專利名稱：抗人p-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域的單克隆抗體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物工程領域，特別涉及一種人P-選擇素凝集素-表皮生長因子(Lectin-EGF，L-EGF)功能域的單克隆抗體及其制備方法和應用。
背景技術：
P-選擇素(P-selectin)是一種分子量為140kD的I型膜糖蛋白，定位于血小板的α顆粒和內皮細胞Weibel-Palade小體內，全長由789個氨基酸殘基組成。其N末端730個氨基酸構成胞外區，包括1個凝集素(Lectin)結構域、1個表皮生長因子(EGF)結構域和9個補體調節蛋白重復序列(SCR)結構域；C末端24個氨基酸構成跨膜區。此外35個氨基酸構成胞漿短尾(Johnston GI，Cook RG，McEver RP.Cloning of GMP-140，a granulemembrane protein of platelets and endotheliumsequence similarity to proteins involved in celladhesion and inflammation.Cell，1989，56(6)1033-1044)。P-選擇素屬細胞粘附分子的選擇素家族，其作為血小板/內皮細胞活化的標志和粘附受體，可介導白細胞與活化內皮細胞等最初粘附，是啟動炎癥反應并維持炎癥狀態的重要成分。其正常情況下不表達或低表達，受到炎癥、損傷等因素刺激后可顯著表達，使原先不表達的臟器也出現表達，故P-選擇素參與免疫炎癥損傷、血栓形成及腫瘤轉移等多種病理生理過程，其過度或持續表達可成為某些臟器病變的標志，與諸多臨床疾病有十分密切的關系。實驗表明，抑制其表達及其細胞粘附已取得良好的抗炎、抗腫瘤轉移等防治效果。為進一步探討P-選擇素的生物學功能及其在炎癥等疾病機制中的作用，以及針對其抗粘附治療意義，近年來P-選擇素的分子結構與功能關系研究已引起人們重視。一般認為其胞外區Lectin結構域是P-選擇素識別配基并介導細胞間粘附的主要活性部位，但還需胞外區中EGF結構域對其構型的穩定和調節，增強其粘附親和力與特異性。故Lectin與EGF的共同區域Lectin-EGF可能是P-選擇素分子識別和粘附的功能結構域(Mehta，P，Cummings，R.D，andMcEver，R，P.Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoproteinligand-1.J.Biol.Chem.1998，27332506)，但目前尚未制得識別該功能域片段的特異性抗體，不能直接研究和證實Lectin-EGF(L-EGF)區域的功能。
發明內容
本發明的目的是為了解決上述課題，提供一種人P-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域的單克隆抗體；本發明的另一目的是提供其制備方法，尤其是生產該單克隆抗體的雜交瘤；本發明的再一目的是提供該單克隆抗體的應用。
本發明的特異性抗人P-選擇素L-EGF功能域的單克隆抗體(PsL-EGFmAb)可按下述方法制得。
利用特異引物，通過RT-PCR從外周血血小板中擴增出人P-選擇素的Lectin-EGF功能域基因，將其克隆至載體中，測序驗證后轉染大腸桿菌，經誘導表達了C端融合6×His的蛋白質；融合蛋白質經分離純化后作為抗原，用該抗原免疫哺乳動物，應用雜交瘤技術，篩選陽性克隆，制備腹水及獲得目的抗體。
其中，上述基因克隆所用的載體一般選用質粒，諸如pET42b(+)；轉染的大腸桿菌可選用BL21。
上述雜交瘤技術包括按照常規方法免疫，例如皮內注射上述抗原蛋白來免疫哺乳動物，將其脾細胞作為免疫細胞與哺乳動物如小鼠的骨髓瘤細胞融合。其中，所說的抗原免疫的哺乳動物較好選擇那些在細胞融合中對將要使用的骨髓瘤細胞有適應性的動物，如小鼠，可選用Balb/c小鼠；而骨髓瘤細胞選用小鼠骨髓瘤細胞SP2/0；將上述免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞融合后，通過間接ELISA篩選陽性克隆；獲得3株可穩定分泌抗L-EGF功能域單抗的雜交瘤細胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1、F3和H5，其亞型分別為IgG2、IgG1和IgG3，輕鏈均為κ型，其中細胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1已于2003年10月4日保藏于中國典型培養物保藏中心，獲得保藏號為CCTCC-C2003012。
對本發明所獲單抗的特性和功能進行了鑒定與檢測表明該單抗對LPS刺激活化的人臍靜脈內皮細胞均有特異性結合反應，并可在體外阻斷凝血酶激活的血小板與中性粒細胞間的粘附，表明本發明的單抗可特異性識別結合天然P-選擇素，具有體外抗活化血小板與中性粒細胞粘附的功能；再深入研究表明所述的單抗對腎缺血再灌注損傷有一定的防治功能，為進一步應用此單抗進行揭示P-選擇素的結構與功能關系，闡明P-選擇素的生理、病理意義，進而為針對其的抗粘附調節與治療提供手段。
另外，該抗體特異性針對人P-選擇素L-EGF功能域，與現有抗P-選擇素全長的單克隆抗體PsmAb相比，更具有免疫特異性，其抗粘附作用也更強。
本發明中的雜交瘤細胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1于2003年10月4日保藏在位于中國武漢大學(郵編為430072)內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，獲得保藏號為CCTCC-C2003012。
圖1為L-EGF基因的RT-PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定的圖譜，M標準分子量(maker)；1、2、3L-EGF基因的RT-PCR產物。
圖2為酶切和PCR擴增后的重組質粒的分析圖譜，MDNA標準分子量；1酶切后的重組質粒產物；2PCR擴增鑒定的產物；3pET42b(+)空質粒。
圖3A為重組質粒在大腸桿菌中的表達產物的SDS-PAGE檢測圖譜；M蛋白標準分子量；1IPTG前的菌樣品；2IPTG后的菌樣品；3經緩沖液C純化后的蛋白；4經緩沖液D純化后的蛋白；5經緩沖液E純化后的蛋白；圖3B為純化后的蛋白經Western blot的分析結果。
