抗腫瘤化合物及其治療用途的制作方法

專利名稱：抗腫瘤化合物及其治療用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及化合物(E)-1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮在治療涉及Met、PDGF-R、FGF-R1、FGF-R3和Kit酪氨酸激酶或Ret癌蛋白的腫瘤中的用途。
背景技術：
RET/PTC癌基因涉及于人乳頭狀甲狀腺腫瘤的轉化過程中且產生于具有不同供體基因的原-RET的酪氨酸激酶域的重排。該基因重排的產物表現出獨立于配體的賴氨酸激酶活性，并且集中在細胞質中。Ret/ptc1是RET/PTC1癌基因的產物，其產生于具有H4/D10S170基因的原-RET酪氨酸激酶域的重排。
Int.J.Cancer 85，384-390(2000)報道了亞芳基2-吲哚酮化合物對Ret/ptc1癌蛋白酪氨酸激酶活性的抑制。指出1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮衍生物(以下為“化合物1”)在回復RET/PTC1癌基因轉化的NIH3T3細胞的形態學表型方面特別有效。在同一文獻中，提議將亞芳基2-吲哚酮化合物對酪氨酸激酶的抑制作用用于研究Ret信號傳導并用于在與Ret-和Ret/ptcs-相關的疾病中控制細胞增殖。

發明內容
已經發現化合物1能有效地抑制在腫瘤發生、發展和向遠端器官擴散中起重要作用的酪氨酸激酶，而不是抑制Ret/ptc1。具體而言，已經顯示化合物1可完全抑制Ret/MEN2A(突變C634R和C634W)、Ret/MEN2B(突變M918T)、Met、PDGF-R、FGF-R1、FGF-R3和Kit(c-Kit和突變A559)酪氨酸激酶的自磷酸化作用、降低它們的表達(下調)并回復由此轉化的細胞表型。
因此，本發明的目的是化合物(E)-1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮或其與可藥用堿的鹽在細胞轉化的初始階段或腫瘤增殖和擴散的后續階段中治療腫瘤的用途，所述腫瘤涉及Met、PDGF-R、FGF-R1、FGF-R3和Kit酪氨酸激酶中至少之一或涉及Ret癌蛋白家族、包括載有與MEN2-相關突變的Ret受體中至少之一。
本發明還涉及化合物1的任何立體異構體或互變異構形式的用途。
抑制失調的組成型活性Ret受體可用于治療散發性髓樣甲狀腺癌(MTC)和與MEN2相關的疾病，包括MTC、嗜鉻細胞瘤、甲狀旁腺增生和腸神經節瘤。
抑制Met可用于對抗上皮源性腫瘤的浸潤/轉移性表型。對于Met-活化的改變，化合物1在治療腎臟腫瘤中也具有明確的療效。
抑制Kit可用于治療胃腸間質腫瘤、小細胞肺癌、精原細胞瘤和血液惡性腫瘤如肥大細胞病和急性髓性白血病。
PDGF-R活化的失控以及其牽涉入自分泌環支持化合物1在對常規療法不響應的腫瘤如神經膠質瘤和隆凸性皮膚纖維肉瘤中的治療用途。另外，PDGF-R涉及腫瘤血管形成和血管發展，由此支持化合物1在控制實體瘤中新血管形成中的用途。
化合物1可用于治療表達高水平的FGF-R1和最終涉及于自分泌環中的各個bFGF配體的黑素瘤和神經膠質瘤。由于該受體在血管形成過程中起重要作用，故通過化合物1抑制該受體可用于控制腫瘤血管形成。
抑制FGF-R3可用于治療多發性骨髓瘤、膀胱癌和子宮頸癌。
對于治療應用，RPI-1及其鹽可用可藥用的載體和賦形劑進行配制。化合物1的苯酚官能團可通過用適宜的有機或無機堿處理而成鹽。藥物組合物可通過口服、胃腸外、舌下或透皮途徑、優選以片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉末劑、糖漿劑、溶液劑、混懸劑、栓劑、控釋形式施用。
