專利名稱：含硫的磷脂衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及預防和/或治療原發性與轉移性腫瘤的方法，該方法涉及使用本發明的脂肪酸類似物治療患有癌癥的患者。
癌癥的兩種本質特征是侵襲和轉移。在一種極端情況下，基膜的微侵襲是從瘤形成到癌的轉變的特征，在另一種極端情況下，轉移一般引起死亡。
原發性腫瘤侵入結締組織分階段進行，受到由腫瘤細胞產生的各種介導物的促進。尚未侵襲基膜并且局限于上皮內的腫瘤細胞被稱為原位癌。
另一方面，當循環中的腫瘤細胞與粘連性淋巴細胞和血小板被捕集在毛細管中和腫瘤細胞膜作用于毛細管內皮時，可以形成轉移瘤。毛細管內皮連接消退，腫瘤細胞配體與內皮和基膜上的受體結合。腫瘤細胞然后釋放膠原酶IV，它破壞膠原蛋白IV，后者是基膜的主要組分。與糖蛋白層粘連蛋白和纖連蛋白的結合、破壞基質的蛋白酶的釋放和能動性與趨化性因子的分泌，都有助于毛細管下結締組織的侵襲。腫瘤細胞然后可以增殖，合成血小板聚集因子，例如血栓烷和前凝血劑，從而引起纖維蛋白繭沉積在細胞周圍。這樣一種繭可以保護微轉移瘤免受宿主免疫系統的攻擊。
可以用本發明組合物和方法預防和/或治療的癌癥包括但不限于人類的肉瘤和癌，例如癌，例如結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤；白血病，例如急性淋巴細胞性白血病和急性髓細胞性白血病(成髓細胞性、前髓細胞性、骨髓單核細胞性、單核細胞性和紅白血病)；慢性白血病(慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)；和真性紅細胞增多、淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥和重鏈疾病。這類癌癥的具體實例描述在下面的章節中。
皮膚障礙 正如WO02/26218所討論的，增生性皮膚疾病普遍見于世界各地，影響到數百萬的人和家養動物。增生性皮膚疾病是以角化細胞增殖或分裂為特征的，也可能與不完全的表皮分化有關。
牛皮癬是本發明所涉及的最嚴重的增生性皮膚疾病。
牛皮癬是一種遺傳性皮膚疾病，以兩個生物學標記為特征。首先，存在突出的表皮過度增殖，涉及加速的和不完全的分化。其次，存在顯著的表皮與真皮炎癥，伴有T淋巴細胞募集增加，在有些情況下還有嗜中性白細胞微膿腫的形成。牛皮癬的很多病理特征可以歸因于表皮角化細胞的生長與成熟改變，伴有表皮細胞增殖增加，發生在皮膚表面的0.2mm內。
牛皮癬發病機理的傳統研究集中在表皮的增加的增殖與增生上。在正常皮膚中，細胞從基底層移動至顆粒層的時間為4至5周。在牛皮癬病灶中，該時間減少了七倍至十倍，因為細胞周期時間縮短了、能夠增殖的細胞絕對數量增加了和實際分裂的細胞比例增加了。在牛皮癬患者的臨床未發病皮膚中，也表現過度增殖現象，不過程度較小。
牛皮癬的一種常見形式是尋常牛皮癬，以界線明顯的紅斑為特征，覆蓋有厚的銀色鱗屑。特有的發現是同型反應(科布內氏現象)，其中在皮膚創傷部位出現新的牛皮癬病灶。
病灶經常位于肢端的伸肌表面，一般也牽涉指甲和頭皮。
牛皮癬的治療努力致力于降低表皮的增殖速率，這通過對細胞分裂的直接作用或者間接減少免疫應答。就局限性牛皮癬患者而言，局部用皮質類固醇的給藥是最方便的門診患者療法。
利用這種方法可以見到迅速的改善，但是有益的短期功效是有限的，長期局部皮質類固醇治療是不明智的。長期局部皮質類固醇療法的副作用可以包括皮膚的萎縮、對所用試劑耐藥性的形成(快速減敏性)和疾病在停止治療后嚴重惡化。垂體-腎上腺抑制是有力局部用皮質類固醇療法的潛在嚴重并發癥，特別是當該試劑覆蓋大部分機體表面和在封閉性敷料下使用時。
類視色素，特別是阿維A酯單獨或者與PUVA的組合也是有效的牛皮癬治療法。阿維A酯尤其可用于牛皮癬的表皮脫落與膿皰變異。不過，在接受類視色素的患者中必須監測若干主要的潛在并發癥。作為一類化合物，類視色素是有力的致畸原，不應當給以沒有使用適當避孕措施的育齡婦女。
阿維A酯象其他類視色素一樣，能夠引起膽固醇和甘油三酯水平升高；因此飲食調節可能是必要的。另外，因為阿維A酯能夠誘發肝毒性，在用藥之前和期間應當定期進行肝功能試驗。
鑒于目前用于治療皮膚增生疾病，例如牛皮癬的不同藥物與光化學療法伴隨有并發癥和副作用，存在對新方法和新組合物的需要，以抑制角化細胞增殖，減輕皮膚增生疾病的癥狀。
炎性與自身免疫障礙 正如WO02/43728所討論的，白介素、干擾素、集落刺激因子和TNFα是一組不同的多功能蛋白質的實例，稱為細胞因子。細胞因子是一類所分泌的可溶性蛋白質，通常以非常低的濃度存在于多種細胞中。淋巴樣、炎性造血性與其他細胞(例如結締組織細胞，例如成纖維細胞、成骨細胞)分泌多種細胞因子，它們通過控制細胞增殖、分化和效應器功能，調節免疫、炎癥、修復和急性期反應。細胞因子的作用受到與特定細胞類型上高親和性受體結合的介導。
一種重要的細胞因子是IL-10，它是一種35-40kDa的肽，由輔助T-細胞、B-細胞、單核細胞、巨噬細胞和其他細胞類型產生。體外IL-10已經證明有免疫抑制性質，證據是其抑制細胞因子產生的能力，所述細胞因子包括IL-1和TNFα。
IL-10也抑制其他炎性細胞因子的活化，因此具有有力的抗炎活性。
最近已經關注在某些以過度IL-1和TNFα產生為特征的病癥的治療中給以IL-10。這類疾病或病癥包括假體關節植入物的松弛、炎癥、糖尿病、癌癥、移植物對宿主的疾病、病毒、真菌與細菌感染、脂多糖內毒素休克、骨髓功能受抑制的疾病、血小板減少、骨質疏松、脊關節病、佩吉特氏病、炎性腸疾病、關節炎、骨關節炎、自身免疫疾病(例如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡)和結締組織疾病。
例如，體外已經顯示純化的IL-10抑制某些類型的病毒感染。US-A-5,665,345公開了通過給以IL-10抑制人細胞中人免疫缺陷病毒、逆轉錄病毒和卡波西肉瘤復制的方法。
還已提示IL-10用于治療某些癌癥。US-A-5,570,190公開了給以外源性IL-10治療哺乳動物急性骨髓性白血病和急性淋巴細胞性白血病。IL-10據說是以純化或重組形式給藥的，據信抑制急性白血病母細胞的增殖。
類似地，顯示IL-10抑制嚴重聯合免疫缺陷小鼠中的骨髓轉移。
上述治療以過度IL-1與TNFα產生為特征的病癥的常規方法局限于靜脈內給以外源性純化或重組IL-10。由于IL-10是一種蛋白質，它難以靜脈內注入哺乳動物，因為蛋白質經常從溶液中析出，與用于靜脈內給藥的塑料或玻璃器皿結合。而且，在與生理溶液例如葡萄糖或鹽水混合時，蛋白質經常是不相容的，并沉淀出來。另外，口服和局部途徑不可用于IL-10給藥。口服途徑不可用是因為蛋白質在胃腸道中降解。
上述方法沒有一個提示增強哺乳動物中內源性IL-10的產生，以預防和治療疾病或病癥。
進而，已知IL-10是巨噬細胞和T-細胞的強大去活化劑，在多種自身免疫與炎性障礙中其生產量是不足的。
本研究顯示，本化合物在來自健康血液供體的PBMC中增強LPS與PHA刺激的IL-10，抑制PHA刺激的IL-2產生。這可能具有若干含義。首先，這些發現提示了本化合物的顯著抗炎凈效果，既增強抗炎細胞因子IL-10的釋放，又抑制炎性細胞因子IL-2的釋放。其次，我們的發現提示本化合物可能調控單核細胞活化(即LPS刺激)和淋巴細胞活化(即PHA刺激)。最后，本化合物對來自健康血液供體的活化PBMC的體外效果可能反映以炎性活化作用增強為特征的各種患者群體的體內情形。事實上，離體的健康對照活化PBMC可能代表在各種炎性障礙中體內治療性干預的有關靶細胞。
另外或者作為替代選擇，本發明化合物或組合物可以用于治療WO-A-98/05635所列舉的障礙。為了容易參照，現在提供該列表的一部分癌癥、炎癥或炎性疾病、皮膚病學障礙、發熱、心血管效應、出血、凝血與急性期反應、惡病質、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克狀態、移植物對宿主的反應、自身免疫疾病、再灌注損傷、腦脊膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤生長、侵襲與擴散、血管生成、轉移瘤、惡性腫瘤、腹水和惡性胸膜滲漏；腦缺血、缺血性心臟病、骨關節炎、類風濕性關節炎、骨質疏松、哮喘、多發性硬化、神經變性、阿爾茨海默氏病、動脈粥樣硬化、中風、脈管炎、克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎；牙周炎、齒齦炎；牛皮癬、特應性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解；角膜潰瘍、視網膜病和手術傷口愈合；鼻炎、變應性結膜炎、濕疹、過敏反應；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內膜異位、動脈粥樣硬化或endosclerosis。
另外或者作為替代選擇，本發明化合物或組合物可以用于治療WO-A-98/07859所列舉的障礙。為了容易參照，現在提供該列表的一部分細胞因子與細胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治療免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒感染；調節淋巴細胞生長；治療癌癥和很多自身免疫疾病；和預防移植排斥或誘導腫瘤免疫性)；調節造血，例如治療骨髓樣或淋巴樣疾病；促進骨、軟骨、腱、韌帶和神經組織生長，例如用于愈合傷口、治療燒傷、潰瘍和牙周疾病與神經變性；抑制或活化促卵泡激素(調控生育力)；趨化性/化學促進活性，例如用于使特定細胞類型活動至損傷或感染部位；止血與溶栓活性，例如用于治療血友病和中風；抗炎活性，例如用于治療膿毒性休克或克羅恩氏病；用作抗微生物劑；用作例如代謝或行為的調控劑；用作止痛劑；治療特定的缺陷障礙；在人類或獸醫醫學中治療例如牛皮癬。
