眼的基因治療的制作方法

專利名稱：眼的基因治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用基因療法治療視網膜疾病的方法。本發明還涉及用于治療視網膜疾病的載體，更特別是反轉錄病毒載體。
發明概述本發明提供治療個體視網膜疾病的方法，包括，在患有視網膜疾病的個體中，使該個體眼組織中的體內內皮抑制素(endostatin)濃度升高至治療該視網膜疾病的有效量。
在一種優選方面中，內皮抑制素為內皮抑制素或內皮抑制素活性片段。
在另一種優選方面中，用于本發明方法中的內皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽。在另一種優選方面，該內皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQID NO1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的變體。這樣的活性片段及變體列在，例如，美國專利6 174 861中，將該公開文本全文引入本文。
在另一種優選方面中，本發明指向治療個體視網膜疾病的方法，包括，在患有視網膜疾病的個體中，使該個體眼組織(尤其是視網膜組織)中的體內內皮抑制素濃度升高至有效量，其中這種提高是通過向個體施用外源內皮抑制素來實現的。
在另一種優選方面中，本發明指向治療個體視網膜疾病的方法，包括，在患有視網膜疾病的個體中，使該個體眼組織(尤其是視網膜組織)中的體內內皮抑制素濃度升高至有效量，其中這種提高是通過使個體內產生內皮抑制素來實現的。在一種更為優選的方面中，這種提高是通過向個體施用有效量的含內皮抑制素編碼核酸的病毒載體來實現的。在一種最為優選的方面中，該病毒載體選自腺病毒——例如無病毒基因的腺病毒(gutless adenovirus)、腺伴隨病毒、反轉錄病毒、和慢病毒，并經眼內或眼周給藥。
在另一種優選方面中，本發明涉及治療個體視網膜疾病的方法，包括，在患有視網膜疾病的個體中，使該個體眼組織(尤其是視網膜組織)中的體內內皮抑制素濃度升高至有效量，其中這種提高是通過向個體內植入至少一個微囊來實現的，其中該微囊含有分泌內皮抑制素的細胞。
視網膜疾病包括，例如，視網膜脫離和視網膜水腫(retinaledema)，包括黃斑水腫(macular edema)。
發明詳述內皮抑制素是XVIII型膠原蛋白的切割產物，已發現它能抑制腫瘤血管發生和生長。干擾素α2a也阻斷腫瘤血管發生并導致血管瘤退化，但是對脈絡膜新生血管形成(CNV)無效。本發明人已經令人驚奇且不可預料地發現，提高個體眼組織中的體內內皮抑制素濃度可以治療象視網膜脫離和視網膜水腫，包括黃斑水腫，這樣的視網膜疾病。
因此，本發明提供視網膜疾病，例如，視網膜脫離和視網膜水腫，包括黃斑水腫，的預防性及治療性治療方法。“治療”包括預防性和治療性治療兩者。“預防性”意指，針對視網膜疾病，例如，視網膜脫離和視網膜水腫，包括黃斑水腫，的完全或部分防護。“治療性”意指視網膜疾病自身的改善，以及，針對進一步視網膜疾病或已經存在的疾病的惡化的完全或部分防護。本發明尤其可以用于治療視網膜脫離和視網膜水腫，包括黃斑水腫。
如本文所使用的，內皮抑制素的“視網膜疾病抑制有效量”是可以導致以下任何或全部結果的內皮抑制素量1)視網膜血管滲透性降低；2)視網膜厚度降低；或3)對視網膜脫離的完全抑制或使視網膜脫離程度降低。
本文所使用的術語“編碼內皮抑制素的DNA序列”意指編碼全長內皮抑制素或內皮抑制素的活性片段、衍生物、或類似物的DNA，例如，這樣的DNA可以是編碼全長內皮抑制素的全長基因、或截短基因、或編碼這樣的內皮抑制素的具有內皮抑制素活性的片段或衍生物或類似物的突變基因。術語“DNA序列”通常指多聚脫氧核糖核苷酸分子，且更特別指通過相鄰戊糖上3′和5′碳原子間的磷酸二酯鍵一個一個相連的脫氧核糖核苷酸線性系列。
因此，在一種實施方式中，本發明指向編碼內皮抑制素或其具有內皮抑制素活性的片段、衍生物或類似物的DNA序列。
美國專利號5 854 205中顯示并描述了編碼內皮抑制素的DNA序列或其片段或衍生物，該文全文引入本文作為參考。
術語“內皮抑制素”指分別根據非還原性和還原性凝膠電泳測定其大小優選為18kDa至20kDa的蛋白質。術語內皮抑制素還包括該18kDa至20kDa蛋白質的活性前體形式。人內皮抑制素的全長氨基酸序列示于SEQ ID NO1中。編碼人內皮抑制素的核酸序列示于SEQ IDNO2中。小鼠內皮抑制素的氨基酸序列，加上小鼠Igκ引導序列，示于SEQ ID NO3中。編碼小鼠內皮抑制素和小鼠Igκ引導序列的核酸序列示于SEQ ID NO4中。
術語內皮抑制素還包括該18kDa至20kDa蛋白質的片段以及具有基本相似氨基酸序列的經修飾的蛋白質和肽，而且它們能夠抑制內皮細胞的增殖。例如，氨基酸的沉默置換(其中某氨基酸用一個結構上或化學上相似的氨基酸進行替代不會顯著改變該蛋白質的結構、構象或活性)是本領域熟知的。這樣的沉默置換意將落入所附權利要求范圍內。
可以理解，術語“內皮抑制素”包括縮短的多肽，其中從全長內皮抑制素(也即，具有SEQ ID NO1的多肽)的任一個或兩個末端、或從該蛋白質內部除去了一或多個氨基酸，然而所產生的分子仍然保持抑制內皮細胞增殖和/或治療視網膜脫離、視網膜水腫、和/或眼新生血管形成的效力。這種縮短的多肽在本文中稱作“片段”。術語“內皮抑制素”還包括延長的蛋白質或肽，其中在內皮抑制素的任一個或兩個末端、或在該蛋白質內部增加了一或多個氨基酸，然而所產生的分子仍然保持內皮增殖的抑制活性。這樣的分子，例如在第一位增加了酪氨酸的分子，對于利用例如125J進行標記是有用的。用其它放射性同位素進行的標記可用于為破壞包含內皮抑制素受體的靶細胞提供分子工具。用“靶向”分子例如蓖麻毒蛋白進行標記可以為破壞帶有內皮抑制素受體的細胞提供一種機制。延長的內皮抑制素多肽、或已經經過共價修飾的內皮抑制素多肽，在本文中統稱為內皮抑制素“衍生物”。
“基本序列同源性”意指內皮抑制素類似物序列和內皮抑制素序列的氨基酸殘基序列間至少約70％的同源性，優選至少約80％的同源性，更優選至少約90％的同源性。
術語內皮抑制素的定義中還包括對內皮抑制素蛋白及其肽片段的修飾。這樣的修飾包括其它分子，包括但不限于天然或非天然存在的氨基酸，對特定位點天然存在的氨基酸的取代。這樣的取代可能改變內皮抑制素的生物活性并產生生物學或藥理學激動劑或拮抗劑。這樣的修飾多肽在本文中稱作“變體”。已經顯示出具有抗腫瘤效應和/或抗血管形成效應的內皮抑制素變體、衍生物、和片段是已知的并且已被報道，例如，在已出版的國際專利申請號WO0067771、WO0063249、WO9931616、WO9929855、和WO9948924中，將這些公開文本全文引入本文作為參考。這樣的內皮抑制素變體、衍生物、和片段也可用在本發明的方法中。
可以在本發明實踐中使用的多肽可以通過常規的藥物制劑施用給需要治療的個體。
本發明另外一種實施方式涉及為上面所討論的任何一種治療效果而施用藥物組合物，與藥學上可接受的載體一起。這樣的藥物組合物可以由內皮抑制素(例如，內皮抑制素)、或內皮抑制素的抗獨特型抗體、或內皮抑制素模擬物組成。這些組合物可以單獨或與至少一種其它物質，例如穩定化化合物，一起施用，它們可以在任何無菌的、生物相容的藥學載體，包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、和水，中進行施用。這些組合物可以單獨、或與其它物質、藥物或激素一起施用給患者。
本發明的藥物組合物可以通過任何途徑進行給藥，包括但不限于，經眼內、眼周、口服、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、經皮、皮下、腹膜內、鼻內、腸、局部、舌下、或直腸途徑。
除活性成分外，這些組合物還可以包含適宜的藥學可接受載體——包括可以使活性化合物便于被加工成可以在藥學上使用的制劑的賦形劑和助劑。在最新出版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中可以找到有關制劑和給藥的進一步技術細節。
口服藥物制劑可以按如下得到通過將活性化合物與固體賦形劑組合，可選地對所得混合物進行研磨，并且在加入適宜助劑(如果需要的話)后對顆粒混合物進行加工得到片劑或糖衣丸核。適宜賦形劑為碳水化合物或蛋白質填充劑，比如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；來自玉米、小麥、稻、土豆、或其它植物的淀粉；纖維素，比如甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、或羧甲基纖維素鈉；樹膠包括阿拉伯膠和黃芪膠，以及象明膠或膠原蛋白等這樣的蛋白質。如果想要的話，可以添加崩解劑或增溶劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸、或其鹽，比如藻酸鈉。
糖衣丸核可與其它適宜的包衣結合使用，比如濃縮糖溶液，它還可包括阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、lacquer溶液，和適宜的有機溶劑或溶劑混合物。片劑或糖片包衣中可以加入染料或色素便于產物鑒別或表示活性化合物的量，即，劑量。
可以口服的藥物制劑包括用明膠制成的push-fit膠囊，以及由明膠和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠囊。Push-fit膠囊可以包含與填充劑或結合劑，比如乳糖或淀粉，潤滑劑，比如滑石粉或硬脂酸鎂，混合的活性成分，以及可選地包含，穩定劑。在軟膠囊中，化合物可以溶解或懸浮在適宜的液體，比如油脂、液體、或含或不合穩定劑的液態聚乙二醇中。
適于腸胃外給藥的藥物劑型可以在水溶液中配制，優選在生理學上可接受的相容緩沖液例如Hanks’溶液、Ringer’s溶液、或生理緩沖鹽水中。水性注射懸液可以含有提高懸液粘度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、或右旋糖酐。此外，活性化合物懸液可適當制成油性注射懸液。適宜的親脂性溶劑或載體包括油脂，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂質體。非脂質聚陽離子氨基聚合物也可以用于運輸。可選地，該懸浮液還包含適宜的穩定劑或提高化合物可溶性的試劑以得以制成高濃度的溶液。
對于局部或鼻給藥，制劑中可以使用適于待滲透的特定屏障的滲透劑。這樣的滲透劑是本領域公知的。
可以通過本領域公知的方式，例如，通過常規的混合、溶解、顆粒化、制成糖丸、乳化、包囊化、截留、或凍干過程，生產本發明的藥物組合物。
該藥物組合物可以以鹽的形式提供，并可以與許多酸形成鹽，這些酸包括但不限于，鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸，等。鹽與相應的游離堿形式相比在水性或其它質子溶劑中傾向于更加可溶。在其它情況中，優選制劑可能是包含以下任一或全部成分的凍干粉末1-50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖、和2-7％甘露醇，pH范圍4.5至5.5，使用前與緩沖液混合。
藥物組合物制好后可以置于適宜容器中并為指定狀況的治療作標記。對于內皮抑制素的給藥，這樣的標記應當包括劑量、次數、和給藥方法。
適于在本發明中使用的藥物組合物包括其中含有實現預定目的的有效量的活性成分的組合物。有效劑量的確定在本領域技術人員的能力范圍內。
活性試劑的治療有效劑量可以在細胞，例如內皮細胞，培養檢測分析中或者在動物模型中進行初步估計，動物模型通常為小鼠、兔、狗、或豬。動物模型還可用于確定適宜的濃度范圍和給藥途徑。這樣的信息之后可以用于確定在人類中的有效劑量和給藥途徑。
治療有效劑量指活性成分，例如內皮抑制素或其片段，內皮抑制素抗體，內皮抑制素激動劑、拮抗劑或抑制劑，改善癥狀或狀況的量。可以通過標準藥學程序在細胞培養物或實驗動物中確定治療效力或毒性，例如，ED50(50％群體中的治療有效劑量)和LD50(對50％群體的致死劑量)。毒性效果和治療效果間的劑量比率為治療指數，它可以用LD50/ED50比值表示。表現出高治療指數的藥物組合物是優選的。將得自細胞培養物檢測分析和動物研究中的數據用于計算在人類使用時的劑量范圍。這樣的組合物中所包含的劑量優選在循環濃度范圍內，循環濃度包括帶極少或不帶毒性的ED50。該劑量根據所使用的劑量形式、患者敏感程度、和給藥途徑在該范圍內變化。
