為減少；且成形加工性、溶脹性得以改進，降解過程更易控制；該仿生材料用轉基因合成，融合質粒一次構建成功，可通過表達純化反復無限次生物合成，大規模生產的成本低廉；本發明同時也為大量低成本地構筑具有特定功能與安全性的組織工程骨架材料(如轉基因骨、轉基因皮膚基體材料)、環保功能性紡織材料等開辟了新思路。
圖1是重組質粒1的構建圖。
圖2是融合質粒2的構建圖。
具體實施例方式
實施例1 人I型膠原基因重組質粒的構建人I型膠原基因片段序列ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 60ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGAAGG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 120CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 180GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 240CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TAGAGGCCCA 300CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 360GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 420GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 480CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 540
CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCAA GGGAGAACCA 600GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 660AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 720CCCACTGGAC CTGCA 735(引自Wendt P.，et a1.，Eur.J.Biochem.30(1)，1972，30(1)169-183)用PCR方法，以人I型膠原基因片段為模板，在人I型膠原基因片段兩端合成具有與表達載體插入位點匹配的限制酶切點，將線狀基因片段定位插入PUC18載體(中國科學院典型培養物保藏委員會基因庫)，并采用后修飾酶方法插入脯氨酰-4-羥化酶基因，以克服該體系表達產物生物活性較低的缺陷，構建重組質粒1(見圖1)。
具體步驟如下(1)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)合成PCR引物，引物序列為P1 5’GGGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCCTCAGCTTTGTGGAT3’P25’CCGGATCCTTATGCAGGTCCAGTGGG 3’在100ul反應體系中，含5ul 2mM dNTP，5’及3’引物各50pmol，模板DNA 5ug。90℃變性5min，50℃退火10min，加入Taq酶，混勻，再加入60ul液體石蠟油，離心后按90℃變性1min，50℃退火1min，72℃反應1min，共循環30次。72℃延長50min，10℃放置10hr。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。產物溶于TE buffer。
(2)質粒提取挑取單個克隆接種于LB液體培養基中，37℃培養12hr。收集菌液，8000rpm離心3min，棄上清。加入預冷的溶液1100ul，振蕩，加入溶液II200ul，冰浴5min，加入150ul溶液III，冰浴10min。8000rpm離心10min，取上清，加入RNase至終濃度10ug/ml，37℃消化30min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。產物溶于TE buffer，4℃保存。
(3)酶切與連接用限制性內切酶消化DNA，T4 DNA連接酶連接8hr。
(4)轉化挑取單個克隆接種于LB液體培養基中，37℃培養12hr。按1/200的比例接種于LB液體培養基中，培養至OD＝0.6。6000rpm離心10min，收集菌體。加入1ml預冷的100mMCaCl2懸浮菌體，冰浴10min。4℃ 6000rpm離心10min，收集菌體。加入100ul預冷的100mMCaCl2懸浮菌體，冰浴12hr。將連接產物加入100ul感受態細胞中，混勻，冰浴30min。熱震蕩90秒，加入400ulLB培養基，37℃培養5hr。涂板，倒置培養12hr。
(5)測序，核苷酸序列見序列表中序號1(6)后修飾技術采用后修飾酶方法插入脯氨酰-4-羥化酶基因，以克服該體系表達產物生物活性可能較低的缺陷。
實施例2人I型膠原基因重組質粒變體的構建采用基因定點突變方法，調控實施例1對應的融合蛋白一級結構中氨基酸的種類，將K33→A、R98→G、K197→A，構建成融合質粒1的變體，變體的核苷酸序列見序列表中序號2。
實施例3 NCAM基因/人I型膠原基因融合質粒的構建NCAM基因片段序列GCTGCCTGCC GACACCACAG CCACTGTCGA GGACATGCTG CCTTCTGTCA CCACCGTCAC 60CACTAACTCT GACACTATCA CCGAAACCTT TGCCACTGCT CAGAACAGCC CTACCAGTGA 120GACCACTACA CTGACCTCCA GTATTGGCCC ACCGGCCACA ACTGTGCCAG ACTCAAATTC 180TGTGCCCGCT GGTCAGGCCA CCCCTTCCAA GGGTGTCACT GCTTCATCCT CGTCCCCAGC 240CTCAGCCCCC AAAGTTGCTC CTCTGGTTGA CCTGAGTGAT ACTCCAACTT CAGCTCCCTC 300TGCTAGCAAT CTGTCCTCCA CTGTCTTGGC TAACCAAGGA GCTGTACTCA GGAACTTCAA 360CCCTGCCAGT GCGGGAGAGA CCTCCAAGGC CCCTCCAGCC AGTAAGGCCT CCCCTGCTCC 420CACCCCCACT CCAGCTGGGG CAGCCAGCCC CTTAGCAGCA GTAGCCGCCC CTGCCACAGA 480
TGCCCCCCAG GCCAAGCAGG AAGCCCCCAG CACCAAAGGT CCGGACCCAG AGCCCACCCA 540GCCTGGCACC GTGAAGAACC CACCTGAGGC AGCCACAGCC CCTGCTAGCC CGAAGAGCAA 600GGCTGCAACC ACAAACCCTT CCCAGGGCGA GGACTTAAAA ATGGACGAAG GGAACTTCAA 660GACCCCAGAT ATTGACCTTG CAAAGGATGT TTTTGCAGCC CTGGGCTCTC CTCGTCCCGC 720CACTGGGGCC AGTGGACAAG CCTCTGAGCT TGCTCCTTCA CCTGCAGACA GCGCTGTGCC 780TCCCGCACCA GCAAAGACCGA 801(引自Kasper C.，et al.，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，1999，55(9)1598-1600)參照實施例1，分別以人I型膠原基因片段、NCAM基因片段為模板，通過PCR方法、限制性酶切技術、連接、轉化等一系列基因工程技術，構建NCAM基因/人I型膠原基因融合質粒2(見圖2)，核苷酸序列見序列表中序號3。并通過插入脯氨酰-4-羥化酶基因，以克服該體系表達產物生物活性較低的缺陷。