另外或者作為替代選擇，本發明組合物可以用于治療WO-A-98/09985所列舉的障礙。為了容易參照，現在提供該列表的一部分巨噬細胞抑制和/或T-細胞抑制活性，因而抗炎活性；抗免疫活性，也就是對細胞和/或體液免疫應答的抑制作用，包括與炎癥無關的應答；抑制巨噬細胞和T-細胞黏附細胞外基質組分和纖連蛋白的能力，以及抑制T-細胞中的fas受體表達的增量調節；抑制所不希望的免疫反應和炎癥，包括關節炎，包括類風濕性關節炎、與過敏有關的炎癥、變態反應、哮喘、系統性紅斑狼瘡、膠原疾病和其他自身免疫疾病、與動脈粥樣硬化有關的炎癥、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心動停止、心肌梗塞、血管炎性障礙、呼吸窘迫綜合征或其他心肺疾病，與消化性潰瘍有關的炎癥、潰瘍性結腸炎和其他胃腸道疾病，肝纖維變性、肝硬化或其他肝疾病，甲狀腺炎或其他腺體疾病，腎小球性腎炎或其他腎與泌尿科疾病，耳炎或其他耳鼻喉科疾病，皮炎或其他皮膚疾病，牙周疾病或其他牙科疾病，睪丸炎或附睪-睪丸炎，不育癥，睪丸創傷或其他免疫相關性睪丸疾病，胎盤功能障礙、胎盤機能不全、習慣性流產、子癇、子癇前期和其他免疫和/或炎性相關性婦科疾病，后葡萄膜炎、中葡萄膜炎、前葡萄膜炎、結膜炎、脈絡膜視網膜炎、葡萄膜視網膜炎、視神經炎、眼內炎癥(例如視網膜炎或囊性黃斑水腫)、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網膜炎、變性性fondus疾病的免疫與炎性組分、眼創傷的炎性組分、由感染所導致的眼部炎癥、增殖性玻璃體-視網膜病、急性缺血性視神經病、過多的瘢痕形成(例如繼發于青光眼過濾手術)、對眼植入物的免疫和/或炎癥反應和其他免疫與炎性相關眼科疾病，與自身免疫疾病或病癥或障礙有關的炎癥(其中在中樞神經系統(CNS)或任意其他器官中，免疫和/或炎癥抑制將是有益的)，帕金森氏病、帕金森氏病治療的并發癥和/或副作用、AIDS相關性癡呆復合征、HIV相關性腦病、德維克氏病、西登哈姆氏舞蹈病、阿爾茨海默氏病和其他變性性疾病，CNS的病癥或障礙、中風的炎性組分、脊髓灰質炎后綜合征、精神病學障礙的免疫與炎性組分、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性大腦炎、腦脊髓炎、急性神經病、亞急性神經病、慢性神經病、格-巴氏綜合征、西登哈姆氏舞蹈病、重癥肌無力、腦假瘤、唐氏綜合征、亨廷頓氏病、肌萎縮性側索硬化、CNS壓迫或CNS創傷或CNS感染的炎性組分、肌肉萎縮與營養障礙的炎性組分、和免疫與炎性相關性中樞與外周神經系統疾病、病癥或障礙，創傷后炎癥、膿毒性休克、傳染性疾病、手術、骨髓移植的炎性并發癥或副作用或者其他移植并發癥和/或副作用，基因療法的炎性和/或免疫并發癥(例如由病毒載體感染引起)或者與AIDS有關的炎癥，用以壓制成抑制體液和/或細胞免疫應答，通過減少單核細胞或淋巴細胞數量治療或改善單核細胞或白細胞增生疾病(例如白血病)，預防和/或治療天然或人工細胞、組織與器官移植中的移植物排斥(例如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起博器、天然或人工皮膚組織)。
治療 這包括任何能夠使人或非人類動物受益的治療應用。治療哺乳動物是特別優選的。人獸治療都屬于本發明的范圍。
治療可以是針對現有病癥的或者可以是預防性的。可以針對成人、少年、嬰兒、胎兒或任意上述的一部分(例如器官、組織、細胞或核酸分子)。
治療用活性試劑可以經由任意適當的途徑按照任意適當的劑量給藥。劑量可以在寬泛的限度內變化，這依賴于治療的性質、所要治療個體的年齡和條件等，醫師將最終決定所使用的適當劑量。不過，不受任何特定劑量的局限，本發明化合物從1μg至1mg/kg體重的每日劑量可能是適合的。服藥可以按照適當的頻率重復。如果形成副作用，那么可以按照良好的臨床實踐減少服藥的量和/或頻率。
多晶型(S)/不對稱碳(S) 本發明試劑可以存在多晶型。
本發明試劑可以含有一個或多個不對稱的碳原子，因此存在兩種或多種立體異構體形式。若試劑含有鏈烯基或亞鏈烯基，則還可以存在順式(E)和反式(Z)異構現象。本發明包括試劑的單個立體異構體，如果適當的話，還包括其單個的互變異構體形式及其混合物。
非對映異構體或者順式與反式異構體的分離可以利用常規技術實現，例如試劑或其適合的鹽或衍生物的立體異構體混合物的分步結晶、色譜或H.P.L.C.。試劑化合物的單個對映體也可以從對應的光學純中間體制備，或者借助拆分制備，例如使用適合的手性載體進行對應外消旋物的H.P.L.C.或者進行非對映異構體鹽的分步結晶，所述鹽是這樣生成的使對應的外消旋物酌情與適合的光學活性酸或堿反應。
同位素變體 本發明還包括本試劑或其藥學上可接受的鹽的所有適合的同位素變體。本發明試劑或其藥學上可接受的鹽的同位素變體被定義為這樣一種，其中至少一個原子被原子數相同但是原子質量不同于自然界常見原子質量的原子所代替。可以結合在本試劑及其藥學上可接受的鹽中的同位素實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別例如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。本試劑及其藥學上可接受的鹽的某些同位素變體，例如其中結合有3H或14C等放射性同位素的那些，可用于藥物和/或底物組織分布研究。氚，即3H和碳-14，即14C同位素是特別優選的，因為它們容易制備和檢測。進而，被氘，即2H等同位素取代因代謝穩定性更大可以提供某些治療上的優點，例如體內半衰期增加或劑量需求減少，因此在有些情況下可能是優選的。本發明試劑及其藥學上可接受的鹽的同位素變體一般可以通過常規工藝制備，使用合適試劑的適當同位素變體。
前體藥物 將為本領域技術人員所領會的是，本發明試劑可以從前體藥物衍生而來。前體藥物是這樣的實體，它們本身可以具備或者可以不具備藥理活性，但是可以被給藥(例如口服或腸胃外)，之后在機體內受到生物轉化作用(例如代謝)，生成有藥理活性的本發明試劑。前體藥物的實例包括這樣的實體，它們具有某些被保護的基團，并且本身可能不具備藥理活性，但是在某些情形中可以被給藥(例如口服或腸胃外)，之后在機體內被代謝生成有藥理活性的本發明試劑。
前體部分(pro-moiety) 將被進一步領會的是，某些被稱為“前體部分”的部分，例如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard，Elsevier，1985所述(其公開內容結合在此作為參考)，可以被置于試劑的適當的官能團上。這類前體藥物也屬于本發明的范圍。
衍生物 本文所用的術語“衍生物”或“衍生的”包括試劑的化學修飾。這類化學修飾的例證是將氫用鹵素基團、烷基、酰基或氨基代替。
化學修飾 在本發明的一種實施方式中，試劑可以是經過化學修飾的試劑。
本發明試劑的化學修飾可以增強或減少試劑與靶之間的氫鍵相互作用、電荷相互作用、疏水性相互作可用、范德華相互作用或偶極相互作用。
一方面，已被鑒定的試劑可以充當開發其他化合物的模型(例如模板)。
現在將在下列實施例中詳細描述本發明。
實施例 結合有所述脂肪酸的本發明磷脂、三酰甘油和其他脂質(天然或非天然)(包括2.3節所提出的脂質)可以顯示與脂肪酸例如TTA相似的治療與生物性質。因而，合成了大量含有硫代脂肪酸衍生物的磷脂、三酰甘油和其他非天然脂質。在一些實施例中進行了體內實驗(在雄性Wistar大鼠中)，目的是比較它們相對于TTA3的生物學效應(關于血漿脂質水平和肝脂肪酸氧化)。還進行了進一步的體內研究，其中在脂質體中結合有TTA和TTA磷脂，以促進靜脈內給藥。
脂肪酸的合成 用于本發明的脂肪酸衍生物可以按照WO01/68502的教導進行合成。
流程1給出合成脂肪酸3和4的策略。首先，在甲醇鈉的存在下使硫代乙酸與十四烷基溴縮合，酸化后得到TTA，為無色固體，收率82％。
流程1 (a)NaOMe，MeOH，r.t.，2d；然后H+，82％；(b)PPh3，AcOH，回流，6d，98％；(c)NaH，DMSO，然后辛醛，0℃，54％；(d)PBr3，吡啶，Et2O，70％；(e)硫代乙酸，NaOMe，MeOH，然后8，96％. 利用維悌希反應在鏻鹽6與1-辛醛之間進行順式-烯烴類似物4的合成，得到順式-烯烴醇7(59％收率)7。醇的溴化和隨后與硫代乙酸二鈉鹽的反應得到所需脂肪酸dTTA4(67％，2步)。
由于維悌希反應關于順式/反式選擇性的不確定性，采用更具順式-選擇性的方法(流程2)。因而將乙酸酯9用p-TsOH水解，使所得伯醇THP-保護，將溴化物經由芬克爾斯坦鹵素置換反應轉化為碘化物，從而得到10，3步收率為70％。然后使碘化物10與就地生成的炔基鋰化物11反應，得到被保護的炔基醇12(76％收率)。在此階段，借助順式-選擇性林德樂氫化作用生成烯烴，反應進行順利，收率良好(93％)。GC-MS分析顯示順式部分的同質性。將被保護的醇在一步中轉化為溴化物8，隨后在堿的存在下用硫代乙酸處理，得到所需脂肪酸4(dTTA)，收率74％(2步)。
流程2 (a)pTsOH，MeOH，Δ；(b)DHP，PPTS，CH2Cl2，r.t.；(c)NaI，丙酮，Δ，＞70％3步；(d)n-BuLi，THF/HMPA，0℃，然后2-(3-碘戊氧基)四氫吡喃，76％；(e)林德樂催化劑，H2，喹啉，己烷，93％；(f)PPh3Br2，PPh3，CH2Cl2，0℃，86％；(g)硫代乙酸，NaOMe，MeOH，然后8，＞85％. 按照上述相似方式合成炔烴類似物5。10-溴癸-1-醇的THP-保護得到14(74％收率)(流程3)8。然后將所得溴化物14用乙炔化鋰處理，得到末端炔烴15，收率65％9。在HMPA的存在下將所得鋰化物用乙基碘處理，從而允許將炔烴用正丁基鋰去質子化，得到烷基化炔烴169。按照與4的合成相似的方式完成合成，得到所需的tTTA5，總收率35％。
流程3 (a)DHP，PPTS，CH2Cl2，r.t.，74％；(b)乙炔化鋰，DMSO，65％；(c)n-BuLi，THF/HMPA，Etl，0℃；(d)PPh3Br2，PPh3，CH2Cl2，87％2步；(e)硫代乙酸，NaOMe，MeOH，然后 17，86％. 2.2磷脂衍生物的合成 磷脂酰膽堿(PC)衍生物1，2-二-十四烷基硫代乙酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(TTA-PC，18)的合成如流程4所示。類似物dTTA-PC19和tTTA-PC20是按照類似方式合成的。
將sn-甘油-3-磷酸膽堿(GPC)用活化脂肪酸，例如脂肪酸咪唑酰胺(imidazolide)酰化是磷脂酰膽堿合成中的標準工藝。這通常是在DMSO陰離子的存在下進行的，以DMSO作為溶劑。據報道沒有外消旋作用10。
流程4 (a)CDI，CHCl3；(b)GPC.CdCl2，DMSO，DBU；5h，56％. 因而，在文獻工藝10的輕微變化中，將TTA3用N，N’-羰基二咪唑(CDI)活化為咪唑酰胺。在DBU(一種防止外消旋作用的位阻堿)的存在下，使sn-甘油-3-磷酸膽堿(GPC)的鎘(II)加合物與這種咪唑酰胺反應，在處理和純化后得到所需的TTA-PC 18，為黃色蠟狀固體，收率56％。類似地得到dTTA-PC 19和tTTA-PC 20，收率分別為65和57％。