確切劑量由醫師根據與需要治療的對象相關的因素確定。對劑量和給藥進行調節以形成活性部分的有效水平或保持目的效果。可能考慮的因素包括疾病狀態的嚴重程度、對象的總體健康、年齡、體重和對象的性別、飲食、給藥時間和頻率、藥物組合、反應敏感程度、和對治療的耐受性/反應。長時間作用藥物組合物可以根據特定制劑的半衰期和清除速率每3至4天、每周、或每兩周給藥一次。
正常劑量，例如，當施用外源制備的內皮抑制素時，可以根據給藥途徑和方法在自約0.1至約20mg/kg每天、優選自2.5至20mg/kg每天的范圍內變化。特定劑量和運送方法的指導在文獻中給出，并且本領域醫師通常可以得到。對于核苷酸，本領域技術人員可以使用不同于蛋白質或其抑制劑的制劑。類似地，多核苷酸或多肽的運輸針對特定細胞、狀況、位置等是特定的。不同的生物可降解或生物相容性聚合物基質，包括微囊、納米球體(nanospheres)、和植入物，可用于實施本發明。
微球體(microspheres)是含有活性藥物的精細球形顆粒。它們與納米球體的基本不同之處在于顆粒大小；微球體的直徑小于約1000μm，而納米球體是亞微米級的(＜1μm)。微球體系統或者含有均一的整體型微球體(monolithic microspheres)或者含有貯庫型(reservoir-type)微球體，在前者中藥物均勻地溶解或分散在聚合物基質中，在后者中藥物被聚合物基質膜殼所包圍。
也可以將整體型或貯庫型系統相結合。例如，活性藥物可以分散于、或被吸收到貯庫型微球體的聚合物表面。
生物可降解聚合物可以包括純度不同的天然或者合成物質。天然聚合物包括多肽和蛋白質(例如，白蛋白、纖維蛋白原、明膠、膠原蛋白)、多糖(例如，透明質酸、淀粉、殼聚糖)、和病毒包膜和活細胞(例如，紅細胞、成纖維細胞、成肌細胞)。天然物質需要在微囊化過程中進行交聯，從而使聚合物變性并形成被包埋的藥物。因此，最常使用合成聚合物。經常使用的合成聚合物包括如聚乳酸(PLA)這樣的多(-羥基)酸、聚羥基丁酸、和乳酸/羥乙酸共聚物(PLGA)。這些化合物是生物相容的、沒有免疫原性、并具有使其易于成型的物理特性(控制生物降解速率)。
膠狀顆粒載體也可以在本發明的方法中用于運送內皮抑制素。脂質體是優選的膠狀載體，它由可同時作為親水和疏水藥物載體的磷脂雙層構成。脂質體由，例如，中性脂質、帶電磷脂、和膽固醇制成。向脂質體表面中添加如聚乙二醇(PEG)這樣的兩親性聚合物可以減緩脂質體的清除。
施用經過PEG修飾的內皮抑制素也在本發明范圍內。PEG是由重復乙撐氧亞單位和兩個可以被化學激活的末端羥基基團構成的聚合物。PEG分子有大量不同的構型。PEG鏈包括線性和支鏈結構——其中一或多個PEG鏈通過如賴氨酸或三嗪這樣的接頭相連。PEG可以在一個位點或多個位點與內皮抑制素結合，優選共價結合。由于支鏈PEG結合于單個位點或者比線性PEG結合的位點少，因此支鏈PEG或許比多個小線性鏈PEG的結合不太可能干擾天然分子的生物活性，因此支鏈PEG為優選的。適于蛋白質口服給藥的藥物制劑描述于，例如，美國專利5 008 114、5 505 962、5 641 515、5 681 811、5 700 486、5 766 633、5 792 451、5 853 748、5 972 387、5 976 569、和6 051561，全部將其全文引入本文作為參考。
可以用基因療法將內皮抑制素運輸至需要治療的個體。本領域中可獲得的任何基因療法都可以根據發明使用。示例性方法如下所述。
在一個優選方面，治療物包括作為表達載體一部分的內皮抑制素編碼核酸，所述表達載體在適宜宿主中表達內皮抑制素或其片段或嵌合蛋白質。特別地，這樣的核酸具有與多肽編碼區可操作性相連的啟動子，該啟動子是可誘導的或組成型的，以及，可選地，是組織特異性的。在另一種特定實施方式中，使用這樣一種核酸分子其中在多肽編碼序列和任何其它目的序列兩側是促進在基因組中目的位點發生同源重組的區域，從而使目的核酸在染色體內表達。
向患者體內運輸內皮抑制素編碼核酸可以是直接的——此時直接將患者暴露于核酸或攜帶核酸的載體，或間接的——此時細胞首先在體外用核酸進行轉化、之后移植到患者體內。這兩種方法分別被稱為體內或體外基因療法。
在一種特定實施方式中，內皮抑制素編碼核酸直接在體內施用，它在體內表達產生編碼產物。這可以通過本領域已知的眾多方法中的任何一種來完成，例如，通過將其構建為適宜核酸表達載體的一部分并用其進行給藥以使其位于細胞內，例如，通過用缺陷型或減毒型逆轉錄病毒或其它病毒載體進行感染(參見，例如，美國專利號4 980 286和上面提及的其它文獻)，或通過直接注射裸DNA(參見，例如，Blezinger等人，Nature Biotechnology，17，343-348(1999))或通過使用微粒子轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉化劑進行包被、包裝入脂質體(參見，例如，Chen等人，Cancer Research，59，3308-3312(1999))、微粒、或微囊中，或通過與已知進入核內的肽關聯給藥，或通過與接受受體介導的內吞作用的配體關聯給藥(參見，例如，美國專利5 166 320、5728 399、5 874 297、和6 030 954，全部將其文引入本文作為參考)(這可用于靶向特異表達該受體的細胞類型)，等。在另一種實施方式中，可以形成核酸-配體復合物，其中的配體含有融合性病毒肽(fusogenic viral peptide)以破壞內體，以使該核酸免于被溶酶體降解。在另一種實施方式中，可以通過靶向一種特異性受體，使該核酸可以在體內被細胞特異性攝取和表達(參見，例如，PCT公開WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188、和WO93/20221)。作為替代方式，可以將該核酸導入細胞內并通過同源重組將其整合到宿主DNA中進行表達(參見，例如，美國專利5 413 923、5 416 260、和5 574 205)。
在一種特異實施方式中，使用了含有內皮抑制素編碼核酸的病毒載體。例如，可以使用逆轉錄病毒載體(參見，例如，美國專利5 219740、5 604 090、和5 834 182)。這些逆轉錄病毒載體已經過修飾從而刪除了包裝病毒基因組以及將其整合進宿主細胞DNA非必需的逆轉錄病毒序列。把基因療法中使用的內皮抑制素編碼核酸克隆進該載體，使得該基因向患者的運送更為便利。
腺病毒是另一種可以在基因療法中使用的病毒載體。腺病毒基因組是線性、雙鏈DNA分子，長約36千個堿基對。病毒基因組各末端都有一個稱為反向末端重復(或ITR)的短序列，它們是病毒復制所必須的。由于腺病毒分子遺傳學已經被詳細描述，使腺病毒成為基因轉移的有利載體。病毒基因組部分可以用帶有外源DNA進行替換。此外，重組腺病毒在結構上是穩定的，而且在大量擴增后沒有發現重排病毒。
腺病毒對于將基因運送至呼吸道上皮來說是尤為吸引人的載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮而在其中引起輕微的疾病。以腺病毒為基礎的運輸系統的其它靶物是肝細胞、中樞神經系統、內皮細胞、和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞的優勢。實施以腺病毒為基礎的基因療法的方法描述于，例如美國專利5 824 544、5 868 040、5 871722、5 880 102、5 882 877、5 885 808、5 932 210、5 981 225、5 994 106、5 994 132、5 994 134、6 001 557、和6 033 8843，全部將其全文引入本文作為參考。
在一種特定實施方式中，為基因治療目的而將要利用腺病毒載體被導入的核酸含有與編碼區域可操作性相連的可誘導啟動子，這樣，可以通過控制適當轉錄誘導物的存在與否來控制該核酸的表達。
將基因組元件整合進腺病毒載體可以提高內皮抑制素編碼DNA序列的表達。因此，根據本發明的另一方面，提供了包括至少一個內皮抑制素編碼DNA序列、和至少一個影響這樣的DNA序列表達的基因組元件的腺病毒載體。術語“基因組元件”根據先前所定義的使用。這樣的基因組元件包括但不限于內含子、5′非翻譯區、和3′非翻譯區、以及內含子和3′和5′非翻譯區之部分。該腺病毒載體可以是上文所描述的腺病毒載體。控制DNA序列的啟動子選自本文中以及現有技術中所描述的那些啟動子。
將由具有感染性、但為復制缺陷型的病毒顆粒構成的載體(其含有至少一條編碼內皮抑制素的DNA序列)以治療宿主脈絡膜新生血管形成的有效量向宿主體內給藥。該組主可以是哺乳動物宿主，包括人和非人靈長類宿主。
可以向哺乳動物宿主施用產生不超過1 000 000ng/ml血液或1mg/ml血液的內皮抑制素水平的有效量的腺病毒載體。可以向哺乳動物宿主施用產生不超過1 000 000ng/ml血液的內皮抑制素水平的有效量腺病毒載體，但是已經發現，一些內皮抑制素，比如內皮抑制素，當由經本發明腺病毒載體轉導的哺乳動物細胞表達時，顯著地比由非哺乳動物細胞(比如酵母細胞或如大腸桿菌細胞這樣的細菌細胞)表達的內皮抑制素更有活性(活性高約1000倍)。因此，為了達到滿意的抗-新生血管形成效果，人們通常可以通過向哺乳動物宿主施用腺病毒載體來為哺乳動物宿主提供較低水平的內皮抑制素，這與向哺乳動物提供顯著更高水平的由酵母或細菌表達的內皮抑制素相反。
在另一種實施方式中，當向哺乳動物宿主給藥時，施用產生宿主體內基本內皮抑制素水平的自約2至20倍內皮抑制素水平的有效量腺病毒載體。通常，在這樣的一種實施方式中，向哺乳動物宿主施用產生至少約300ng/ml血液、優選自約300ng/ml至約3000ng/ml、更優選自約500ng/ml至約1500ng/ml水平的活性多肽表達的有效量的腺病毒載體。
在另一種實施方式中，施用其量為自約108噬斑形成單位至約1014噬斑形成單位，優選自約108噬斑形成單位至約1011噬斑形成單位，更優選自約109噬斑形成單位至約1010噬斑形成單位的病毒載體。上述所列量的腺病毒載體為優選。
可以全身性施用感染性載體粒子，比如，例如，通過靜脈內(比如，例如，經外周靜脈注射)或經門靜脈施用，施用至膽管、肌內、腹膜內、或鼻內給藥。作為替代，可以局部施用感染性載體粒子，通過例如眼內或眼周注射。可以這樣注射進眼前房或后房，例如，注射進房水或玻璃體液。作為替代，可以在視網膜下注射，例如，通過在視網膜后注射含載體的溶液試樣(例如，1至10微升每份試樣)，之后，溶液被吸收，感染性載體粒子感染眼組織的局部細胞并產生活性多肽。這樣的給藥可以包括單次注射同一天內多次注射、數周或數月內的單次注射、或數周或數月內的多次注射。
這些載體粒子可以與適于向患者施用的藥學可接受載體結合給藥。該載體可以是液體載體(例如，鹽水溶液)、或固體載體、比如，例如微載體珠(mirocarrier beads)。
腺伴隨病毒(AAV)已被提議用于基因治療，包括治療腫瘤的內皮抑制素基因療法(參見，例如，Nguyen等人，Cancer Research，58，5673-5677(1998))。產生并利用AAV的方法描述于，例如，美國專利5 173 414、5 252 479、5 552 311、5 658 785、5 763 416、5 773289、5 843 742、5 869 040、5 942 496、和5 948 675，全部將其全文引入本文作為參考。
基因療法的另一種途徑涉及通過如電擊法、脂質轉染法、磷酸鈣介導的轉染、或病毒感染這樣的方法將基因轉移進組織培養細胞。通常，轉移方法包括將選擇標記轉移進細胞。之后對細胞進行選擇以分離已經攝入并表達了該轉移基因的那些細胞。之后將那些細胞轉移進患者。