實施例4 NCAM基因/人I型膠原基因融合質粒變體的構建采用基因定點突變方法，調控實施例3對應的融合蛋白一級結構中氨基酸的種類，例如將K293→A、R358→G、K457→A，構建成融合質粒2的變體，變體的核苷酸序列見序列表中序號4。
實施例5-8 實施例1、實施例2、實施例3、實施例4基因的表達選取傳代迅速、研究操作簡便的E.Coli表達體系，經ITPG誘導技術，在該體系中高效表達，獲得四種高生物活性、高表達的人I型膠原蛋白(a)或其變體(b)及人I型膠原/NCAM的融合蛋白(c)或其變體(d)。
將表達產物分別經還原與非還原12％SDS-PAGE分離，Bio-Rad凝膠轉移儀轉移60min。用封阻液封阻NC膜5hr。加入一抗反應10hr，用封阻液洗三次。二抗按1∶10∶200稀釋后與NC膜反應5hr，用封阻液洗三次。TBS洗膜2次，每次5min。將NC膜浸于20ml TBS+10mg DAB+20ul H2O2中顯色。SDS-PAGE顯示表達所得蛋白的分子量分別為實施例5-21kD、實施例6-21kD、實施例7-56kD、實施例8-56kD。用GST融合蛋白親合層析柱(Pharmacia Biotech公司)進行分離純化，收集產物，在凍干機上冷凍干燥過夜，產物為凍干粉(a)、(b)、(c)及(d)。以12％的SDS-PAGE鑒定純度，產物純度都達90％以上。
四種轉基因蛋白產物用氨基酸序列分析儀測序，結果見序列表中序號5，6，7，8。
實施例9融合蛋白溶液的紡絲將實施例5-8中四種轉基因蛋白產物凍干粉(a)(b)(c)及(d)分別配制成5％的水溶液，采用濕法紡絲。凝固浴由乙醇與丙酮的混合溶液組成(乙醇∶丙酮＝30-50∶100)，凝固浴液浸長1m，浴溫25℃左右，噴絲頭孔數3000，孔徑0.09mm，紡絲速度8m/min，成型后經過水洗工序，去掉凝固液與可溶性雜質。制成纖維單絲纖度1.5dtex，斷裂強度2.0CN/dtex，伸長率15％的纖維。再通過圓編法編織成人工神經導管，外管徑1.0mm，管壁厚度0.1mm。
分別測定四種凍干粉的營養特性及加工特性。營養特性以細胞增殖度為指標測定值為50-99％，加工性能以表觀粘度為指標，測定值為0.4-1.0PaS(測定方法參見國家技術監督局.G B/T 16886-1997醫療器械生物學評價；Bao QB，et al.，Biomaterials，1996，171157)。
細胞增殖度測定如下將TF1細胞配制成1×104-5×104/ml的細胞懸液，分別注入含有培養液的培瓶中，37℃恒溫培養箱培養24小時，測試組棄去原培養液，更換為測試物浸提液。更換后2、4、7天，測試組和對照組每組各取三瓶，用分光光度計測定OD588nm。細胞增殖度＝測試組平均值/對照組平均值×100％。
表觀粘度可采用旋轉粘度計，按照常規方法測定。
測定結果如表1所示
表1
序列表<110>東華大學<120>轉基因合成的人I型膠原融合蛋白神經基貭膜仿生材料<130>SPI038382<160>8<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>735<212>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS<400>1ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGGTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 60ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGAAGG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 120CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 180GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 240CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TAGAGGCCCA 300CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 360GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 420GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 480CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 540CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCAA GGGAGAACCA 600GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 660AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 720CCCACTGGAC CTGCA 735<210>2<211>735<212>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS<400>2ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 60ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGGCAG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 120CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 180GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 240CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TGGCGGCCCA 300CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 360GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 420
GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 480CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 540CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCGC AGGAGAACCA 600GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 660AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 720CCCACTGGAC CTGCA 735<210>3<211>1515<212>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS<400>3GCTGCCTGCC GACACCACAG CCACTGTCGA GGACATGCTG CCTTCTGTCA CCACCGTCAC 60CACTAACTCT GACACTATCA CCGAAACCTT TGCCACTGCT CAGAACAGCC CTACCAGTGA 120GACCACTACA CTGACCTCCA GTATTGCCCC ACCGGCCACA ACTGTGCCAG ACTCAAATTC 180TGTGCCCGCT GGTCAGGCCA CCCCTTCCAA GGGTGTCACT GCTTCATCCT CGTCCCCAGC 240CTCAGCCCCC AAAGTTGCTC CTCTGGTTGA CCTGAGTGAT ACTCCAACTT CAGCTCCCTC 300TGCTAGCAAT CTGTCCTCCA CTGTCTTGGC TAACCAAGGA GCTGTACTCA GGAACTTCAA 360CCCTGCCAGT GCGGGAGAGA CCTCCAAGGC CCCTCCAGCC AGTAAGGCCT CCCCTGCTCC 420CACCCCCACT CCAGCTGGGG CAGCCAGCCC CTTAGCAGCA GTAGCCGCCC CTGCCACAGA 480TGCCCCCCAG GCCAAGCAGG AAGCCCCCAG CACCAAAGGT CCGGACCCAG AGCCCACCCA 540GCCTGGCACC GTGAAGAACC CACCTGAGGC AGCCACAGCC CCTGCTAGCC CGAAGAGCAA 600GGCTGCAACC ACAAACCCTT CCCAGGGCGA GGACTTAAAA ATGGACGAAG GGAACTTCAA 660GACCCCAGAT ATTGACCTTG CAAAGGATGT TTTTGCAGCC CTGGGCTCTC CTCGTCCCGC 720CACTGGGGCC AGTGGACAAG CCTCGGAGGA GGAGGAYCCG GAGGAGGAGG CTCCGGCGGC 780GGCCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 840ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGAAGG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 900CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 960GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 1020CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TAGAGGCCCA 1080CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1140GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 1200GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 1260CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1320CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCAA GGGAGAACCA 1380GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 1440AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 1500CCCACTGGAC CTGCA 1515<210>4<211>1515<213>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS
<400>4GCTGCCTGCC GACACCACAG CCACTGTCGA GGACATGCTG CCTTCTGTCA CCACCGTCAC 60CACTAACTCT GACACTATCA CCGAAACCTT TGCCACTGCT CAGAACAGCC CTACCAGTGA 120GACCACTACA CTGACCTCCA GTATTGCCCC ACCGGCCACA ACTGTGCCAG ACTCAAATTC 180TGTGCCCGCT GGTCAGGCCA CCCCTTCCAA GGGTGTCACT GCTTCATCCT CGTCCCCAGC 240CTCAGCCCCC AAAGTTGCTC CTCTGGTTGA CCTGAGTGAT ACTCCAACTT CAGCTCCCTC 300TGCTAGCAAT CTGTCCTCCA CTGTCTTGGC TAACCAAGGA GCTGTACTCA GGAACTTCAA 360CCCTGCCAGT GCGGGAGAGA CCTCCAAGGC CCCTCCAGCC AGTAAGGCCT CCCCTGCTCC 420CACCCCCACT CCAGCTGGGG CAGCCAGCCC CTTAGCAGCA GTAGCCGCCC CTGCCACAGA 480TGCCCCCCAG GCCAAGCAGG AAGCCCCCAG CACCAAAGGT CCGGACCCAG AGCCCACCCA 540GCCTGGCACC GTGAAGAACC CACCTGAGGC AGCCACAGCC CCTGCTAGCC CGAAGAGCAA 600GGCTGCAACC ACAAACCCTT CCCAGGGCGA GGACTTAAAA ATGGACGAAG GGAACTTCAA 660GACCCCAGAT ATTGACCTTG CAAAGGATGT TTTTGCAGCC CTGGGCTCTC CTCGTCCCGC 720CACTGGGGCC AGTGGACAAG CCTCGGAGGA GGAGGAYCCG GAGGAGGAGG CTCCGGCGGC 780GGCCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 840ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGGCAG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 900CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 960GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 1020CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TGGCGGCCCA 1080CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1140GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 1200GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 1260CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1320CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCGC AGGAGAACCA 1380GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 1440AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 1500CCCACTGGAC CTGCA 1515<210>5<211>245<214>PRT<213>人工序列<220.
