乳鐵蛋白組合物和創傷治療的方法

專利名稱：乳鐵蛋白組合物和創傷治療的方法
技術領域：
本發明涉及乳鐵蛋白組合物和使用該組合物治療創傷的方法。所述組合物可單獨給藥或與其它標準創傷愈合療法聯合給予。此外，該組合物還可包含金屬螯合劑。
背景技術：
已經研制出的用于治療創傷，如部分皮膚燒傷的生物技術產品相對較少。絕大多數努力針對的是慢性創傷，其無需適當水平的細胞生長因子用于愈合。慢性潰瘍治療的絕大多數常規選擇均包括迅速清創以除去所有不能生長發育的組織，一種非-承重的治療方案，在用溫和的香皂和水清潔潰瘍周圍的皮膚時，每天更換濕的生理鹽水敷料2次。目前慢性潰瘍的先進療法包括生長因子、皮膚替代療法、酶和機械清創以清潔局部出血組織、濕的創傷敷料、非-抗生素清潔劑、抗生素(Edmonds等人，2000，Lipsky和Berendt 2000，Moulin等人，1998，Mandracchia等人，2001)。然而，目前慢性創傷的療法并不完全有效。事實上，Regranex凝膠或Becaplermin(重組-人血小板-衍生的生長因子-BB)，市場上僅有的用于慢性創傷的生物產品(糖尿病性神經病性潰瘍)與安慰劑相比，顯示出僅9-23％的改善，與單獨良好的潰瘍護理相比，顯示出僅4-22％的改善(Mandracchia等人，2001，Edmonds等人，2000，Wieman 1998)。因此，仍然需要用于慢性和/或急性創傷的有效治療。
乳鐵蛋白是一種在肌體中表達的免疫調節人蛋白，并發現它們在乳汁和初乳中的濃度最高。重組人乳鐵蛋白(RhLF)是在黑曲霉(黑曲霉)，一種絲狀真菌中產生的重組糖蛋白。所有物質中的RhLF與天然乳鐵蛋白在結構上是相同的，并具有與宿主防御機理相關的廣泛功能。例如，已經報道過乳鐵蛋白可激活天然殺傷(NK)細胞，誘導集落刺激活性，激活多形核中性粒細胞(PMN)，調節粒細胞生成，增強抗體-依賴性細胞毒性，刺激淋巴因子-激活的殺傷(LAK)細胞活性，并加強巨嗜細胞毒性。
先前已經描述過在各種原核生物和真核生物包括曲霉(美國專利號US6,080,559、家畜(美國專利號US5,919,913)、稻、谷、酵母(美國專利號US6,228,614)和巴斯德畢赤氏酵母(美國專利號US6,455,687、6,277,817、6,066,469)中表達后，重組人乳鐵蛋白是純化的。而且還描述了用于全長人乳鐵蛋白表達的表達系統(例如，美國專利號US6,100,054)。在所有情況中，教導的一部分是全長cDNA的表達和加工前導肽后的N-末端是甘氨酸的完整蛋白的純化。Nuijens等人(美國專利號6,333,311)獨立描述了人乳鐵蛋白的變體，但他們的焦點僅限于在乳鐵蛋白N-末端結構域中發現的精氨酸殘基的缺失或取代。
EDTA(乙二胺四乙酸)是一種合成化合物，其具有熟知的結合金屬的特性。EDTA最普遍用于螯合療法，一種包括反復靜脈內給予EDTA以將毒素從血流中排出的治療。EDTA給藥是用于重金屬如鉛、汞、砷和鉈中毒的醫學上接受的療法，且已被食品和藥品監督管理局(FDA)批準用于該用途。
EDTA已經被建議作為心臟病的治療。將螯合療法用于心臟病的支持者主張EDTA聯合口服維生素和礦物質幫助溶解與動脈粥樣硬化有關的斑塊和礦物質沉積。雖然很多患有心臟病的美國人已經求助于EDTA螯合療法以改善他們的狀況，但FDA還沒有批準該療法作為心臟病的可選擇性療法。人們認為EDTA螯合可通過螯合血流中的雜質而幫助加強免疫系統。
本發明首次研究出適宜的送遞系統以送遞乳鐵蛋白，從而治療急性和/或慢性潰瘍或其它類型創傷，如燒傷。此外，本發明首次使用乳鐵蛋白聯合金屬螯合劑治療急性和/或慢性創傷。
發明概述本發明涉及一種組合物，它包含乳鐵蛋白或至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代的N-末端乳鐵蛋白變體。該組合物可被用作創傷愈合的治療。治療方法包括給予乳鐵蛋白組合物，其可局部、口服或腸胃外施用。該乳鐵蛋白組合物還可與標準創傷愈合療法聯合給予。
本發明的實施方案包括具有N-末端乳鐵蛋白變體的乳鐵蛋白組合物。更具體而言，該乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。這種N-末端乳鐵蛋白變體包括至少缺少N-末端甘氨酸殘基的變體或包含N-末端甘氨酸殘基取代的變體。所述取代可包括用天然或人工氨基酸殘基取代N-末端甘氨酸殘基。例如，所述取代可包括用陽性氨基酸殘基或陰性氨基酸殘基取代N-末端甘氨酸殘基或用除甘氨酸之外的中性氨基酸殘基取代N-末端甘氨酸殘基。其它N-末端乳鐵蛋白變體包括缺少一個或多個N-末端殘基或N-末端具有一個或多個取代的乳鐵蛋白。
在特定實施方案中，所述N-末端乳鐵蛋白變體包含至少1％乳鐵蛋白成分、至少5％乳鐵蛋白成分、至少10％乳鐵蛋白成分、至少25％乳鐵蛋白成分、至少50％乳鐵蛋白成分或之間的任何范圍。
本發明的實施方案是一種包含治療有效量的乳鐵蛋白成分和室溫下具有約1-約12,000,000cP粘度的藥學可接受聚合物的藥物組合物，其中所述乳鐵蛋白的用量足以改善創傷。所述乳鐵蛋白是哺乳動物乳鐵蛋白，如人或牛乳鐵蛋白。更具體而言，所述乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。此外，所述乳鐵蛋白組合物包含其至少N-末端甘氨酸被截短和/或取代的變體。所述N-末端乳鐵蛋白變體包含至少1％乳鐵蛋白成分、至少5％乳鐵蛋白成分、至少10％乳鐵蛋白成分、至少25％乳鐵蛋白成分、至少50％乳鐵蛋白成分或之間的任何范圍。
在特定實施方案中，所述聚合物選自乙烯基聚合物(即，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇)、多糖聚合物(即，纖維素、纖維素衍生物、糖胺聚糖、瓊脂、果膠、海藻酸、葡聚糖、淀粉和殼聚糖)、糖胺聚糖聚合物(即，透明質酸、軟骨素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸肝素和肝素)、蛋白聚合物(即，膠原、明膠和纖連蛋白)、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物(即，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)和丙烯酰胺聚合物(即，聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺)。優選，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是F88或F127。
在又一實施方案中，藥物組合物中乳鐵蛋白(乳鐵蛋白或其中至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代的N-末端乳鐵蛋白變體)的濃度為約0.0001％(w/w)-約30％(w/w)。更具體而言，所述聚合物濃度為約0.5％(w/w)-約3.0％(w/w)且所述聚合物具有約500-約13,000,000的平均分子量。
優選實施方案是一種藥物組合物，它包含足以改善創傷用量的重組人乳鐵蛋白(rhLF乳鐵蛋白或其中至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代的N-末端乳鐵蛋白變體)，和聚合物，其中所述聚合物選自乙烯基聚合物、多糖聚合物、糖胺聚糖聚合物、蛋白聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物、和丙烯酰胺聚合物，其中該組合物是一種在室溫下具有約1-約12,000,000cP粘度的水凝膠。所述聚合物濃度為約0.5％(w/w)-約3.0％(w/w)且該聚合物具有約500-約13,000,000的分子量。
另一優選實施方案是一種藥物組合物，它包含足以改善創傷用量的乳鐵蛋白成分和藥學可接受的聚合物，所述聚合物選自具有約0.5％(w/w)-約3.0％(w/w)濃度和約500-約13,000,000分子量的乙烯基聚合物、多糖聚合物、糖胺聚糖聚合物、蛋白聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物、和丙烯酰胺聚合物，其中所述組合物是一種在室溫下具有約1-約12,000,000cP粘度的水凝膠。
本發明另一實施方案是一種治療創傷的方法，包括給予受治療者足以改善創傷的用量的乳鐵蛋白成分。所述乳鐵蛋白成分分散于藥學可接受的載體中。在其它實施方案中，將所述乳鐵蛋白成分與其它標準創傷愈合療法聯合給予。所述乳鐵蛋白成分可給予至少1周、6周、12周、36周等，或之間的任何范圍。
在其它實施方案中，還可將分散于藥學可接受的載體中的金屬螯合劑與乳鐵蛋白成分聯合給予。優選的金屬螯合劑包括，但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)或[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)。更優選所述金屬螯合劑是EDTA。
可進行治療的舉例性創傷包括，但不限于皮膚創傷、骨創傷、內部創傷、胃腸創傷、口腔創傷、眼創傷、手術創傷、或其任意組合。皮膚創傷可以是全層皮膚創傷或部分皮膚創傷。在特定實施方案中，所述創傷被進一步定義為慢性創傷，例如但不限于糖尿病性潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、壓迫性潰瘍、和感染性創傷。此外，所述創傷被進一步定義為急性創傷。舉例性急性創傷包括，但不限于一度燒傷、部分皮膚燒傷、全層皮膚燒傷、撕裂傷、槍彈傷、和感染性創傷。
在其它實施方案中，所述乳鐵蛋白是局部、口服或腸胃外給藥的。此外，還可將抗酸劑與所述乳鐵蛋白成分聯合給藥。
在特定實施方案中，所給予的乳鐵蛋白成分的用量(乳鐵蛋白或至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代的N-末端乳鐵蛋白變體)為每天約0.0001μg-約100g。所給予的EDTA的用量為每天約1ng-約1g。
在其它實施方案中，所述乳鐵蛋白組合物是一種具有約0.0001-約30％乳鐵蛋白濃度的局部用凝膠、溶液、膠囊或片劑。局部用凝膠是由選自乙烯基聚合物、多糖聚合物、糖胺聚糖聚合物、蛋白聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物、和丙烯酰胺聚合物的聚合物構成的。所述聚合物濃度為約0.5％(w/w)-約3.0％(w/w)且所述聚合物具有約50,000-約13,000,000的分子量。
另一實施方案是一種治療創傷的方法，包括通過在創傷附近局部給予乳鐵蛋白而補充受治療者局部免疫系統的步驟。該乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌。
