專利名稱：具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法
技術領域：
本發明涉及一種修復和重建骨缺損的生物材料，特別是一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法。
背景技術：
同種骨組織具有來源廣、提供生物愈合以及治療費用低等優點，因此廣泛應用于各種原因引起的骨關節缺損修復與重建治療。歐美國家，每年大約使用100萬件，我國同種骨移植的臨床應用從上個世紀五十年代開始，近10年才建立正規的骨組織組織庫，每年大約使用2萬件。
目前骨組織庫提供的產品，包括新鮮冷凍骨、冷凍干燥骨和脫鈣骨。制備過程取材、修整、脫脂/脫鈣、滅菌、冷凍和深低溫保存，其制備方法為直接冷凍和鈷源輻射滅菌，經處理后的骨組織失去其生物活性，同時鈷源輻射后骨的生物力學強度明顯降低。依據組織凍傷理論，如果將常溫下骨組織直接放入-80℃或更低溫的環境下，骨表層和深層降溫速率的不一致將導致骨組織細胞內冰晶形成的不一致，出現細胞內冰晶形成(intracellular ice formation，IIF)、細胞的冷休克、細胞外液的玻璃樣變以及凍融過程中對細胞的影響是細胞損傷的重要因素。導致制備后同種骨組織的生物誘導活性消失，生物力學強度下降，移植后出現骨折、骨不愈合和關節功能障礙等并發癥，嚴重制約臨床應用。在游離細胞的凍存研究中，冷凍生物學家們發現緩慢降溫和快速復溫有利于細胞的存活，在歐美等國正在進行器官方面包括心臟、腎臟和肝臟等的應用基礎研究，在骨組織方面未見報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具備良好的生物誘導活性和生物力學強度，維持一定數量具有生物活性的軟骨細胞，增加移植后同種骨的愈合能力，減少并發癥的發生率，改善移植后的關節功能，為臨床提供適宜的生物移植材料的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法。
實現本發明目的的技術解決方案為一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其步驟為1、生物活性骨組織的獲取在無菌條件下獲取同種骨關節組織；2、生物活性骨組織的修整剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關節囊、韌帶和肌肉的附著點；3、生物活性骨組織的脫脂氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝；4、梯度降溫將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以0.5～2℃/min的速率梯度降溫至-40℃～-60℃，歷時20-80min；5、保存將降溫后的骨組織投入-60～80℃冰箱中保存。
本發明與現有技術相比，其顯著優點是經梯度降溫、深低溫保存的同種骨關節能夠保持骨的超微結構的完整性、骨誘導活性、生物力學強度，同時維持一定數量的成活的軟骨細胞，能夠增加移植后與宿主的愈合能力，減少并發癥的發生率，改善移植后的關節功能，為臨床提供具備生物活性的同種骨關節。
四說明書附圖
附圖是本發明的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法的流程示意圖。
五
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步描述。
實施例1。結合附圖，一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其具體的實施過程為在無菌條件下獲取同種骨關節組織，剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關節囊、韌帶和肌肉的附著點，用氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝，將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以2℃/min的速率梯度降溫至-40℃，歷時80min，將降溫后的骨組織投入-80℃箱中保存。
經本發明制備和保存后一月的同種骨組織的力學數據如下拉伸彈性模量壓縮彈性模量拉伸 壓縮處理(Gpa) (Gpa)泊松比μ 泊松比μ本發明制備、18.23 13.630.32 0.345保存同種骨Reilly測試17.918.3正常新鮮股骨數據表明以本發明制備、保存的同種骨組織的彈性模量與新鮮骨組織無明顯差異，說明經制備、保存后骨組織的生物力學特性與新鮮骨相近。
實施例2。結合附圖，一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，用于骨腫瘤切除后修復、重建大段骨缺損的保肢治療。
患者，男性，16歲。右大腿下部疼痛一月，經影像學和病理學檢查證實為右股骨下段骨肉瘤，經手術切除完整右股骨下段的腫瘤骨關節，切除長度16公分，切除后遺留的股骨下段缺損，采用本發明方法制備的同種異體股骨下段進行骨骼重建，不僅徹底地切除了腫瘤組織，而且保留了患肢的功能。采用同種異體骨移植是肢體腫瘤保肢治療的主要方法之一，國外文獻統計90％以上的肢體惡性骨腫瘤都獲得保肢治療。
惡性骨腫瘤保肢治療的重要環節，是如何重建惡性骨腫瘤切除后的大段骨缺損，大段同種骨移植是最常用的方法。其具體的實施過程為在無菌條件下獲取同種骨關節組織，剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關節囊、韌帶和肌肉的附著點，用氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝，將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以1.0℃/min的速率梯度降溫至-50℃，歷時50min，將降溫后的骨組織投入-100℃冰箱中保存。