圖4A為未刺激的血小板和中性粒細胞的狀態圖(400×)；圖4B為凝血酶刺激后的血小板和中性粒細胞的粘附狀態圖(400×)；圖4C為經凝血酶刺激的血小板預先用對照單抗處理后和中性粒細胞的粘附狀態圖(400×)；圖4D為經凝血酶刺激的血小板預先用本發明的單抗處理后和中性粒細胞的粘附狀態圖(400×)。
圖5為生理鹽水對照組腎缺血再灌注6h的組織照片(HE，×100)。
圖6為PsmAb組腎缺血再灌注6h的組織照片(HE，×100)。
圖7為PsL-EGFmAb組腎缺血再灌注6h的組織照片(HE，×100)。
圖8為生理鹽水對照組腎缺血再灌注6h的組織照片(×10,000)。
圖9為PsmAb組腎缺血再灌注6h的組織照片(×10,000)。
圖10為PsL-EGFmAb組腎缺血再灌注6h的組織照片(×10,000)。
圖11為生理鹽水對照組腎缺血再灌注6h P-selectin表達的免疫組化照片(×400)。
圖12為PsL-EGFmAb組腎缺血再灌注6h P-selectin表達的免疫組化照片(×200)。
圖13為重組質粒pET42b(+)-Lectin-EGF(pET42b(+)-L-E)構建示意圖。
具體實施例方式
在下面的實施例中進一步說明本發明，但并不限制本發明的范圍。
1、下面所述實施例中的材料為1)質粒、菌株及主要制劑質粒pET42b(+)為Novagen公司產品。大腸桿菌DH5α、BL21均為上海瑞金醫院實驗室保存；限制性內切酶(NdeI、HindIII)、T4DNA連接酶、dNTP均為Promega公司產品；Pfu DNA聚合酶，DNA maker、瓊脂糖為上海生工生物公司產品；FITC標記的羊抗鼠IgG、RNA抽提液Trizol、逆轉錄試劑盒、DMEM培養基、胎牛血清、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑、PEG、HAT、HT均為GibcoBRL公司產品；鼠抗6×His單克隆抗體、PCR產物回收試劑盒及質粒純化試劑盒，Ni2+-NTAsuperflow樹脂為QIAGEN公司產品；HRP標記的羊抗鼠IgG抗體為博亞公司產品；實驗對照抗P-選擇素全長單克隆抗體(PsmAb)獲自中科院生物化學與細胞生物學研究所；ConA、LPS、TNF-α、胰酶、凝血酶購自華美生物技術公司；6％Dextran購自Sigma公司；2.5％戊巴比妥鈉溶液購自上海化學試劑廠；BUN、Scr檢測試劑購自上海醫用化學研究所；免疫組化P-選擇素單抗、鏈菌素抗生物素蛋白-生物素酶標法(labelled streptavidinbiotin，LSAB)試劑盒購自DAKO公司；3H-TdR、三氯醋酸、閃爍液、硝基氯化四氮唑藍(NBT)、氧化型輔酶I(NAD+)、吩嗪二甲硫酸鹽(PMS)購自上海仕博生物技術有限公司；乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、甲醛、戊二醛、IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)；3，3-二氨基聯苯胺(DAB)等其他常規試劑均為市售進口或國產分析純。
2)動物與細胞株8～12周齡Balb/c小鼠，雌性，20～25g/只，購自中科院上海動物實驗中心；Wistar大鼠，均為雄性，體重為200～250g，購自中國科學院上海實驗動物中心，實驗前于本院動物房專人飼養1周，正常飲食；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由上海市免疫研究所提供；臍靜脈內皮細胞株ECV-304購自中科院生物化學與細胞生物學研究所。
3) 自配試劑(1)細胞培養液 將RPMI 1640補充20％滅活胎牛血清，加抗生素(青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml、二性霉素25mg/ml)，谷氨酰胺(200mmol/L)及丙酮酸鈉(100mmol/L)配成完全培養液。
(2)次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷(HT)儲存液(100×)次黃嘌呤 136.1mg胸腺嘧啶核苷 38.7mg加雙蒸水至100ml，在45～50℃水浴中溶解。過濾除菌，分裝-20℃保存。
(3)氨基嘌呤(A)儲存液(100×)氨基嘌呤 1.76mg雙蒸水 90ml1mol/L NaOH 0.50ml加雙蒸水至100ml，過濾除菌，分裝-20℃保存。
(4)HAT培養液完全RPMI 1640 98ml100×HT儲存液 1ml100×A儲存液 1ml(5)HT培養液完全RPMI 1640 99ml100×HT儲存液 1ml(6)50％PEG液選用的PEG分子質量4500，濃度為50％。將PEG高壓滅菌30min，融化并冷卻到50℃(仍是液體狀態時)，加等量的無血清1640培養液，混勻后即分裝-20℃保存。用前置37℃，CO2培養箱培養一夜。
(7)10％二甲亞砜(DMSO)凍存液RPMI 1640中加入10％DMSO。臨用前新鮮配置，或置于4℃冰箱(避光)備用，保存1個月左右。
(8)包被液(pH9.6的0.05mol/L碳酸緩沖液)碳酸鈉 1.59g碳酸氫鈉2.93g雙蒸水 1000ml(9)稀釋緩沖液(含0.3％牛血清白蛋白(BSA)的pH7.4 0.02mol/L PBS緩沖液)氯化鉀 0.2g磷酸二氫鉀 0.2g磷酸氫二鈉·12H2O 2.9g氯化鈉 8g雙蒸水 1000ml臨用前加BSA(10)洗滌液同稀釋緩沖液，但以0.05％Tween-20代替BSA。