該組合物可采用常規技術、使用本領域已知的成分進行制備。活性成分的量可根據疾病的嚴重程度、患者年齡、施用類型和途徑而改變，然而通常使用的量為0.1至1000mg/Kg、優選5至300mg/Kg、更優選20至200mg/Kg，單或多劑、每天一次或多次使用。
發明詳述載有可引起組成型酪氨酸激酶活性的氨基酸取代基的Ret癌蛋白涉及散發性MTC和遺傳性2型多發性內分泌腺瘤形成綜合征(MEN2A、MEN2B和家族性MTC)，所有這些疾病均以存在MTC為特征(Jhiang S.M.等人，Oncogene 19，5590，2000)。然而在散發性MTC中，RET突變是體細胞性的，在MEN2患者中，RET突變存在于種系水平。這些突變引起受體的組成型活化，而沒有改變其在細胞膜上的定位。在本研究中所用的Ret癌蛋白涉及Cys634(指Ret/MEN2AC634R和Ret/MEN2AC634W)或Met918(指Ret/MEN2BM918T)，并且分別代表了在MEN2A和MNE2B中表達頻率最高的Ret癌蛋白。已經在RET/MEN2A(C634R)基因轉染的鼠細胞(NIH3T3MEN2A(C634R)細胞)和分別以表達Ret/MEN2A(C634W)和Ret/MEN2B(M918T)為特征的人髓樣甲狀腺癌細胞系TT和MZ-CRC-1中證明了化合物1的抑制效應(圖1、2)。在這些細胞系中觀察到癌蛋白酪氨酸磷酸化和表達減少(圖1C和2A)。化合物1對Ret/MEN2A和Ret/MEN2B受體自磷酸化的抑制作用與抗增殖作用有關(圖1B和2B)。NIH3T3MEN2A(C634R)轉染子在暴露于化合物1后回復了它們的轉化表型(圖1A)。在異種移植了TT腫瘤的裸鼠中已經觀察到顯著的劑量依賴性抗腫瘤活性口服施用每日劑量50-100mg/Kg(每日兩次)后，化合物1的治療達到80％腫瘤重量抑制(TWI)，而沒有產生毒性(圖3)。考慮到MTC的攻擊性和常規治療對其無療效，故所證實的化合物1在控制MTC細胞增殖中的藥理學和生物化學效應尤其重要。
Met，即肝細胞生長因子受體是以腫瘤發展和轉移性生長為特征的浸潤過程中所涉及的蛋白酪氨酸激酶(Maulik G.等人，Cytok.Growth FactorRev.13，41，2000)。改變如突變、過度表達或牽涉入自分泌環是激酶組成型活化失控的原因。Met激酶活性失控涉及于多種上皮源性腫瘤的浸襲力。在乳頭狀甲狀腺癌中，Met被頻繁地過度表達。圖4中所示結果表明在用化合物1處理的乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1中，Met自磷酸化作用呈劑量依賴性抑制。在經處理的細胞中，Met蛋白質水平也有所降低。
其它涉及自分泌環或新血管形成過程的受體酪氨酸激酶如PDGF-R(Rosenkranz S.和Kazlauskas A.Growth Factors 16，201，1999)和FGF-R1(Powers C.J.等人，Endocr.Rel.Cancer 7，165，2000)在癌生長中起重要作用。在對常規療法沒有響應的腫瘤如神經膠質瘤和黑素瘤中，觀察到這些受體的活化失調。圖5和6中所示結果表明化合物1對由自分泌刺激(圖5A)或由外源性配體(圖5B和6A)誘導的受體自磷酸化作用的劑量依賴性抑制。這些效應與受體表達降低有關。化合物1的濃度高于15μM可完全抑制PDGF-R的磷酸化作用。
FGF-R3受體酪氨酸激酶的活化突變如染色體異位或點突變導致組成型活性FGF-R3受體失調，其已涉及多發性骨髓瘤和膀胱癌和子宮頸癌(Powers C.J.等人，Endocr.Rel.Cancer 7，165，2000)。化合物1下調在NIH3T3轉染子中外源性表達的FGF-R3的酪氨酸自磷酸化作用和表達的能力在圖6B中進行了圖解。