在這種實施方式中，在將最后的重組細胞進行體內給藥之前，將核酸導入細胞。可以用本領域已知的任何方法來完成這種導入，包括但不限于轉染、電穿孔法、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染，細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞(microcell)介導的基因轉移、原生質體融合，等。本領域中已知了大量用于將外源基因導入細胞的方法而且它們可以用于本發明，只要受體細胞的必須的發育和生理功能未被破壞。這一技術應當使核酸向細胞穩定轉移，由此該核酸可以被細胞表達且優選地可被其細胞后代遺傳并表達。在另一種實施方式中，在細胞中通常不表達、或由細胞低水平表達的內源基因，可以被與該內源基因可操作性相連的啟動子激活，由此提供高水平表達內源基因的細胞，使該細胞合成并分泌內皮抑制素。
產生和注射這樣的細胞的方法(也即，從或內源或外源基因或核酸產生高水平蛋白質的那些方法)描述于特別是美國專利號5 641670、5 733 761、5 968 502、6 048 729、6 054 288、6 063 630、和6 187 305。在優選實施方式中，以裝入微囊的形式來運送產生內皮抑制素的細胞，例如，裝入藻酸鈉或藻酸鈣聚L-賴氨酸藻酸鹽微膠囊中的細胞形式(參見，例如，Read等人，Nature Biotechnology 19，29-34(2001年1月)和Joki等人，Nature Biotechnology 19，35-39(2001年1月))。可以將該微囊化的細胞移植在眼附近或由細胞產生的內皮抑制素最迅速進入對象血流的位置，例如，在肝臟。預計的細胞使用量依賴于期望的效應、患者狀態等，而且可由本領域技術人員測定。
可以為基因治療目的而向其中導入核酸的細胞包括任何想得到的、可以得到的細胞類型，而且包括但不限于上皮細胞、內皮細胞、角質形成細胞、成纖維細胞、肌細胞、肝細胞；血細胞，比如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干細胞或始祖細胞，尤其是造血干細胞或祖先細胞，例如，獲自骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等的那些。
在一種優選實施方式中，用于基因療法的細胞是患者自體的。
在一種將重組細胞用于基因治療的實施方式中，將內皮抑制素編碼核酸導入細胞，這樣該細胞或其后代可以表達該核酸，而且之后為治療目的體內施用該重組細胞。在一種特定實施方式中，使用干細胞或始祖細胞。根據本發明的這一實施方式，可以使用任何可以體外分離并保持的干和/或始祖細胞。這樣的干細胞包括但不陷于造血干細胞(HSC)，比如皮膚和內臟襯里這樣的上皮組織的干細胞、胚胎心肌細胞、肝臟干細胞(參見，例如，WO94/08598)、和神經干細胞。
上皮干細胞(ESCs)或角質形成細胞可通過已知方法獲自比如皮膚或內臟襯里這樣的組織。在分層上皮組織例如皮膚中，通過生發層(與基底層最接近的一層)內干細胞的有絲分裂進行更新。內臟襯里中的干細胞使這一組織快速更新。獲自患者或供體皮膚或內臟襯里的ESC或角質形成細胞可以在組織培養中培養。如果ESC由供體提供，還可以使用抑制宿主對移植物反應性的方法(例如，施用放射、藥物或抗體來促進適當的免疫抑制)。
至于造血干細胞(HSC)，在本發明這一實施方式中可以使用任何分離、增殖、體外保持HSC的技術。可以完成這些的技術包括(a)從分離自未來宿主、或供體的骨髓細胞分離和建立HSC培養物，或(b)利用先前建立的長期HSC培養物，其可能是同種異體或異種的。非自體HSC優選與抑制未來宿主/患者的移植免疫反應的方法相結合。在本發明的一種特殊實施方式中，人骨髓細胞可通過針吸從后髂嵴獲得(參見，例如，Kodo等人，1984，J.Clin.Invest.731377-1384)。可以以高度富集或基本純的形式制備HSC。這種富集可以在長期培養之前、期間、或之后進行，并且可以用本領域中的任何技術完成。可以用，例如，改良Dexter細胞培養技術(Dexter等人，1977，J.CellPhysiol.91335)或Witlock-Witte培養技術(Witlock和Witte，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 793608-3612)建立并保持骨髓細胞的長期培養物。
特別將本說明書中所參考的所有專利、公開出版物、(包括已出版的專利申請)、和數據庫登記號和保藏登記號完整地引入本文作為參考，仿佛這樣的每個專利、公開出版物、(包括已出版的專利申請)、和數據庫登記號和保藏登記號都特別地且單獨地被指定引入本文作為參考。
然而，應當理解，本發明的范圍不限于上述特定實施方式。可以用除具體描述的之外的其它方式來實施本發明，它們仍在本發明所附權利要求書范圍內。
進一步的方面涉及內皮抑制素在制備用于治療患有視網膜脫離或視網膜水腫的患者的藥物中的用途，其中所述內皮抑制素特別地是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽，或其中所述內皮抑制素如整個本公開文本中所定義或描述的。
實施例1腺病毒載體的產生方法1用引物5′-ACT GGT GAC GCG GCC CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAGCC-3′(SEQ ID NO6)和5′-AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGGCCT AT-3′(SEQ ID NO7)從獲自Genome Systems(St.Louis，MO)的小鼠膠原蛋白XVIII克隆ID 748987中經聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出小鼠內皮抑制素(mEndo)cDNA(598-bp F1片段)。用引物5′-CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG-3′(SEQ ID NO8)和5′-CTG ATG AGTATG GGC CGC GTC ACC AGT GG-3′(SEQ ID NO9)從pSecTag2(InVitrogen，Carlsbad，CA)PCR擴增出小鼠免疫球蛋白k鏈引導序列(Ig-k leader)(147-bp F2片段)。PCR用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)在下列條件下完成35個循環95℃熱起始3分鐘，95℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，和72℃延伸2分鐘。DNA片段經凝膠純化。以上述產生的F1和F2DNA片段為模板利用PCR拼接重疊延伸(splice overlap extension)裝配小鼠Ig-k引導序列和鼠內皮抑制素cDNA從而產生sig-mEndo嵌合DNA(718bp)。PCR用引物5′-CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG-3′(SEQ ID NO8)和5′-AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGG CCT AT-3′(SEQ ID NO10)以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene)來完成。PCR在下列條件下運行35個循環95℃熱起始3分鐘，95℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，和72℃延伸2分鐘。
將718-bp sig-mEndo嵌合DNA插入到腺病毒穿梭質粒pAvF91xr的Nhe1和Cla1位點間，處于Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子下游和猿病毒40(SV40)多聚腺苷酸信號上游，構建得到pAvmEndoLxr腺病毒穿梭質粒。pAvmEndoLxc中除用經Asc1和Nhe1消化的猿巨細胞病毒(sCMV)啟動子片段替換RSV啟動子之外，其它與pAvmEndoLxr相同。這兩個穿梭質粒都含有用于Cre/lox-介導重組的LoxP位點。pAvmEndoLxr和pAvmEndoLxc腺病毒質粒中的轉基因序列都經直接序列分析驗證。
通過由Cre/lox-介導的兩個質粒，pSQ3和pAvmEndoLxr，之間的重組來產生編碼sig-mEndo嵌合體的重組Av3mEndo(缺失了E1、E2a、和E3)。該pSQ3質粒包含loxP位點、以及在該位點之后含有缺失了自左側末端反向末端重復(ITR)至E1a末端這一區域的Av3基因組。pAvmEndoLxr和pSQ3各自首先用NotI和ClaI限制性酶線性化。用磷酸鈣哺乳動物轉染系統(Promega，Madison，WI)完成對293細胞的瞬間轉染(六孔板各孔4×105個細胞)。用總體積為1.8ml的4.8mg線性化的pAvmEndoLxr、12mg線性化的pSQ3、6mg pcmvCre、和6mgpcmvE2a制備磷酸鈣-DNA沉淀。向各孔中加入0.6-ml磷酸鈣-DNA沉淀。將293細胞與磷酸鈣-DNA沉淀于37℃下溫育16小時。除去沉淀，細胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌。轉染后十五天，觀察細胞病變效果(CPE)。之后刮取收集細胞和培養基。經五個凍融循環制備粗病毒裂解物。
用0.3mM地塞米松在含有5％FBS的Richter’s CM上在S8細胞中再擴增Av3mEndo載體直到觀察到CPE。如(Mittereder等人，1996)所述測定腺病毒載體滴度(粒子每毫升)和生物學滴度(噬斑形成單位[PFU]每毫升)。以同樣的方式利用Cre/lox-介導的pSQ3和pAvmEndoLxc的重組產生由CMV啟動子驅動的、包含sig-mEndo的重組Av3CsmEndo。通過限制性消化和DNA印跡分析來驗證純化的Av3mEndo、Av3CsmEndo、和對照Av3NulI的正確基因組結構。已證實Av3mEndo和Av3CsmEndo種子批對于復制型腺病毒(RCA)為陰性。
經Av3mEndo轉化的S8細胞上清液中含有可以有效抑制由VEGF165誘導的HUVEC細胞遷移的20-kDa蛋白質，這一大小為預計的內皮抑制素大小，而且經ELISA證實106經Av3mEndo轉導的Hep3B細胞每24小時分泌1-2μg鼠內皮抑制素。
腺病毒載體的產生方法2從驟凍的2周齡C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)肝臟分離RNA(RNeasy Mini試劑盒；Qiagen，Valencia，CA)并經Moloney鼠白血病(Moloney murine leukemia)病毒逆轉錄酶(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)處理得到鼠cDNA。用正義引物5′-GATCTCTAGACCACCATGCATACTCATCAGGACTT-3′(SEQ ID NO11)和反義引物5′-ACTGGAGAAAGAGGTTTATCTAGCTACTAG-3′(SEQ ID NO12)經PCR將鼠內皮抑制素基因克隆進TA克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用正義引物5′-GATCTCTAGACCACCATG AGGTACATGATTTTAGGCTTGCTCGCCCTTGCGGCAGTCTGCAGCGCGGCCCATACTCATACTCATCAGGACTTTCAG-3′(SEQ IDNO14)和反義引物(同上)經PCR將18氨基酸E3/19K信號序列MRYMILGLLALAAVCSAA(SEQ ID NO13)插入到內皮抑制素序列上游。質粒DNA在DH5細胞(Life Technologies)中擴增，并驗證信號序列—鼠內皮抑制素(ss-mEndo)序列(ABI Prism 310自動測序儀；PEApplied Biosystems，Foster City，CA)。