(11)底物緩沖液0.2mol/L磷酸氫二鈉 25.3ml0.1mol/L檸檬酸 24.7ml雙蒸水 100ml(12)LB液體培養基配置每升培養基，應在950ml去離子水中加入胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5g氯化鈉 10g用5mol/L NaOH調pH至7.0(13)TE緩沖液10mmom/L Tris-Hcl，pH8.01mmom/L EDTA，pH8.0(14)2×SDS上樣緩沖液10mmom/L Tris-HCl，pH6.820mmom/L DTT4％SDS2％溴酚蘭20％甘油(15)紅細胞裂解液成分為0.83％氯化銨，4℃保存(16)10×RNA電泳緩沖液(MOPS 0.2mol/L，EDTA 0.01mol/L，NaAC 0.05mol/L混勻后用2mol/L氫氧化鈉調節pH至7.0，臨用時以DEPC-H2O稀釋)(17)RNA上樣緩沖液(成分有100％甲酰胺0.5ml、37％甲醛0.2ml、10×電泳緩沖液0.1ml、溴酚蘭0.06ml，臨用時配制)2、主要儀器1)低速離心機(日本HITACHI公司)2)光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)3)CO2培養箱(德國HERAEUS公司)4)隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)5)PCR儀(HEMA公司)6)7020全自動生化儀(日本HITACHI公司)7)H-800電子顯微鏡(日本HITACHI公司)8)勻漿機(亞力恩公司)9)低溫臺式離心機(HERAEUS公司)10)SCR20BA低溫離心機(HITACHI公司)11)凝膠成像系統(TANNON公司)12)垂直電泳及電轉移裝置(Bio-Rad公司)
13)β計數儀(PACKARD公司)下面實施例中未特別指出的比例或百分比均為重量比或重量百分比。
實施例1總RNA抽提1、正常人新鮮靜脈血20ml(3.8％枸櫞酸抗凝)，低速離心得富含血小板的血漿，用1/6(體積比)3.8％枸櫞酸鈉洗滌，離心得血小板。將離心得血小板通過旋渦混合使其懸浮于1ml TRizol液中。
2、于室溫下靜置5min，加入0.2ml氯仿，顛倒混勻后，室溫靜置3min。
3、10000g 4℃離心15min，將上層水相吸入一新離心管，加入等體積異丙醇，室溫靜置10min。
4、10000g 4℃離心10min，棄上清。用75％乙醇洗滌RNA沉淀，7500g 4℃離心5min。
5、無菌干燥后用10-20μl無RNase的雙蒸水溶解，用紫外分光光度儀測定RNA的純度及含量，取RNA 4.5μl，5×甲醛凝膠電泳緩沖液2μl，甲醛3.5μl，甲酰胺10μl混合，65℃溫育15min，加入2μl甲醛凝膠電泳緩沖液上樣，5V/cm，電泳45min，鑒定RNA的完整性。
RNA含量(μg)＝稀釋倍數×A260×40×原液(ml)實施例2 RT-PCR擴增以4μg實施例1所得之總RNA為模板，進行逆轉錄反應獲得cDNA。以該cDNA鏈為模板，用上述引物進行PCR擴增得到人P-選擇素Lectin-EGF區域474bp片段。
1、引物設計根據上述文獻已報道的P-selectin基因序列和GeneBank(登錄號M25322)并結合載體的多克隆酶切位點，在上、下游引物5’端分別加入限制性內切酶位點，引物序列如下，下劃線部分為NdeI和HindIII酶切位點，引物由上海生工生物公司合成。
P1L-E1 5’GGCCAT ATGTGG ACT TAT CAT TAC AGC AC 3’NdeIP2L-E2 5’CGGAAG CTTCTC TCT CAG GTA TTC ACA T 3’HindIII2、RT-PCR逆轉錄反應體系和反應條件RNA(1.0μg/μl) 4μlRandomHemx2μlDEPC-H2O 5.8μl
混勻后，65℃ 15min5×RT緩沖液 4μlDTT(0.1mol/L) 2μldNTP(25mmol/L)0.2μlRNA sin(40U/μl)1μlM-MLV逆轉錄酶(200U/μl) 1μl混勻后，37℃ 1h，95℃ 10min總體積 20μlPCR反應體系10×PCR緩沖液 2.5μldNTP(25mmol/L)0.1μlP10.2μlP20.2μlcDNA模板3μlddH2O 18μlpfu(2.5～5U/μl)1μlPCR反應條件94℃預變性5min后，按94℃變性40s，55℃復性40s，72℃延伸90s，35個循環后再延伸10min。
3、PCR產物電泳取上述產物于2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μl溴化乙錠)中進行電泳分析，100V，30min，紫外燈下觀察上述RT-PCR產物染色條帶，結果表明擴增片段的大小與預期的474bp相符(如圖1所示)。
4、PCR產物純化用QIAGEN quick-spin PCR純化試劑盒回收PCR產物，具體過程詳見試劑盒說明。
實施例3 重組質粒的構建(參考圖13所示)1、pET42b(+)質粒的大量抽提采用QIAGEN公司Hispeed質粒大抽試劑盒進行。將保存的pET42b(+)質粒菌種接種于含30ug/ml卡那霉素(Kan)的LB液體培養基中，37℃振搖培養12～16h。培養結束后，將150ml細菌培養液分裝于4支大離心管中400rpm 4℃離心20min，棄上清，加入6ml Buffer P1(已加RNaseA)，使沉淀懸浮充分；加入6ml Buffer P2，輕輕上下顛倒5次使其混合均勻，室溫放置5min；加入6ml Buffer P3輕輕上下顛倒5次使其混合均勻，將其倒入預先準備的過濾套管中，室溫放置10min；同時準備Hispeed過濾柱并加入4mlBuffer QBT平衡，待液體重力落下排空，在離心套管中插入栓子均勻用力將溶液壓入Hispeed過濾柱中，待液體重力落下排空；用20ml Buffer QC洗柱；更換新管，柱中加5ml Buffer QF洗脫DNA；移去柱，在管中加3.5ml異丙醇混合，室溫放置5min，沉淀DNA；取一支20ml注射器，拔去栓子，將注射器與一個QIA濾器進行連接，并將混合物轉移至注射器中，插入栓子均勻用力使混合物通過濾器；移開濾器，拔出栓子后再將濾器安裝上，插入栓子，均勻用力使空氣通過濾器并重復此步；用濾紙擦干濾器去除異丙醇；取一支5ml注射器，拔去栓子，將濾器與注射器連接，在注射器中加入1ml TEBuffer，插入栓子，將DNA洗脫入1.5ml離心管中；重復此步再次洗脫得產物，-20℃保存。
2、pET42b(+)質粒和PCR擴增的目的基因雙酶切雙酶切體系質粒和實施例2所得之PCR純化產物各10μl，10×緩沖液2μl，內切酶各1μl，ddH2O 6μl，共20μl，37℃水浴4h。
3、酶切產物電泳回收純化將酶切產物經1％瓊脂糖電泳，在紫外燈下迅速挖取含相應大小的目的基因片段和質粒的瓊脂糖凝膠塊(約100mg)，放入1.5ml離心管中，用QIAGEN凝膠回收試劑盒回收純化。