磷脂酰乙醇胺(PE)衍生物1，2-二-十四烷基硫代乙酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TTA-PE，21)的合成如流程4所示。按照類似方式合成類似物dTTA-PE22和tTTA-PE23。
由Wang等11略微改進的工藝實現所需的酶學磷脂酰轉移作用，從磷脂酰膽堿轉移至磷脂酰乙醇胺。
流程5(a)PLD，30℃，pH6.5，兩相系統，乙醇胺，4h，94％ 從所合成的TTA-PC18開始，在過量乙醇胺的存在下通過磷脂酶D(PLD)的酶學磷脂酰轉移作用得到TTA-PE21，收率良好(94％)，為淡黃色蠟狀固體。類似地得到dTTA-PE22和tTTA-PE23，收率分別為89和86％。
利用HBTU/DMAP偶聯條件，分別使TTA3、dTTA4和tTTA5與甘油偶聯，合成TTA-TAG24、dTTA-TAG25和tTTA-TAG26。得到所需的甘油三酯，收率良好(例如TTA-TAG24的收率為85％)。
2.2.3生物學結果 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。將大鼠處死，評價脂質降低效果、脂肪酸氧化增加和關鍵線粒體酶的活性，所述酶為肉堿棕櫚酰轉移酶-II、3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶和脂肪酰-CoA氧化酶。
在進一步的研究中，向雄性Wistar大鼠(每一處理組4只大鼠)通過尾靜脈注射含有TTA(60μmol TTA)、TTA-PC(50μmol TTA)或沒有TTA(DMPC)的脂質體。注射后1.5或3小時殺死大鼠，收集血漿，測定三酰甘油和膽固醇水平。
酯化TTA的脂質降低效果 從表1可以看到，與對照相比，全部處理導致血漿三酰甘油和膽固醇水平有顯著減少。最大減少(60％)是由TTA-PC實現的，它比非酯化TTA更顯著地減少血漿三酰甘油水平。
表1酯化與非酯化TTA對雄性Wistar大鼠血漿脂質的影響(mmol/L)處理三酰甘油膽固醇對照1.20±0.351.84±0.25TTA0.64±0.31a1.14±0.23aTTA-PC0.47±0.21a，b0.74±0.20aTTA-TAG0.56±0.21a1.18±0.12a 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。
a顯著不同于對照(0.5％CMC)，p＜0.05. b顯著不同于未酯化TTA，p＜0.05. 酯化TTA減少肝脂質含量 從表2可以看到，與對照相比，飼喂酯化TTA導致肝三酰甘油水平有顯著減少，最大減少(30％)是由TTA-PC實現的。這說明了對與脂肪肝有關的病理狀態的有益效果。
表2酯化與非酯化TTA對雄性Wistar大鼠肝三酰甘油含量的影響(μmol/mg蛋白質)處理三酰甘油對照3.71±0.50TTA3.09±0.96TTA-PC2.53±0.43aTTA-TAG2.88±0.50a 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。
a顯著不同于對照(0.5％CMC)，p＜0.05. 酯化TTA增加脂肪酸氧化 增加脂肪酸氧化是TTA降低脂質效果的重要因素。增加脂肪酸分解代謝將減少可用于酯化的脂肪酸量，從而減少肝產生和分泌VLDL。從表3可以看到，與對照相比，全部三種飼喂方案顯著增加棕櫚酰-輔酶A的氧化作用，其中TTA-PC比其他兩種處理具有略大的效果。
表3酯化與非酯化TTA對大鼠肝組織勻漿中棕櫚酰-CoA氧化的影響處理被氧化的棕櫚酰-CoA(nmol/mg/min)對照0.75±0.06TTA1.32±0.22aTTA-PC1.39±0.15aTTA-TAG1.37±0.08a 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。
a顯著不同于對照(0.5％CMC)，p＜0.05. 酯化TTA增加肉堿棕櫚酰轉移酶-II的活性 肉堿棕櫚酰轉移酶-II是脂肪酸向線粒體轉運的重要酶。已經顯示TTA誘導的CPT-II活性增加是TTA增加脂肪酸氧化的重要因素。從表4看到，全部三種處理顯著增加這種酶的活性，TTA-PC的這種增加作用顯著高于非酯化的TTA。
表4酯化與非酯化TTA對線粒體肉堿棕櫚酰轉移酶-II活性的影響處理酶活性(nmol/mg/min)對照8.32±1.42TTA19.51±5.50aTTA-PC31.96±2.63a，bTTA-TAG17.88±4.37a 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。
a顯著不同于對照(0.5％CMC)，p＜0.05. b顯著不同于未酯化TTA，p＜0.05. 酯化TTA增加3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶的活性 3-羥基-3-甲基戊二酰(glutharyl)-CoA合酶被認為是線粒體中酮體產生的限速酶。酮體的產生一般隨著脂肪酸氧化的增加而增加，為外周組織中的能量產生提供能源。與對照相比，全部處理顯著增加這種酶的活性，TTA-PC飼喂后所增加的活性比非酯化TTA飼喂后大三倍(表5)。
表5酯化與非酯化TTA對大鼠肝組織勻漿中3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶活性的影響處理酶活性(nmol/mg/min)對照28.23±4.43TTA45.72±5.98aTTA-PC97.77±20.51a，bTTA-TAG40.35±6.16a 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。
a顯著不同于對照(0.5％CMC)，p＜0.05. b顯著不同于未酯化TTA，p＜0.05. 酯化TTA增加脂肪酰-CoA氧化酶的活性 脂肪酰-CoA氧化酶是嚙齒動物脂肪酸過氧化物酶體氧化中的限速酶。它是其基因表達受轉錄因子PPARα調節的很多酶之一，所述因子是脂質分解代謝調節中的重要轉錄因子。該酶被認為是判斷化合物是PPARα配體的優異標志。與對照相比，全部處理增加這種酶的活性，PC-TTA飼喂后所增加的活性顯著高于非酯化TTA飼喂后(表6)。
表6酯化與非酯化TTA對大鼠肝組織勻漿中脂肪酰-CoA氧化酶活性的影響處理酶活性(nmol/mg/min)對照16.50±4.74TTA63.10±35.84aTTA-PC129.48±15.05a，bTTA-TAG49.87±22.51a 按照等摩爾劑量TTA(1mmol/天/kg體重)向雄性Wistar大鼠(每一處理組4-5只大鼠)飼喂TTA、TTA-PC或TTA-TAG達6天。對照大鼠僅接受0.5％CMC。
a顯著不同于對照(0.5％CMC)，p＜0.05. b顯著不同于未酯化TTA，p＜0.05. TTA和PC-TTA的脂質體制劑減少血漿脂質 TTA的脂質體制劑允許比其他溶液更高的TTA濃度用于靜脈內注射。將TTA或TTA-PC結合在脂質體中，與不含TTA的DMPC脂質體比較。在注射后1.5或3小時測定三酰甘油和膽固醇的血漿水平，從表7可以看到，與DMPC相比，在脂質體中注射的TTA和TTA-PC都將降低血漿膽固醇和三酰甘油，減少的三酰甘油水平顯著低于DMPC注射后。
表7含有酯化與非酯化TTA的脂質體對雄性Wistar大鼠血漿脂質的影響(mmol/L)制劑三酰甘油1.5h三酰甘油3h膽固醇1.5h膽固醇3hDMPC脂質體-1.97±0.28-1.80±0.24TTA脂質體1.68±0.201.38±0.28a1.56±0.091.58±0.08TTA-PC脂質體1.00±0.14a1.69±0.601.67±0.311.52±0.29 通過尾靜脈向雄性Wistar大鼠(每一處理組4只大鼠)注射含有TTA(60μmol TTA)、TTA-PC(50μmol TTA)或沒有TTA(DMPC/SA)的脂質體。在注射后1.5或3小時殺死大鼠，收集血漿，測定三酰甘油和膽固醇水平。
a顯著不同于DMPC，p＜0.05. 2.2.4討論生物學效應 代謝綜合征是一種復雜的病癥，以胰島素敏感性減低、血液脂質異常(TAG升高伴有HDL降低、低密度LDL升高和膳食后脂血延長)、腹部肥胖和高血壓為特征。這種病癥與血漿脂肪酸水平升高和骨骼肌中三酰甘油蓄積有聯系。脂質代謝異常是形成這些障礙的核心。這種代謝的調節是復雜的，受多種脂質代謝產物與介導物和各種轉錄因子的影響，其復雜的相互作用遠非人們所理解的。
肥胖與2型糖尿病之間的聯系是由于過多體脂對胰島素全身響應性的不利影響，導致胰島素對碳水化合物與脂質代謝的作用減低，這引起代償性高胰島素血癥。脂肪組織質量是胰島素抗性和代謝綜合征形成和發病的關鍵決定因素癥。盡管胰島素抗性的最明顯表現是糖尿病，不過程度不太嚴重的胰島素抗性導致多組分障礙，被稱為代謝綜合征(或X綜合征)。
有令人信服的證據表明，適度的身體活動和體重下降可提高胰島素敏感性和改善代謝綜合征的特性。這也反映在體脂質量下降上。因而，有理由相信，脂肪組織質量、骨骼肌三酰甘油含量和血漿脂肪酸水平減少將有益于這些脂質障礙和提高胰島素敏感性。
代謝綜合征已被世界衛生組織和American National CholesterolEducation Program(NCEP)Adult Treatment Panel(ATPIII)定義為一種臨床實體[Curr Opin Lipidol，Volume 14(3)，pp329-332]。兩種定義都反映該綜合征的異質性。世界衛生組織的定義包括葡萄糖耐受性受損或2型糖尿病、和/或胰島素抗性，加下面中的兩項腹部肥胖、脂血異常、高血壓和微白蛋白尿。另一方面，NCEP定義包括下面中的三項或以上禁食血漿葡萄糖水平升高(＞6.0mmol/l)、甘油三酯濃度升高(＞1.6mmol/l)、低HDL膽固醇(女性＜1.3mmol/，男性＜1mmol/l)、血壓升高(＞＝130/85mmHg)和腹部肥胖(男性腰圍＞102cm，女性＞88cm)。
這些疾病的發生和流行不斷增加(包括工業化國家和發展中國家)，死亡率、發病率和對個人、團體與社會的醫藥負擔都在日益增加。它們經常是難以治療的。從科學觀點來看，這些疾病和病癥的起源和發病是復雜的，人們對此僅有部分認識。
過去五年已經引入2型糖尿病和肥胖的突破性新藥。這些藥物包括用于2型糖尿病的羅格列酮(SmithKline Beecham′s Avandia)和吡格列酮(Lilly′s Actos)，和用于肥胖的奧利司他(Roche′s Xenical)和西布曲明(Knoll AG′s Meridia)。