ss-mEndo構建體經EcoR1消化并通過鈍端連接克隆進腺病毒穿梭質粒pAd/CMV.1的多克隆位點。所得質粒與5型E1 A/B-缺失Ad2重組，并用于感染293細胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。通過蛋白酶K消化、苯酚抽提、和乙醇沉淀提取噬斑DNA，并經PCR篩選ss-mEndo。在293細胞中擴增所得病毒，Ad-ss-mEndo。用相似的策略產生包含β-gal(Ad-β-gal)基因和螢火蟲熒光素酶(Ad-luc)基因的對照重組病毒。用標準噬斑形成檢測測定293細胞中的病毒滴度。細胞在由含有10％FCS、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、50μg/ml慶大霉素、0.5μg/ml兩性霉素B、和4mM谷氨酸的DMEM(Biofluids，Rockville，MD)組成的完全培養基中生長。用Ad-ss-mEndo、Ad-luc、或無病毒以MOI介于0.1至100(1.0ml完全培養基中每106個細胞，105至108個pfu)間感染細胞，并于37℃溫育24小時。上清液2×g離心5分鐘，并根據制造商說明用競爭性EIA(Cytimmune Sciences，College Park，MD)檢測內皮抑制素。在纖維素柱(Centricon YM-10；Millipore，Bedford，MA)中將293細胞上清液濃縮10倍，并用570ng/ml兔抗鼠內皮抑制素多克隆IgG抗體(Cytimmune Sciences贈品)做蛋白質印跡分析(NuPAGE；Novex，San Diego，CA)。用EIA鼠內皮抑制素標準作為陽性對照。用上述Ad-β-gal感染細胞并在24小時后用染色試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)檢測β-gal，由此測試鼠結腸腺癌細胞系MC38(由Surgery Branch，National CancerInstitute開發)對腺病毒感染的易感性。用鼠肝細胞系NMuLi(美國典型培養物保藏中心)對Ad-β-gal感染的易感性作為陽性對照。
腺病毒載體的產生方法3將來自BALB/c小鼠的肝臟組織勻漿，并抽提總RNA(Rneasy試劑盒；Qiagen，Chatsworth，CA)。用寡聚(dT)引物(SuperScript II；Life Technologies，Grand Island，NY)經反轉錄PCR擴增出第一鏈cDNA。經PCR(帶有Cla1接頭的正義引物，5′-ATCGATCATACTCATCAGGACTTTCAGCC-3′(SEQ ID NO15)；帶有Not1接頭的反義引物，5′-GCGGCCGCCTATTTGGAGAAAGAGGTCAT-3′(SEQ IDNO16))擴增出全長小鼠內皮抑制素cDNA用于亞克隆進pBluescript(Stratagene)。將編碼大鼠胰島素引導序列的合成寡核苷酸克隆在內皮抑制素基因前面。驗證序列之后，將大鼠胰島素引導序列-內皮抑制素cDNA克隆進如Bautista，D.S.等人，(1991)Virology 182，578-596所述用于拯救重組腺病毒的重組腺病毒(ADV)穿梭載體pADV.hEF1-α(人延長因子1-α)。通過吸光度(A260)測定病毒粒子，用標準瓊脂糖覆層噬斑檢測法測定293細胞的噬斑形成單位。對分離自人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的RNA進行反轉錄-PCR獲得用于構建ADV.hVEGF165的cDNA。JC和LLC細胞系獲自美國典型培養物保藏中心。細胞在RPMI培養基1640(JC)和DMEM(LLC)中培養。所有培養基都補加了10％FBS、0.2mM谷氨酸鹽、和1％青霉素/鏈霉素。室溫下用IV型膠原蛋白酶(Sigma)灌注(0.2％，溶于Hanks平衡鹽溶液中)20分鐘從臍帶分離得到HUVEC。之后在補加了20％FBS、0.2mM谷氨酸鹽、1％青霉素/鏈霉素、和1ng/ml bFGF的M199培養基中在用膠原蛋白(1％，溶于PBS)包被的平板上培養細胞。
實施例2向小鼠的基因轉移和CNV的誘導將病毒載體注射進成年C57BL/6小鼠的尾靜脈。用2×1011粒子(particles)的Av3mEndo(n＝18)或Av3mNull(n＝17)或用6×1010粒子的Av3CsmEndo或Av3CsNull注射小鼠。注射病毒載體四天后，用鹽酸氯胺酮(100mg/kg體重)麻痹小鼠，用1％托吡卡胺(tropicamide)使瞳孔放大，如Tobe等人，Am.J.Pathol.153，1641-1646(1998)先前所描述的用氪激光光凝固法使各小鼠每只眼睛的玻璃膜在三個位置破裂。簡言之，用Coherent Model 920光凝固器的狹縫燈傳遞系統(slit lamp delivery system)和一塊用作接觸鏡的手持蓋玻片來進行氪激光凝固法(100μm點大小，0.1秒持續時間，120mW)。在離視覺神經2～3個視神經盤直徑(disc diameter)的9、12、和3點鐘的位置進行灼燒。激光照射時蒸發泡的產生，它表示玻璃膜的破裂，是獲得CNV的重要因素，因此只有起泡的灼燒才包括在該項研究中。經Av3mEndo注射的小鼠有一次灼燒沒有起泡，經Av3mNull注射的小鼠有三次灼燒沒有起泡。有一只經Av3mEndo注射的小鼠有一只眼睛的角膜有一個妨礙激光使用的角膜疤，因此未曾使用該眼。
實施例3由激光誘導的CNV損傷大小的測定激光處理之后兩周，利用兩種不同的技術之一評估CNV損傷的大小，由Seo等人，Amer.J.Pathol.154，1743-1753(1999)先前報導的對連續切片上的CNV總和面積(integrated area)的測定或由Edelman等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41，S834(2000)描述的對脈絡膜flat mounts中CNV面積的測定。對于用Av3mEndo注射的小鼠，10只小鼠用flat mount技術評估以及8只用連續切片評估，對于用Av3mNull注射的小鼠，10只小鼠用flat mount技術評估以及7只用連續切片評估。
如Tobe等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39，180-8(1998)先前所述，麻痹用于flat mount技術的小鼠并用含有50mg/ml經熒光素標記的右旋糖酐(2×106平均mw，Sigma，St.Louis，MO)的1ml磷酸緩沖鹽水灌注。取出眼睛并在10％磷酸鹽緩沖福爾馬林中固定1小時。取出角膜和晶狀體，從視杯中小心分離出完整視網膜。在視杯的邊緣到中緯線做徑向切割(4-7，平均為5個)，并在Aquamount中使鞏膜向上、脈絡膜向下將視杯水平安放(flat mounted)。用熒光顯微鏡檢測Flat mounts，用3CCD彩色攝像儀和幀接收器(framegrabber)將圖像數字化。用Image-Pro Plus測量與各次灼燒有關的超熒光總面積，其對應于總維管疤。
對于用Av3mEndo注射的小鼠，總計評估了19只眼(有一只眼睛沒有進行激光處理就已經存在了角膜疤)而且由于有一次灼燒沒有起泡，因此測定了56個損傷。對于用Av3mNull注射的小鼠，總計評估了20只眼，而且由于有3次灼燒沒有起泡，因此測定了57個損傷。對每只眼睛內的面積取平均值，做log轉換后，用廣義估計方程(generalized estimating equations，GEE)完成回歸分析。該分析調節每只小鼠右眼和左眼間的相關性。
用激光處理了兩周后，將用于測定連續切片上的CNV總和面積的小鼠處死，將眼睛迅速取出并冷凍在適宜切割溫度包埋化合物(OCT；Miles Diagnostics，Elkhart，IN)中。沿每個灼燒整個區域切割冷凍連續切片(10μm)，并用選擇性地與血管細胞結合的生物素化griffonia simplicifolia lectin B4(GSA，Vector Laboratories，Burlingame，CA)進行組織化學染色。4℃下將載玻片放在甲醇/H2O2中孵育10分鐘，用0.05M Tris緩沖鹽水洗滌，pH 7.6(TBS)，并在10％正常豬血清中孵育30分鐘。室溫下用生物素化的GSA孵育載玻片2小時，用0.05M TBS漂洗后，用與過氧化物酶偶聯的抗生物素蛋白(Vector Laboratories)于室溫孵育45分鐘。用0.05M TBS洗滌10分鐘后，用Histomark Red(Kirkegaard和Perry)孵育載玻片以產生能夠與黑色素區分開的紅色反應產物。用Contrast Blue(Kirkegaard和Perry)對一些載玻片進行復染色。
為了進行定量評估，用Axioskop顯微鏡檢查經GSA染色的切片，并用3CCD彩色攝像機和幀接收器(frame grabber)使圖像數字化。用Image-Pro Plus軟件描繪并測定視網膜下空間中經GSA染色血管的面積。對于各損傷，對所有出現了損傷的切片做面積測量，并把它們加在一起以得出總和面積測量值。對每只眼睛中的測量值取平均值，并用GEE做回歸分析。
在最初的實驗中，將位于由激光誘導的玻璃膜破裂位點的CNV量與用Av3mEndo注射的小鼠和用Av3mNull注射的小鼠相比。用兩種不同的技術估測CNV的量；對脈絡膜flat mounts上用熒光標記的右旋糖酐灌注的CNV面積的測定，和對貫穿整個損傷的連續切片上CNV面積的測定。與未注射小鼠和用Av3Null注射的小鼠相比，用Av3mEndo注射的小鼠中，脈絡膜flat mounts中的由激光誘導的CNV面積更少。由不知曉處理組的調查者完成的圖像分析證實了由視覺比較所見的區別，這表明用Av3mEndo注射的小鼠中的灌注CNV損傷平均面積顯著小于用Av3Null注射對照的(表1)。
表1脈絡膜Flat Mounts上的灌注CNV面積
貫穿整個損傷的連續切片上的CNV總和面積
經CNV損傷的連續切片還顯示，與用Av3Null注射的小鼠相比，在用Av3mEndo注射的小鼠中有較小的損傷。將各系列切片上的CNV面積相加得到的CNV總和面積——其估測了三維的大小，證實了與Av3Null注射小鼠相比用Av3mEndo注射的小鼠中在玻璃膜破裂位置處的CNV顯著更小(表1)。由于兩種測量技術給出了非常相似的信息，在后面的實驗中只施用了脈絡膜flat mounts。
內皮抑制素血清水平與CNV面積之間存在反相關性。用載體進行靜脈內注射4～7天后內皮抑制素血清水平是最適宜的。用Av3mEndo、Av3CsmEndo、Av3Null、或Av3CsNull注射了一組小鼠。第四天進行激光處理，注射后七天獲得血清。在調查者不知道載體組和內皮抑制素血清水平的情況下，激光光凝固法后14天測定了脈絡膜flat mounts上的CNV面積。用Av3CsmEndo注射的小鼠看來比未注射小鼠或用Av3CsNull注射的小鼠的CNV更少。圖像分析證實，與對照相比，用Av3CsmEndo或Av3mEndo注射的小鼠中的CNV損傷面積顯著更少(表2)。
表2脈絡膜Flat Mounts上的灌注CNV面積
*相對于無載體對照的差異；**相對于相應空載體對照的差異對每只小鼠中的CNV損傷平均面積vs內皮抑制素血清水平作圖顯示出強的負相關，r＝-0.66。
實施例4眼和肝臟中的內皮抑制素表達分析為確定全身性施用腺病毒載體是否會對眼睛產生顯著的轉導，用Av3nBg對一組小鼠進行了注射。該載體由RSV啟動子表達β-半乳糖苷酶。五天后，處死這些小鼠，并用化學發光分析測定眼和肝臟勻漿中的β-半乳糖苷酶活性。將肝臟和眼從小鼠中取出后迅速冷凍。檢測當天，在裂解緩沖液(40∶1 v/v 1×Reporter裂解緩沖液(Promega，Madison WI)Protease Inhibitor Cocktail(Sigma，St Louis MO))中將肝臟或眼勻漿。用Bradford Assay(Biorad，Hercules CA)測定蛋白質含量。用Galacto-Light system(Tropix，Bedford MA)測定β-半乳糖苷酶活性。
在接受了載體的小鼠的肝臟中，β-半乳糖苷酶活性水平比未注射對照高約1000倍，而在眼中，注射載體的動物和對照動物間的該酶活性水平相似。在給予了表達該酶的腺病毒之后的眼中未出現可檢測的β-半乳糖苷酶活性，這意味著血管內注射內皮抑制素載體后的抗血管生成效應是由于內皮抑制素的全身性生成而非局部生成引起的。