由于突變或牽涉入不同腫瘤如小細胞肺癌、胃腸間質腫瘤、精原細胞瘤和白血病的自分泌環，Kit酪氨酸激酶被組成型活化(Heinrich M.C.等人，J.Clin.Oncol.20，1692，2002)。如圖7所示，化合物1抑制在NIH3T3細胞中外源性表達的Kit(Δ559)突變體的組成型自磷酸化作用和表達(圖7B)。該抑制作用與所轉染細胞的轉化的形態學表型的回復有關(圖7A)。另外，圖7C顯示在小細胞肺癌細胞系N592中化合物1對通過自分泌環活化的c-Kit的劑量依賴性抑制。
如此處所用的術語“腫瘤”意欲包括但不限于各種組織和/或器官如肌肉、骨或結締組織、皮膚、腦、肺、性器官、淋巴系統或腎臟系統、乳房或血細胞、肝、消化系統、胰和甲狀腺或腎上腺的惡性或非惡性細胞的異常細胞增殖。異常細胞增殖可包括但不限于卵巢、乳房、腦、前列腺、結腸、肝、肺、卵巢、子宮、子宮頸、胰、胃腸道、頭、頸、鼻咽、皮膚、膀胱、胃、腎臟或睪丸的腫瘤、卡波西肉瘤、膽管癌、絨毛膜癌、神經母細胞瘤、維爾姆斯瘤、霍奇金病、黑素瘤、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病以及急性或慢性粒細胞性淋巴瘤。
本發明的化合物可單獨或者與其它抗腫瘤或抗癌劑組合施用，所述抗腫瘤或抗癌劑包括但不限于阿霉素、柔紅霉素、甲氨蝶呤、長春新堿、6-巰嘌呤、阿糖胞苷、環磷酰胺、5-FU、六甲密胺、卡鉑、順鉑、伊達比星、紫杉醇、多西他賽、拓撲替康、伊立替康、吉西他濱、L-PAM、BCNU和VP-16。本發明的化合物還可包括在用于治療腫瘤的藥盒中。該藥盒可包括其它的抗癌或抗腫瘤劑。
下述附圖更詳細地解釋本發明。


圖1化合物1對表達外源性RET/MEN2A(C634R)的NIH3T3MEN2A(C634R)轉染子的效應。A)NIH3T3MEN2A(C634R)細胞的轉化的形態學表型的回復。將細胞暴露于6μM化合物1達24小時，然后在相差顯微鏡下照相(原始放大率×100)。B)抗增殖效應。將NIH3T3MEN2A(C634R)細胞和親本NIH3T3細胞用濃度遞增的藥物處理72小時，然后用庫爾特計數儀計數。可從中計算出所報導的IC50值的劑量效應曲線表明Ret癌蛋白陽性細胞系對藥物的敏感性更高。C)Ret/MEN2A(C634R)自磷酸化作用和表達的抑制。將細胞用溶劑(-)或10μM化合物1(+)處理指定的時間。制備全細胞溶解產物并進行SDS-PAGE，并用抗-pTyr抗體進行免疫印跡分析。剝離探針后，將濾膜用抗-Ret抗體重新印跡。箭頭指示Ret/MEN2A受體的部分和全部糖基化形式。在暴露于藥物2小時后，受體顯示被部分脫磷酸化。更長時間后，酪氨酸完全脫磷酸，這與受體的表達減少有關。
圖2化合物1對包含與MEN2相關的RET突變體的人MTC細胞系的效應。A)對Ret自磷酸化作用的抑制。將分別表達RET/MEN2A(C634W)和RET/MEN2B(M918T)的TT和MZ-CRC-1細胞用指定濃度的化合物1處理24小時。對照細胞(C)接受溶劑。制備全細胞提取物用于免疫印跡分析，用抗-pTyr和抗-Ret抗體探測。如抗-pTyr印跡所顯示，將細胞用化合物處理導致兩種細胞系中的Ret受體的酪氨酸磷酸化作用均呈劑量依賴性抑制。在用最高濃度的藥物處理的細胞中觀察到受體濃度的表達下降。B)抗增殖效應。將TT和MZ-CRC-1細胞用濃度遞增的化合物1處理7天，然后用庫爾特計數儀計數。劑量效應曲線證明了藥物干擾兩種MTC細胞系的增殖潛力的能力。
圖3化合物1在包含TT髓樣甲狀腺癌異種移植物的裸鼠中的抗腫瘤活性。在s.c.接種腫瘤細胞后25天開始藥物治療。化合物1以50或100mg/Kg每天兩次(2qd)口服遞送，連續10天(以箭頭表示)。對照小鼠接受賦形劑。該處理誘導對腫瘤生長的顯著的劑量依賴性抑制。對于50mg/Kg和100mg/Kg的劑量，TWI分別為60％(P＜0.005)和80％(P＜0.0005)。