又一實施方案是一種增強遭受創傷的受治療者局部免疫系統的方法，包括局部給予受治療者乳鐵蛋白組合物的步驟。乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌。乳鐵蛋白可刺激細胞因子或趨化因子的產生。可被乳鐵蛋白刺激的舉例性細胞因子包括，但不限于白介素-18(IL-18)、白介素-12(IL-12)、粒細胞/巨嗜細胞集落-刺激因子(GM-CSF)、和γ-干擾素(IFN-γ)。舉例性趨化因子包括，但不限于巨嗜細胞炎性蛋白3α(MIP-3α)、巨嗜細胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、或巨嗜細胞炎性蛋白β(MIP-1β)。
本發明的乳鐵蛋白組合物還可抑制細胞因子或趨化因子。所述細胞因子選自白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)、和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。此外，所述乳鐵蛋白組合物還可抑制基質金屬蛋白酶(MMP)產生。
此外，白介素-18或粒細胞/巨嗜細胞集落-刺激因子可刺激免疫細胞的產生或活性。所述免疫細胞選自T淋巴細胞、天然殺傷細胞、巨嗜細胞、樹突細胞、及多形核細胞。更具體而言，所述多形核細胞是中性粒細胞且T淋巴細胞選自CD4+、CD8+和CD3+T細胞。
在又一實施方案中，白介素-18或粒細胞/巨嗜細胞集落-刺激因子可刺激參與創傷修復的細胞的產生或活性。參與創傷修復的細胞選自角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞、樹突細胞和肌成纖維細胞。TNF-α的抑制可進一步抑制樹突細胞的遷移和成熟。所述樹突細胞是朗格罕氏細胞。
另一實施方案是一種治療創傷的方法，包括經由選自肌內、靜脈內、腹膜內、眼內、關節內的腸胃外途徑將乳鐵蛋白組合物給予手術區域，以增加體循環中乳鐵蛋白的量，而補充受治療者全身免疫系統的步驟。
另一實施方案是一種增強遭受創傷的受治療者全身免疫系統的方法，包括腸胃外給予受治療者乳鐵蛋白組合物的步驟。
另一實施方案是一種治療創傷的方法，包括通過口服給予乳鐵蛋白組合物，以增加受治療者胃腸道中乳鐵蛋白的量，而補充受治療者粘膜免疫系統的步驟。
此外，另一實施方案是一種增強遭受創傷的受治療者粘膜免疫系統的方法，包括口服給予受治療者乳鐵蛋白組合物。
前述已經相當全面地概括了本發明的特征和技術優點，下面將通過本發明的詳細描述更好地理解本發明。下面將描述形成本發明權利要求主題的本發明的其它特征和優點。應當認識到所公開的概念和特定實施方案可很容易地用作改進或設計實現本發明相同目的的其它結構的基礎。還應認識到這種等價構造并沒有背離權利要求闡明的本發明。從下列描述結合附圖將更好地理解據信為本發明特征的新特征，如它的構造和操作方法，以及其它目的和優點。然而，應當理解每幅附圖僅用于舉例說明和描述，而不是對本發明的限制。
附圖簡述為了更全面地了解本發明，現在將參考下列描述連同附圖。


圖1表示在健康和糖尿病小鼠中給予或沒有給予重組人乳鐵蛋白carbopol凝膠的75％創傷閉合發生率。
圖2A和圖2B表示在健康小鼠中，有或沒有重組人乳鐵蛋白溶液局部給藥的創傷愈合時程。CGS-21680(圖2A)或RegranexTM(圖2B)用作陽性對照。在圖2A中，*是指與緩沖液相比顯著(p＜0.05)，**是指與緩沖液相比非常顯著(p＜0.01)且#是指與CGS-21680相比顯著(p＜0.05)。在圖2B中，*是指與緩沖液相比顯著(p＜0.05)，′是指與rhPDGF[Regranex]相比顯著(p＜0.05)，**是指與緩沖液相比非常顯著(p＜0.01)，且″是指與rhPDGF[Regranex]相比非常顯著(p＜0.01)。
圖3表示局部rhLF對健康小鼠中75％創傷閉合發生率的影響。RegranexTM用作陽性對照。
圖4A、圖4B和圖4C表示口服rhLF對健康(圖4A)和糖尿病(圖4B)小鼠75％創傷閉合發生率的作用，和對糖尿病小鼠100％創傷閉合發生率的作用(圖4C)。
圖5A和圖5B表示用和沒用重組人乳鐵蛋白溶液的局部(圖5A)或口服(圖5B)給藥愈合的感染性創傷中75％創傷閉合的發生率。
發明詳述在不背離本發明范圍和精神的前提下，對本申請中公開的發明進行的各種實施方案和改進對本領域技術人員而言是顯而易見的。
A.定義當與權利要求和/或說明書中的術語“包含”結合使用時，此處所用的詞語“一個”或“一種”可指“一種”，但也與“一種或多種”、“至少一種”、和“一種或一種以上”相一致。
此處所用術語“急性創傷”是指在短時間內愈合的創傷。急性創傷的例子包括，但不限于部分皮膚燒傷、撕裂傷、槍彈傷或感染性創傷。
此處所用術語“慢性創傷”是指需長時間愈合的創傷或沒有外部干預就不會愈合的創傷。此外，此處所用的“慢性創傷”還指“慢性潰瘍”，可廣義分成三種主要類型糖尿病性潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、褥瘡性或壓迫性潰瘍。此外，慢性創傷還可包括需長時間愈合的感染性創傷。
此處所用術語“細胞因子”是指由影響其它細胞行為，例如刺激或抑制細胞增殖的細胞制造的蛋白。例如，由淋巴細胞制造的細胞因子常被稱作淋巴因子或白介素。本領域技術人員應認識到術語細胞因子是在文獻中所用的通稱，是指由可影響其它細胞行為的細胞制造的蛋白。
此處所用術語“趨化因子”是指涉及細胞，例如吞噬細胞和淋巴細胞的遷移和激活的小分子細胞因子。本領域技術人員應認識到趨化因子在炎性和免疫反應過程中起著重要作用。
此處所用術語“乳鐵蛋白”或“LF”是指天然或重組的乳鐵蛋白。天然乳鐵蛋白可通過從哺乳動物的乳汁或初乳或其它天然來源純化獲得。重組乳鐵蛋白(rLF)可通過在基因改變的動物、植物、真菌、細菌、或其它原核生物或真核物種中重組表達或直接產生，或通過化學合成而制造。
此處所用術語“乳鐵蛋白成分”是指具有乳鐵蛋白或其一部分的成分，其中至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代。
此處所用術語“金屬螯合劑”是指結合金屬的化合物。可用于本發明中的金屬螯合劑包括二價金屬螯合劑，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、羥基乙三胺二乙酸(HEDTA)或其鹽。
此處所用術語“N-末端乳鐵蛋白變體”是指其中至少N-末端甘氨酸已被截短和/或取代的乳鐵蛋白。N-末端乳鐵蛋白變體還包括，但不限于一個或多個N-末端氨基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16個N-末端氨基酸殘基等的缺失和/或取代。因此，N-末端乳鐵蛋白變體包含至少1-16個N-末端氨基酸殘基的缺失或截短和/或取代。乳鐵蛋白至少N-末端甘氨酸的缺失和/或取代可介導與全長乳鐵蛋白相同的生物學作用并可增強乳鐵蛋白的生物學活性，例如，通過刺激各種細胞因子，如IL-18、MIP-3α、GM-CSF或IFN-γ的產生。
此處所用術語“腸胃外給藥”包括任何形式的給藥，其中在不包括經由腸吸收的情況下，受治療者吸收該化合物。本發明中所用的舉例性腸胃外給藥包括，但不限于肌內、靜脈內、腹膜內、眼內、或關節內給藥。此外，腸胃外給藥還包括給予到手術區域中。
此處所用術語“藥學可接受的載體”包括任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和延遲吸收劑等。這種介質和試劑在藥物活性物質中的使用是本領域熟知的。除了與本發明的載體或細胞不相容的任何常規介質或試劑外，預期了其在治療性組合物中的應用。還可將補充性活性成分摻入到該組合物中。
此處所用術語“藥物組合物”是指乳鐵蛋白成分分散于藥學可接受的載體中。所述乳鐵蛋白組合物還可包含乳鐵蛋白或其中至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代的N-末端乳鐵蛋白變體。
此處所用術語“口服給藥”包括，但不限于口服、口腔、腸內或胃內給藥。
此處所用術語“受治療者”是指可按照此處所述方法口服給予人乳鐵蛋白成分的任何哺乳動物受治療者。在特定實施方案中，本發明的方法可用于治療人類受治療者。其它實施方案包括治療遭受創傷的人類受治療者。
此處所用術語“治療有效量”是指改善或挽救疾病或狀況的癥狀的用量。
此處所用術語“局部給藥”包括，但不限于局部、真皮(例如，透真皮或真皮內)、表皮或皮下。
此處所用術語“治療”和“治療”是指給予受治療者治療有效量的重組人乳鐵蛋白成分，從而使受治療者疾病改善。所述改善是癥狀的任何改善或挽救。所述改善是可觀察或可測量的改善。因此，本領域技術人員應認識到治療可改善疾病狀況，但不能完全治愈疾病。
此處所用術語“創傷”是指任何損傷，如潰瘍，這是由于疾病或病癥、或意外、事故、或手術過程所引起的。創傷可被進一步定義為急性和/或慢性。
B.乳鐵蛋白本發明所用乳鐵蛋白可通過從天然來源，例如，但不限于哺乳動物的乳汁分離和純化獲得。所述乳鐵蛋白優選哺乳動物乳鐵蛋白，如牛或人的乳鐵蛋白。在優選實施方案中，所述乳鐵蛋白是使用本領域熟知且使用的基因工程技術，如在基因改變的動物、植物或真核生物中重組表達而重組產生的，或直接產生的，或化學合成的。見，即美國專利號US5,571,896；5,571,697和5,571,691,它們引入此處作為參考。
在某些方面，本發明提供天然LF和/或rLF的生物學活性，例如，刺激和/或抑制細胞因子或趨化因子的能力增強的乳鐵蛋白變體。特別是，本發明提供至少N-末端甘氨酸殘基已被取代和/或截短的乳鐵蛋白變體。所述N-末端乳鐵蛋白變體可天然存在或通過一個或多個氨基酸的取代或缺失而修飾。
所述缺失變體可通過乳鐵蛋白的蛋白水解和/或編碼截短乳鐵蛋白的多核苷酸表達而產生，正如美國專利號US6,333,311所述，其引入此處作為參考。
取代變體或置換變體通常包括用一個氨基酸替代蛋白中一個或多個位點處的另一氨基酸。取代可以是保守的，即，用相似形狀和電荷的氨基酸取代其中一個氨基酸。保守置換是本領域熟知的且包括，例如丙氨酸-絲氨酸；精氨酸-賴氨酸；天門冬酰胺-谷酰胺或組氨酸；天門冬氨酸鹽-谷氨酸鹽；半胱氨酸-絲氨酸；谷酰胺-天門冬酰胺；谷氨酸鹽-天門冬氨酸鹽；甘氨酸-脯氨酸；組氨酸-天門冬酰胺或谷酰胺；異亮氨酸-亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸-纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸-精氨酸；甲硫氨酸-亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸-蘇氨酸；蘇氨酸-絲氨酸；色氨酸-酪氨酸；酪氨酸-色氨酸或苯丙氨酸；和纈氨酸-異亮氨酸或亮氨酸的改變。
在進行這種改變時，可考慮氨基酸的親水指數。親水性氨基酸指數對賦予蛋白相互作用的生物學功能方面很重要，這是本領域通常都了解的(Kyte和Doolittle，1982)。可以接受的是氨基酸的相對親水性對所得蛋白的二級結構作出貢獻，其依次限定蛋白與其它分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。