操作步驟簡述如下每管中加入300μl緩沖液QG，50℃放置10min，每2min混搖一次直至完全溶解；檢查混合物顏色為橙色，加3M醋酸鈉(pH5.0)10μl，混合使其顏色變成黃色(同緩沖液QG)；由于pET42b(+)5.9Kb＞4Kb，L-E 474bp＜500bp，故在其管中加入100μl異丙醇增加產量，把樣品轉入回收柱中，13000rpm室溫離心1min；棄液體，將回收柱放入收集管中，加500μl緩沖液QG至柱中，13000rpm室溫離心1min；加750μl緩沖液PE至柱中，13000rpm室溫離心1min；棄液體，空柱離心1min；將回收柱放入1.5ml Ep管中，在濾膜中心加30μl的Elution Buffer，靜置1min后離心1min，所得即為回收產物，-20℃保存。
4、連接反應將純化的產物定量后，按目的基因片段與質粒摩爾數3∶1比例加樣。10μl反應體系T4DNA連接酶1μl，10×連接酶緩沖液2μl，加目的基因片段和質粒并補足水至10μl總量，16℃過夜。
5、重組質粒鑒定上述連接反應得到重組原核表達質粒，定名為pET42b(+)-L-E。重組質粒經NdeI、HindIII雙酶切，得目的片段。經限制性內切酶酶切后電泳，證實所插入片段與預期的結果相符(如圖2所示)。另經DNA測序，克隆的基因片段與上述文獻報道及GenBank(登錄號M25322)的序列完全一致。
6、轉化采用氯化鎂制備感受態細菌。取1ml對數生長前期DH5α細菌，5000rpm離心10min后去上清，加入100μl預冷的1×TSS致敏緩沖液(含10％PEG 8000，5％DMSO，50mmol/L MgCl2，pH6.5)懸浮細菌；冰浴5min后，加入5μl連接產物并混勻，繼續冰浴30min；加900μl LB(20mmol/L葡萄糖)，37℃振蕩培養1h，取200μl均勻涂布含Kan的LB平板上，37℃倒置培養16h。
7、質粒小量抽提挑取單個菌落接種至5ml含Kan(原核)的LB中37℃振搖培養12h；取1ml菌液以12000rpm 4℃離心1min后去上清，加入100μl預冷的溶液I(含50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)懸浮細菌，再加入200μl新鮮配制的溶液II(含0.2mol/L NaOH，1％SDS)，輕柔混勻后加入150μl預冷溶液III(含3mol/L KCl，5mol/L醋酸)，充分混勻后置冰浴5min。12000rpm 4℃離心10min后取上清，等體積苯酚/氯仿/異戊醇(三者體積比為25∶24∶1)抽提后，加入2倍體積無水乙醇，室溫放置5min，12000rpm 4℃離心10min后70％乙醇洗滌沉淀，用30μl TE(含RNaseA 100μg/ml)溶解后，取適量經過雙酶切后行1％瓊脂糖電泳初步鑒定。
8)序列測定取酶切鑒定正確的1ml菌液送上海基康生物技術有限公司測序。
9)克隆至原核表達載體對測序驗證后的pET42b(+)-L-E質粒進行提取，并按上述6法轉化入表達菌BL21。
10)質粒在大腸桿菌中表達將轉化的BL21大腸桿菌接種于5ml LB培養液中，37℃活化過夜，次日將該菌液以2％體積比例接種于250ml LB培養基中，37℃培養3h后，取1ml菌液，測A600并收集菌體作為誘導表達前的對照，其余菌液中加IPTG至終濃度為1mmol/L，誘導3h后，測A600并收集菌體。
實施例4目的蛋白質的表達與純化1、表達蛋白提取與純化收集250ml實施例3所得之表達菌，將其懸浮于4ml緩沖液A(6mol/L GuHCl，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH8.0)中，經超聲波破菌后，15000rpm/min 4℃離心15min，保留上清。取1ml Ni2+-NTAsuperflow(每ml樹脂可吸附10mg 6xHis融合蛋白)與上清液37℃混合1h，用4ml緩沖液C(8mol/L Urea，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/LTris-HCL，pH6.3)洗脫雜蛋白。專一性吸附的6xHis融合蛋白分別用2ml緩沖液D(8mol/LUrea，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH5.9)和2ml緩沖液E(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH4.5)進行洗脫。
2、表達蛋白的檢測采用SDS-PAGE和免疫印跡法進行檢測蛋白。對誘導前、誘導后及純化的樣品按0.1A10ul PBS懸浮樣品，加等體積2×SDS上樣緩沖液，沸水浴3～5min，進行SDS-PAGE電泳。分離膠為15％，積層膠為5％，接通電源后，先50V電泳約1h，待樣品進入分離膠后，調整電壓為100V，電泳2.5h。隨后將蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上。用誘導前作為對照。具體如下1)將轉移緩沖液冷至4℃。
2)切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素薄膜并用轉移緩沖液濕潤，放置15min直到沒有氣泡。
3)割4張普通濾紙其大小與膠尺寸相符，并將其浸泡在轉移緩沖液中。
4)海綿在轉移緩沖液中充分浸濕。
5)在轉移槽中倒入200ml轉移緩沖液。
6)電泳后，切取有用部分的膠并很快地轉移至緩沖液中洗滌。
7)打開蛋白質轉移槽的膠板，依次放入①浸濕的海綿；②兩張用轉移液飽和的濾紙；③用轉移緩沖液沖洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的所有氣泡；④放上硝酸纖維素膜；⑤緩沖液飽和的濾紙；⑥浸濕的海綿。
8)小心地合上轉移槽的膠板，并立即放入轉移槽中，倒入轉移緩沖液，使浸沒轉移膠版。
9)插上電極，注意正負極方向，打開電泳儀開關調至80mA，過夜。
10)轉移結束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。
免疫印跡膜的處理(0.5ml/cm)1)用TBS緩沖液洗膜5～10min。
2)將膜用封閉溶液封閉，用搖床輕輕搖動60min。
3)輕輕地轉移掉封閉溶液，并用TBS溶液洗膜兩次，懸浮洗膜一次，第二次10min。
4)加入1ml鼠抗6×His單克隆抗體(1∶50體積比稀釋)第一抗體，置搖床上輕搖，室溫下過夜。
5)棄第一抗體溶液，并用TBS洗3次，每次10min，置搖床輕輕搖動。