已經證明本發明化合物(TTA-PC和TTA-TAG)增加脂肪酸氧化，減少血漿與肝脂質水平。由于這些新穎脂質與TTA的結構聯系和預計它們可能遵循相似的生物學代謝途徑，預期本發明化合物能夠用于預防和/或治療肥胖、糖尿病、高胰島素血癥、脂肪肝和高血壓。這些可取的作用已經得到母體脂肪酸類似物十四烷基硫代乙酸(TTA)的證明，它對脂肪酸氧化和血漿與肝脂質具有性質上相似的作用。已經證明TTA可改善高胰島素血癥、高血糖、脂肪肝和肥胖(WO01/68582)。
已經證明被S或Se取代的脂肪酸類似物由于雜原子的存在而具有抗氧化性質(WO97/03663)。由于相似的分子結構，也預期本發明化合物具有抗氧化性質，因而可以抑制低密度脂蛋白的氧化性修飾。
由于與S和Se取代的脂肪酸分子結構上的相似性，也預期本發明化合物具有抗炎性質，這已經在十四烷基硫代乙酸和十四烷基硒代乙酸中得到了證明(WO02/43728)。
再狹窄和動脈粥樣硬化的過程是相關的，但不是相似的。再狹窄是對使用氣囊冠狀血管成形術(PTCA)或者在血管壁中插入支架之后血管損傷的響應，涉及一種炎性反應和氧化性應激反應。它是一種修復過程，導致因血管壁中平滑肌細胞增殖與移行而使腔變窄，還有膠原與膠原橋連數量上的變化。因而，預期本發明化合物將抑制再狹窄的過程。進而預期它們將有效預防和/或治療炎性障礙(關于TTA參見WO02/43728)。
進一步預期本發明化合物將抑制特定癌細胞和平滑肌細胞的增殖，這已經在其他雜原子取代的脂肪酸類似物中得到了證明。因而，這些化合物可以有效預防和/或治療增生性皮膚障礙，它們涉及角化細胞增殖增加和分化減少(關于TTA參見WO02/26218)。
進而預期它們將有效抑制腫瘤的生長，可以用于抑制腫瘤的轉移性質，也就是抑制繼發性腫瘤的形成(關于TTA參見WO02/03983)。
2.3實驗 2.3.1化學實驗 一般工藝 干燥CH2Cl2是以五氧化磷蒸餾的，其他溶劑是購買的，根據需要預先干燥。薄層色譜(TLC)是在預涂層的Merck-Kieselgel 60 F254鋁襯平板上進行的，用紫外光、碘、酸性鉬(IV)酸銨、酸性香蘭素乙醇溶液或酌情其他試劑顯色。快速柱色譜是在Merck-Kieselgel 60(230-400目)上完成的。紅外光譜是在Jasco FT/IR 620上記錄的，使用NaCl平板。質譜是用Bruker Esquire 3000，VG-7070B或JEOLSX-102儀器記錄的。1H & 13C NMR光譜是在Bruker DRX300，Advance400 UltrashieldTM或Jeol GX-270Q機器上記錄的，使用殘留的同位素溶劑作為內部參照(CHCl3，δH＝7.26ppm)(s＝單峰，d＝雙峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quin＝五重峰)。所有化學品都是從Sigma-Aldrich或Lancaster購買的，如果沒有另外說明的話。FCC表示硅膠快速柱色譜。
十四烷基硫代乙酸(TTA)3
將硫代乙酸(3.32g，36.0mmol)的MeOH(150ml)溶液連續用NaOMe(25％MeOH溶液，12g，0.08mol)和十四烷基溴(10.0g，0.036mol)處理，在室溫下劇烈攪拌48小時。將混合物倒入H2O中，酸化至pH2(濃HCl)，用二乙醚萃取。干燥(MgSO4)，在真空中濃縮，得到粗固體，經過快速柱色譜(FCC)純化(含25％EtOAc的己烷至含35％EtOAc的己烷)，得到3，為無色固體(8.6g，82％)；m.p.64-66℃(文獻值65-67℃)； δH(300MHz，CDCl3)0.89(t，3H，J6.7Hz)，1.27(m，22H)，1.32(m，2H)，1.61(m，2H)，2.67(t，2H，J7.4)和3.28(s，2H)；MS(FAB+)289(M+H)+，288M+；HRMS實測值M+288.211823.計算值C16H32O2SM+288.212302. (6-羥基己基)三苯基溴化鏻6
將6-溴-1-己醇(5.0g，27.6mmol)和三苯膦(7.6g，28.2mmol)在乙腈(100ml)中回流6天，然后在真空中除去溶劑，得到粗的6(12.0g，98％)；δH(300MHz，CDCl3)1.53(m，4H)，1.69(m，4H)，3.65(m，2H)，3.73(m，3H)，7.7-7.9(m，15H). (Z)-6-十四碳烯-1-醇7
將(6-羥基己基)三苯基溴化鏻6(0.5g，1.13mmol)的熱DMSO(3ml)溶液加入到甲亞磺酰基甲烷離子(從NaH(57mg，2.37mmol)和DMSO(1ml)制備，在70-75℃N2下80分鐘)的THF溶液，同時在冰浴中冷卻。將亮黃色正膦溶液在室溫下攪拌10分鐘，然后在0℃下用辛醛(0.159g，1.25mmol)處理。攪拌20分鐘后，將反應混合物倒入5ml H2O中，用乙醚萃取若干次。用MgSO4干燥，濃縮，得到殘余物，經過FCC純化(含14％EtOAc的己烷)，得到7(0.13g，54％，文獻值60％)； δH(270MHz，CDCl3)0.86(3H，t，J6.5Hz)，1.10-1.43(16H，m)，1.55(2H，m)，2.00(4H，m)，3.6(2H，t，J6.5Hz)和5.3-5.4(2H，m). 順式-1-溴-十四碳-6-烯8
在0℃下，將醇7(115mg，0.541mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液連續用四溴化碳(395mg，1.20mmol)和三苯膦(312mg，1.20mmol)處理，溫熱至室溫，攪拌2小時。將反應混合物用水研制，用二氯甲烷萃取，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。粗產物經過快速柱色譜純化，使用己烷作為洗脫劑，從而得到純的8，為亮色的油(105mg，0.381mmol，70％)； δH(270MHz，CDCl3)；0.87(3H，t，J6.1Hz)，1.1-1.65(14H，m)，1.85(2H，quin，J7.0)，2.03(4H，m)，3.4(2H，t，J6.8)和5.35(4H，m)；δC(67.5MHz，CDCl3)27.06，27.32 27.72，27.91，28.04，28.96，29.32，29.37，29.71，29.83，31.96，32.82，34.01，129.31，130.47. 順式-十四碳-6-烯基硫代乙酸(dTTA)4
將硫代乙酸(35mg，0.38mmol)的甲醇(20ml)溶液連續用甲醇鈉(50mg，0.9144mmol)和溴化物8(105mg，0.381mmol)處理，在室溫下攪拌2天。將反應混合物用水稀釋，用冷的濃HCl水溶液酸化。水層用己烷萃取，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮，得到粗殘余物，經過快速柱色譜純化(洗脫劑含65-75％EtOAc的己烷梯度洗脫)，得到純的4，為粘性的油(105mg，0.367mmol，96％)； δH(270MHz，CDCl3)；0.86(3H，t，J6.8)，1.35(14H，m)，1.60(2H，m)，2.00(4H，m)，2.65(2H，t，J7.4)，3.24(2H，s)，5.34(2H，m)和10.0(1H，br s)；δC(67.5MHz，CDCl3)14.20，22.76，27.09，27.31，28.45，28.89，29.32，29.35，29.35，29.83，31.95，32.82，33.54，129.44，130.36和176.77；MS(CI)304(M+NH4)+；HRMS實測值[M+NH4]+304.230876.計算值C16H34NO2S[M+NH4]+304.231026. 2-(5-碘-戊氧基)-四氫-吡喃10
利用Bestmann和Gunawardena的方法10從5-溴戊基乙酸酯9分3步合成標題化合物10。因而從9(58.8g，0.281mol)得到純的碘化物10(54.7g，0.183mol，65％)； δH(270MHz，CDCl3)；1.40-1.90(12H，m)，3.17(2H，t，J6.9)，3.30-3.55(2H，m)，3.69-3.90(2H，m)和4.55(1H，m)；δC(67.5MHz，CDCl3)7.05，19.75，25.54，27.38，28.74，30.82，33.42，62.47，67.28，69.65，73.45，98.97和116.07；MS(EI)297(M-H)+；HRMS實測值[M-H]+297.034067.計算值C10H18O2I[M-H]+297.035157. 2-十四碳-6-炔基氧基-四氫-吡喃12
在0℃下，將1-壬炔11(1.0g，8.06mmol)的THF(20ml)溶液用n-BuLi(1.7M己烷溶液，6.6ml，0.011mmol)處理，將所得淡黃色溶液攪拌15分鐘。然后加入HMPA(15ml)，將混合物在0℃下攪拌另外15分鐘。然后在0℃下向所得暗黃色/橙色溶液加入10(3.6g，0.0121mol)，導致溶液顏色立即變為亮黃色。將該亮黃色溶液在室溫下攪拌過夜，在此階段將其用水研制，用己烷萃取。將己烷萃取液用水充分洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮，得到亮黃色殘余物，經過快速柱色譜純化(洗脫劑含8.5％EtOAc的己烷)，得到純的12(1.6g，70％)； δH(270MHz，CDCl3)；0.86(3H，t，J6.2)，1.15-1.85(13H，m)，2.11(4H，m)，3.30-3.55(2H，m)，3.69-3.90(2H，m)和4.56(1H，m)；δC(67.5MHz，CDCl3)14.17，18.82，18.82，19.74，22.71，25.57，25.57，28.91，28.91，29.08，29.24，29.38，30.49，30.84，31.84，62.40，62.40，67.57，67.57，98.90.MS(EI)295(M+H)+；HRMS實測值295.2616[M+H]+.計算值C19H35O2295.263706[M+H]+. 順式-1-溴-十四碳-6-烯8