已經以各氨基酸的親水性和電荷特性為基礎排列了它們的親水指數(Kyte和Doolittle，1982)，這些是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸鹽(-3.5)；谷酰胺(-3.5)；天門冬氨酸鹽(-3.5)；天門冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
某些氨基酸可被具有相似親水指數或值且仍然產生具有相似生物學活性的蛋白，即獲得生物學功能等價蛋白的其它氨基酸取代是本領域已知的。在進行這種改變時，優選親水指數±2以內，特別優選±1以內的那些，且更優選±0.5以內的那些的氨基酸取代。
以親水性為基礎有效進行類似氨基酸的取代也是本領域已知的。美國專利號US4,554,101，其引入此處作為參考，描述了蛋白的最大局部平均親水性，正如由其相鄰氨基酸的親水性規定的那些，與蛋白的生物學性質相關。正如在美國專利US4,554,101中詳細描述的，已經給氨基酸殘基分配了下列親水值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天門冬氨酸鹽(+3.0±1)；谷氨酸鹽(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天門冬酰胺(+0.2)；谷酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
此外，應當了解其中一個氨基酸可用具有相似親水值且仍可獲得生物學等價和免疫學等價蛋白的其它氨基酸取代。在這種改變中，優選親水值±2以內，特別優選±1以內的那些，更特別優選±0.5以內的那些的氨基酸取代。
因此，在本發明中，取代變體或置換可使用標準誘變技術，例如，定點誘變產生，正如在美國專利US5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377；5,789,166和6,333,311中公開的那些，它們引入此處作為參考。預期至少N-末端甘氨酸殘基可用20種天然存在的氨基酸，例如，帶正電荷的氨基酸(精氨酸、賴氨酸、或組氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸、天門冬酰胺、半胱氨酸、谷酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸)和/或帶負電荷的氨基酸(天門冬氨酸或谷氨酸)中的任何一種置換或取代。此外，預期N1-N16范圍內的任何氨基酸殘基均可被置換或取代。預期至少多達16個N-末端氨基酸殘基可被置換或取代，只要所述蛋白仍然保留其生物學和/或功能活性，其可刺激各種生長因子，如IL-18、MIP-3α、GM-CSF或IFN-γ的產生。因此，本發明的N-末端乳鐵蛋白變體被認為是乳鐵蛋白的功能等價物。
在功能等價物方面，本領域技術人員可很好理解的是，“生物學功能等價物”蛋白的固有定義是在分子規定部分內進行的改變數量有限，且同時保留分子的可接受水平的等價生物學活性。因此，此處定義的生物學功能等價物是選自氨基酸(或密碼子)可被取代的那些蛋白。功能活性被定義為乳鐵蛋白刺激或抑制各種細胞因子或趨化因子的能力。
此外，可用修飾和/或稀有氨基酸取代N-末端氨基酸殘基。下面提供舉例性而非限制性的修飾和/或稀有氨基酸的列表。


N-末端乳鐵蛋白變體(缺失和/或取代)在乳鐵蛋白制品(乳鐵蛋白組合物)中的存在和相對比例是用標準方法，通過Edman降解過程，確定N-末端氨基酸序列而進行的。N-末端乳鐵蛋白變體的相對比例包含至少1％乳鐵蛋白成分、至少5％乳鐵蛋白成分、至少10％乳鐵蛋白成分、至少25％乳鐵蛋白成分、至少50％乳鐵蛋白成分或之間的任何范圍。
在該方法中，所述蛋白與異硫氰酸苯酯(PITC)反應，其在堿性條件下與氨基末端的氨基酸殘基反應形成苯氨基硫代甲酰基衍生物(PTC-蛋白)。然后三氟醋酸裂解其anilinothialinone(ATZ-氨基酸)衍生物的第一個氨基酸，并剩下新的氨基末端用于下一個降解循環。
N-末端乳鐵蛋白變體的百分比還可通過用丹磺酰化反應更準確地進行。簡單地說，在堿性條件(pH10)下使蛋白與丹磺酰氯進行丹磺酰化反應。丹磺酰化反應后，將反應混合物干燥成顆粒，然后在6N HCl中完全水解。N-末端氨基酸的比例是用內聯熒光計通過RP HPLC鑒定的，并與由已知的丹磺酰化氨基酸構成的標準品進行比較。
C.藥物組合物本發明描述了一種包含分散于藥物載體中的乳鐵蛋白成分的組合物。包含在本發明組合物中的乳鐵蛋白包括乳鐵蛋白或至少N-末端甘氨酸殘基被截短或取代的N-末端乳鐵蛋白變體。更具體而言，所述N-末端乳鐵蛋白變體包含至少1％該成分、至少5％該成分、至少10％該成分、至少25％該成分、至少50％該成分或之間的任何范圍。
此外，所述組合物包含分散于藥物載體中的乳鐵蛋白連同金屬螯合劑。因此，本發明描述了一種有或沒有分散于藥物載體中的金屬螯合劑的乳鐵蛋白組合物。本領域技術人員應理解這兩種組合物(例如，單獨的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白結合金屬螯合劑)均落在本發明的范圍內且可根據所需反應類型互換使用。預期向乳鐵蛋白組合物中加入金屬螯合劑可增強金屬離子的螯合并由此加強免疫系統或增強乳鐵蛋白的作用。
可與乳鐵蛋白結合使用的金屬螯合劑包括二價金屬螯合劑，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、羥基乙三胺二乙酸(HEDTA)或其任何的鹽。更優選，將EDTA與乳鐵蛋白結合使用。
此外，根據本發明，在有或沒有惰性稀釋劑的藥學可接受載體中提供適合給藥的本發明組合物。所述載體應是可同化的且包括液體、半-固體，即糊、或固體載體。除了對受體或對其中所含成分的治療有效性有害的任何常規介質、試劑、稀釋劑或載體外，其在可給藥的組合物中實踐本發明方法的應用是適宜的。載體或稀釋劑的例子包括脂肪、油、水、生理鹽水溶液、脂類、脂質體、樹脂、粘合劑、填充劑等，或其組合。
根據本發明，所述成分與載體以任何方便且實用的方式結合，即，通過溶解、混懸、乳化、混合、膠囊化、吸收等。這種過程對本領域技術人員而言是常規的。
在本發明的特定實施方案中，所述成分與半-固體或固體載體完全結合或混合。混合可以任何方便的方式進行，如研磨。還可在混合過程中加入穩定劑，以防止該成分的治療活性損失，即在胃或開放性創傷環境中變性。用于組合物中的穩定劑的例子包括緩沖液、氨基酸如甘氨酸和賴氨酸、碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等，蛋白水解酶抑制劑等。此外，預期二價金屬螯合劑，例如EDTA還可用于使本發明的組合物穩定。更優選，對于口服給藥的組合物而言，所述穩定劑還可包括胃酸分泌拮抗劑。此外，對于局部給藥的組合物而言，所述穩定劑還可包括皮膚酸拮抗劑。
與半-固體或固體載體結合用于口服給藥的組合物可被進一步配制成硬或軟殼的明膠膠囊、片劑或丸劑。更優選，用腸溶衣給明膠膠囊、片劑、或丸劑包衣。腸溶衣可防止所述成分在pH酸性的胃或上部腸中變性。見，例如，美國專利號US5,629,001。到達小腸后，其中的堿性pH可溶解包衣，使乳鐵蛋白成分釋放出來并由專門的細胞，例如，上皮enterocyte和派爾斑M細胞吸收。
此外，可將用于局部給藥、與半-固體載體結合的成分進一步配制成凝膠軟膏劑。用于形成凝膠軟膏劑制品的優選載體是凝膠聚合物。凝膠聚合物可防止血清蛋白酶所致的該成分在開放性皮膚中變性。本發明的凝膠制品還可提供一種用于乳鐵蛋白或其活性在創傷部位控釋的系統。控釋是指藥物釋放或活性釋放足以在長時間內，如長達24小時或更多，優選1-12小時內維持治療水平。本發明的凝膠制品可增加乳鐵蛋白在創傷部位的接觸時間并提供獲得創傷愈合率顯著增加所需的持續釋放劑量形式。這是一個非常重要的優點，是因為它不用對創傷頻繁施用制品，且由此更少干擾創傷和它的細胞成分。
本發明的凝膠制品具有粘附在創傷上并適應不規則的肌體或創傷外形的優點。所述凝膠可直接施用于創傷部位或結合順應性多孔或微孔底物，例如涂層形式，施用于創傷部位。凝膠具有含水量高(保持創傷濕潤)、吸收創傷滲出物的能力、容易施用于創傷上并容易通過清洗除去的其它優點。當施用于創傷時，凝膠有涼涼的感覺，并由此可增加患者的舒適感和制品的接受性，特別是對敏感性創傷而言。
根據凝膠預期應用的不同，本發明的水凝膠具有不同的粘性。粘性是液體流動阻力的測量值。它被定義為剪切應力與剪切速度的比值。剪切應力是在所施加力的影響下液體流動的阻力，即，與外力相對的肌體內的分子阻力。剪切應力被定義為力與剪切面積的比值。當剪切液體時，假設層狀流，液體各層以不同速度運動。各層運動的相對速度僅僅是剪切速度的其中一個因素。其它是剪切平面之間的距離、或間隙。因此，剪切速度被定義為凝膠速度與間隙的比值。速度具有達因/秒/cm2的量綱。這些量綱被稱作泊。除非另有說明，其中粘度的量綱是指厘泊(cP)，是用Brookfield粘度計測量的。除非另有說明，所有粘度值都是指室溫下，例如，22℃-25℃下的。
本發明中乳鐵蛋白的用量可從約1μg-約100g乳鐵蛋白之間變化。在優選實施方案中，本發明的組合物包含約0.0001％-約30％濃度的乳鐵蛋白。更優選，乳鐵蛋白是以10mg-25g口服給藥的或乳鐵蛋白是以1μg-5g局部給藥的。所述乳鐵蛋白可包含乳鐵蛋白或至少N-末端甘氨酸殘基被截短和/或取代的N-末端乳鐵蛋白變體。
更優選，本發明的組合物還包含金屬螯合劑，例如，但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、羥基乙三胺二乙酸(HEDTA)或其鹽。組合物中金屬螯合劑的用量可從約1ng-約1g變化。優選的金屬螯合劑是EDTA。
本發明形成凝膠的物質可以是能夠形成粘性水溶液的水溶性聚合物或非水溶性、遇水可膨脹的聚合物(例如，膠原)，其還可形成粘性溶液。可膨脹的聚合物是吸水但不溶于水中的那些。此處描述的聚合物交聯形式可能不是水溶性的，但遇水可膨脹。因此，聚合物的交聯形式落在本發明的范圍之內。交聯是指共價鍵合聚合物鏈連同雙功能試劑如戊二醛。而且，本領域技術人員應了解某些聚合物可能必須以鹽或部分中和的形式使用，以制成水溶性的。例如，就透明質酸而言，優選使用透明質酸鈉提供適宜的水溶性。
在用于局部或切口創傷愈合的水凝膠制品中，所述聚合物可選自乙烯基聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、多糖、蛋白、聚(環氧乙烷)、丙烯酰胺聚合物及其衍生物或鹽。應當了解聚(環氧乙烷)包括聚乙二醇。在用于眼前房創傷愈合的凝膠制品中，所述聚合物可與上述相同，區別在于不優選使用聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚(環氧乙烷)。且，用于前房時，優選聚合物是可生物降解的，即，它分解成無害的成分，從前房中排出或在前房中代謝。在低粘度、用于眼創傷愈合的含水制品中，形成凝膠的聚合物可與局部或切口創傷愈合所用的相同，區別在于不優選使用聚(環氧乙烷)。