<221>CHAIN<400>5Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr1 5 10 15Ser Tyr Leu Ala Thr Ser Gln His Val Ser Glu Ala Ser Ala Gly Arg20 25 30Lys Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Pro Gln Gly Glu Arg Gly Pro Pro35 40 45Gly Pro Pro Gly Arg Asp Lys Glu Asp Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly50 55 60
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<220>
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Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly450 455 460Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu465 470 475 480Arg Gly Arg Ile Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp485 490 495Gly Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala500 50權利要求
1.一種轉基因合成的人I型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料，其特征在于所述神經基質膜仿生材料是通過轉基因合成的人I型膠原融合蛋白或其變體。
2.如權利要求1所述的神經基質膜仿生材料，其特征在于所述轉基因合成的人I型膠原融合蛋白，是由人I型膠原蛋白基因與神經再生促進劑的基因通過轉基因合成融合基因，再通過表達生成的具有人I型膠原蛋白結構域及具有神經再生促進劑結構域的融合蛋白。
3.如權利要求1所述的神經基質膜仿生材料，其特征在于所述的人I型膠原融合蛋白變體，是通過采用基因定點突變調控所述融合蛋白一級結構中氨基酸的種類而構建成的融合基因變體，再通過表達生成的融合蛋白變體。
4.如權利要求2所述的神經基質膜仿生材料，其特征在于所述神經再生促進劑選自成年蛋白、神經細胞粘附蛋白、神經生長因子、睫狀神經營養因子或腦源性神經營養因子。
5.如權利要求4所述的神經基質膜仿生材料，其特征在于所述神經再生促進劑是神經細胞粘附蛋白。
6.如權利要求2所述的神經基質膜仿生材料，其特征在于所述轉基因合成的人I型膠原融合蛋白是由人I型膠原蛋白基因與神經細胞粘附蛋白基因通過轉基因合成融合基因，其核苷酸序列見序列表中序號3，再通過表達生成的具有人I型膠原蛋白結構域及神經細胞粘附蛋白結構域的融合蛋白，其氨基酸序列見序列表中序號7。
7.如權利要求3所述的神經基質膜仿生材料，其特征在于所述的人I型膠原融合蛋白變體，是通過采用基因定點突變將所述融合蛋白一級結構中的K293，R358和K457分別調控為A，G和A而構建成的融合基因變體，其核苷酸序列見序列表中序號4，再通過表達生成的融合蛋白變體，其氨基酸序列見序列表中序號8。
8.權利要求1、2、3、6或7所述的神經基質膜仿生材料的應用，其特征在于所述仿生材料可配制成0.5-10重量％的水溶液，通過紡絲加工成纖維，或凍干成纖維，或澆鑄成管形、平板膜形狀。
9.如權利要求8所述的神經基質膜仿生材料的應用，其特征在于所述纖維或平板膜可用于加工成人工神經導管，或用于矯形、整形美容，或用于促進創面愈合，創面止血或作為手術殘腔填充物。
全文摘要
一種轉基因合成的人I型膠原融合蛋白神經基質膜仿生材料，是通過轉基因合成的人I型膠原融合蛋白或其變體。它是由人I型膠原蛋白基因與神經再生促進劑基因通過轉基因合成得融合基因，再通過表達生成的具有人I型膠原蛋白結構域及神經再生促進劑結構域的融合蛋白。也可采用基因定點突變調控融合蛋白一級結構，構建成融合蛋白的變體。該材料具有神經細胞生長所需的特定引導識別，再生促進，營養功能及可成形加工特性。該材料可配制成0.5－10重量％的水溶液，通過紡絲加工或凍干成纖維，或澆鑄成其它形狀。進一步可加工成人工神經導管，以模擬神經軸突再生過程中基質膜的功能，還可用于矯形、整形美容等。又該轉基因合成材料，大規模生產成本低廉。
文檔編號A61L31/04GK1616117SQ20031010856
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月13日 優先權日2003年11月13日
發明者陳皓, 張菁, 謝涵坤, 成立萍 申請人:東華大學