實施例5用Av3mEndo注射的小鼠與用Av3CsmEndo注射的小鼠間的比較用2×1011粒子的Av3mEndo(n＝10)或Av3mNull(n＝9)對小鼠進行尾靜脈注射，或用6×1010粒子的Av3CsmEndo(n＝11)或Av3CsmNull(n＝11)注射。還包括一個未注射對照組(n＝11)。注射后四天，如上所述用激光使各鼠各眼的玻璃膜發生三處破裂。注射后七天，從各鼠的尾靜脈抽血，血清于-80℃保存以用于ELISA。注射后18天以及激光處理后14天，如上所述估計脈絡膜flat mounts上的CNV面積。
用鼠內皮抑制素酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒(ACCUCYTE鼠內皮抑制素Cytlmmune Sciences，College Park，MD)根據制造商說明測定內皮抑制素血清水平。
第二個載體構建物Av3CsmEndo的表征證實，與用最大耐受劑量的Av3mEndo粒子(2×1011pfu)注射的小鼠中的水平相比，Av3CsmEndo的血管內注射產生高約10倍的最大內皮抑制素水平。用Av3mEndo和Av3CsmEndo注射的小鼠中的內皮抑制素血清水平顯著高于未注射或注射了空載體的對照小鼠中的水平。小鼠中的基本內皮抑制素水平介于約30至150ng/ml血清之間。
因此，注射了由Rous肉瘤病毒啟動子驅動sig-mEndo表達的構建體的小鼠具有適度高的內皮抑制素水平，并且在激光誘導的玻璃膜破裂位點比用空病毒注射的小鼠具有顯著較小的CNV損傷。注射了由猿巨細胞病毒啟動子驅動sig-mEndo的構建體的小鼠具有約10倍高的內皮抑制素血清水平并具有顯著較小的CNV，幾乎完全抑制。
實施例6編碼人內皮抑制素的重組腺載體的制備從人α1(XVIII)膠原蛋白cDNA PCR擴增出人內皮抑制素cDNA。通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)從人肝臟polyA RNA(Clonetech，Palo Alto，CA)產生人肝臟cDNA。用Perkin ElmerRT-PCR試劑盒(Perkin Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA)和引物5′-TTT TTT TTT CAG TGT AAA AGG TC-3′(SEQ ID NO17)在以下條件中進行1個循環完成反轉錄室溫下10分鐘，42℃反轉錄3分鐘，99℃變性5分鐘，5℃冷卻5分鐘，保持在4℃直到cDNA用乙醇沉淀并重懸。用引物5′-CAG ATG ACA TCC TGG CCA G-3′(SEQID NO18)和5′-CTA TAC AGG AAA GTA TGG CAG C-3′(SEQ ID NO19)從已經制備好的cDNA PCR擴增出790bp人內皮抑制素cDNA片段。在以下條件下完成35個循環95℃熱起始3分鐘，80℃3分鐘，之后添加Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，95℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，以及72℃延伸3分鐘。凝膠純化出790bp人內皮抑制素cDNA片段經并如所述進行再擴增——除了使用58℃的退火溫度。凝膠純化790bp人內皮抑制素cDNA片段，并根據制造商說明用PCR-Script Cloning試劑盒(Stratagene)將其克隆進PCR-Script Amp SK+以產生pcrhend I。由Gene Therapy CoreTechnologies Molecular Core Laboratory at Genetic Therapy，Inc.Gaithersburg，MD經直接測序分析驗證pcrhend I質粒的人內皮抑制素cDNA區域。
根據以下程序用人BM40基底蛋白質引導序列來組裝人內皮抑制素cDNA片段。使兩條合成寡核苷酸，5′-GCC AAG CTT CCA TGA GGGCCT GGA TCT TCT TTC TCC TTT GCC TGG CCG GGA GGG CTC TGG CAG CCCCTC AGC AAG AAG CGC TCG CTC ACA GCC ACC GCG ACT TCC AGC CGG TGCTCC A-3′(正義)(SEQ ID NO20)、和5′-CCA GGT GGA GCA CCGGCT GGA AGT CGC GGT GGC TGT GAG CGA GCG CTT CTT GCT GAG GGG CTGCCA GAG CCC TCC CGG CCA GGC AAA GGA GAA AGA AGA TCC AGG CCC TCATGG AAG CTT GGC-3′(反義)(SEQ ID NO21)，退火來產生BM40基底蛋白引導序列，之后用Hind III和Sex A1消化。將經過消化的BM40基底蛋白引導序列克隆進pcrhend I的Hind III和Sex A1位點以產生pBmpcrhen質粒。通過直接測序分析驗證pBmpcrhen質粒的整個sig-hEndo區域。
在以下程序中，在pAvF9Lxr腺病毒穿梭質粒中將含有Factor IX(F9)的序列替換為含有sig-Endo的序列來產生腺病毒穿梭質粒pAV1bmhendlx。Sac1消化后經Klenow補齊和Sal I消化從pBmpcrhen產生含有sig-hEndo序列的800bp片段。pAvF9Lxr質粒用Barn HI限制酶消化，之后經Klenow補齊并用Sal I限制酶消化以除去含有F9的序列。凝膠純化這兩個片段，并使其連接以產生pAV1bmhendlx。
經RT-PCR從來自人肝臟poly A RNA的人α1(XVIII)膠原蛋白cDNA C-末端產生人內皮抑制素cDNA。從兩條合成寡核苷酸產生人BM40基底蛋白引導序列。用退火后的人BM40基底蛋白引導序列與人內皮抑制素cDNA的5′克隆以形成用于分泌人內皮抑制素蛋白的sig-hEndo嵌合蛋白。將sig-hEndo嵌合DNA克隆進腺病毒穿梭質粒pAvF9lxr以產生pAV1bmhendlx(附

圖12A)。通過自動測序分析驗證整個sig-hEndo嵌合序列。
根據下列程序用“Quick Cre/Lox雙質粒系統”產生編碼sig-hEndo嵌合蛋白的重組Av3bmhendlx(帶有E1、E2a、和E3-缺失)。首先用Not I和Cla I限制酶分別使質粒pAV1bmhendlx和pSQ3線性化。用0.3μM地塞米松預處理S8細胞24小時，之后用LipofectAMINE PLUSReagent(Life Technologies，Rockville，MD)在含有4×105 S8細胞每孔的6孔板上完成S8細胞瞬時轉染。用1μg線性化的pSQ3、0.5μg pCre、和0.5μg線性化的pAV1bmhendlx、和6μl脂質轉染胺根據制造商的方法(Life Technologies)制備脂質轉染胺復合DNA(lipofectamine complexed DNA)。37℃下將S8細胞與脂質轉染胺復合DNA溫育4.5小時。除去脂質轉染胺復合DNA，并用PBS洗滌細胞。37℃下用5％CO2培養轉染的S8細胞直到觀察到致細胞病變。刮取收集細胞和培養基。經五個凍融循環制備粗病毒裂解物。在含有5％FBS的Richter’s CM培養基中用0.3μM地塞米松使Av3bmhendlx在S8細胞中再擴增直到觀察到致細胞病變。
Av3bmhendlx介導的人內皮抑制素表達和分泌在經載體轉導的S8細胞中表征。經SDS-PAGE分析用Av3bmhendlx感染的細胞的上清蛋白質，也即，人內皮抑制素。在4至12％的線性梯度預制凝膠上分析每20μg上清蛋白質。將SDS-PAGE轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用考馬斯藍R-250對該膜染色。從膜印跡上切出對應于人內皮抑制素正確大小的20kDa蛋白條帶，并對其做N-末端蛋白質測序分析。測定了三個主要分泌蛋白質的蛋白質序列，其中50％具有帶附加氨基酸殘基APQQEALA(SEQ ID NO5)的人內皮抑制素氨基酸序列，25％含有殘基LA，以及25％不帶有來自人BM40基底蛋白質信號肽的殘基。在來自Av3Null細胞的上清蛋白質中未發現20kDa蛋白質。該結果證實，人內皮抑制素經過人BM40基底蛋白信號肽加工后，經Av3bmhendlx轉導的S8細胞表達并分泌人內皮抑制素。
實施例7由BIV載體介導的抗血管生成基因表達對視網膜滲漏、增厚、脫離、和新生血管形成的體內抑制從三個組成系統產生編碼eGFP的牛免疫缺陷病毒(BIV)載體(描述于已出版的國際專利公開號WO0144458中，將該公開文本全文引入本文作為參考)。根據Takahashi，K.等人Hum.Gene Ther.13，1305-1316(2002)，轉移載體BIVendostain衍生自pBSV4MGpptGAG，一種基于BIV的、在MND U3啟動子下編碼eGFP的轉移載體構建體。用鼠內皮抑制素(mEndo)替換了eGFP編碼序列。特別的，為使eGFP從親體質粒pBSV4MGpptGAG中缺失，通過PCR擴增了eGFP加上一些側翼序列。所用引物為eGFP1FOR 5′-GCGCATGTCGACAGAATATGGGCCAAAC-3′，其在PCR產物5′末端摻入Sal1位點，和eGFP1REV 5′-GCGCTACTGCAGAGCTAATGAGCTACAC-3′，其在PCR產物3′末端摻入Pst1位點。用Sal1和Pst1切割該片段，并將其與已經事先用Sal1和Pst1消化的pBSII(KS+)連接，從而形成pBS2eGFP。用ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，LaJolla，CA)使eGFP從pBS2eGFP中缺失。把PCR引物設計成位于eGFP基因外部的兩側、并指向外部，從而使其能擴增包括整個側翼序列和質粒、但除eGFP之外的一切。所用引物為DELeGFP1FOR5′-CCGGCTAGCTTAAGGGTGGCGACCGGT-3′，其加入了Nhe1和AfIII限制性位點，和DELeGFP1REV5′-GCTTCGAACGCGTAGCGGCCAACCCTC-3′，其加入了BstBI和Mlu1限制性位點。根據制造商的說明處理擴增子，并將其連接形成缺失了eGFP、但帶有從其親本質粒的側翼序列的pBS2deleGFP。該策略還在中間形成了四個新的限制性位點。對該片段進行測序以確定未引入突變。根據Mori，K.等人Amer.J.Pathol.159，313-320(2001)從腺病毒穿梭質粒，pAVmEndolxr制備mEndo基因插入物。用Nhe1和Cla1消化該質粒以釋放mEndo片段。將該片段與已經事先用Nhe1和BstBI(末端與Cla1相容)消化的pBS2deleGFP相連，由此產生pBS2deleGFPmEndo。將Woodchuck肝炎病毒轉錄后調控元件(WPRE)插入mEndo下游的Mlu1位點，由此形成pBS2deleGFPmEndoPRE。最后，用Bsu36I和BbvCI消化質粒pBS2deleGFPmEndoPRE以釋放mEndo編碼序列和原始eGFP側翼序列，將該片段與已經事先用Bsu36I和BbvCl消化的pBS4MGpptGAG相連，由此產生pBvMNDmEndoPRE。還產生了空BIV載體pBvMNDPRE，并將其用作陰性對照載體。除了不含mEndo編碼序列，PBvMNDPRE與pBvMNDmEndPRE相同。
簡言之，為產生編碼mEndo的BIV載體粒子(BIVendostatin)，在150mm培養皿(2×107細胞/皿)中用45μg pBvMNDmEndoPRE、45μg基于BIV的包裝構建體pBIVminipack、和13.5μg假型化包膜表達構建體pVSV-G轉染293T細胞。為產生BIV空載體(BIVNuII)，用pBvMNDPRE構建體替代pBvMNDmEndoPRE。轉染后四十八小時，收集載體并經0.45μm濾膜過濾。之后用超離心濃縮載體上清液。將濃縮的載體等分并保存于-80℃直至使用。