用于本發明中的乙烯基聚合物可選自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。用于本發明中的多糖選自纖維素或纖維素衍生物、糖胺聚糖、瓊脂、果膠、海藻酸、葡聚糖、淀粉、和殼聚糖。淀粉以兩種形式存在，α-直鏈淀粉和支鏈淀粉。優選水溶性更高的α-直鏈淀粉。糖胺聚糖選自透明質酸、軟骨素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸肝素和肝素。糖胺聚糖與任何其它形成凝膠的聚合物結合用于增強創傷愈合。用于本發明中的蛋白選自膠原、明膠和纖連蛋白。所述丙烯酰胺聚合物是聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺聚合物。優選生物相容性聚丙烯酰胺聚合物。在又一實施方案中，carbomer是優選的聚丙烯酰胺聚合物。Carbomer是與蔗糖或季戊四醇的烷基酯交聯的丙烯酸的合成高分子量聚合物。Carbomer的適宜可商業得到的級別包括Carbopol 910、Carbopol 934P、Carbopol 940、Carbopol 941、Carbopol 971P、Carbopol 974P、Carbopol 980、Carbopol 981、Carbopol 1342、Rheogic 252L、Rheogic 250H、和Hostacerin PN73。
在用于局部或切口創傷愈合的凝膠制品中，室溫下的粘度可以為1,000-12,000,000cps。優選粘度范圍是50,000-2,000,000。在本發明其中一個實施方案中，局部凝膠制品可包含0.01-5重量％、具有約450,000-4,000,000平均分子量的聚丙烯酸。在優選實施方案中，所述聚丙烯酸以0.5-1.5重量％存在并具有2,000,000-4,000,000的平均分子量。聚丙烯酸凝膠的pH應為4.5-8且更優選6.5-7.5。
在另一實施方案中，本發明的局部和切口用凝膠可包含15-60重量％、具有約500-50,000平均分子量的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在優選實施方案中，所述嵌段共聚物以15-40重量％存在并具有1,000-15,000的平均分子量。本發明中所用的嵌段共聚物通常被稱作Pluronic。優選的Pluronic是Pluronic F88和F127。
在又一實施方案中，所述局部或切口用凝膠可包含1-20重量％、具有約50,000-700,000分子量的纖維素聚合物。在優選實施方案中，所述纖維素聚合物以2-8重量％存在并具有80,000-240,000的平均分子量。優選的纖維素聚合物是羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)和甲基纖維素(MC)。
在又一實施方案中，局部和切口用凝膠可包含0.5-10重量％、具有500,000-8,000,000平均分子量的透明質酸。在優選實施方案中，透明質酸以1.5-6.0重量％存在且平均分子量大于1,000,000。
丙烯酰胺聚合物可用于所有類型的創傷愈合，特別是眼前房。可吸收的丙烯酰胺聚合物，如聚丙烯酰胺可成為現有眼用載體系統，如透明質酸的良好替代品。丙烯酰胺聚合物可具有1-13百萬、優選約4-6百萬的平均分子量。凝膠中丙烯酰胺的重量百分比可以是2-5％、優選3.5-4.5％。取代的丙烯酰胺聚合物，如甲基和烷基取代的聚合物也落在本發明的范圍內。
用于眼前房中時，丙烯酰胺凝膠送遞系統具有下列特征送遞基質溶解或降解的任何產物均是無毒的且不會阻礙小梁篩工作；凝膠是光學透明的；且凝膠可留在前房中而不會引起不利的臨床反應，如不可接受的眼壓升高。
所需粘度范圍可通過改變制品中聚合物的分子量和濃度百分比而獲得對本領域技術人員而言是顯而易見的。例如，具有較低粘度的凝膠可使用低分子量的聚合物或低百分比濃度或兩者組合而獲得。高粘度凝膠可通過使用較高分子量的聚合物和較高百分比濃度獲得。中間粘度可通過相應改變分子量和濃度百分比而獲得。
低粘度溶液可包含0.01-2重量％、具有約100,000-4,000,000分子量的聚丙烯酸。在優選實施方案中，聚合物以0.05-0.5％存在。在另一實施方案中，這種稀釋的粘性溶液可包含2-40重量％、具有500-500,000平均分子量的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。優選，濃度為2-20％且分子量為1,000-15,000。可選擇性地，稀釋的粘性溶液可包含1-20％具有約80,000-240,000分子量的纖維素聚合物。優選濃度為1-10％。在又一實施方案中，所述稀釋的粘性溶液可包含0.5-5.0重量％、具有約500,000-8,000,000平均分子量的透明質酸。優選，濃度為0.5-2.0％且平均分子量為1,000,000-6,000,000。如果稀釋的粘性溶液用作滴眼劑，則優選粘度為1-100cps。如果用于其它應用，如浸泡繃帶，那么1.0-5,000的任何粘度都是適宜的。
配制后，以和劑量制品相容的形式給予溶液且用量是治療有效的，可改善或挽救癥狀。所述制品可以各種劑量形式，如可攝取的溶液、藥物釋放膠囊、凝膠軟膏劑等很容易地給藥。根據所治療的受治療者情況，劑量可發生某些改變。負責給藥的人可，在任何情況下，可決定個體受治療者的適宜劑量。此外，對于人類給藥而言，制品要滿足FDA Office of Biologics standards要求的無菌、全面的安全性和質量標準。
D.創傷的治療根據本發明，在上述任何藥物載體中提供的乳鐵蛋白成分是口服、局部、或腸胃外給予懷疑或具有創傷的受治療者的。本領域技術人員可以若干因素，如吸收、代謝、送遞方法、年齡、體重、疾病嚴重程度和對治療的反應為基礎，確定給予受治療者的該成分的治療有效量。成分的口服給藥包括口服、口腔、腸內或胃內給藥。還預期了該成分可用作食品添加劑。例如，在攝取前將該成分撒在食物上或加入到液體中。該成分的局部給藥包括局部、真皮、表皮、或皮下給藥。腸胃外給藥包括，但不限于肌內、靜脈內、腹膜內、眼內或關節內給藥或給予到手術區域中。
本發明被設計用于治療任何類型的創傷，其包括，但不限于皮膚創傷、內部創傷、胃腸創傷、口腔創傷、骨創傷、眼創傷、手術創傷、或其任意組合。創傷可在，不限于皮膚、內部器官、胃和腸(胃腸)、口腔粘膜、和眼睛(眼創傷，例如，眼睛中的角膜潰瘍、放射性角膜切開術、角膜移植、epikeratophakia和其它手術誘導的創傷)上發現。根據引起創傷的過程不同，創傷還可分為，但不限于，切口創傷、切除創傷、糖尿病性潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、褥瘡性或壓迫性創傷、化學創傷、和燒傷。
本發明的又一實施方案是給予本發明的組合物治療皮膚創傷。皮膚創傷進一步包括，但不限于完全皮層創傷和部分皮層創傷。完全皮層創傷包括完全除去表皮和真皮到筋膜平面或皮下脂肪的深層。在皮膚松懈的人群中，肉膜的薄層肌肉系統，其與真皮基底堅固粘連，通常也被除去。在部分皮層創傷中，大量真皮，絕大多數是網狀的，留在后面，且，更重要的是，巨大多數表皮附件的基底(皮脂腺和汗腺、毛囊)仍然保持完整。
此外，創傷可被進一步定義為急性創傷。急性創傷具有相對較快的愈合率，特別是在健康受治療者中。然而，在上了年紀或無免疫應答的人中，愈合可能延長。如果創傷受到感染，愈合也可能延長。用本發明組合物治療的優選急性創傷包括，但不限于部分皮膚燒傷、撕裂傷、槍彈傷或感染性創傷。
創傷還可被定義為慢性創傷。慢性創傷或慢性潰瘍的例子包括，但不限于糖尿病性潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、褥瘡性或壓迫性潰瘍。此外，慢性創傷還可包括感染性創傷。慢性創傷是不能修復或修復非常緩慢的創傷，且表現出結構組織和與正常組織功能協調的部分或全部缺失。慢性創傷或慢性潰瘍可廣義分成三種主要類型糖尿病性潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、褥瘡性或壓迫性潰瘍。糖尿病性潰瘍常常出現在足部。慢性糖尿病性狀態和葡萄糖控制較差導致由于漸進性動脈硬化所致的外周循環和微循環較差；導致傾向創傷的四肢無感覺的神經病學改變；和可包括細胞生長因子的量和對細胞生長因子反應降低的創傷愈合過程的內在缺陷。在靜脈曲張性潰瘍的情況下，靜脈血壓過高引起微循環受到干擾且毛細管發生病理學改變，促炎細胞因子和蛋白酶的水平持續升高。成纖維細胞開始衰老且對生長因子的反應降低，其不利地散布。蛋白水解酶和它們的抑制劑不平衡。當皮膚在壓力之下不運動，血液流動8-12小時即發生壓迫性潰瘍。
在本發明優選實施方案中，給予有效量的本發明成分(單獨的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白與金屬螯合劑結合)以密封、閉合、改善或修復創傷。且，預期了本發明的成分還可降低、減少、或抑制創傷的細菌性感染，其有助于創傷的愈合過程。
治療方案也可變化，且常常取決于創傷類型、創傷位置和/或愈合進展、以及患者的健康狀況和年齡。顯然，某些類型的創傷將需要更強的治療，而同時，某些患者不能耐受更多的繁重方案。將更好地配備臨床醫師，以根據治療性制品的已知功效和毒性(如果有的話)進行這種選擇。
在特定實施方案中，以單一劑量或多個劑量給予該組合物。單一劑量可每天、或一天多次、或一周多次、或每月一次或一月多次給藥。在又一實施方案中，該組合物是以一系列劑量給予的。該系列劑量可每天、或一天多次、每周一次、或一周多次、或每月一次、或一月多次給予。因此，本領域技術人員應認識到根據創傷類型、部位、受治療者健康狀況等的不同，本發明的乳鐵蛋白組合物可給予任何時間周期，直到創傷愈合至少50％、60％、75％、80％、90％、95％或100％或之間的任何范圍。
進行局部給藥時，本發明的凝膠制品可用于覆蓋吸收紗布敷料的纖維，從而形成可放置于創傷上的創傷愈合繃帶。優選低粘度制品用于該用途。創傷愈合繃帶可通過用含具有創傷愈合活性的乳鐵蛋白水凝膠溶液浸泡紗布敷料而制備。然后將該繃帶施用于創傷，使紗布涂層纖維與創傷接觸并刺激創傷愈合率。
在將本發明凝膠施用于內部或切口創傷的那些應用中，優選形成凝膠的聚合物是可生物降解的。這些的例子是膠原、糖胺聚糖、明膠和淀粉。所述纖維素不是可生物降解的。合成聚合物，如乙烯基聚合物不是可生物降解的。此處所述聚合物的生物可降解性是本領域技術人員熟知的。
本發明又一實施方案是一種治療創傷的方法，包括通過增加創傷附近乳鐵蛋白的量而補充局部免疫系統的步驟。優選，將乳鐵蛋白局部給予創傷。
此外，本發明還提供一種治療創傷的方法，包括通過增加體循環中乳鐵蛋白的量而補充全身免疫系統的步驟。優選，經由腸胃外途徑，其包括，但不限于肌內、靜脈內、腹膜內、眼內、關節內給予乳鐵蛋白，或給予到手術區域中。