將炔烴12(150mg，0.509mmol)、喹啉(0.18ml，1.50mmol)與林德樂催化劑(Pd，5％wt百分數基于碳酸鈣，混有鉛，100mg)的混合物在H2氣氛(氣囊壓力)和室溫下攪拌3小時。通過硅藻土過濾除去固體殘余物后，將濾液用水洗滌，用己烷萃取，干燥(MgSO4)，濃縮，得到粗殘余物，該殘余物不經純化。在0℃下將殘余物溶于二氯甲烷，將混合物連續用三苯膦(52mg，0.20mmol)和二溴化三苯膦(236mg，0.56mmol)處理，將所得混合物在0℃下攪拌1小時。然后將混合物用10％含水碳酸鉀、水洗滌，干燥(MgSO4)。濃縮，得到粗殘余物，經過快速柱色譜純化(洗脫劑己烷)，得到純的8(81％)； δH(270MHz，CDCl3)；0.87(3H，t，J6.1Hz)，1.1-1.65(14H，m)，1.85(2H，quin，J7.0)，2.03(4H，m)，3.4(2H，t，J6.8)和5.35(4H，m)；δC(67.5MHz，CDCl3)27.06，27.32 27.72，27.91，28.04，28.96，29.32，29.37，29.71，29.83，31.96，32.82，34.01，129.31，130.47. 2-(10-溴癸氧基)四氫吡喃14
在0℃下，將1-溴癸-1-醇13(5.0g，21.1mmol)用二氫吡喃(2.14g，25.4mmol)與吡啶鎓-對-甲苯磺酸鹽(0.1g cat.)的無水二氯甲烷(100ml)溶液處理，在室溫下攪拌8小時。用10％NaHCO3猝滅反應，用二氯甲烷萃取。將有機萃取液用鹽水和水洗滌，經無水MgSO4干燥。在真空中除去溶劑，得到油，經過FCC純化(含4-8％Et2O的己烷)。得到純的14，為粘性的油(5.0g，15.5mmol，73％)； δH(270MHz，CDCl3)1.27-1.91(22H，m)，3.36(2H，t，J6.9Hz)，3.34-3.90(4H，m)和4.55(1H，m)；MS(FAB+)321M+，HMRS實測值319.127007(M-H+).計算值C15H28BrO2，319.127267(M-H)+. 2-(十二碳-11-炔基-1-氧基)四氫吡喃15
在干燥N2氣氛下，將無水DMSO(15ml)加入到冷的乙炔化鋰(1.47g，15.2mmol)中。將混合物在5℃下攪拌10分鐘，然后用14(3g，11.3mmol)的DMSO(4ml)溶液逐滴處理。將所得混合物在5℃下攪拌3小時，溫熱至室溫過夜，然后用冰水猝滅，繼之以用乙醚萃取若干次。將醚萃取液用水洗滌若干次，經MgSO4干燥，在真空中濃縮，得到粗產物。經過FCC純化(含4％EtOAc的己烷)，得到純的15(1.95g，65％)；δH(270MHz，CDCl3)1.20-1.50(12H，m)，1.50-1.88(10H，m)，1.95(1H，t，J 2.6Hz)，2.19(2H，dt，J2.6，7.0Hz)，3.35-3.92(4H，m)和4.58(1H，m)；HRMS實測值267.231735(M+H)+.計算值C17H31O2267.232406(M+H)+. 2-十四碳-11-炔基氧基-四氫-吡喃16
按照與炔烴12相同的方式合成炔烴16。因而從末端炔烴15(5.09g，0.0191mol)和乙基碘(5.46g，0.031mol)得到粗的16，不經純化直接用于下一步，即溴化物17的合成。
14-溴-十四碳-3-炔17
在0℃下，將炔基醚16(5.62g，0.0191mol)的二氯甲烷(150ml)溶液連續用四溴化碳(8.23g，0.0248mol)和三苯膦(13g，0.050mol)處理，在室溫下攪拌5小時。將溶液用硅膠處理，在真空中除去溶劑，將干燥殘余物裝上已備好的快速柱。用己烷洗脫，得到純的溴化物17(87％，從15計)； δH(270MHz，CDCl3)1.10(3H，t，J7.4)，1.27-1.54(14H，m)，1.84(2H，quin，J7.3)，2.15(4H，m)和3.40(2H，t，J6.8).δC(100MHz，CDCl3)12.82，14.79，27.28，29.23，29.26，29.4，29.53，29.80，29.80，30.11，33.04，79.96(quartenary)and 82.00(quartenary). 十四碳-11-炔基硫代乙酸(tTTA)5
按照與化合物3和4相同的方式合成酸5。因而從溴化物17(4.4g，15.98mmol)和硫代乙酸(1.5g，16.2mmol)得到粗的酸，該酸從己烷中結晶，從而得到純的酸5(3.90g，86％)，為白色固體；δH(270MHz，CDCl3)1.10(3H，t，J7.30)，1.20-1.50(14H)，1.60(2H，m)，2.15(4H，m)，2.64(2H，t，J7.30)，3.25(2H，s)和11.0(1H，br s)；δC(67.5MHz，CDCl3)12.49，14.47，18.80，28.80，28.95，28.95，29.21，29.21，29.21，29.51，32.88，33.56，79.82，81.80和176.51；MS(CI)302[M+NH4]+，HMRS實測值302.214964[M+NH4]+.計算值C16H32NO2S302.215376[M+NH4]+. 1，2-二-十四烷基硫代乙酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(TTA-PC，18)
在N2氣氛下，向攪拌著的TTA3(231mg，0.80mmol)的無水CHCl3(5ml)溶液加入N，N-羰基二咪唑(CDI；162mg，1.00mmol)。同時，將sn-甘油-3-磷酸膽堿氯化鎘(II)加合物(GPC；137mg，0.30mmol，1eq.)溶于DMSO(5ml)，同時輕微加熱。向該溶液加入DBU(120μl，0.80mmol)。將CHCl3溶液以及另外的CHCl3(2ml)經由套管轉移至DMSO溶液。7小時后，將粗反應混合物用0.1M乙酸(20ml)中和，然后用2∶1CHCl3∶MeOH混合物(總體積150ml)萃取，用1∶1H2O∶MeOH混合物洗滌(從100ml逐步到250ml，洗滌五次)，每次反萃取。合并隨后的有機級分，在真空中濃縮，使水和甲醇與苯共沸。殘留的橙色-褐色粘性油經過SiO2快速柱色譜純化[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，77.54∶20.23∶2.23]，得到TTA-PC18，為灰白色蠟狀固體(135mg，56％)； Rf0.33[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，65∶25∶4]；1H NMR(270MHz，CDCl3)δH 0.82(6H，t，J＝6.5Hz，2CH2CH3)，1.15-1.39(44H，2m，22CH2)，1.47-1.65(4H，m，2CH2CH3)，2.54-2.61(4H，2xt，J＝7.2Hz，2CH2SCH2CO2)，3.20和3.23(2x1H，2s，2CH2SCH2CO2)，3.34(9H，s，N(CH3)3)3.59-3.67(2H，m，CH2N(CH3)3)，3.87-3.98(2H，m，甘油-C3-Ha，b)，4.07-4.15(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝7.8Hz，甘油-C1-Hb)，4.26-4.33(2H，m，CH2CH2N(CH3)3)，4.34-4.39(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝2.5Hz，甘油-C1-Ha)，5.13-5.22(1H，m，甘油-C2-H)，13C NMR(67.5MHz，CDCl3)δC 170.44，170.19(2CO)，71.66(d，JCP＝7.74Hz，POCH2CHCH2)，66.30(d，JCP＝4.67Hz，POCH2CH2N(CH3)3)，63.63(POCH2CHCH2)，63.28(d，JCP＝25.2Hz，POCH2[甘油])，59.38(d，JCP＝21.2Hz，POCH2[膽堿])，54.42(N(CH3)3)，33.66，33.50，32.80，32.73，29.77(40xCH2)，29.43，28.91，28.89，28.89，22.75，14.18(2CH3)；m/z(FAB+)820([M+Na]+)，798([M+H]+)；HRMS計算值C40H81NO8PS2798.514126.實測值798.510895([M+H]+). 1，2-二(順式-十四碳-6-烯基硫代乙酰)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(dTTA-PC，19)
在N2氣氛下，向攪拌著的dTTA4(229mg，0.80mmol)的無水CHCl3(5ml)溶液加入N，N’-羰基二咪唑(CDI；162mg，1.00mmol)。同時，將sn-甘油-3-磷酸膽堿氯化鎘(II)加合物(GPC；137mg，0.30mmol，1eq.)溶于DMSO(5ml)，同時輕微加熱。向該溶液加入DBU(120μl，0.80mmol)。將CHCl3溶液以及另外的CHCl3(2ml)經由套管轉移至DMSO溶液。7小時后，將粗反應混合物用0.1M乙酸(20ml)中和，然后用2∶1CHCl3∶MeOH混合物(總體積150ml)萃取，用1∶1H2O∶MeOH混合物洗滌(從100ml逐步到250ml，洗滌五次)，每次反萃取。合并隨后的有機級分，在真空中濃縮，使水和甲醇與苯共沸。殘留的橙色-褐色粘性油經過SiO2快速柱色譜純化[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，77.54∶20.23∶2.23]，得到dTTA-PC19，為灰白色蠟狀固體(155mg，65％)； Rf0.33[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，65∶25∶4]；1H NMR(270MHz，CDCl3)δH0.82(6H，t，J＝6.5Hz，2CH2CH3)，1.15-1.39(28H，2m，14CH2)，1.47-1.65(4H，m，2CH2CH3)，1.92-2.07(8H，m，2CH2CH＝CHCH2)，2.54-2.61(4H，2xt，J＝7.2Hz，2CH2SCH2CO2)，3.20和3.23(2x1H，2s，2CH2SCH2CO2)，3.34(9H，s，N(CH3)3)3.59-3.67(2H，m，CH2N(CH3)3)，3.87-3.98(2H，m，甘油-C3-Ha，b)，4.07-4.15(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝7.8Hz，甘油-C1-Hb)，4.26-4.33(2H，m，CH2CH2N(CH3)3)，4.34-4.39(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝2.5Hz，甘油-C1-Ha)，5.13-5.27(1H，m，甘油-C2-H)和5.25-5.38(4H，m，2CH＝CH)；13C NMR(67.5MHz，CDCl3)δC170.36，170.09(2CO)，130.29，129.38(2C＝C)，71.58(d，JCP＝7.74Hz，POCH2CHCH2)，66.30(d，JCP＝4.67Hz，POCH2CH2N(CH3)3)，63.63(POCH2CHCH2)，63.16(d，JCP＝25.2Hz，POCH2[甘油])，59.38(d，JCP＝21.2Hz，POCH2[膽堿])，54.42(N(CH3)3)，33.60，33.46，32.72，32.64，31.91，29.77，29.40，29.32，29.28，28.96，28.47，27.29，27.11，22.75和14.18(2CH3)；m/z(FAB+)816([M+Na]+)，794([M+H]+)；HRMS計算值C40H77NO8PS2794.482826.實測值794.480957([M+H]+). 1，2-二(十四碳-11-炔基硫代乙酰)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(tTTA-PC，20)