6)加入1ml HRP標記的羊抗鼠IgG單克隆抗體(1∶50體積比稀釋)第二抗體，將膜浸泡在此溶液中。置搖床上輕搖，室溫放置4h。
7)棄第二抗體溶液，用TBS洗3次，每次10min。
8)最后用TBS溶液洗，以轉移Tween-20。
9)取10ml底物DAB溶液，將膜浸入此溶液中至顯色清楚為止。
BL21轉化菌經IPTG誘導后表達的總蛋白質，經SDS-PAGE鑒定，在相對分子質量約16kD處有一明顯的表達條帶(如圖3A所示)，與Lectin-EGF基因編碼融合蛋白質的理論預期值相符。表達蛋白質經Ni2+-NTA superflow親和柱純化，純度達90％以上。另取陽性條帶蛋白質進行Western blot檢測，結果顯示在上述相同位置呈明顯陽性結果(如圖3B所示)。
實施例5動物免疫8周齡健康雌性Balb/c小鼠2只，用自制的抗原即實施例4所得之純化蛋白免疫3～4次，每次每只抗原量為50μg(加等量弗氏完全佐劑乳化)。初次用弗氏完全佐劑-抗原乳劑于足底及背部皮內多點注射，再次用弗氏不完全佐劑-抗原乳劑于腹股溝淋巴結及背部皮內免疫，融合前3d 50μg抗原尾靜脈加強免疫一次。三次免疫間隔時間為10～15d。最后一次免疫3～4d后，經ELISA檢測抗體陽性之后處死小鼠取脾細胞作融合用。
實施例6細胞融合、篩選及克隆化1、細胞準備1)脾細胞制備在最后一次加強免疫后第3d，取小鼠的脾臟，置于無血清的1640培養液中，用注射器內栓將脾臟攆碎，通過尼龍網過濾，制備細胞懸液。1000rpm離心5min，棄上清后重懸于5ml血清1640培養液中，計數細胞濃度。
2)飼養細胞制備于Balb/c小鼠腹腔先注射0.5ml石蠟油，4d后處死小鼠剖開腹膜，用5ml無血清1640培養液注入小鼠腹腔，清清晃動后抽出腹腔液，離心計數。用20％FCS(小牛血清)-1640調整細胞濃度至0.5～2×105/ml，立即種到96孔培養板內，0.1ml/孔，1×104/孔。
3)骨髓瘤細胞制備選用小鼠骨髓瘤株SP2/0，收集對數生長期的骨髓瘤細胞，洗滌記數，調整濃度為4～5×105/ml，懸浮于無血清1640培養液中備用。
2、細胞融合將脾細胞與SP2/0細胞以10∶1(細胞數比)混合，1000rpm離心5min，傾去上清，輕彈沉降下來的細胞團塊，使之完全松散。以1ml移液管吸取50％PEG 1ml在1min內邊攪拌邊加入，加完后靜置90s。之后以無血清1640培養液終止融合，開始時須緩慢加入(1ml/min)，而后逐漸加快，邊加邊攪，共加入10ml終止液。1000rpm離心7min，去除上清，繼續下一步操作。從加入PEG開始融合到融合終止，整個過程須在37℃水浴下進行。
3、陽性克隆的篩選1)細胞培養將離心后的細胞團塊輕輕彈散。待細胞完全松散后用HAT培養基重懸，加入到已用飼養細胞鋪好的96孔板中，每孔100μl。置于37℃，5％(體積百分比)CO2的培養箱中培養。一周后，在倒置顯微鏡下觀察克隆生長情況并記錄每孔克隆數。觀察后每孔補充100μl新鮮HAT培養基。待細胞生長至占培養孔底1/3面積時即可吸取培養液上清進行ELISA檢測。
2)ELISA檢測以包被液將原核表達蛋白(抗原)濃度調為50ng/ml，每孔100μl包被酶標板，置于4℃過夜后甩干上清。
用洗滌液將包被好的酶標板洗滌3次，每次5min，然后用1％BSA-PBS封閉液封閉，每孔200μl，室溫放置2h。
傾去封閉液，同上洗滌，每孔加入100μl待檢雜交瘤上清，于37℃孵育1.5h。
傾去未結合樣品，洗滌后每孔加入1∶1000(體積比)稀釋的羊抗鼠IgG-HRP(辣根過氧化物酶)結合物100μl，于37℃孵育1h。
將多余的酶結合物洗去，同上洗滌。每孔加入100μl的底物反應液，室溫顯色10-30min后，每孔加入50μl的終止液(2mol/L H2SO4)終止反應。用酶標儀495nm測OD值，OD值大于陰性孔2倍以上者進行克隆化培養。
4、雜交瘤細胞的克隆化(單個細胞培養)采用有限稀釋法進行克隆化。
1)克隆當天制備飼養細胞，接種96孔板內，0.1ml/孔(2×104/孔)。
2)陽性細胞從培養板內輕輕沖洗下，計數。
3)用培養液連續稀釋細胞懸液成10個細胞/ml接種加有飼養細胞的96孔板內，0.1ml/孔。
4)10天左右，雜交瘤細胞集落長至孔底1/3面積時，開始測定上清中抗體活性。
5)測得有抗體活性的陽性細胞孔時，再克隆，共進行3次。
經上述重復進行ELISA篩選及亞克隆，最后篩選出3株能穩定分泌抗P-選擇素Lectin-EGF單抗(PsL-EGFmAb)的雜交瘤細胞株，分別為PsL-EGFmAb-CSRJZT-1(CCTCC-C2003012)、F3和H5。
實施例7單克隆抗體的制備及鑒定1、腹水制備及抗體純化接種Babl/c小鼠前7～10d腹腔注射0.5ml石蠟油。將上述3株雜交瘤分別擴大培養后對Balb/c小鼠進行腹腔注射(2×107cell/只)，10～14d后收集腹水，腹水產量為4～6mL/只，2000rpm離心，5min，取上清，用Protein A Sepharose-4B柱純化腹水中的單抗(沈關心，周汝麟主編，現代免疫學實驗技術，第2版，湖北科學技術出版社，199851)，-80℃保存。
2、單抗篩選和亞類鑒定的結果及效價測定利用羅氏公司Ig亞類測定試劑盒，檢測上述3株陽性雜交瘤細胞的培養上清液，鑒定結果分別為IgG2、IgG1和IgG3，其輕鏈均為κ型；用間接ELISA法檢測細胞培養上清液和腹水中單抗效價，抗原為Lectin-EGF融合蛋白質及非表達菌的蛋白質。
其中，間接ELISA法檢測腹水抗體效價的步驟如下1)用稀釋緩沖液將腹水依次稀釋成體積比為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400、1∶204800，設4個復孔。
2)將抗P-selectin單抗(實驗對照PsmAb)依次稀釋成體積比為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400、1∶204800，設2個復孔。
3)以Lectin-EGF片段蛋白包被酶標板，采用間接ELISA法檢測腹水抗體效價，腹水未純化效價可達10-5，腹水經Protein A Sepharose-4B柱層析，純化后抗體ELISA檢測的效價可達10-6。