此外，另一實施方案是一種治療創傷的方法，包括通過增加受治療者胃腸道中乳鐵蛋白的量而補充粘膜免疫系統的步驟。
在其它實施方案中，本發明提供一種通過給予受治療者乳鐵蛋白成分而增強遭受創傷的受治療者免疫系統的方法。根據給藥方式的不同，可增強免疫系統的不同方面。例如，該成分的局部給藥可增強局部免疫系統，即創傷附近的局部免疫系統。該成分的腸胃外給藥可增強全身免疫系統。此外，該成分的口服給藥可增強粘膜免疫系統，其還可產生全身作用。在其它實施方案中，乳鐵蛋白成分與金屬螯合劑，例如EDTA聯合給藥。
預期免疫系統，無論是局部、全身還是粘膜免疫系統都是通過乳鐵蛋白刺激細胞因子和/或趨化因子而增強的。舉例性細胞因子包括胃腸道中的白介素-18和GM-CSF，已知其可增強免疫細胞或刺激免疫細胞產生。例如，白介素-18可增強天然殺傷細胞或T淋巴細胞，其可殺死感染創傷的細菌。在特定實施方案中，白介素-18(IL-18)可增強CD4+、CD8+和CD3+細胞。IL-18是Th1細胞因子并與白介素-12和白介素-2協同發揮作用，刺激淋巴細胞IFN-γ的產生是本領域技術人員已知的。還可增強其它細胞因子或趨化因子，例如，但不限于IL-12、IL-1b、MIP-3α、MIP-1α、或IFN-γ。還可抑制其它細胞因子或酶，例如，但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、或基質金屬蛋白酶。還預期了IL-18或GM-CSF可刺激參與創傷修復細胞的產生或活性，例如，但不限于，角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞、和肌成纖維細胞。此外，預期了乳鐵蛋白可抑制TNF-α的產生，其抑制涉及炎癥的細胞。
E.聯合療法為了增加本發明成分的有效性，將本發明成分與可有效治療創傷的其它藥劑，如生長因子、皮膚替代療法、酶和手術清創術、濕創傷敷料、清潔劑、抗生素結合是可取的。這類創傷愈合劑能夠積極影響受治療者的創傷，例如，通過增強皮膚細胞的生長率、增加對皮膚細胞的血液供給、促進抗感染創傷的細菌的免疫反應、殺死細菌、清潔局部出血組織、促進創傷閉合。更通常，以有效促進創傷愈合的聯合用量提供這些其它創傷愈合劑。該方法可包括同時給予本發明的成分和藥劑或多種因子。這可通過給予單一成分或包含兩種藥劑的藥物制品獲得，或通過同時或間隔足夠緊密地給予兩種不同成分或制品而導致該作用重疊，其中一種組合物包括乳鐵蛋白成分，另一種組合物包括第二種藥劑。
可選擇性地，本發明的成分可在其它創傷愈合劑治療之前或之后進行，中間間隔幾分鐘到幾周。在給予其它創傷愈合劑和本發明成分或分開施用于創傷的實施方案中，其中一種通常在每次送遞之間確保顯著的時間周期而不會中斷，這樣該藥劑和人乳鐵蛋白成分仍然能夠對創傷發揮有利的協同作用。在這種情況中，預期了其中一種可與創傷接觸/在彼此約1-14天內，更優選彼此約12-24小時內給予兩種形式。在某些情況下，顯著延長治療時間是可取的，然而，每次給藥間隔若干天(2、3、4、5、6或7)-若干周(2、3、4、5、6、7或8)。
1.生長因子創傷愈合療法包括基于生長因子的治療。例子包括，但不限于Regranex(Becaplermin-BB凝膠)、AuTolo-Gel(自體活化的血小板releasate)、Procuren(自體凝血酶-誘導的血小板releasate)。生長因子通過促進新的高度血管化結締組織的成粒或形成；刺激表皮細胞、血管內皮細胞和其它皮膚細胞的增殖、分化和遷移；增強膠原、膠原酶、和胞外基質的產生而不受限地發揮作用。
2.皮膚替代療法例子包括但不限于Apligraf(雙層活皮膚)、Trancyte(人成纖維細胞-衍生的臨時皮膚代用品)、Dermagraft(永久的、單層皮膚代用品)、Epicel(活的單層人造皮膚)、Integra(基于膠原的皮膚再生模板)、AlloDerm(由人尸體制造的單層人造皮膚)、CCS(活的、培養的、人造皮膚)。
3.酶和手術清創術清創術是一種清潔局部缺血或死亡組織的方法或過程。酶清創術包括Accuzyme木瓜蛋白酶-尿素清創軟膏和Collagenase Santyl，手術清創術是指物理除去創傷中至少一部分局部缺血或死亡組織。清創術可反復進行，例如，每1、2、3、4、5、6、或7天、或每1、2、3、4、和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個月。酶清創術治療可以是各種劑量。還預期了本發明可與酶或手術清創術聯合使用。
4.敷料創傷愈合療法包括以敷料為基礎的各種治療。敷料種類包括但不限于無定形水凝膠、水凝膠片、吸收性物質、海藻酸鹽、生物學及合成敷料、膠原、復合材料、接觸層、彈性紗布、泡沫材料、紗布和無紡敷料、水狀膠體、浸漬敷料、硅膠片、銀敷料、透明薄膜、創傷填充劑。
5.清潔劑例子包括但不限于Biolex、Lamin、Wound Wash Saline、Techni-Care、CarraKlenz、DiaB Klenz、MicroKlenz、RadiaCareKlenz、UltraKlenz、Comfee Sea-Clens、Optipore Sponge、Saf-Clens、Shur-Clens、Dermagran、DermaKlenz、Dumex、Gene Klenz、GRX、Allclenz、Restore、Hyperion、Medi Tech、Skintegrity、MPM Antimicrobial、ClinsWound、Septicare、Lobana Saline。
6.抗微生物劑例子包括但不限于甲磺滅膿霜、Thermazene霜(1％磺胺嘧啶銀)、卡地素末-碘墊或凝膠。靜脈內抗菌劑的例子包括但不限于伊米配能/西司他丁、β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/咪巴克坦)、和廣譜頭孢菌素(頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢他啶)。其它例子包括，但不限于Bensal HP、Barri-Care、Care-Crème、FormulaMagic、Baza、Micro-Guard、Ca-Rezz、Diabet-X產品、MitrazolPowder、PiercingCare、Triple Care產品、和各種抗真菌霜劑和粉劑。
7.壓迫動力壓迫的例子，包括泵和套管，如但不限于ArtAssist、ArterialFlow、EdemaFlow、PulStar、Circulator Boot、Flowplus、Flowpress、Flowtron。靜態壓迫包括但不限于封套、手套、襪子、護膝、下肢支持器、袖套、郁積墊、壓縮針織襪、非-彈性帶、高壓縮繃帶、浸漬過鋅的繃帶、彈性繃帶。
8.氧氣療法系統高壓氧療法的例子包括但不限于用于放下一名患者的隔室、使一名患者坐起至25度角的隔室、使一名患者坐起至90度角的隔室、同時治療不止一名患者的隔室。局部高壓氧療法的例子包括但不限于用于肢端潰瘍的可任意處理的局部高壓氧系統，用于褥瘡、術后和創傷的可任意處理的局部高壓氧系統。
9.水療法、電療法例子包括但不限于干式水療機器；用于部分-和全層-皮膚創傷、在創傷區域維持溫暖和濕度的非-接觸熱創傷護理系統；提供非-熱、脈沖高頻、高峰值功率、電磁能以治療急性和慢性創傷中的水腫和疼痛的系統；使用可控、局部負壓并支持濕創傷愈合的系統；用于具有各種尖端的各種創傷的部位-特異性治療、低于15psi可控壓力的脈動沖洗器；各種創傷沖洗和渦流系統。
10.營養治療產品例子包括但不限于等滲、高-蛋白、含纖維的管狀食物以支持創傷愈合；高-蛋白、沒有膽固醇的營養添加物。
11.粘合劑、膠、密封劑、貼劑例子包括但不限于Dermabond、CoStasis、CoSeal、BioGlue、FibRx、FocalSeal、FloSeal、AutoSeal、Indermil、Syvek、LiquiSheild、LiquiBand、Quixil、CryoSeal、VIGuard FibrinSealant、和各種膠帶、封閉物和保護產品。
12.局部創傷愈合促進劑例子包括但不限于局部氣溶膠，其可刺激慢性創傷的毛細血管床；具有鋅-營養制品的皮膚保護劑；幫助瘢痕感覺更柔軟和更平滑的局部凝膠；清潔降解蛋白、促進健康成粒、控制局部炎癥并減輕創傷氣味的親水軟膏劑；選擇性補充巨嗜細胞的油水創傷敷料乳狀液。
13.其它生物治療劑助劑療法也可與本發明聯合使用。助劑或免疫調節劑的使用包括，但不限于腫瘤壞死因子；干擾素α、β和γ；IL-2和其它細胞因子；F42K和其它細胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、和其它趨化因子。
F.實施例下列實施例用于證實本發明的優選實施方案。本領域技術人員應能夠預期實施例中公開的技術，其代表了本發明人發現的技術，可在本發明的實踐中很好地發揮作用，并由此被認為構成其實踐的優選方式。然而，根據本發明的說明書，本領域技術人員應認識到可在特定實施方案中進行多種改變，它們已被公開且在不背離本發明精神和范圍的情況下仍然獲得同樣或相似的結果。
實施例1rhLF Carbomer凝膠的制備按照本發明制備聚丙烯酸或980級Carbomer凝膠(Carbopol980)。
制備具有0％、0.1％、0.3％、1％、2.5％、和8.5％理論標記強度的6種30-g rhLF凝膠。該凝膠具有表1和2所示的通式。
表1.rhLF凝膠的通式

**見表2中的總體積表2.用于制備凝膠的磷酸鹽緩沖液和rhLF原液的體積

**溶于磷酸鹽緩沖液Lot#E01764-03L中的100mg/ml rhLF將凝膠混合在預先稱重的125ml不銹鋼燒杯中并使用程控Caframo混合器(Model BDC1850，Ontario，Canada)混合。通常的混合速率是600rpm，其中使用具有1/2”直徑葉片的不銹鋼攪拌棒。凝膠是通過將Carbopol 980加入到磷酸鹽緩沖液(6mM磷酸二氫鈉一水合物、9mM磷酸一氫鈉七水合物、50mM NaCl、pH7)中制備的。用于制備原始凝膠的磷酸鹽緩沖液的體積在表2第4欄中表示(標題“磷酸鹽緩沖液的體積”)。Carbopol 980完全水合后(通常在45分鐘內)，加入甘油、丙二醇、和苯氧乙醇，接著加入檸檬酸，然后是乙二胺四乙酸二鈉。最后，加入二甲硅氧烷。這些凝膠的pH為3-3.5。在該點，加入20％氫氧化鈉以升高pH。當pH達到約6時，加入rhLF(如表2笫3欄“原液體積”所示)。然后將pH升至7。與上述過程的唯一不同是用8.5％w/w rhLF凝膠。因為所需原液體積較大，將Carbopol 980直接加入到26ml含rhLF的磷酸鹽緩沖液中。由此，使8.5％w/w/凝膠中的rhLF暴露于3-3.5的pH中大約30-45分鐘的時間。
Brookfield DV-III+Rheometer用于一式三份測量凝膠的粘度(每種凝膠0.5ml)。條件是溫度25℃；平衡時間5分鐘；旋轉速率1.7RPM；旋轉時間5分鐘。結果在表3中表示。
表3凝膠粘度