采用梯度降溫、深低溫保存的同種骨組織進行移植手術，在臨床上具有良好的愈合能力，通常移植后的四個月在同位素锝99骨掃描片上可觀察到移植部位骨濃聚的現象，特別在宿主骨與移植骨的結合部位，表明移植骨的骨代謝活躍，提示與宿主開始骨愈合。在移植后6個月普通X-線平片上可觀察新生骨已形成并包繞移植骨。通常在8-10月宿主骨與移植骨的結合部位的間隙消失，表明宿主骨與移植骨已完全愈合，較直接冷凍骨和冷凍干燥骨相比，骨愈合的時間縮短約2-3個月，其中最長的隨訪時間達36個月，移植骨未發現骨折的現象。目前已在臨床實驗性已應用60余例，各種并發癥的發生率低于25％。
實施例3。結合附圖，一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，用于骨感染性骨缺損的修復、重建治療。因骨髓炎引起骨缺損是臨床上常見的感染性疾病，自體骨移植是常用的治療方法，一方面給患者帶來新的痛苦，另一方面自體骨往往滿足不了缺損的需要，應用同種骨組織移植是新的治療方法。其具體的實施過程為在無菌條件下獲取同種骨關節組織，剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關節囊、韌帶和肌肉的附著點，用氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝，將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以1.5℃/min的速率梯度降溫至-40℃，歷時60min，將降溫后的骨組織投入-90℃冰箱中保存。
采用梯度降溫、深低溫保存的同種骨組織進行感染性骨缺損的修復手術，在臨床上能夠修復因感染引起的骨缺損，恢復骨的連續性，同時能夠有效的控制感染，使骨髓炎得到康復。目前已在臨床實驗性已應用20余例，臨床有效率達96％。為臨床治療骨髓炎提供一種可靠、經濟的修復手段。
外傷性骨缺損、骨腫瘤性和感染性骨缺損是臨床常見的疾病，通常需要骨移植進行修復和重建。歐美國家應用廣泛，每年大約使用100萬件，而國內有記錄的每年大約只有2萬件。我國的人口基數大，同時處于發展中國家，骨的創傷、感染和腫瘤等疾病的發病率高，具有普遍的應用基礎。本發明獲得的同種骨組織的制備方法，所獲得的同種骨移植材料，能夠保持骨的超微結構的完整性、骨誘導活性、生物力學強度。能夠加速移植后與宿主的愈合能力，減少并發癥的發生率，改善移植后的關節功能，為臨床提供具備生物活性的同種骨組織，具有廣泛的應用前景，能夠產生極大的經濟和社會效益。
權利要求
1.一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其特征在于其步驟為1.1生物活性骨組織的獲取在無菌條件下獲取同種骨關節組織；1.2生物活性骨組織的修整剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關節囊、韌帶和肌肉的附著點；1.3生物活性骨組織的脫脂氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝；1.4梯度降溫 將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以0.5～2℃/min的速率梯度降溫至-40℃～-60℃，歷時20-80min；1.5保存將降溫后的骨組織投入-80℃～180℃冰箱中保存。
2.根據權利要求1所描述的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其特征在于將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以1～2℃/min的速率梯度降溫至-40℃～-50℃，歷時20-80min，將降溫后的骨組織投入-70～80℃冰箱中保存。
3.根據權利要求1所描述的具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其特征在于將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以2℃/min的速率梯度降溫至-40℃，歷時80min，將降溫后的骨組織投入-80℃～180℃冰箱中保存。
全文摘要
本發明涉及一種具備生物活性同種骨組織的制備及保存方法，其步驟為1.生物活性骨組織的獲取在無菌條件下獲取同種骨關節組織；2.生物活性骨組織的修整剔除軟組織及骨膜，清除骨髓組織，保留部分關節囊、韌帶和肌肉的附著點；3.生物活性骨組織的脫脂氯仿甲醇浸泡，生理鹽水沖洗后包裝；4.梯度降溫將預處理后的骨組織放置程序降溫儀中，以0.5～2℃/min的速率梯度降溫至－40℃～－60℃，歷時20－80min；5.保存將降溫后的骨組織投入－60～80℃冰箱中保存。本發明能夠保持骨的超微結構的完整性、骨誘導活性、生物力學強度，同時維持一定數量的成活的軟骨細胞，能夠增加移植后與宿主的愈合能力，減少并發癥的發生率，改善移植后的關節功能。
文檔編號A61L27/00GK1528469SQ20031010603
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月9日 優先權日2003年10月9日
發明者施鑫, 吳蘇稼, 趙建寧, 周光新, 陸盟, 施 鑫 申請人:中國人民解放軍南京軍區南京總醫院