3、單抗的特性鑒定1)一般性質腹水經紫外測定蛋白濃度，CCTCC-C2003012、F3和H5產生的單抗蛋白質定量分別為16.71g/L、22.68g/L和22.32g/L。此外，ELISA檢測結果表明，雜交瘤細胞培養上清液和腹水中單抗均能與融合蛋白質Lectin-EGF特異性結合，而不與非表達菌的蛋白質結合。
2)單抗與活化內皮細胞的結合采用間接免疫熒光染色法和流式細胞儀(FACS)檢測。分別取經LPS(50mg/L及100mg/L)刺激和未受刺激培養24h的內皮細胞ECV304(4×105/mL)，均分別與3株單抗和對照單抗(均1∶40體積比稀釋)于4℃作用4h，再與二抗(羊抗鼠IgG-FITC)于4℃作用0.5h。最后用1％多聚甲醛-PBS固定細胞后上FACS分析結果。
經檢測，3株單抗和對照單抗均可與經LPS刺激培養24h的ECV304細胞特異性結合(僅出現單一結合峰)。其中CCTCC-C2003012分泌的單抗與兩種濃度LPS激活的細胞結合率分別為18.65％、29.25％，對照單抗為20.60％、31.59％，且隨LPS濃度的增加，單抗與ECV304細胞結合率均也隨之增加。
應用實施例1 PsL-EGFmAb對血小板與中性粒細胞粘附的影響1、方法1)分離血小板取5ml正常人EDTA抗凝血，500rpm低速離心10min，得富含血小板血漿，3000rpm離心10min，棄上清得血小板(1×108/mL)。
2)分離中性粒細胞于上述低速離心后得到的富含血細胞沉積物，加入2倍體積的PBS緩沖液和1/3體積的Dextran分離中性粒細胞，混勻后37℃孵箱放置15min，上層即富含中性粒細胞成分，加入紅細胞裂解液至10ml，1000rpm離心10min，棄上清得中性粒細胞(1×107/mL)。
3)取分離的血小板(1×108/mL)20μl滴片制成細胞微孔片，與凝血酶(1U/mL)或PBS(陰性對照)于37℃孵箱作用10min，加1％多聚甲醛-PBS固定，用Tris(250mmol/L)中止固定15min；PBS緩沖液洗血小板3次后，再分別與3株單抗(1∶40體積比稀釋)、對照單抗(1∶40體積比稀釋)及1％BSA-PBS于37℃作用15min。然后加入中性粒細胞(1×107/mL)20μl作用30min后，置顯微鏡下觀察結果。
2、結果如圖4A-4D所示，未受凝血酶刺激的血小板不與中性粒細胞粘附結合；經凝血酶激活后的血小板可與中性粒細胞明顯結合；而預先用本發明的單抗和對照單抗分別處理后的血小板均不顯示與中性粒細胞粘附結合。
3、結論上述結果表明，本發明的單抗在體外具有阻斷活化血小板與中性粒細胞結合的抗粘附功能。
應用實施例2 PsL-EGFmAb對中性粒細胞與內皮細胞粘附的影響1、方法1)人臍靜脈內皮細胞株ECV-304置含10％小牛血清的1640培養液，37℃，5％CO2條件下培養，2d換液一次。收集細胞時，加入胰酶作用1min，見細胞收縮為圓形后，再加入含10％小牛血清的1640培養液終止消化，轉移細胞至離心管中，2000rpm離心3min，去上清，打勻沉淀。調整細胞濃度至3～5×106/ml。
2)于96孔板中每孔加入上述細胞混懸液100μl，約含細胞3～5×105。37℃，5％CO2培養24h后觀察細胞貼壁情況，如果細胞貼壁良好，則繼續進行，反之重新開始。
3)于96孔板每孔加入TNF-α(終濃度為500U/ml)處理呈單層的內皮細胞，繼續培養24h。
4)用生理鹽水配制PsL-EGFmAb、PsmAb溶液。于含有ECV-304的96孔板中，分別按3個濃度(終濃度分別為0.01、0.05、0.1mg/ml)加入上述二種藥物，5μl/孔，輕輕振蕩后，37℃放置30min。
5)制備人外周血中性粒細胞(1)取15ml正常人新鮮EDTANa2抗凝血，分成5管，1×PBS 1～2倍稀釋。
(2)從底部輕緩加入Ficoll分離液2ml，避免破壞液面。
(3)2000rpm，低速離心30min，棄上清(血漿)與中層(淋巴細胞與Ficoll分離液)，收集富含紅細胞與中性粒細胞的沉積物。
(4)加入2倍體積的PBS緩沖液和1/3體積的Dextran，混勻。
(5)置37℃孵箱放置30min。
(6)吸出上清，1500rpm，離心10min。
(7)棄上清，加入4℃預冷的紅細胞裂解液至10ml，混勻后置4℃ 5min。
(8)1500rpm，離心10min，棄上清得中性粒細胞，用PBS洗滌，合并后計數，調整細胞濃度至3～5×106/ml。
(9)常規Gimsa染色，鏡下觀察，純度應大于95％。
6)中性粒細胞與內皮細胞粘附實驗在步驟4)結束后，于96孔板內再加入中性粒細胞100μl(3～5×105個細胞/孔)，每組3復孔，置37℃，5％CO2孵育30min，用PBS洗去未粘附細胞。另設空白孔(只加內皮細胞，不行TNF-α刺激)和對照孔(加內皮細胞，行TNF-α刺激后再加中性粒細胞)。
7)加入0.25％虎紅，100μL/孔，振蕩后，室溫作用30min。用自來水輕輕沖洗游離虎紅后，再用1×PBS洗滌，稍干后，加PBS-乙醇(1∶1體積比)200μL/孔，振蕩后，室溫作用1h，酶標儀570nm測OD值。
計算方法粘附量＝實驗孔OD值-空白孔OD值8)數據結果以均數±標準差表示，采用t檢驗。
2、結果
PsL-EGFmAb對中性粒細胞與內皮細胞粘附的影響(表1)表1中性粒細胞與內皮細胞粘附試驗檢測結果 *與其他各組比較，P＜0.05；**在各濃度，與其他各組比較，P＜0.05；***在各濃度，與其他各組比較，P＜0.05。
3、結論本實驗利用TNF-α誘導血管內皮細胞活化，從而表達P-選擇素，并介導與中性粒細胞粘附，藉此模擬體內急性炎癥早期的反應狀態。在此基礎上，應用PsL-EGFmAb和對照單抗進行干預研究。研究發現，二種單抗處理組的細胞粘附量均少于生理鹽水對照組(P＜0.05)，干預效果均隨藥物濃度的升高而增強。此外，在相同的濃度下，本發明的PsL-EGFmAb抗粘附效應均比對照單抗PsmAb強(兩兩比較，P＜0.05)。
應用實施例3 PsL-EGFmAb對大鼠腎缺血再灌注損傷的防治作用粘附分子P-選擇素通過介導中性粒細胞與內皮細胞粘附聚集，在缺血再灌注引起的腎組織損傷中起重要作用。下面應用實施例擬利用腎缺血再灌注大鼠模型，進一步觀察和分析PsL-EGFmAb對再灌注腎損傷的防治作用，以評價該單抗在作為抗粘附作用藥物中的應用價值。
1、方法1)65只Wistar大鼠被隨機分為治療組和非治療組，分別按不同再灌注時間(1、3、6、24h)再分為4組。
治療組每時間點10只。其中，PsL-EGFmAb和PsmAb治療組各5只。
非治療對照組每時間點5只，以生理鹽水對照。
另設5只作為假手術對照組(僅做麻醉、開腹，不阻斷血流)。