就標準曲線而言，1.563-25μg/ml rhLF標準品是通過在去離子(DI)水中稀釋100mg/ml rhLF原液(lot#E01764-03L)而制備的。所有有效樣品是從3ml鋁制卷曲試管的頂層、中間、和底層采集的，并制備成約10μg/mL理論濃度的rhLF的DI水溶液。所有有效凝膠均通過內含物均勻性檢測(+/-10％)。
實施例2Carbomer凝膠中的rhLF對完全皮層、開放性創傷的生物利用度使用5組各3只ICR雄性小鼠(重22±2克)。在環己烯巴比妥(90mg/Kg，IP)麻醉下，修剪肩部和背部區域。鋒利的鉆孔器(ID 12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚。
如表4所示，損傷后立即局部給予低劑量和高劑量的重組人乳鐵蛋白(rhLF)(carbopol-980凝膠制品)或靜脈內給予一個劑量(液體溶液)。創傷損傷后立即將rhLF劑量給予20g小鼠。使用下列劑量(1)安慰劑，0.04ml/只小鼠，局部；(2)50mg/Kg，0.04ml 2.5％凝膠；(3)170mg/Kg，0.04ml 8.5％凝膠。在施用試驗化合物后的第0、15、30、60、120、和240分鐘處死3只動物(一只雄性、兩只雌性)。給處死的動物放血；使用EDTA抗凝，從EDTA血中分離血漿，并將樣品快速冷凍并在-80℃貯存。
表4rhLF-實驗設計和方法的生物利用度

按照由制造商提供的說明，使用OXIS Health Products，Inc的BIOXYTECHLacto F EIA試劑盒測定血漿中rhLF的濃度。結果是通過測量490nm波長處的吸光度獲得的。
IV給藥后，相對于峰值rhLF血漿濃度計算所得峰值血漿濃度。以50mg/Kg(151ng/ml)和170mg/Kg(75.1ng/ml)劑量將局部凝膠施用于開放性完全皮層創傷后，rhLF的劑量調節峰值濃度低于5mg/kg IVrhLF(92，455.1ng/ml)后標準化峰值濃度的0.5％(見表5)。通過濃度曲線下平均面積(AUC)計算的總血漿生物利用度為18.4μg.分/ml，該曲線是相對于使用50mg/Kg局部凝膠劑量的170mg/Kg血漿rhLF時程標準化的，表明低于0.5％的絕對全身生物利用度。170mg/Kg局部凝膠劑量的AUC是9.6μg.分/ml，且與低于0.5％的絕對全身生物利用度相對應(見表5)。
表5局部施用的rhLF對小鼠開放性創傷的藥動學

*相對于170mg/kg標準化的值**用相對于170mg/kg標準化的值計算的AUC實施例3rhLF Carbopol凝膠在創傷愈合實驗中的功效將2.5％和8.5％濃度強度的RhLF carbopolymer凝膠直接施用于正常和糖尿病db/db小鼠的全層皮膚、開放性創傷上。糖尿病(db/db)小鼠表達較低水平的若干生長因子和受體，至少部分導致愈合率降低。
麻醉小鼠，修剪每只動物的肩部和背部區域，鋒利的鉆孔器(ID12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚(開放性、完全皮層創傷)。每天一次將不同劑量的rhLF局部施用于創傷(0.02ml/創傷)，正常小鼠為11天，糖尿病db/db小鼠為20天，以和陰性對照那些的愈合率進行比較。陰性對照為安慰劑凝膠。在若干時間點，于透明塑料上描繪創傷區域并用Image分析器測量。評價達到75％創傷閉合的發生率并使用Fisher′s精密試驗比較差異。p＜0.05水平的差異被認為是統計學顯著的。50％創傷閉合(CT-50)的計算時間是經由多項式方程(2次)測量的，差異是用顯著性t-試驗評價的。
圖1表示在第12天有77％正常小鼠(p＜0.01)、在第15天有66％糖尿病db/db小鼠(p＜0.05)中，0.1％-8.5％的rhLF凝膠可介導75％創傷閉合發生率的改善。下面表6表示在各濃度下，正常小鼠75％創傷閉合發生率和50％創傷閉合(CT-50)的計算時間的個體值。
表6較寬范圍的Rh1F凝膠強度均可加速正常小鼠的創傷愈合

以這些結果為基礎，預期局部、口服、或腸胃外乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌、刺激IL-18、IL-12、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、或IFN-γ，并抑制IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、或基質金屬蛋白酶。還預期了IL-18或GM-CSF可刺激免疫細胞和參與創傷修復的細胞的產生或活性，且TNF-α可抑制涉及炎癥的細胞。
實施例4rhLF、CGS-21680、和Regranex在正常小鼠中的創傷愈合時程麻醉每組7只ICR小鼠，修剪每只動物的肩部和背部區域，鋒利的鉆孔器(ID 12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚。在第3、5、7、9和11或12天，在透明塑料片上描繪創傷區域，并用Image分析器定量。
在損傷后立即局部施用rhLF溶液、賦形劑(緩沖液)、或陽性對照(RhPDGF)，之后每天一次總共持續10或11天。不成對的t-試驗用于每個測量時間點治療和賦形劑組之間的比較。P＜0.05的差異被認為是統計學顯著的。CGS-21680是一種腺苷A2A受體激動劑，先前描述過它可非常有效地促進創傷愈合且事實上可比RegranexTM更快速促進創傷愈合。RhPDGF(重組人血小板衍生的生長因子-BB，RegranexTM，becaplermin)，其目前是市場上唯一用于慢性創傷(糖尿病性神經病性潰瘍)的可利用的生物療法，以100微克/克(0.01％)的批準強度用作陽性對照。
圖2A表示rhLF發揮了可與CGS-21680相比較的愈合作用，表明rhLF較之RegranexTM(rhPDGF，Becaplermin)可更快速促進創傷修復。圖2B證實rhLF與RegranexTM相比，可促進更大程度的創傷愈合。
以這些結果為基礎，預期了局部、口服、或腸胃外乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌、刺激IL-18、IL-12、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、或IFN-γ，并抑制IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、或基質金屬蛋白酶。還預期了IL-18或GM-CSF可刺激免疫細胞和參與創傷修復的細胞的產生或活性，且TNF-α可抑制涉及炎癥的細胞。
實施例5rhLF局部用溶液vs.Regranex在創傷愈合實驗中的功效麻醉小鼠，修剪每只動物的肩部和背部區域，鋒利的鉆孔器(ID12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚(開放性完全皮層創傷)。每天一次將不同劑量的rhLF局部應用于創傷(0.02ml/創傷)，正常小鼠為11天，糖尿病db/db小鼠為20天，以和陰性和陽性對照的那些比較愈合率。陰性對照或安慰劑是rhLF賦形劑(PBS溶液)。
RhPDGF(重組人血小板衍生的生長因子-BB，RegranexTM，becaplermin)，一種批準用于治療慢性糖尿病潰瘍的藥物，以100微克/克(0.01％)批準強度用作陽性對照。在各時間點，將創傷區域描繪在透明塑料上，并用Image分析器測量。評價達到75％創傷閉合動物的發生率，并使用Fisher′s精密試驗比較差異。p＜0.05水平的差異被認為是統計學顯著的。
圖3表示5個實驗的總結數據，證實0.1％-10％劑量的rhLF與Regranex相比，創傷修復功效更好。相對于安慰劑(42只動物，p＜0.0001)，用rhLF 0.1％-10％(147只動物)治療的動物在實驗最后一天75％創傷閉合的發生率增加了34％，相對于Regranex(21只動物，p＜0.001)則增加了32％。在健康小鼠中，相對于安慰劑，1％rhLF可顯著(p＜0.01)將該參數增加了38％，相對于becaplermin(Regranex)則增加了36％(p＜0.01)。在創傷修復功能受損的糖尿病db/db小鼠中，在第15天，1％rhLF凝膠與安慰劑相比可將75％創傷閉合發生率增加83％(p＜0.01)。
以這些結果為基礎，預期了局部、口服、或腸胃外乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌、刺激IL-18、IL-12、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、或IFN-γ，并抑制IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、或基質金屬蛋白酶。還預期了IL-18或GM-CSF可刺激免疫細胞和參與創傷修復的細胞的產生或活性，且TNF-α可抑制涉及炎癥的細胞。
實施例6口服rhLF在創傷愈合實驗中的功效麻醉小鼠，修剪每只動物的肩部和背部區域，鋒利的鉆孔器(ID12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚(開放性完全皮層創傷)。每天一次將不同劑量的rhLF局部應用于創傷，正常小鼠共11天，或糖尿病db/db小鼠共20天，以和陰性對照的那些比較愈合率。陰性對照或安慰劑是rhLF賦形劑(PBS溶液)。在各時間點，將創傷區域描繪在透明塑料上，并用Image分析器測量。評價達到75％或100％創傷閉合動物的發生率并使用Fisher′s精密試驗比較差異。P＜0.05％水平的差異被認為是統計學顯著的。
在各時間點，將創傷區域描繪在透明塑料上并用Image分析器測量。對正常小鼠而言，在第9-12天評價達到75％創傷閉合動物的發生率，對糖尿病小鼠而言，在第15或19天評價達到75％創傷閉合動物的發生率，并使用Fisher’s精密試驗比較差異。P＜0.05％水平的差異被認為是統計學顯著的。
圖4A表示與口服安慰劑相比，將0.5-4.5mg/Kg劑量的口服rhLF給予健康小鼠可使75％創傷閉合發生率增加43％，使用最高劑量可增加52％(p＜0.01)。圖4B表示與安慰劑相比，將4.5-65mg/Kg劑量的口服rhLF給予糖尿病db/db小鼠可在第15天使75％創傷閉合發生率增加75％，所試驗的最高劑量則可增加83％(p＜0.01)。同樣，圖4C表示與安慰劑相比，4.5-65mg/Kg劑量的口服rhLF對糖尿病db/db小鼠而言，可在第19天使100％創傷閉合發生率增加75％，使用最高劑量則可增加100％(p＜0.01)。
以這些結果為基礎，預期了局部、口服、或腸胃外乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌、刺激IL-18、IL-12、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、或IFN-γ，并抑制IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、或基質金屬蛋白酶。還預期了IL-18或GM-CSF可刺激免疫細胞和參與創傷修復的細胞的產生或活性，且TNF-α可抑制涉及炎癥的細胞。