在N2氣氛下，向攪拌著的tTTA5(228mg，0.80mmol)的無水CHCl3(5ml)溶液加入N，N’-羰基二咪唑(CDI；162mg，1.00mmol)。同時，將sn-甘油-3-磷酸膽堿氯化鎘(II)加合物(GPC；137mg，0.30mmol，1eq.)溶于DMSO(5ml)，同時輕微加熱。向該溶液加入DBU(120μl，0.80mmol)。將CHCl3溶液以及另外的CHCl3(2ml)經由套管轉移至DMSO溶液。7小時后，將粗反應混合物用0.1M乙酸(20ml)中和，然后用2∶1CHCl3∶MeOH混合物(總體積150ml)萃取，用1∶1H2O∶MeOH混合物洗滌(從100ml逐步到250ml，洗滌五次)，每次反萃取。合并隨后的有機級分，在真空中濃縮，使水和甲醇與苯共沸。殘留的橙色-褐色粘性油經過SiO2快速柱色譜純化[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，77.54∶20.23∶2.23]，得到tTTA-PC20，為灰白色蠟狀固體(135mg，57％)； Rf0.33[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，65∶25∶4]；1H NMR(270MHz，CDCl3)δH1.09(6H，t，J＝6.9Hz，2CH2CH3)，1.15-1.60(32H，m，16CH2)，2.0-2.17(CH2C≡CCH2)，2.56(4H，2xt，J＝7.2Hz，2CH2SCH2CO2)，3.20和3.23(2x1H，2s，2CH2SCH2CO2)，3.34(9H，s，N(CH3)3)，3.59-3.67(2H，m，CH2N(CH3)3)，3.87-3.98(2H，m，甘油-C3-Ha，b)，4.07-4.15(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝7.8Hz，甘油-C1-Hb)，4.26-4.33(2H，m，CH2CH2N(CH3)3)，4.34-4.39(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝2.5Hz，甘油l-C1-Ha)，5.13-5.27(1H，m，甘油-C2-H)；13C NMR(67.5MHz，CDCl3)δC170.36，170.09(2CO)，81.6和79.58(2C≡C)，71.61(d，JCP＝7.74Hz，POCH2CHCH2)，66.35(d，JCP＝4.67Hz，POCH2CH2N(CH3)3)，63.65(POCH2CHCH2)，63.22(d，JCP＝25.2Hz，POCH2[甘油])，59.33(d，JCP＝21.2Hz，POCH2[膽堿])，54.47(N(CH3)3)，33.64，33.50，32.79，32.72，29.56，29.56，29.32，29.21，29.21，29.03，28.92，28.87，18.76，14.45和12.46(2CH3)；m/z(FAB+)812([M+Na]+)，790([M+H]+)；HRMS計算值C40H73NO8PS2790.451526.實測值790.453156([M+H]+). 1，2-二-十四烷基硫代乙酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TTA-PE，21)
在30℃下，將乙醇胺(91μl，1.50mmol，6eq.)在100mM NaOAc/50mMCaCl2緩沖液(0.625ml)，pH6.5(用乙酸調節pH)中的溶液加入到攪拌著的18(135mg，0.169mmol，1eq.)的CHCl3(5ml)溶液中。向該兩相系統加入PLD(在440μl上述緩沖液pH6.5中含有310單位)，將反應混合物在30℃下攪拌3小時。加入另外的PLD(35單位)。10小時后，將水相稀釋至15ml，將粗有機產物用CHCl3∶MeOH，2∶1洗滌(30ml×3)進行萃取。合并有機層，用H2O(15ml)洗滌，然后在真空中濃縮，經過SiO2快速柱色譜純化[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，77.54∶20.23∶2.23]。得到標題化合物21，為非常淡黃色的蠟狀固體(120mg，94％)Rf0.32[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，65∶25∶4]；1H NMR(400MHz，CDCl3)δH0.85(6H，t，J＝6.9Hz，2CH2CH3)，1.15-1.41(44H，2m，22CH2)，1.50-1.62(4H，m，2CH2CH3)，2.58(4H，2t，J＝6.9Hz，2CH2SCH2CO2)，3.05-3.13(2H，m，CH2NH3)，3.20和3.24(2H，2s，2CH2SCH2CO2)，3.85-3.91(2H，m，甘油-C3-Ha，b)，3.97-4.05(2H，m，CH2CH2NH3)，4.09-4.14(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝6.4Hz，甘油-C1-Hb)，4.30-4.35(1H，dd，2J＝11.8Hz，3J＝2.6Hz，甘油-C1-Ha)，5.14-5.20(1H，m，甘油-C2-H)，8.20-8.60(br s，NH3)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δC170.29，170.13(2CO)，71.28(d，JCP＝27.6Hz，POCH2CHCH2)，63.73(d，JCP＝22.0Hz，POCH2[甘油])，63.25(POCH2CHCH2)，62.40(m，POCH2[膽堿])，40.49(CH2NH3)，33.59，33.42，32.81，32.75，32.01，29.81(14CH2)，29.46，29.09，28.97，28.93，22.77和14.19. 1，2-二-(順式-十四碳-6-烯基硫代乙酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dTTA-PE，22)
在30℃下，將乙醇胺(91μl，1.50mmol，6eq.)在100mM NaOAc/50mMCaCl2緩沖液(0.625ml)，pH6.5(用乙酸調節pH)中的溶液加入到攪拌著的19(188mg，0.237mmol，1eq.)的CHCl3(5ml)溶液中。向該兩相系統加入PLD(在440μl上述緩沖液pH6.5中含有250單位)，將反應混合物在30℃下攪拌3小時。加入另外的PLD(35單位)。10小時后，將水相稀釋至15ml，將粗有機產物用CHCl3∶MeOH，2∶1洗滌(30ml×3)進行萃取。合并有機層，用H2O(15ml)洗滌，然后在真空中濃縮，經過SiO2快速柱色譜純化[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，77.54∶20.23∶2.23]。得到標題化合物22，為非常淡黃色的蠟狀固體(158mg，89％)Rf0.32[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，65∶25∶4]；1H NMR(400MHz，CDCl3)δH0.85(6H，t，J＝6.9Hz，2CH2CH3)，1.15-1.41(36H，2m，18CH2)，1.50-1.62(4H，m，2CH2CH3)，1.90-1.21(8H，m，2CH2CH＝CHCH2)，2.58(4H，2t，J＝6.9Hz，2CH2SCH2CO2)，3.05-3.13(2H，m，CH2NH3)，3.20和3.24(2H，2s，2CH2SCH2CO2)，9Hz，2CH2SCH2CO2)，3.05-3.13(2H，m，CH2NH3)，3.20和3.24(2H，2s，2CH2SCH2CO2)，3.85-3.91(2H，m，甘油-C3-Ha，b)，3.97-4.05(2H，m，CH2CH2NH3)，4.09-4.14(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝6.4Hz，甘油-C1-Hb)，4.30-4.35(1H，dd，2J＝11.8Hz，3J＝2.6Hz，甘油-C1-Ha)，5.14-5.20(1H，m，甘油-C2-H)，5.22-5.32(4H，m，2CH＝CH)，8.20-8.60(br s，NH3)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δC170.28，170.11(2CO)，130.29，129.41(2C＝C)，71.28(d，JCP＝27.6Hz，POCH2CHCH2)，63.73(m，POCH2[甘油])，63.25(POCH2CHCH2)，62.40(m，POCH2[膽堿])，40.49(CH2NH3)，33.58，33.41，32.72，32.67，31.94，29.82，29.46，29.35，29.31，28.99，28.55，28.52，27.32，27.16，22.75和14.18(2CH3)；m/z(FAB+)748([M+Na]+)，770([M+H]+)；HRMS計算值C37H67NO8PS2748.404576.實測值748.404526([M+H]+). 1，2-二-(十四碳-11-炔基硫代乙酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(tTTA-PE，23)