2)大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型構建2.5％戊巴比妥鈉腹腔麻醉，開腹，暴露腎臟。用無創傷微動脈夾夾閉左腎動脈，同時切除右腎，60min后移去微動脈夾，恢復灌注。治療組均于恢復灌注前5min，于陰莖靜脈分別注射PsL-EGFmAb及PsmAb，劑量均為2mg/kg，對照組于相同的時間陰莖靜脈注射生理鹽水1ml。實驗組與對照組均分別按相應時相點于腹主動脈采血及取腎組織。
3)標本采集及檢測方法
(1)血標本部分用于檢測BUN、Scr；部分用于測定凝血酶原時間(PT)與部分激活凝血時間(KPTT)。
(2)取腎組織置10％甲醛中固定，常規切片和HE染色，光鏡下觀察腎組織病變情況。
(3)在400倍光鏡下觀察病理切片，每個視野選擇10個腎小管評分，共選取皮質區域的5個不同視野，按50個腎小管累積評分。腎小管病理改變評分依據①腎小管上皮細胞扁平(1分)；②刷狀緣脫落(1分)；③間質水腫(1分)；④胞漿空泡形成(1分)；⑤細胞壞死(1～2分)；⑥腎小管管腔阻塞(1～2分)；⑦分值高代表損傷嚴重，單個腎小管損傷最高積分為10分，最低為0分。
(4)取腎組織置2％戊二醛固定，制片后，進行電鏡觀察，觀察亞細胞結構的病理改變。
(5)免疫組化LSAB法檢測腎組織中P-selectin表達。
主要操作步驟如下①組織切片經二甲苯脫蠟3次，每次20min；梯度乙醇水化(100％，95％，70％，50％乙醇各一檔，每檔2min)后，TBS漂洗5min，3次。
②3％過氧化氫孵育10min以清除內源性過氧化物酶活性。TBS漂洗5min，3次，③滴加1∶20(體積比)稀釋的正常兔血清，室溫下孵育20min。抖掉并擦拭多余的血清。
④滴加1∶100(體積比)稀釋的P-selectin全長單抗(一抗)，室溫下孵育30min，4℃過夜。TBS漂洗3次，共5min。
⑤滴加1∶400(體積比)稀釋的生物素化兔抗鼠免疫球蛋白(二抗)，室溫下孵育30min。TBS漂洗3次，共5min。
⑥滴加1∶400(體積比)稀釋的抗生物素化過氧化酶-鏈霉卵蛋白素復合物，室溫下孵育30min。TBS漂洗3次，共5min。
⑦滴加0.05％DAB顯色劑，室溫下孵育2～10min。流水沖洗10～20min。
⑧蘇木素復染5min，自來水沖洗20min。鹽酸酒精分化，流水沖洗10～20min。
⑨切片經95％、100％乙醇各二檔脫水，二甲苯二次透明，中性樹膠封片。
⑩光鏡下判定結果(陽性呈棕黃色顆粒)。
4)數據結果以均數±標準差表示，采用t檢驗。
2、結果
1)大鼠腎缺血再灌注24h的BUN與Scr變化(表2)表2模型鼠BUN、Scr的變化BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)假手術組 7.88±0.57 39.00±4.47生理鹽水組*14.54±0.67102.21±4.76PsmAb組 9.3±0.50 50.05±4.18PsL-EGFmAb組**8.78±0.46 45.62±3.17*與假手術組相比，P＜0.01；與各治療組相比，P＜0.01；**與PsmAb組相比，P＜0.05。
2)缺血再灌注后腎組織病理學改變(1)肉眼改變缺血再灌注后，生理鹽水對照組的大鼠腎臟皮質蒼白、髓質瘀血，顏色深暗；治療組則腎臟外觀與假手術組接近。
(2)光鏡改變缺血再灌注后，生理鹽水對照組的大鼠腎臟可見腎小管上皮細胞腫脹，出現明顯的變性與壞死，腎小管阻塞，腔內有脫落細胞，間質有出血或充血水腫及大量炎細胞浸潤，再灌注1h、24h較輕，3h與6h組病變較重；治療組，光鏡下僅見部分腎小管上皮細胞輕度腫脹、少量變性與壞死，腎間質無明顯改變及炎細胞浸潤(圖5、6、7)。
(3)電鏡改變缺血再灌注1h后，腎臟即出現超微結構改變，3h后改變明顯。生理鹽水對照組出現嚴重的線粒體腫脹，排列紊亂；基底膜不完整；腎小管管腔狹窄，上皮細胞空泡變性，近曲小管上皮細胞內有明顯的脂滴，核固縮多見；間質有較多白細胞浸潤，以中性粒細胞為主，巨噬細胞亦可見到。抗粘附治療組線粒體腫脹為輕度，形狀尚清晰，排列較整齊；基底膜相對完整；腎小管管腔狹窄不明顯，部分上皮細胞輕度空泡變性，近曲小管上皮細胞核固縮偶見；間質白細胞浸潤較少，中性粒細胞少見(圖8、9、10)。
3)腎組織P-selectin的表達缺血再灌注1h，P-selectin即在腎組織中廣泛表達，至24h仍有表達，包括腎小球系膜區、毛細血管、腎小管和腎間質等，其中以腎小管上皮細胞表達最為明顯。經PsL-EGFmAb及對照單抗PsmAb治療后，腎組織內基本未出現棕黃色顆粒，即基本未見P-selectin表達(圖11、12)。
4)腎小管損傷評分(表3)
表3模型鼠腎小管損傷評分結果1h 3h 6h24h假手術組 0 00 0生理鹽水組*53.20±2.77 79.00±1.51 113.60±2.88 225.80±3.76PsmAb組41.00±1.56 65.00±1.53 83.60±3.78 164.60±3.21PsL-EGFmAb組**35.00±2.34 60.80±1.92 82.80±2.59 149.60±2.70*在各時間點，生理鹽水對照組與各治療組相比，P＜0.05；**在缺血再灌注1、3、24h，與其他各組相比，P＜0.05；在6h點，與PsmAb組相比，P＞0.05。
5)兩種藥物對模型鼠PT、KPTT的影響(表4)表4模型鼠PT、KPTT測定結果PT(s) KPTT(s)假手術組 13.4±1.717.9±2.9生理鹽水組 13.7±1.417.6±3.1PsmAb組 13.4±1.317.3±2.9PsL-EGFmAb組 13.5±1.217.2±3.0各組間兩兩比較，P＞0.05。
3、結論利用大鼠腎缺血再灌注損傷模型，再次證明P-selectin與腎缺血再灌注損傷關系密切。經兩種單抗藥物治療后，P-選擇素表達下調，腎組織內炎癥細胞浸潤減少，病理損傷相對較輕，腎小管損傷評分情況也與此趨勢一致。進一步表明抑制P-選擇素及其介導的細胞粘附，可阻抑白細胞粘附聚集、炎癥介質釋放等級聯反應，從而減輕炎癥反應與腎損傷，改善腎功能。顯示了兩種藥物均有良好抗粘附防治效果，進一步比較后發現，在相同實驗條件下，PsL-EGFmAb效果最佳，表明該功能域單抗可能更具靶向性。此外，上述實驗也提示，本發明的單抗對機體凝血指標無明顯影響，顯示了使用安全性。