實施例7在感染性創傷中進行的局部和口服rhLF創傷愈合實驗試驗局部rhLF在細菌感染性創傷中的功效。該動物模型提供了一種臨床相關的狀況，因為糖尿病常常具有感染性潰瘍且這種感染據信導致創傷修復受損。金黃色釀膿葡萄球菌是感染糖尿病性足部潰瘍的最常見細菌，且與死亡率增加有關。
麻醉每組7只ICR雄性小鼠，修剪每只動物的肩部和背部區域，鋒利的鉆孔器(ID12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚。鉆孔后立即將9.6×105CFU/0.02ml/小鼠的金黃色釀膿葡萄球菌(Smith)施用于每只動物的創傷區域上。在第3、5、7、9和12天，將創傷區域描繪在透明塑料片上，并用Image分析器定量。
損傷且細菌感染后立即施用局部rhLF、口服rhLF、賦形劑(緩沖液)或陽性對照(Regranex 0.01％)，之后每天一次共持續11天。對于口服施用的乳鐵蛋白而言，經由管飼法給予小鼠0.130ml的rhLF溶液(用可彎曲的管直接喂飼動物)。評價達到75％創傷閉合動物的發生率并用Fisher′s精密試驗比較差異。P＜0.05水平的差異被認為是統計學顯著的。
圖5A和圖5B表示相對于安慰劑而言，局部rhLF可使75％閉合發生率增加86％(p＜0.01)，相對于Regranex則可增加71％(p＜0.05)。圖5B表示相對于安慰劑而言，口服rhLF可使75％閉合發生率增加72％(p＜0.05)。
以這些結果為基礎，預期了局部、口服、或腸胃外乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌、刺激IL-18、IL-12、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、或IFN-γ，并抑制IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、或基質金屬蛋白酶。還預期了IL-18或GM-CSF可刺激免疫細胞和參與創傷修復的細胞的產生或活性，且TNF-α可抑制涉及炎癥的細胞。
實施例8最佳局部rhLF劑量的確定實施例5中的實驗方案用于測定促進小鼠創傷愈合的最低口服rhLF劑量。系統地試驗小劑量rhLF，直到再沒有明顯的創傷修復作用。加入EDTA以嘗試增加rhLF的功效且進一步降低rhLF的有效劑量。局部賦形劑用作陰性對照。
實施例9最佳口服rhLF劑量的測定實施例5中的實驗方案用于測定促進小鼠創傷愈合的最低口服rhLF劑量。系統地試驗小劑量rhLF，直到再沒有明顯的創傷修復作用。加入EDTA以嘗試增加rhLF的功效且進一步降低rhLF的有效劑量。口服賦形劑用作陰性對照。
實施例10組合研究實施例5中的實驗方案用于測定小鼠創傷愈合率。試驗有和沒有EDTA的口服與局部rhLF和口服rhLF與局部Regranex的組合。口服賦形劑+安慰劑凝膠，和口服賦形劑+Regranex分別是陰性和陽性對照。口服rhLF+安慰劑凝膠和口服賦形劑+局部rhLF是協同對照。
實施例11RhLF凝膠和液體生理鹽水制品對用敷料覆蓋的創傷的功效比較實施例5的實驗方案用于測定小鼠的創傷愈合率。將0.2mg/ml的rhLF液體制品(0.02ml 10mg/ml溶液)施用于創傷上。然后用生理鹽水弄濕的紗布敷料覆蓋創傷區域。每天重復該過程共10天。每天將RhLF凝膠0.2mg
直接施用于創傷上并用敷料覆蓋，共10天。每天將0.02ml rhLF溶液賦形劑和安慰劑凝膠施用于創傷上并用敷料覆蓋，共10天。Regranex是陽性對照且以相似方式局部施用0.02ml(100μg/ml臨床濃度)。
實施例12rhLF凝膠和敷料的不同施用方案的功效實施例5的實驗方案用于測定小鼠創傷愈合率。每天將RhLF凝膠0.2mg
直接施用于創傷上并用生理鹽水潤濕的紗布敷料覆蓋，共10天。另一組小鼠則是每隔一天更換一次敷料。在第三組中，將RegranexrhLF凝膠施用于創傷上并用敷料覆蓋。12小時后，用生理鹽水或水輕輕沖洗潰瘍以除去殘余凝膠，并用新敷料再次覆蓋創傷12小時。安慰劑凝膠0.02ml和Regranex0.02ml(100μg/ml)分別是陰性和陽性對照，并使用后者的方案施用。
實施例13RhLF凝膠每天一次與每天兩次的比較實施例5的實驗方案用于測定小鼠創傷愈合率。每天將RhLF凝膠0.2mg/創傷/天
直接施用于創傷上，共10天。給第二組動物每天兩次(BID)施用0.1mg，每次施用間隔12小時。安慰劑凝膠0.02ml和Regranex 0.02ml(100μg/ml)每天施用一次，分別為陰性和陽性對照。
實施例14單獨的局部rhLF或與Regranex組合的功效實施例5的實驗方案用于測定小鼠創傷愈合率。每天將RhLF凝膠0.2mg/創傷/天
直接施用于創傷上，共10天。第二組小鼠接受rhLF 0.2mg/創傷和Regranex 2μg/創傷(0.02ml/創傷，100μg/ml)。第三組接受rhLF 0.02mg/創傷和Regranex 0.002μg/創傷，以測試可能的協同作用。安慰劑凝膠0.02ml、安慰劑+Regranex0.02ml(100μg/ml)、和單獨的Regranex分別是陰性、協同、和陽性對照。
實施例15局部rhLF在糖尿病性潰瘍患者中的劑量增加、藥動學和藥效學試驗這是對人類進行的I/II期14-天劑量增加研究，它被設計用于評價局部rhLF凝膠的加大給藥方案對慢性糖尿病性潰瘍患者的作用，并測定1％直到高達8.5％rhLF濃度的最大耐受劑量(如果有的話)。評價RhLF促進潰瘍愈合的能力。
實施例16口服rhLF在糖尿病性潰瘍患者中的劑量增加、藥動學和藥效學試驗研究設計與實施例14相同，區別在于口服施用有和沒有EDTA的rhLF。
實施例17對糖尿病性潰瘍患者進行的rhLF與安慰劑和標準護理試驗這是一種在人類中進行的隨機、雙盲、安慰劑-對照、多中心研究。它是在糖尿病性潰瘍患者中進行的12-周II期臨床試驗，用于評價與安慰劑、Regranex、和僅有標準護理相比，使用兩個劑量水平的rhLF局部或口服給藥進行治療的功效。功效是通過創傷部分和完全閉合的發生率，和愈合時間評價的。
實施例18rhLF自Carbomer凝膠的釋放試驗各濃度強度RhLF-Carbopol-980凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統的接收緩沖液中檢測。
實施例19rhLF-乙烯基聚合物凝膠的其它研究以聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯醇聚合物為基礎制備含RhLF的凝膠。如實施例1所述，凝膠粘度是通過Brookfield DV-III+Rheometer測定的且蛋白內含物均勻性是用BCA測定法測量的。如實施例2所述，在將這些乙烯基聚合物施用于正常小鼠的開放性完全皮層創傷上后評價生物利用度。如實施例3-5所述，在小鼠模型中測試這些乙烯基聚合物凝膠制品的創傷愈合活性的功效。測試各濃度強度的這些乙烯基聚合物凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統中的接收緩沖液中檢測。
實施例20rhLF-多糖聚合物凝膠的研究制備RhLF-多糖聚合物凝膠。如實施例1所述，通過BrookfieldDV-III+Rheometer測定凝膠粘度并用BCA測定法測量蛋白內含物的均勻性。如實施例2所述，在將這些多糖聚合物凝膠施用于正常小鼠的開放性完全皮層創傷上后評價生物利用度。如實施例3-5所述，在小鼠模型中測試多糖聚合物凝膠制品的創傷愈合活性的功效。測試各濃度強度的多糖聚合物凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統中的接收緩沖液中檢測。
實施例21rhLF-糖胺聚糖聚合物凝膠的研究制備RhLF-糖胺聚糖聚合物凝膠制品。如實施例1所述，凝膠粘度是通過Brookfield DV-III+Rheometer測定的且蛋白內含物均勻性是用BCA測定法測量的。如實施例2所述，在將這些糖胺聚糖聚合物凝膠施用于正常小鼠的開放性完全皮層創傷上后評價生物利用度。如實施例3-5所述，在小鼠模型中測試糖胺聚糖聚合物凝膠制品的創傷愈合活性的功效。測試各濃度強度的糖胺聚糖聚合物凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統中的接收緩沖液中檢測。
實施例22rhLF-蛋白聚合物凝膠的研究制備RhLF-蛋白聚合物凝膠制品。如實施例1所述，凝膠粘度是通過Brookfield DV-III+Rheometer測定的且蛋白內含物均勻性是用BCA測定法測量的。如實施例2所述，在將這些蛋白聚合物凝膠施用于正常小鼠的開放性完全皮層創傷上后評價生物利用度。如實施例3-5所述，在小鼠模型中測試蛋白聚合物凝膠制品的創傷愈合活性的功效。測試各濃度強度的蛋白聚合物凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統的接收緩沖液中檢測。
實施例23rhLF-Pluronic聚合物凝膠的研究制備RhLF-Pluronic聚合物凝膠制品。如實施例1所述，凝膠粘度是通過Brookfield DV-III+Rheometer測定的且蛋白內含物均勻性是用BCA測定法測量的。如實施例2所述，在將這些pluronic聚合物凝膠施用于正常小鼠的開放性完全皮層創傷上后評價生物利用度。如實施例3-5所述，在小鼠模型中測試pluronic聚合物凝膠制品的創傷愈合活性的功效。測試各濃度強度的pluronic聚合物凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統中的接收緩沖液中檢測。
實施例24rhLF-丙烯酰胺聚合物凝膠的研究制備RhLF-丙烯酰胺聚合物凝膠制品。如實施例1所述，凝膠粘度是通過Brookfield DV-III+Rheometer測定的且蛋白內含物均勻性是用BCA測定法測量的。如實施例2所述，在將這些丙烯酰胺聚合物凝膠施用于正常小鼠的開放性完全皮層創傷上后評價生物利用度。如實施例3-5所述，在小鼠模型中測試丙烯酰胺聚合物凝膠制品的創傷愈合活性的功效。測試各濃度強度的丙烯酰胺聚合物凝膠隨時間從劑量形式中釋放rhLF的動力學并在體外擴散系統中的接收緩沖液中檢測。
實施例25施用N-1截短物比例不同的RhLF制品的創傷愈合率使用小鼠創傷愈合模型比較N-1截短物百分比不同的rhLF制品的生物活性。麻醉每組7只小鼠，修剪每只動物的肩部和背部區域，鋒利的鉆孔器(ID12mm)用于除去包括肉膜和粘連組織的皮膚(開放性、完全皮層創傷)。每天一次將rhLF(20微克/只小鼠)或安慰劑局部施用于創傷上共11天。在各時間點，將創傷區域描繪在透明塑料上并用Image分析器測量。評價CT50(50％閉合時間)。(實驗AN-W2、W3、W9)。