在30℃下，將乙醇胺(91μl，1.50mmol，6eq.)在100mM NaOAc/50mMCaCl2緩沖液(0.625ml)，pH6.5(用乙酸調節pH)中的溶液加入到攪拌著的20(185mg，0.234mmol，1eq.)的CHCl3(5ml)溶液中。向該兩相系統加入PLD(在440μl上述緩沖液pH6.5中含有250單位)，將反應混合物在30℃下攪拌3小時。加入另外的PLD(35單位)。10小時后，將水相稀釋至15ml，將粗有機產物用CHCl3∶MeOH，2∶1洗滌(30ml×3)進行萃取。合并有機層，用H2O(15ml)洗滌，然后在真空中濃縮，經過SiO2快速柱色譜純化[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，77.54∶20.23∶2.23]。得到標題化合物23，為非常淡黃色的蠟狀固體(151mg，86％)Rf0.32[CH2Cl2∶MeOH∶H2O，65∶25∶4]；1H NMR(400MHz，CDCl3)δH□1.09(6H，t，J＝6.9Hz，2CH2CH3)，1.15-1.60(32H，m，8CH2)，2.0-2.17(CH2C≡CCH2)，2.56(4H，2xt，J＝7.2Hz，2CH2SCH2CO2)，3.05-3.13(2H，m，CH2NH3)，3.20和3.23(2x1H，2s，2CH2SCH2CO2)，3.85-3.91(2H，m，甘油-C3-Ha，b)，3.97-4.05(2H，m，CH2CH2NH3)，4.09-4.14(1H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝6.4Hz，甘油I-C1-Hb)，4.30-4.35(1H，m，甘油-C1-Ha)，5.14-5.20(1H，m，甘油-C2-H)，8.20-8.60(br s，NH3)；13C NMR(67.5MHz，CDCl3)δC170.27，170.11(2CO)，81.60和79.58(2C≡C)，71.28(d，JCP＝27.6Hz，POCH2CHCH2)，63.70(d，JCP＝22.0Hz，POCH2[甘油])，63.22(POCH2CHCH2)，62.35(m，POCH2[膽堿])，40.47(CH2NH3)，33.58，33.41，32.78，32.72，29.61(3 CH2)，29.56，29.37，29.23(3CH2)，29.04，28.95(2CH2)，28.88，18.79，14.45和12.47(2CH3). 1，2，3-三-十四烷基硫代乙酰-sn-甘油(TTA-TAG，24)
在N2氣氛下，將二甲氨基吡啶(2.08g，17.00mmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU；6.45g，17.00mmol)和甘油(0.45g，4.95mmol)加入到攪拌著的TTA3(5.00g，17.00mmol)的無水CHCl3(120ml)溶液中。將所得混合物在室溫下攪拌24小時。將粗反應混合物用7％檸檬酸洗滌，有機相經MgSO4干燥。殘留固體經過SiO2快速柱色譜純化[Et2O∶己烷，1∶5]，得到TTA-TAG24，為白色固體(3.80g，85％)Rf0.35[Et2O∶Hexane，1∶5]；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.88(9H，t，J＝6.0Hz，3CH2CH3)，1.23-1.41(66H，2m，33CH2)，1.55-1.63(6H，m，3CH2CH3)，2.62(4H，t，J＝7.6，CH2SCH2CO2)，2.63(4H，t，J＝7.6，CH2SCH2CO2)，3.15(6H，s，CH2SCH2CO2)，4.19(2H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝6.0Hz，甘油-C1-Ha和甘油-C3-Ha)，4.32(2H，dd，2J＝12.0Hz，3J＝4.4Hz，甘油-C1-Hb和甘油-C3-Hb)，5.30-5.35(1H，m，甘油-C2-H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.08，169.77(3CO)，69.69(甘油-C2)，62.66(甘油-C1和甘油-C3)，33.45，33.34，32.81，32.77，31.97，29.73，29.74，29.66，29.58，29.41，29.28，29.0，28.84，28.81，22.74，14.17(3CH3)；m/z(ESI)925([M+Na]+). 2.3.4生物學實驗 方法 動物和處理 在實驗開始時將體重200-250g的雄性Wistar Charles River大鼠喂養在金屬絲籠中，控制房間的溫度(22±1℃)和光線(光照從7.00a.m.至7.00p.m.)。它們可以自由進食和飲水。向它們飼喂StandardLaboratory Rat Chow R-34-EWOS-ALAB(EWOS Sweden)生長大鼠供養飼料。每籠兩只大鼠。在實驗開始之前，使動物適應至少5天。每天記錄重量增量和食物攝取量。將TTA和酯化TTA(1，2-二(十四烷基硫代乙酰)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(TTA-PC)和甘油1，2，3-三(十四烷基硫代乙酸酯)(三酰甘油)(TTA-TAG))懸浮在0.5％羧甲基纖維素(CMC)中，通過胃插管給藥，最終體積為0.8-1.2ml，每天一次達6天。
在實驗結束時，將動物用熒光母素麻醉(0.4ml/100g體重)，進行心臟穿刺，在含有EDTA的真空容器中獲得血樣。制備血漿，利用Monotest酶試劑盒(Boehringer Mannheim，Germany)測量三酰甘油和膽固醇。
核后與線粒體級分的制備和酶活性的測量 將從單個雄性Wistar大鼠中新鮮分離的肝臟在冰冷的蔗糖緩沖液(0.25M蔗糖、10mM HEPES(pH7.4)和2mM EDTA)中均質化。按照DeDuve等13利用制備型差速離心法制備核后與線粒體級分。修飾、純度和收率如文獻所述14。如文獻所述15，使用[1-14C]-棕櫚酰-CoA(Radiochemical Centre，Amersham，England)作為底物測量核后級分中的酸溶性產物。本質上如Bremer所述16測量線粒體級分中的肉堿棕櫚酰轉移酶-II活性，按照Clinkenbeard等17測量核后級分中的3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶。利用Small等所述偶聯測定法18測量核后級分中的脂肪酰-CoA氧化酶。通過在棕櫚酰-CoA的存在下監測二氯熒光黃吸光度的增加，測量過氧化氫的產生。
脂質體的制劑和給藥 一般工藝。1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)和硬脂酸(SA)是從Sigma-Aldrich購買的。十四烷基硫代乙酸(TTA)和1，2-二-十四烷基硫代乙酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(TTA-PC)是在我們的實驗室合成的。在二氯甲烷中制備脂質的儲備溶液(5mg/ml)，貯存在-20℃下。二氯甲烷在新鮮蒸餾后使用，使用PBS(10mM磷酸鹽緩沖液，150mMNaCl，pH7.4)進行脂質體的水化。
脂質體的制備。將相關脂質在二氯甲烷中的混合物在50ml圓底燒瓶中干燥成薄層。向脂質膜加入PBS，然后將混合物在40-50℃水浴中振蕩10分鐘。將所得脂質體懸液用聲波處理5分鐘。
示差掃描量熱法(DSC)。利用VP-DSC微量熱計(MicroCalTMIncorporated)得到差示熱分析圖，從5℃加熱至60℃的速率為1℃/min。基于峰頂溫度測量相變溫度(Tc)。
光子相關性分光術(PCS)。在N4 plus MD亞微米顆粒分析儀(Beckman Coulter，High Wycombe，Buckinghamshire，U.K.)上測量粒徑。在20℃下進行全部測量，在90℃下記錄，平衡時間為1分鐘，單次運行時間為300秒。將緩沖液的折光指數設置在1.333。利用單模式分析計算平均粒徑和標準分布。
ζ電位(ZP)。在Delsa 440 SX(Beckman Coulter，High Wycombe，Buckinghamshire，U.K.)上利用表面電荷電泳法測量ζ電位。
TTA脂質體 將TTA配制成DMPC/TTA脂質體系統。分析和表征不同摩爾比的DMPC∶TTA脂質體。用于TTA靜脈內注射的最終制劑是DMPC/TTA(1∶1)的PBS溶液。所制備和注射的TTA濃度如表7所示。
表7 脂質體 TTA cc.(mg/ml)總脂質cc.(mg/ml) PCS(nm)TTA8.9428.64 265.3±114.3 TTA-PC脂質體 TTA-PC脂質體最初是從單獨的TTA-PC配制的，但是發現所能達到的最高濃度為2.5mg/ml脂質。為了達到更高的濃度，將TTA-PC脂質體用硬脂酸穩定化。用于TTA-PC靜脈內注射的最終制劑是TTA-PC∶SA(2∶1)的PBS溶液。所制備和注射的TTA-PC濃度如表8所示。這些劑量是相對于隱含于TTA-PC中的TTA量計算的。
表8脂質體TTA-PC cc.(mg/ml)總脂質cc.(mg/ml) PCS(nm)TTA-PC12.514.72 209.1±84.6 將脂質體按所示濃度懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，將溶液用聲波處理備用。在溶于等摩爾量NaOH后，將非酯化TTA(10mmol/L)溶于200mg/ml白蛋白注射溶液(″Octapharma″)。最終的pH為7.0。在將大鼠用熒光母素麻醉后(0.4ml/100g體重)，通過尾靜脈注射脂質體或TTA溶液(1ml)。如上所述殺死大鼠。
在上述說明中提到的所有出版物都結合在此作為參考。所述發明方法和系統的各種修改和變化對本領域技術人員而言將是顯而易見的，并不背離發明的范圍和精神。盡管已經結合具體優選實施方式描述了發明，不過應當理解所要求保護的發明不應僅限于這類具體實施方式
。事實上，所述實施發明的方式的各種修改對化學或相關領域技術人員而言將是顯而易見的，都屬于下列權利要求的范圍。