圖4對用化合物1處理的人乳頭狀甲狀腺癌細胞(TPC-1)中Met自磷酸化作用和表達的抑制。A)將TPC-1細胞暴露于溶劑(-)或指定濃度的化合物1達72小時。使用等量的蛋白質以用抗Met-抗體進行免疫沉淀(IP)或用于制備全細胞溶解產物(WCL)。通過SDS-PAGE分離免疫沉淀的蛋白質和WCL、轉移至硝酸纖維素膜并用抗-pTyr或抗-Met抗體進行免疫印跡分析。B)細胞如A中處理。將細胞提取物用抗-pTyr抗體進行免疫沉淀并用抗-Met抗體探測。C)使細胞血清饑餓24小時，在后18小時暴露于溶劑或化合物1(60μM)。然后將其不經處理(-)或者用20ng/ml HGF刺激(+)達10分鐘。將細胞溶解產物用抗-Met進行免疫沉淀并用抗-pTyr或抗-Met抗體探測。藥物處理消除了組成型或HGF誘導的Met酪氨酸磷酸化作用，并引起Met表達下降。
圖5化合物1對全細胞中PDGF-R自磷酸化作用和表達的抑制。A)將2N5A細胞(通過產生PDGF-R自分泌刺激的COL1A1/PDGFB重排所轉化的NIH3T3)用指定濃度的化合物1處理72個小時。將細胞提取物用抗-PDGF-R進行免疫沉淀并用抗-pTyr或抗-PDGF-R抗體進行免疫印跡分析。B)將Swiss 3T3細胞血清饑餓24小時，然后用指定濃度的化合物1處理18個小時。在用1nM PDGF刺激5分鐘后，制備全細胞溶解產物并用抗-pTyr或抗-PDGF-R進行免疫印跡分析。顯示了抗-肌動蛋白印跡的蛋白質負載量。在兩種細胞體系中，均證明了藥物誘導的對受體酪氨酸磷酸化作用和表達的劑量依賴性抑制。
圖6化合物1對全細胞中FGF-R1和FGF-R3受體的自磷酸化作用和表達的抑制。A)將Swiss 3T3細胞血清饑餓24小時，然后用指定濃度的化合物1處理18個小時。在用100ng/ml FGF刺激5分鐘后，制備全細胞溶解產物，并用抗-pTyr或抗-FGF-R1進行免疫印跡分析。顯示了抗-肌動蛋白印跡的蛋白質負載量。B)將經FGF-R3突變體Y373C轉化的NIH3T3以指定濃度處理72個小時。將細胞提取物用抗-FGF-R3免疫沉淀，然后用抗p-Tyr或抗-FGF-R3進行免疫印跡分析。在兩種細胞體系中，均證明了化合物1對受體酪氨酸磷酸化作用和表達的劑量依賴性抑制。
圖7化合物1對表達組成型活化形式的Kit的細胞系的效應。A)表達外源性突變KIT(Δ559)的NIH3T3轉染子的轉化的形態學表型的回復。將細胞用20μM化合物1處理，24小時后在相差顯微鏡下照相(原始放大率×100)。B)NIH3T3轉染子中Kit(Δ559)自磷酸化作用和表達的抑制。將細胞用指定濃度的化合物1處理72個小時。將細胞溶解產物用抗-Kit抗體進行免疫沉淀并用抗-p-Tyr或抗-Kit抗體進行免疫印跡分析。C)SCLC細胞系N592中c-Kit的表達和自分泌環活化的自磷酸化作用的抑制。將細胞用指定濃度的化合物1處理24小時。將全細胞溶解產物用抗-Kit抗體或用特異性識別酪氨酸磷酸化的/活化的Kit(p-Kit)的抗體進行免疫印跡分析。在兩種細胞體系中，均證明了藥物誘導的對受體酪氨酸磷酸化作用和表達的劑量依賴性抑制。
材料和方法細胞系和培養條件在本研究中使用以下人髓樣甲狀腺癌(MTC)細胞系。TT細胞系來源于與MEN2A相關的MTC，以表達載有突變C634W的RET癌基因為特征。MZ-CRC-1細胞系來源于與MEN2B相關的MTC，以表達載有突變M918T的RET癌基因為特征。將TT細胞在添加有15％胎牛血清(FCS)(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的Ham′s F12培養基(Bio Whittaker，Verviers，比利時)中培養，而使MZ-CRC-1細胞在添加有10％FCS的Dulbecco改良Eagle’s培養基(DMEM)(Bio Whittaker)中生長。將用作Met過度表述模型的人乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1在含10％FCS的DMEM中常規培養。來源于人SCLC的N592細胞的特征是通過SCF配體自分泌刺激Kit活化。