檢測濃縮載體的反轉錄酶(RT)活性，這是對載體粒子的一種測定。BIVendostatin和BIVNull載體的RT活性都約為15μg/m l。我們之前已經用基于BIV的編碼eGFP的載體顯示了1ng RT約等于1×105轉導單位(T.U.)。因此，所估測的BIVendostatin載體滴度為1.5×109T.U./ml。為檢測BIVendostatin載體是否能夠介導mEndo的有效產生，用1μl(15ng RT當量載體粒子)BIVNull載體或等量的BIVendostatin載體在六孔板(4×105細胞/孔)中轉導Cf2Th細胞。轉導后四十八小時，根據制造商的指導(Cytimmune Sciences Inc.，College Park，MD)用商業內皮抑制素檢測試劑盒，Accucyte小鼠內皮抑制素檢測系統，檢測細胞上清液中的內皮抑制素表達。經BIVendostatin載體轉導的細胞產生412ng/ml內皮抑制素，而BIVNull載體未顯示可檢測的內皮抑制素水平。
經視網膜下注射向單轉基因小鼠(IRBP/rtTA-TRE/VEGF tg小鼠)(該轉基因小鼠在強力霉素誘導下從小鼠感光細胞表達血管內皮生長因子)，施用根據O’Reilly等人，Gell；88(2)277-85(1997)制備的編碼鼠內皮抑制素的BIV載體。向小鼠右眼中注射BIV載體，而用左眼作為不注射載體的對照。注射后三周，在轉基因小鼠的引用水中加入0.5mg/ml強力霉素。通過熒光血管造影檢查發現，由強力霉素誘導的VEGF表達導致轉基因小鼠左眼上產生嚴重的新生血管形成。由BIV載體介導的內皮抑制素表達完全阻斷同一小鼠右眼中由VEGF誘導的新生血管形成。
經免疫組織化學染色的眼冷凍切片(這些切片來自右眼視網膜下接受了1.5×106轉導單位(TU)的BIVendostatin注射且左眼接受了1.5×106TU BIVNull注射、并且在注射載體四周后安樂死的成年C57BL/6小鼠的眼睛)顯示，經BIVendostatin注射的眼睛表現出RPE細胞中以及整個內核層的內皮抑制素強染色，一些血管壁細胞帶有密集染色。內網層中線性染色結構是Muller細胞突起典型的。用BIVNull注射的眼睛沿內界膜和玻璃膜出現反應產物，這可能是由于與膠原蛋白XVIII交叉反應導致的。
右眼接受了1.5×106轉導單位(TU)的BIVendostatin、且左眼接受了1.5×106TU BIVNull的視網膜下注射的成年雙重轉基因rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠在注射四周后開始在其飲用水中加入2mg/ml強力霉素，使用強力霉素3天后用[3H]甘露醇測定這些小鼠的視網膜血管滲透性。與用空載體注射的伴眼相比，在表達內皮抑制素的眼中視網膜至肺(retina to lung(RLLR))被顯著降低，這表明用兩個不同載體系統之中任一個表達內皮抑制素都導致對由VEGF誘導的視網膜血管滲透性的抑制。
成年rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠(其右眼接受了1.5×106TUBIVendostatin且左眼接受了1.5×106TU BIVNull視網膜下注射、并在注射載體四周后其飲用水中添加了0.5mg/ml強力霉素)在開始使用強力霉素四天后接受熒光血管造影。用BIVendostatin注射的小鼠在用BIVendostatin注射的眼中表現為出現正常的帶有清晰壁的視網膜血管，這表明極少或幾乎沒有熒光素滲透，而用BIVNull注射的眼在整個視網膜都顯示彌散熒光，這表示廣泛的熒光素外溢。開始使用強力霉素七天后，與用BIVNull注射的眼相比仍幾乎沒有跡象顯示在用BIVendostatin注射的眼中有熒光素外漏。當視網膜血管滲透性提高時，視網膜中積累了導致視網膜變厚的液體。黃斑變厚稱為黃斑水腫，異常變厚量與視敏度呈反向相關。因此，視網膜變厚是欲評估的生理學相關變量，并適于用比如光學相干X射線斷層攝影術(OCT)或視網膜變厚分析(RTA)這樣的體內成像技術對其進行精確的定量。在飲用水中開始使用0.5mg/ml強力霉素以誘導VEGF表達七天后，用BIVendostatin注射的眼冷凍切片比用BIVNull注射的眼表現更少的視網膜增厚。用八只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠定量評估內皮抑制素對用VEGF誘導的視網膜厚度的影響。
用1.5×106TU BIVendostatin視網膜下注射右眼、用1.5×106TUBIVNull視網膜下注射左眼四周后，開始在小鼠飲用水中使用0.5mg/ml強力霉素。開始使用強力霉素七天后，通過離各視神經邊緣300μm沿水平子午線的成像分析測定視網膜厚度，并取平均值以得出各眼的單實驗值。用BIVNull注射的眼中的平均視網膜厚度顯著大于用BIVendostatin注射眼的平均視網膜厚度。
用1.5×106TU BIVendostatin視網膜下注射右眼、用1.5×106TUBIVNull視網膜下注射左眼四周后，開始在小鼠飲用水中使用0.5mg/ml強力霉素。開始使用強力霉素七天后，與用BIVendostatin注射的眼相比，用BIVNull注射的眼中的視網膜新生血管形成量顯著更大。
當在rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠的飲用水中給以2mg/ml強力霉素5天或更久時，這些小鼠表達高水平的VEGF并發生出嚴重的新生血管形成和視網膜脫離。用十一只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠評估BIV載有的內皮抑制素對由視網膜VEGF導致的這一嚴重表型的影響。用1.5×106TU BIVendostatin視網膜下注射右眼、用1.5×106TU BIVNull視網膜下注射左眼四周后，開始在小鼠飲用水中使用2mg/ml強力霉素。開始使用強力霉素七天后，使小鼠安樂死，將眼在2％多聚甲醛中固定。做總體病理檢查后，把它們在OCT中冷凍并切片。用蘇木精和曙紅對連續切片染色。由對載體組未知的觀察者檢查各眼是否出現總體、部分、或無視網膜脫離。用BIVendostatin注射的眼中總體視網膜脫離顯著少于用BIVNuII注射的眼中的總體視網膜脫離。與僅一只用BIVNuII注射的眼沒有視網膜脫離相比，有四只用BIVendostatin注射的眼沒有視網膜脫離。
實施例8眼內注射為進行利用腺病毒載體的研究，在成年小鼠一只眼中視網膜下注射6×107粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1∶1混合物，另一只眼中視網膜下注射6×107粒子的AGVnull。為進行利用慢病毒載體的研究，小鼠一只眼中接受5×106轉導單位(TU)的BIVendostatin，另一只眼接受5×106TU的BIVNuI1。校準拉伸式玻璃微量移液管以通過壓下腳踏開關吸取1μl載體。用聚光透鏡系統在解剖顯微鏡和接觸透鏡上完成注射，這可以使視網膜在注射過程中可視化。麻醉小鼠，使其瞳孔放大，并在解剖顯微鏡下將尖的微量移液管頭穿透鞏膜至其后緣并定位在剛好視網膜上方。按壓腳踏開關使注射液噴射刺穿視網膜。由于出現小視網膜脫離(bleb(小泡))，因此這一技術的創傷極小，而且直接可視化保證了注射的成功。小泡的大小十分一致，而且這些小泡涉及約小于一半的視網膜面積。
實施例9由無病毒基因的腺病毒載體介導的眼中的受控內皮抑制素表達根據Xu等人，Molecular Therapy；3262(2001)描述的方法完成利用腺病毒載體運輸系統的內皮抑制素體內受控表達。分別從質粒pAGVas521和pAGVC7mEndo產生編碼可由三苯氧胺誘導的嵌合轉錄因子的AGV載體AGVas521、和可調控內皮抑制素轉基因AGVC7mEndo。根據Reddy，P.S.等人，Molec.Ther.5，63-73(2002)，該AGV質粒除含有轉基因表達盒(參見下述)外還含有側翼為獨特Pac I位點的左和右ITRs、Ad5包裝信號、以及作為DNA“填充物”的約25kb的人αsynuclein內含子區域。質粒pAGVas521含有可由三苯氧胺誘導的嵌合轉錄因子，它由單一鋅指DNA結合結構域、以人雌激素受體為基礎的經修飾的配體結合結構域、和衍生自VP16的由CMV啟動子驅動的反式激活區域組成。為構建pAGVas521，用Nru I和Bam HI消化pAvCv-C7LBD分離出該嵌合轉錄因子表達盒，并將其插入pBLSV2。質粒pBLSV2衍生自pBluescript(Strategene，La Jolla，CA)，含有兩個多克隆位點多接頭。用Bspe I消化所得質粒pBLSV2as521，并與用Xma I消化的pGTI.24aPL2連接形成pGTI24as521。pGTI24aPL2含有一個側翼為人synuclein填充DNA的多克隆位點多接頭。接下來，用Pac I消化pGT124as521以釋放質粒骨架，并根據Toietta，G.等人，Mot.Ther.5，204-210(2002)所述通過在BJ5138大腸桿菌中的同源重組與經Pme I-Mlu I消化的pBV2結合以產生pAGVas521。質粒pBV2含有26625bp的人synuclein填充DNA。
質粒pAGVC7mEndo含有驅動鼠內皮抑制素表達的、配體可誘導轉錄因子調控的啟動子。為構建pAGVC7mEndo，用AscI(鈍端)和BamHI消化pav-6X2C7tatamendo并將其插入pBLSV2C7endo。用Bam HI和Eco RI消化質粒pBLSV2C7endo，末端補齊并與用Sma I消化的pGTI245.aPL2連接以產生pGTI24C7endo。最后，用Pac I消化pGTI245.aPL2以釋放質粒骨架，并根據上述Toietta的方法通過在BJ5138大腸桿菌中的同源重組與經Pme I和Mlu I消化的pBV4結合以產生pAGVC7mEndo。質粒pBV4含有27191bp的人synuclein填充DNA。
根據Reddy等人的描述完成無病毒基因的載體的產生、大規模制備和純化。通過光學密度檢測測量粒子滴度。通過限制性酶消化驗證載體完整性來分析從CsCI-純化載體提取的DNA。用一種基于六鄰體(hexon)的定量PCR檢測方法確定AGV制品中的輔助病毒污染水平。本研究中所使用的AGVNuII、AGVas521、和AGVC7mEndo制品的輔助病毒污染水平分別為0.09％、1.9％、和1.4％。
對C57BL/6小鼠全身性施用編碼可誘導轉錄因子、或可調控內皮抑制素轉基因的早期世代的E1/E2a/E3缺陷型載體之后，這一三苯氧胺-可誘導系統在C57BL/6小鼠血清中顯示出高水平的可誘導內皮抑制素表達。
該調控系統由兩個構件組成，一個可誘導的轉錄因子、和一個驅動內皮抑制素表達的應答啟動子。該轉錄因子由一個經過修飾的對三苯氧胺產生應答的人雌激素配體結合結構域、一個獨特的半胱氨酸2-組氨酸2鋅指DNA結合基序、和一個來自VP16的最小反式激活結構域組成。該應答啟動子由被轉錄因子DNA結合結構域(DBD)識別的DNA序列六個重復、和一個編碼內皮抑制素的DNA組成。在三苯氧胺存在下，該轉錄因子激活從與最小啟動子連接的獨特靶核酸序列的轉錄。當用熒光素酶進行體外評估時，三苯氧胺誘導高至250倍的表達。該系統整合到兩個無病毒基因的腺病毒載體中，它們都不含全部的病毒編碼區域。一個載體編碼轉錄因子，第二個編碼驅動編碼內皮抑制素的核酸的靶啟動子。將這兩種載體注射進小鼠，其導致有效的肝轉導。向小鼠施用三苯氧胺導致可誘導的內皮抑制素表達，由此產生高至20μg/ml的極高血漿水平。兩個月中完成了四次三苯氧胺誘導。在不存在三苯氧胺時，觀察到了背景水平的內皮抑制素。
用三苯氧胺處理接受了構成可誘導系統的AGVC7mEndo和AGVas521載體對注射的小鼠表現出整個視網膜的內皮抑制素強染色，這證實了內皮抑制素表達在視網膜中的強烈誘導。
用[3H]甘露醇作為追蹤劑測定成年IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠中視網膜血管滲透性，這些小鼠右眼接受了6×107粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1∶1混合物視網膜下注射且左眼接受了6×107粒子的AGVNuII視網膜下注射、以及之后用三苯氧胺處理六天以誘導內皮抑制素表達，其中最后三天這些小鼠還接受了強力霉素以誘導VEGF表達。與僅誘導了VEGF表達的伴眼相比，在同時誘導了內皮抑制素和VEGF表達的眼中視網膜至肺(RLLR)和視網膜至腎滲漏比(RRLR)都被顯著降低。這證實，內皮抑制素抑制VEGF-誘導的視網膜血管滲透性提高。