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權利要求
1、一種脂質化合物，包含至少一個非極性部分和極性部分，其中每個或者至少一個非極性部分為式X-Y-Z-，其中X是烴基鏈，Y選自S、Se、SO2、SO和O中的至少一個，Z是可選的烴基，其中該極性部分為式-[C(O)]mPHG，其中PHG是極性首基，m是非極性部分的數量。
2、根據權利要求1的化合物，其中每個非極性部分為式X-Y-Z-，其中X是烴基鏈，Y選自S、Se、SO2、SO和O中的至少一個，Z是可選的烴基。
3、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
其中p是1至10，優選1、2或3，每個X、Y和Z是彼此獨立地加以選擇的。
4、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
5、根據權利要求1的化合物，包含至少兩個非極性部分，其中每個非極性部分獨立地選自式X-Y-Z-的非極性部分。
6、根據權利要求3的化合物，其中該化合物為下式
其中每個X、Y和Z是彼此獨立地加以選擇的。
7、根據權利要求5的化合物，其中該化合物為下式
其中每個X、Y和Z是彼此獨立地加以選擇的。
8、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中該極性首基從下列之一衍生而來磷脂、神經酰胺、三酰甘油、溶血磷脂、磷脂酰絲氨酸、甘油、醇、烷氧基化合物、單酰甘油、神經節苷脂、鞘磷脂、腦苷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇(PI)、二酰甘油、磷脂酸、甘油糖、多元醇和磷脂酰甘油。
9、根據權利要求8的化合物，其中該極性首基從磷脂衍生而來。
10、根據權利要求9的化合物，其中該磷脂是中性或陰離子型磷脂。
11、根據權利要求10的化合物，其中該磷脂選自磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。
12、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中該極性首基(PHG)為式-W-連接基-HG，其中W選自CH2、O、NR1和S，其中R1是H或烴基，連接基是可選的連接基團，HG是首基。
13、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X是選自可選被取代的烷基、可選被取代的鏈烯基和可選被取代的炔基的基團。
14、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X是選自未取代的烷基、未取代的鏈烯基和未取代的炔基的基團。
15、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X是選自未取代的C6-C24烷基、未取代的C6-C24鏈烯基和未取代的C6-C24炔基的基團。
16、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X是選自未取代的C10-C18烷基、未取代的C10-C18鏈烯基和未取代的C10-C18炔基的基團。
17、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X是選自未取代的C14烷基、未取代的C14鏈烯基和未取代的C14炔基的基團。
18、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X是碳氫化合物鏈。
19、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中X選自S和Se。
20、根據權利要求19的化合物，其中Y是S。
21、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中Z是烷基。
22、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中Z是C1-C10、優選C1-C6、優選C1-C3烷基。
23、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中Z是-CH2-。
24、根據前述權利要求任意一項的化合物，其中Y-Z一起代表基團[Y1-CH2]n，其中Y1選自S、Se、SO2、SO、O、CH2，其中當Y1是CH2時，鏈X-Y-Z含有偶數個原子，并且其中n是整數1至20。
25、根據權利要求24的化合物，其中Y1選自S、Se、SO2、SO和O。
26、根據權利要求25的化合物，其中Y1選自S和Se。
27、根據權利要求26的化合物，其中Y1是S。
28、根據權利要求24至26任意一項的化合物，其中n是1至10，優選1至5，優選1、2或3。
29、根據權利要求24至27任意一項的化合物，其中n是1。
30、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
其中Y2和Y3獨立地是S或Se，X2和X3獨立地選自未取代的C10-C18烷基、未取代的C10-C18鏈烯基和未取代的C10-C18炔基。
31、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
其中X2和X3獨立地選自未取代的C10-C18烷基、未取代的C10-C18鏈烯基和未取代的C10-C18炔基。
32、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
其中X2和X3獨立地選自未取代的C14烷基、未取代的C14鏈烯基和未取代的C14炔基。
33、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
其中X2和X3獨立地選自CH3(CH2)13-、CH3(CH2)6CH＝CH(CH2)5-和CH3CH2C≡C(CH2)10-。
34、根據權利要求30、31、32或33的化合物，其中該極性首基從磷脂的極性首基衍生而來。
35、根據權利要求34的化合物，其中該磷脂是磷脂酰膽堿(PC)或磷脂酰乙醇胺(PE)。
36、根據權利要求1的化合物，其中該化合物為下式
其中每個W、X、Y和Z是彼此獨立地加以選擇的。
37、根據權利要求36的化合物，其中該化合物為下式
其中Y2、Y3和Y4獨立地是S或Se，X2、X3和X4獨立地選自C10-C18烷基、C10-C18鏈烯基和C10-C18炔基。
38、根據權利要求36的化合物，其中該化合物為下式
其中X2、X3和X4獨立地選自C10-C18烷基、C10-C18鏈烯基和C10-C18炔基。
39、包含脂質體和根據權利要求1至38任意一項的化合物的組合。
40、藥物組合物，包含根據權利要求1至38任意一項的化合物或者根據權利要求39的組合，可選地混合有藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑。
41、可局部給藥的根據權利要求40的藥物組合物。
42、可腸胃外給藥的根據權利要求40的藥物組合物。
43、可靜脈內給藥的根據權利要求42的藥物組合物。
44、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽或者根據權利要求39的組合在醫藥中的用途。
45、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于治療和/或預防選自X綜合征、肥胖、高血壓、脂肪肝、糖尿病、高血糖、高胰島素血癥和狹窄的病癥。
46、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于降低哺乳動物的血液膽固醇與甘油三酯濃度和/或抑制低密度脂蛋白的氧化性修飾。
47、在需要時引起人類或非人類動物的重量減輕或脂肪質量減少的方法，包含對其給以有效量的根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽。
48、改變動物脂肪分布與含量的方法，包含對其給以有效量的根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽。
49、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于抑制和/或防止腫瘤生長。
50、治療和/或預防原發性和繼發性轉移瘤的方法，包含給以根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽。
51、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于預防和/或治療增生性皮膚障礙。
52、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于抑制角化細胞增殖和/或誘導其分化。
53、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于預防和/或治療炎性障礙。
54、增強哺乳動物細胞或組織白介素-10(IL-10)內源性產生的方法，包含給以根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽。
55、抑制哺乳動物細胞或組織白介素-2(IL-2)內源性產生的方法，包含給以根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽。
56、根據權利要求1至38任意一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在藥物生產中的用途，所述藥物用于抑制受刺激的外周單核細胞(PBMC)增殖。
全文摘要
本發明提供一種脂質化合物，包含至少一個非極性部分和極性部分，其中每個或者至少一個非極性部分為式X－Y－Z－，其中X是烴基鏈，Y選自S、Se、SO2、SO和O中的至少一個，Z是可選的烴基，其中該極性部分為式－[C(O)] m PHG，其中PHG是極性首基，m是非極性部分的數量。
文檔編號A61K31/21GK1675229SQ0381743
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月16日 優先權日2002年6月20日
發明者A·D·米勒, M·R·喬根森, R·博格, J·斯科夫 申請人:Ic Vec有限公司, 蒂亞梅迪卡有限公司