將N592細胞在添加有10％FCS的RPMI 1640中培養。將鼠SWISS3T3和NIH3T3成纖維細胞在含10％小牛血清(Colorado SerumCompany，Denver，CO)的DMEM中培養。另外，使用不同癌基因轉染的NIH3T3細胞。NIH3T3MEN2A轉染子表達RET-MEN2A(C634R)癌基因的短同種型；NIH3T3KITΔ559細胞表達載有在GIST中發現的活化突變Δ559的KIT；NIH3T3FGFR3(Y373C)表達載有在人多發性骨髓瘤細胞系中發現的活化突變Y373C的FGF-R3。2N5A細胞是產生PDGF-R自分泌刺激的COL1A1/PDGFB重排所轉化的NIH3T3細胞。將所有NIH3T3轉染子于10％CO2氣氛下保持在DMEM加5％小牛血清中。
抗增殖實驗將細胞在用化合物1處理3天(NIH3T3和NIH3T3MEN2A細胞)或7天(MTC細胞)后進行胰蛋白酶消化，用庫爾特計數儀計數(CoulterElectronics，Luton U.K.)。由劑量效應曲線計算能夠抑制細胞增殖50％的濃度(IC50)。每個實驗一式兩份進行。
抗體使用以下多克隆抗體識別兩種Ret同種型共有的COOH-末端序列(aa1000-1014)的抗-Ret(Borrello M.G.等人，Mol.Cell Biol.16，2151，1996)；來自于Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的抗-cKit、抗-Met和抗-FGF-R3；來自于Sigma(St.Louis，MO)的抗-肌動蛋白；來自于UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)的抗-PDGF-R α/β；來自于Cell SignalingTechnology(Beverly，MA)的抗phospho-cKit(Tyr 719)。鼠單克隆抗-磷酸酪氨酸(抗-pTyr)4G10和抗-FGF-R1抗體來自于Upstate Biotechnology。
免疫沉淀和免疫印跡分析在制備全細胞提取物時，將細胞溶解于含1mM PMSF、10μg/ml抑胃酶肽、12.5μg/ml亮抑酶肽、100KIU抑酶肽、1mM原釩酸鈉、1mM鉬酸鈉的十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，2％SDS)中。在適當稀釋的等分試樣中通過bicinchionic acid(BCA)法(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白質濃度，然后將樣品調節至終濃度為10％甘油、5％β-巰基乙醇和0.001％溴酚藍。
對于免疫沉淀實驗，將細胞用化合物1或溶劑處理指定的時間。將單層細胞用冷磷酸緩沖鹽水加0.1mM原釩酸鈉沖洗兩次，然后在溶解緩沖液(50mM HEPES pH7.6、150mM NaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1.5mMMgCl2、1mM EGTA、100mM NaF、10mM焦磷酸鈉、10μg/ml抗蛋白酶、20μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制劑、10μg/ml E64、1mg/ml pefabloc SC)中于冰上放置20分鐘。然后收集細胞、通過22-號針吸取，并以10000g于4℃離心20分鐘。通過BCA試劑(Pierce)測定蛋白質濃度。將細胞提取物用蛋白質A-瓊脂糖和指定的抗體于4℃旋轉孵育2小時。用20mM HEPES pH7.6、150mM NaCl、10％甘油、0.1％Triton X-100洗滌3次后，將免疫沉淀物用完全樣品緩沖液洗脫。