如表7所示，含全部完整蛋白的rhLF制品以及含27％-42％N-1截短物的那些相對于它們各自的安慰劑全部表現出統計學顯著性功效。各批之間的改善百分比是可比較的且在統計學上是不可區分的。
表7.三種不同RhLF制品的創傷愈合率

實施例26N-1截短比例不同的RhLF制品的創傷閉合發生率在實施例25描述的實驗中，在用安慰劑或rhLF治療的小鼠中測量80％創傷閉合的發生率。在同一實驗中，相對安慰劑動物而言，rhLF治療過的動物中80％創傷閉合的絕對發生率是在第9天(7001和L007)或第12天(L005)測定的。
如表8所示，含完全完整蛋白的rhLF制品以及含27％-42％N-1截短物的那些全部表現出創傷閉合功效的增加，且相對于它們各自的安慰劑是統計學顯著的。
表8.三種不同RhLF制品的創傷閉合發生率

引用的參考文獻說明書中提及的所有專利和公開出版物均是屬于本發明的、本領域技術人員水平的表示。所有專利和公開出版物均引入此處作為參考，它們與特別且單獨引入此處作為參考的各公開出版物程度相同。
美國專利號US 4,554,101美國專利號US 5,220,007美國專利號US 5,284,760美國專利號US 5,354,670美國專利號US 5,366,878美國專利號US 5,389,514美國專利號US 5,571,691美國專利號US 5,571,697美國專利號US 5,571,896美國專利號US 5,629,001美國專利號US 5,635,377美國專利號US 5,789,166美國專利號US 5,919,913美國專利號US 6,066,469美國專利號US 6,080,559美國專利號US 6,100,054美國專利號US 6,277,817美國專利號US 6,228,614美國專利號US 6,333,311美國專利號US 6,455,687Edmonds M等人″Diabetes Metab Res Rev.2000；16(Suppll)S51-S54.
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雖然已經詳細描述了本發明及其優點，但應當理解在不背離由權利要求限定的本發明的條件下，可在此處進行各種改變、替代和變化。此外，本發明的范圍不限于說明書中描述的方法、機器、制造、物質組成、方式、方法和步驟的特定實施方案。可利用從現有或日后發展的內容、方法、機器、制造、物質組成、方式、方法或步驟很容易預期，并實現與此處所述的相應實施方案基本相同的功能或獲得基本相同的結果。因此，權利要求在它們的范圍內預期包括這種方法、機器、制造、物質組成、方式、方法、或步驟。
權利要求
1.一種包含N-末端乳鐵蛋白變體的乳鐵蛋白組合物。
2.根據權利要求1所述的乳鐵蛋白組合物，其中所述乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。
3.根據權利要求1所述的乳鐵蛋白組合物，其中所述N-末端乳鐵蛋白變體至少缺少N-末端甘氨酸殘基。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述N-末端乳鐵蛋白變體包含至少1％-至少50％乳鐵蛋白成分。
5.一種藥物組合物，它包含治療有效量的乳鐵蛋白成分和在室溫下具有約1-約12,000,000cP粘度的藥學可接受的聚合物。
6.根據權利要求5所述的組合物，其中所述乳鐵蛋白是哺乳動物乳鐵蛋白。
7.根據權利要求5所述的組合物，其中所述乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。
8.根據權利要求5所述的組合物，其中所述乳鐵蛋白是N-末端乳鐵蛋白變體。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述N-末端乳鐵蛋白變體包含至少1％-至少50％乳鐵蛋白成分。
10.根據權利要求5所述的組合物，其中所述聚合物選自乙烯基聚合物、多糖聚合物、糖胺聚糖聚合物、蛋白聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物和丙烯酰胺聚合物。
11.根據權利要求10所述的組合物，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是F88或F127。
13.根據權利要求5所述的組合物，其中所述乳鐵蛋白濃度為約0.0001％(w/w)-約30％(w/w)。
14.根據權利要求10所述的組合物，其中所述聚合物濃度為約0.5％(w/w)-約3.0％(w/w)且所述聚合物具有約500-約13,000,000的平均分子量。
15.一種用于治療受治療者創傷的方法，包括使創傷接觸權利要求5的組合物的步驟。
16.一種治療創傷的方法，包括給予受治療者治療有效量的乳鐵蛋白組合物的步驟。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物是局部、口服、或腸胃外給藥的。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物是口服給藥的。
19.根據權利要求18所述的方法，進一步包括給予抗酸劑連同所述乳鐵蛋白組合物。
20.根據權利要求16所述的方法，進一步包括給予標準創傷愈合療法連同所述乳鐵蛋白組合物。
21.根據權利要求16所述的方法，其中所述給藥包括給予所述組合物至少1周-至少12周。
22.根據權利要求16所述的方法，其中給予的乳鐵蛋白量為每天約0.0001μg-約100g。
23.根據權利要求16所述的方法，其中所述組合物是具有約0.0001％-約30％乳鐵蛋白濃度的局部用凝膠、溶液、膠囊或片劑。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述局部用凝膠是由選自乙烯基聚合物、多糖聚合物、糖胺聚糖聚合物、蛋白聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物和丙烯酰胺聚合物的聚合物構成的。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述聚合物濃度為約0.5％(w/w)-約3.0％(w/w)且所述聚合物具有約50,000-約13,000,000的分子量。
26.根據權利要求16所述的方法，其中所述創傷選自皮膚創傷、骨創傷、內部創傷、胃腸創傷、口腔創傷、眼創傷、和手術創傷。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述創傷被進一步定義為慢性創傷。
28.根據權利要求26所述的方法，其中所述創傷被進一步定義為急性創傷。
29.根據權利要求27所述的方法，其中所述慢性創傷選自糖尿病性潰瘍、靜脈停滯性潰瘍、壓迫性潰瘍、和感染性創傷。
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述急性創傷選自一度燒傷、部分皮膚燒傷、全層皮膚燒傷、撕裂傷、槍彈傷、和感染性創傷。
31.一種治療創傷的方法，包括通過在創傷附近局部給予一定量的乳鐵蛋白組合物而補充受治療者局部免疫系統的步驟。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述乳鐵蛋白可殺死感染創傷的細菌。
33.一種增強遭受創傷的受治療者局部免疫系統的方法，包括局部給予受治療者乳鐵蛋白組合物的步驟。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物可刺激細胞因子或趨化因子的產生。
35.根據權利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物可抑制細胞因子或趨化因子。
36.根據權利要求34所述的方法，其中所述細胞因子選自白介素-18(IL-18)、白介素-12(IL-12)、粒細胞/巨噬細胞集落-刺激因子(GM-CSF)、和γ-干擾素(IFN-γ)。
37.根據權利要求34所述的方法，其中所述趨化因子是巨噬細胞炎性蛋白3α(MIP-3α)、巨噬細胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、巨噬細胞炎性蛋白1β(MIP-1β)。
38.根據權利要求35所述的方法，其中所述細胞因子選自白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)、和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。
39.根據權利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物可抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的產生。
40.根據權利要求35所述的方法，其中白介素-18或粒細胞/巨噬細胞集落-刺激因子可刺激免疫細胞的產生或活性。
41.根據權利要求35所述的方法，其中白介素-18或粒細胞/巨噬細胞集落-刺激因子可刺激參與創傷修復的細胞的產生或活性。
42.根據權利要求40所述的方法，其中所述免疫細胞選自T淋巴細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突細胞、及多形核細胞。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述多形核細胞是中性粒細胞。
44.根據權利要求42所述的方法，其中所述T淋巴細胞選自CD4+、CD8+和CD3+T細胞。
45.根據權利要求41所述的方法，其中所述參與創傷修復的細胞選自角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞、和肌成纖維細胞。
46.根據權利要求38所述的方法，其中抑制TNF-α可進一步抑制樹突細胞的遷移和成熟。
47.根據權利要求46所述的方法，其中所述樹突細胞是朗格罕氏細胞。
48.一種治療創傷的方法，包括經由腸胃外途徑給予一定量的乳鐵蛋白組合物而補充受治療者全身免疫系統的步驟。
49.一種增強遭受創傷的受治療者的全身免疫系統的方法，包括腸胃外給予受治療者乳鐵蛋白組合物的步驟。
50.一種治療創傷的方法，包括通過口服給予一定量的乳鐵蛋白組合物而補充受治療者粘膜免疫系統的步驟。
51.一種增強遭受創傷的受治療者的粘膜免疫系統的方法，包括口服給予受治療者乳鐵蛋白組合物。
全文摘要
本發明涉及乳鐵蛋白組合物和使用該組合物治療創傷的方法。所述組合物可單獨給藥或與其它標準創傷愈合療法聯合給予。
文檔編號A61L15/32GK1694720SQ03825068
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月16日 優先權日2002年9月16日
發明者J·恩格爾邁爾, A·瓦拉德哈查里 申請人:阿根尼克斯有限公司