實施例10轉基因小鼠和試驗方法本研究中使用了由Ohno-Matsui，K.等人Am.J.Pathol.160，711-719(2002)產生的兩個雙重轉基因小鼠系，這兩個小鼠系都帶有在視網膜中可誘導的VEGF表達。在其中的一個小鼠系中，光感受器間維生素A類結合蛋白(IRBP)啟動子與反向的四環素反式激活子(rtTA)系統結合以指導光感受器中VEGF的強力霉素-可誘導表達。這些小鼠稱為IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠。在雙重轉基因小鼠中第二個小鼠系中，視紫質啟動子而非IRBP啟動子與反向的四環素反式激活子(rtTA)系統結合以指導光感受器中VEGF的強力霉素-可誘導表達。這些小鼠稱為rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠。
1)內皮抑制素的免疫組織化學將眼刺穿并置于4％多聚甲醛/5％蔗糖中，之后在0.1M、pH 7.4的磷酸緩沖液中4℃孵育過夜1.5小時。之后漂洗該眼并迅速冷凍于0.1M磷酸緩沖液/溶于OCT的20％蔗糖的2∶1混合物中。使十微米冷凍切片干燥，之后在冰冷的4％多聚甲醛中固定30分鐘。漂洗后，用含有6.25％H2O2的冰冷甲醇對玻片阻斷15分鐘，之后再用Tris-緩沖鹽溶液中的(TBS)2％脫脂牛奶于室溫下阻斷30分鐘。于室溫下將玻片在溶于2％牛奶/TBS中的1.5μg/ml多克隆山羊抗小鼠內皮抑制素IgG(R&D Systems，Minneapolis，MN)中孵育1小時。在0.1％牛奶/TBS中洗滌10分鐘后，室溫下將玻片在溶于2％牛奶/TBS中的2μg/ml生物素綴合的抗山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)中孵育30分鐘。在0.1％牛奶/TBS中洗滌10分鐘后，室溫下將玻片在鏈酶抗生物素蛋白-磷酸酯酶(Kirkegaard和Perry，Cabin John，MD)孵育30分鐘。在0.05M Tris HCI中洗滌五分鐘后，用HistoMark Red(Kirkegaard和Perry)使玻片顯色并固定。
2)用[3H]甘露醇作為追蹤劑對視網膜血管滲透性的測定對成年雙重轉基因IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠(n＝11)右眼視網膜下注射6×107粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1∶1混合物和左眼視網膜下注射6×107粒子的AGVNuII。第二天開始每天對小鼠施以腹膜下注射500μg溶于5％DMSO葵花子油中的三苯氧胺，三天后，對在它們的飲用水中給以2mg/ml強力霉素。開始使用強力霉素后三天，用[3H]甘露醇測定視網膜血管滲透性。簡言之，對小鼠腹膜內注射1μCi/克體重[3H]甘露醇(New England Nuclear，Boston，MA)。一小時后，殺死該小鼠并取出眼睛。取出角膜和晶狀體，仔細地從視杯中分離出完整視網膜并將其置于預先稱重的閃爍瓶(scintillationvials)中。打開胸腔，取出左上肺葉并將其置于另一個預先稱重的閃爍瓶中。做左背部切口，進入腹膜后隙而不進入腹膜腔。用鑷子夾住腎血管，取出左腎，清除全部脂肪并將其放到一個預先稱重的閃爍瓶中。除去瓶中的所有液體，并使瓶中的殘余液體蒸發20分鐘。給小瓶稱重，記錄組織重量。向各小瓶中加入一毫升NCSII溶解液(Amersham，Chicago，IL)，將小瓶在50℃水浴中孵育過夜。將溶解了的組織恢復至室溫，并用溶于甲苯中的20％苯甲酰過氧化物使其在50℃水浴中脫色。將小瓶恢復至室溫，加入五毫升Cytoscint ES(ICN，Aurora，OH)和30μl冰乙酸。4℃將小瓶在黑暗中保存數小時以除去化學發光。用Wallac 1409液體閃爍計數器(Gaithersburg，MD)對放射活性進行計數。
3)用熒光素泄漏估測視網膜血管滲透性對成年rho/rtTA-TRE/VEGF雙重轉基因小鼠右眼視網膜下注射1.5×106轉導單位(TU)的BIVendostatin以及左眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVNuII。注射載體四周后，開始在小鼠的飲用水中加入0.5mg/ml強力霉素。四或七天后，對小鼠腹膜內注射12μl/g體重的1％熒光素鈉(Alcon，Fort Worth，Texas)，一分鐘后用體內熒光顯微鏡對各眼拍照。引發VEGF表達七天后，使另一只小鼠安樂死，在各眼中相同的位置沿與視神經相鄰的視網膜后部做視網膜冷凍切片。切片用Griffonia simplicifolia lectin，蘇木精、和曙紅染色。用BIVNull注射的眼(F和H)中的視網膜比用BIVendostatin注射的眼(E和G)中的視網膜厚得多。
4)視網膜厚的測量對成年rho/rtTA-TRE/VEGF雙重轉基因小鼠右眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVendostatin和左眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVNull。注射載體四周后，開始在小鼠的飲用水中加入0.5mg/ml強力霉素。開始使用強力霉素七天后，使小鼠安樂死，在各眼中相同的位置沿與視神經相鄰的視網膜后部做10μm視網膜冷凍切片。切片用生物素化的Griffonia simplicifolia lectin B4(GSA，VectorLaboratories，Burlingame，CA)染色，該染料選擇性結合于血管細胞22。將玻片在甲醇/H2O2中4℃孵育十分鐘，用0.05M、pH7.6(TBS)Tris-緩沖鹽溶液洗滌，并在10％正常豬血清中孵育30分鐘。室溫下將玻片與生物素化的GSA孵育2小時，用0.05M TBS漂洗后，將它們與綴合了過氧化物酶的抗生物素蛋白(Vector Laboratories)于室溫下孵育45分鐘。用HistoMark Red(Kirkegaard和Perry)使玻片顯色以產生紅色反應產物，并用蘇木精和曙紅復染。通過對離視神經各邊緣300μm的圖像做分析測定視網膜厚度，求平均值以得出單個實驗值。
5)雙重轉基因小鼠中的視網膜新生血管形成的評估使用了三只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠評估內皮抑制素對由VEGF-誘導的視網膜新生血管形成的效果。右眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVendostatin以及左眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVNull四周后，開始在小鼠飲用水中加入0.5mg/ml強力霉素。開始使用強力霉素七天后，使小鼠安樂死，對各眼從虹膜外周邊緣至相隔180°的另一邊緣做切片(10μm切片)。切片用Griffonia simplicifolia lectin(GSA)、蘇木精、和曙紅染色。
光感受器層中的GSA染色面積是新生血管形成的指征，在虹膜的一條邊緣至另一邊緣100μm的切片(一般每只眼睛13張切片)上測定該面積。這13個測定值的平均值構成單個實驗值，即每張切片的新生血管形成面積。
6)雙重轉基因小鼠中視網膜脫離的評估對十一只成年rho/rtTA-TRE/VEGF雙重轉基因小鼠右眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVendostatin以及左眼視網膜下注射1.5×106TU的BIVNuII。注射載體后四周，開始在小鼠飲用水中加入2mg/ml強力霉素。四天后，使小鼠安樂死，放大瞳孔，并由兩位觀察者獨立對各眼做眼底鏡檢查，觀察是否存在完全或部分視網膜脫離、或者沒有脫離。
序列表<110>Novartis AG<120>眼的基因治療<130>4-32625<160>21<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>183<212>PRT<213>人<400>1His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180<210>2<211>551<212>DNA<213>人<400>2acagccaccg cgacttccag ccggtgctcc acctggttgc gctcaacagc cccctgtcag 60gcggcatgcg gggcatccgc ggggccgact tccagtgctt ccagcaggcg cgggccgtgg120ggctggcggg caccttccgc gccttcctgt cctcgcgcct gcaggacctg tacagcatcg180tgcgccgtgc cgaccgcgca gccgtgccca tcgtcaacct caaggacgag ctgctgtttc240ccagctggga ggctctgttc tcaggctctg agggtccgct gaagcccggg gcacgcatct300tctcctttga cggcaaggac gtcctgaggc accccacctg gccccagaag agcgtgtggc360atggctcgga ccccaacggg cgcaggctga ccgagagcta ctgtgagacg tggcggacgg420aggctccctc ggccacgggc caggcctcct cgctgctggg gggcaggctc ctggggcaga480gtgccgcgag ctgccatcac gcctacatcg tgctctgcat tgagaacagc ttcatgactg540cctccaagta g 551<210>3
<211>207<212>PRT<213>小鼠<400>3Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val20 25 30Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly35 40 45Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly50 55 60Leu Ser Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu65 70 75 80Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Gly Ser Val Pro Ile Val Asn85 90 95Leu Lys Asp Glu Val Leu Ser Pro Ser Trp Asp Ser Leu Phe Ser Gly100 105 110Ser Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly115 120 125Arg Asp Val Leu Arg His Pro Ala Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His130 135 140Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg Arg Leu Met Glu Ser Tyr Cys Glu Thr145 150 155 160Trp Arg Thr Glu Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu165 170 175Ser Gly Arg Leu Leu Glu Gln Lys Ala Ala Ser Cys His Asn Ser Tyr180 185 190Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ser Phe Ser Lys195 200 205<210>4<211>624<212>DNA<213>小鼠<400>4atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60gacgcggccc atactcatca ggactttcag ccagtgctcc acctggtggc actgaacacc120cccctgtctg gaggcatgcg tggtatccgt ggagcagatt tccagtgctt ccagcaagcc180cgagccgtgg ggctgtcggg caccttccgg gctttcctgt cctctaggct gcaggatctc240tatagcatcg tgcgccgtgc tgaccggggg tctgtgccca tcgtcaacct gaaggacgag300gtgctatctc ccagctggga ctccctgttt tctggctccc agggtcaagt gcaacccggg360gcccgcatct tttcttttga cggcagagat gtcctgagac acccagcctg gccgcagaag420agcgtatggc acggctcgga ccccagtggg cggaggctga tggagagtta ctgtgagaca480tggcgaactg aaactactgg ggctacaggt caggcctcct ccctgctgtc aggcaggctc540ctggaacaga aagctgcgag ctgccacaac agctacatcg tcctgtgcat tgagaatagc600ttcatgacct ctttctccaa atag 624<210>5<211>8<212>PRT<213>人<400>5Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Ala1 5<210>6
<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6actggtgacg cggcccatac tcatcaggac tttcagcc 38<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>7aagggctatc gatctagctg gcagaggcct at 32<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR 引物<400>11gatctctaga ccaccatgca tactcatcag gactt 35<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>12actggagaaa gaggtttatc tagctactag 30<210>13<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>13Met Arg Tyr Met Ile Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ala Val Cys Ser1 5 10 15Ala Ala<210>14<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>14gatctctaga ccaccatgag gtacatgatt ttaggcttgc tcgcccttgc ggcagtctgc 60agcgcggccc atactcatac tcatcaggac tttcag 96<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>15atcgatcata ctcatcagga ctttcagcc 29<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>17tttttttttc agtgtaaaag gtc23<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>18cagatgacat cctggccag 19<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>19ctatacagga aagtatggca gc 22<210>20<211>118<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>20gccaagcttc catgagggcc tggatcttct ttctcctttg cctggccggg agggctctgg60cagcccctca gcaagaagcg ctcgctcaca gccaccgcga cttccagccg gtgctcca 118<210>21<211>123<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>21ccaggtggag caccggctgg aagtcgcggt ggctgtgagc gagcgcttct tgctgagggg 60ctgccagagc cctcccggcc aggcaaagga gaaagaagat ccaggccctc atggaagctt120ggc 12權利要求
1.治療患有視網膜脫離或視網膜水腫的個體的視網膜脫離或視網膜水腫的方法，包括使患有視網膜脫離或視網膜水腫的個體眼組織中的內皮抑制素量提高至抑制視網膜脫離或視網膜水腫的有效量。
2.權利要求1的方法，其中內皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽。
3.權利要求1的方法，其中內皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的變體。
4.權利要求1的方法，其中所述提高是通過向個體施用外源內皮抑制素來實現的。
5.權利要求1的方法，其中所述提高是通過使個體內產生內皮抑制素來實現的。
6.權利要求5的方法，其中所述提高是通過向個體施用有效量的含有內皮抑制素編碼核酸的病毒載體來實現的。
7.權利要求6的方法，其中該病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、反轉錄病毒、和慢病毒。
8.權利要求7的方法，其中該病毒載體是腺病毒載體。
9.權利要求5的方法，其中所述提高是通過向個體內植入至少一個微囊來實現的，其中該微囊含有分泌內皮抑制素的細胞。
10.權利要求9的方法，其中該微囊含有藻酸鹽。
11.權利要求10的方法，其中該微囊含有藻酸鈉。
12.權利要求11的方法，其中該微囊含有藻酸鈣。
13.權利要求12的方法，其中該微囊含有多聚L-賴氨酸。
14.權利要求9的方法，其中該細胞含有外源內皮抑制素編碼核酸。
15.權利要求9的方法，其中該細胞過表達內源內皮抑制素編碼基因。
16.權利要求4的方法，其中向個體施用約2.5mg/kg每天至約20mg/kg每天的內皮抑制素。
17.權利要求8的方法，其中以有效量施用腺病毒載體以使該個體表達內皮抑制素從而在該個體血清中產生不超過1 000 000ng/ml的內皮抑制素濃度。
18.權利要求8的方法，其中以有效量施用腺病毒載體以使該個體表達內皮抑制素從而在該個體血清中產生至少約300ng/ml的內皮抑制素濃度。
19.權利要求18的方法，其中內皮抑制素在個體中以有效量表達從而在該個體血清中產生約300ng/ml至約3000ng/ml的內皮抑制素濃度。
20.權利要求19的方法，其中內皮抑制素在個體中以有效量表達從而在該個體血清中產生約300ng/ml至約1500ng/ml的內皮抑制素濃度。
21.權利要求6的方法，其中載體以約108噬斑形成單位至約1014噬斑形成單位的量施用。
22.權利要求8的方法，其中載體以約108噬斑形成單位至約1014噬斑形成單位的量施用。
23.權利要求9的方法，其中微囊以有效量植入以使細胞表達內皮抑制素從而在該個體血清中產生不超過1 000 000ng/ml的內皮抑制素濃度。
24.權利要求8的方法，其中微囊以有效量植入以使個體表達內皮抑制素從而在該個體血清中產生至少約300ng/ml的內皮抑制素濃度。
25.權利要求18的方法，其中微囊以有效量植入個體從而在該個體血清中產生約300ng/ml至約3000ng/ml的內皮抑制素濃度。
26.權利要求19的方法，其中微囊以有效量植入個體從而在該個體血清中產生約300ng/ml至約1500ng/ml的內皮抑制素濃度。
27.權利要求6的方法，其中內皮抑制素編碼核酸具有SEQ IDNO2所示的序列。
28.根據權利要求6的方法，其中病毒載體經眼內施用。
29.根據權利要求28的方法，其中病毒載體經視網膜下施用。
30.根據權利要求28的方法，其中病毒載體經玻璃體內施用。
31.根據權利要求7的方法，其中病毒載體為慢病毒載體。
32.權利要求33的方法，其中以有效量施用慢病毒載體以使該個體表達內皮抑制素從而在該個體血清中產生不超過1 000 000ng/ml的內皮抑制素濃度。
33.權利要求32的方法，其中以有效量施用慢病毒載體以使該個體表達內皮抑制素從而在該個體血清中產生至少約300ng/ml的內皮抑制素濃度。
34.權利要求33的方法，其中內皮抑制素在個體中以有效量表達從而在該個體血清中產生約300ng/ml至約3000ng/ml的內皮抑制素濃度。
35.權利要求34的方法，其中內皮抑制素在個體中以有效量表達從而在該個體血清中產生約300ng/ml至約1500ng/ml的內皮抑制素濃度。
36.權利要求31的方法，其中慢病毒載體為牛免疫缺陷病毒載體。
37.權利要求36的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經眼內施用。
38.權利要求37的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經視網膜下施用。
39.權利要求48的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經玻璃體內施用。
40.權利要求6的方法，其中的提高是通過向個體施用病毒載體而可誘導地實現的，所述病毒載體能夠使得在個體內產生將誘導內皮抑制素編碼核酸表達的物質。
41.權利要求36的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經眼周施用。
42.權利要求6的方法，其中病毒載體經眼周施用。
43.內皮抑制素在生產用于治療患有視網膜脫離或視網膜水腫的個體中的視網膜脫離或視網膜水腫的藥物中的用途，其中所述內皮抑制素特別是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽。
44.權利要求43的用途，其中內皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的變體。
45.權利要求43的用途，其中在眼組織中引起內皮抑制素量提高。
46.權利要求45的用途，其中所述提高是通過施用有效量含有內皮抑制素編碼核酸的病毒實現的。
47.權利要求46的用途，其中所述病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、反轉錄病毒、和慢病毒。
48.權利要求46的用途，其中所述提高是通過在患有視網膜脫離或視網膜水腫的個體中植入至少一個微囊實現的，其中該微囊含有分泌內皮抑制素的細胞。
全文摘要
提供了通過提高患有VEGF－誘導的視網膜脫離或視網膜水腫的個體的眼組織中體內內皮抑制素蛋白濃度至抑制視網膜脫離或視網膜水腫有效量來治療VEGF－誘導的視網膜脫離或視網膜水腫的方法。
文檔編號A61K38/39GK1708513SQ03823134
公開日2005年12月14日 申請日期2003年8月27日 優先權日2002年8月28日
發明者P·A·坎普契亞羅, M·卡萊克 申請人:諾瓦提斯公司