應用實施例4 PsL-EGFmAb對大鼠腎缺血再灌注損傷免疫防御功能的調節1、方法1)大鼠腎缺血再灌注損傷模型構建及標本采集的方法見應用實施例3。
2)有絲分裂原誘導的大鼠T細胞增殖實驗。
(1)自腎缺血再灌注24h，取大鼠脾臟，制成細胞懸液。
(2)計數，用含20％胎牛血清的1640完全培養液，調整細胞濃度至1.0×106/ml。
(3)于96孔培養板中各孔加入含20％胎牛血清的1640完全培養液20μl，ConA(10μg/ml)或0.9％NaCl對照液20μl，各4孔。然后各孔加入上述細胞懸液100μl，加蓋，置37℃，5％(體積比)CO2培養72h。
(4)每孔加入20μl3H-TdR(相當于1μCi，特異性比活性為5Ci/mmol)，繼續培養4h，用細胞收集器將細胞吸附在玻璃纖維濾紙片上，用生理鹽水充分洗滌，洗去游離的3H-TdR。滴加5％三氯醋酸1～2ml固定細胞，并用無水乙醇脫水、脫色。
(5)將濾紙片烘干后，用鑷子按順序分別依次放入盛有4ml閃爍液的塑料管內。用β閃爍儀測定樣品1min，將4份測定值中除去讀數最高或最低者，取其平均值。
(6)計算實驗組(加ConA)及對照組(加NaCl)每分鐘脈沖數cpm值。
刺激指數(stimulating index，SI) 3)LPS刺激B細胞增殖實驗(1)脾細胞懸液制備、計數及細胞濃度(1×106/ml)調整同上2)中的步驟(2)。
(2)于96孔培養板中各孔加入含20％胎牛血清的1640完全培養液20μl，100μl LPS(10μg/ml)或0.9％NaCl對照液20μl，各4孔。然后各孔加入脾細胞懸液100μl，加蓋，置37℃，5％(體積比)CO2培養72h。
(3)培養至46h時，每孔加入50μl 0.1mCi/ml的3H-TdR，繼續培養。
(4)收集細胞至玻璃纖維濾膜上，濾膜放烘箱內干燥。
(5)將濾膜于含5ml閃爍液的測量瓶中，β閃爍儀自動測定樣品1min，將4份測定值中讀數最高或低者除去，取其平均值。
(6)計算實驗組(加LPS)及對照組(加NaCl)cpm值 4)LDH酶釋放法測定NK細胞活性(1)底物溶液配制(臨用前)硝基氯化四氮唑藍(NBT)4mg，氧化型輔酶I(NAD+)10mg，吩嗪二甲硫酸鹽(PMS)1mg，加蒸餾水2ml溶解，混勻后取上液1.6ml加1mol/L乳酸鈉0.4ml，然后加0.1mol/L、pH7.4的PBS至10ml。
(2)用完全1640培養液將脾細胞懸液調整濃度至1×107/ml，作效應細胞備用。
(3)取經24h培養的YAC-1細胞，用完全1640培養液洗滌1次，1000rpm，離心6min。去上清，用完全RPMI-1640培養液重懸后計數，并用0.5％臺盼藍染色檢測活性，活細胞應＞95％，然后調整細胞濃度至1×105/ml，作靶細胞備用。
(4)用40孔細胞培養板，每樣本3個復孔，每孔各加100μl靶細胞和效應細胞混勻。同時設靶細胞自然釋放對照組和最大釋放對照組(靶細胞100μl+1％ NP-40液100μl)，100rpm低速離心2min后，置37℃，5％(體積比)CO2溫箱培養2h。
(5)取出培養物，吸取各孔上清100μl加于另一反應板中，每孔加入新鮮配制的底物溶液100μl，置室溫避光反應10～15min，每孔加入1mol/L檸檬酸終止液30μl，以終止酶促反應。
(6)用酶標檢測儀于570nm波長下讀取各孔OD值，并計算NK細胞活性。
5)數據結果以均數±標準差表示，進行t檢驗。
2、結果1)T細胞功能的檢測結果(表5)表5模型鼠T細胞功能檢測結果T細胞活性(SI)假手術組*14.83±1.27生理鹽水組 5.76±2.45PsmAb組 50.97±25.79PsL-EGFmAb組**51.56±19.91*與其他各組相比，P＜0.01；**與生理鹽水組相比，P＜0.05；與PsmAb組相比，P＞0.05。
2)B細胞功能的檢測結果(表6)表6模型鼠B胞功能檢測結果B細胞活性(SI)假手術組*8.37±0.32生理鹽水組 3.27±1.04PsmAb組3.63±0.50PsL-EGFmAb組**3.51±0.10*與其他各組相比，P＜0.01；**與PsmAb組相比，P＞0.05。
3)NK細胞功能的檢測結果(表7)表7模型鼠NK細胞功能檢測結果NK細胞活性(％)假手術組*15.56±1.95生理鹽水組 27.04±3.79PsmAb組16.09±3.24PsL-EGFmAb組**15.72±0.28
*與生理鹽水組相比，P＜0.01；與PsmAb組、PsL-EGFmAb組相比，P＞0.05；**與PsmAb組相比，P＞0.05。
3、結論由上述實驗結果可見，大鼠腎臟缺血再灌注后，體內T、B細胞活性明顯受抑，而NK細胞顯著激活。提示在缺血再灌注應激損傷過程中，不同淋巴細胞據各自生物學功能產生了不同的免疫防御反應，可能與缺血再灌注損傷所致機體免疫防御機制改變有關。進一步發現，經單抗藥物治療后，大鼠T、NK細胞活性產生上調或下調，而B細胞活性變化不明顯，但均未見細胞功能抑制。可能是因為經抗粘附治療后，可調節或影響上述各具不同生物活性細胞的粘附分子選擇素信號轉導，以致產生不同調抑結果。故本研究提示，本發明的PsL-EGFmAb對腎缺血再灌注的抗粘附保護作用，可能與其同時兼有抗炎和免疫調節作用有關，但至少不會產生免疫抑制或降低機體抵抗力，從而進一步表明本發明的PsL-EGFmAb可能更具有潛在的臨床應用前景。
權利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于該抗體能特異性針對人P-選擇素凝集素-表皮生長因子功能域，與P-選擇素結合。
2.產生如權利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為CCTCC-C2003012。
3.如權利要求1所述的單克隆抗體在制備抗粘附作用藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種能特異性地抗人P－選擇素凝集素－表皮生長因子功能域的單克隆抗體，以及產生該單克隆抗體的雜交瘤。本發明的單抗為進一步揭示P－選擇素的結構與功能關系，闡明P－選擇素的生理、病理意義，并可為針對P－選擇素的抗粘附調節與治療提供了手段。
文檔編號A61P29/00GK1542020SQ20031010852
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月7日 優先權日2003年11月7日
發明者周同, 周 同 申請人:上海第二醫科大學附屬瑞金醫院