將標化的免疫沉淀物(0.5-4mg細胞提取物)或全細胞溶解物(30-60μg)在SDS-PAGE上拆分，并轉移至硝基纖維素濾膜。將膜與一抗于4℃孵育過夜。使用來自于Amersham Biosciences(Little Chalfont，英國)或Pierce的增強型化學發光檢測系統、通過辣根過氧化物酶-綴合的抗-鼠或抗-兔抗體顯現各免疫反應帶。
體內實驗所有試驗均使用8-11周齡的雌性無胸腺CD-1裸鼠(Charles River，Calco，意大利)進行。將小鼠供養于恒溫恒濕的層流室中。根據英國癌癥研究指南協調委員會(the United Kingdom Coordinating Committee onCancer Research Guidelines)，實驗設計經Istituto Nazionale per lo Studio ela Cura dei Tumori的動物實驗倫理委員會(米蘭，意大利)批準(Workman P.等人，British Journal of Cancer，77，1，1998)。
將MTC細胞TT(1.6×107細胞)以得自體外細胞培養物的細胞懸液形式s.c.接種于小鼠中。每個對照或藥物處理組包括8-10個腫瘤。于第0天注射腫瘤細胞，每兩周用游標卡尺測定腫瘤直徑以跟蹤腫瘤的生長。根據下式計算腫瘤重量(TW)TW(mg)＝腫瘤體積(mm3)＝d2×D/2，其中d和D分別為最短和最長直徑。當腫瘤剛剛能被測定(平均TW約50mg)時，即接種腫瘤細胞25天后，開始藥物處理。將化合物1溶解于5％乙醇、5％Cremophor EL、90％鹽水(0.9％NaCl)中，每日口服遞送，每日兩次(2qd)，持續10天。對照小鼠接受溶劑溶液。
藥物功效以TW抑制百分比(經藥物處理小鼠相對對照小鼠的TWI％表示為TWI％＝100-(平均TW處理/平均TW對照×100)評價。為了進行統計分析，在評價TWI％的當天將對照和經處理小鼠的TW通過Student’s t檢驗(雙尾)進行比較。P值小于0.05認為具有統計學的顯著性。
(E)-1，3-二氫-4-羥基亞芐基-5，6-二甲氧基-(1H)-吲哚-2-酮(化合物1)的制備1)2-硝基-4，5-二甲氧基苯乙酸的合成 C10H11NO6，M.W.241.20將45g(0.23mole，1eq.)3，4-二甲氧基苯乙酸于28℃-35℃、N2氣氛和機械攪拌下溶于100mL(2.2體積)冰醋酸中。將該溶液冷卻至15℃-20℃，并于45’內加入發煙硝酸(98％，33mL)在冰醋酸(25mL)中的混合物。一旦加入完成，即可觀察到紅色固態沉淀。將懸浮液傾倒入冰水(600mL)中，攪拌下放置2小時。濾出固體、用水洗滌并于60℃干燥8小時，得到44g終產物。
產率79.3％(mmol/mmol)TLC(SiO2；乙酸乙酯10/AcOH 0.5)Rf酸＝0.6；Rf產物＝0.5。
m.p.199℃-202℃1H-NMR，(DMSO)3.9ppm(s，6H)；4.0ppm(s.，2H)；7.12ppm(s.，1H)；7.7ppm(s.，1H)。
2)1，3-二氫-5，6-二甲氧基-(1H)-吲哚-2-酮的合成 C10H11NO3，M.W.193.11將9.2g(38.14mmole，1eq.)3，4-二甲氧基-2-硝基-苯乙酸于25℃、N2氣氛和機械攪拌下懸浮于冰醋酸(92mL，10體積)中。向懸浮液中以兩等份加入Fe粉，325篩目，97％(12.0g，214.86mmole，5.6eq.)。第一份于室溫下加入；然后將混合物回流，30分鐘后加入第二份Fe。30’后反應完成，TLC(SiO2；CHCl39/MeOH 1)，Rf硝基＝0.65，Rf吲哚酮＝0.71。
將灰色懸浮液冷卻至室溫，將乙酸于低壓下蒸發至固態粗品，將該固態粗品懸浮于氯仿(200mL)中。將鹽濾出，有機相用NaCl飽和溶液(100mL)洗滌、經Na2SO4干燥并蒸發至干。將固體懸浮于乙醚(35mL)中達30’、過濾并于50℃干燥2小時。得到6.7g米色固體。
產率90.9％(mmol/mmol)m.p.199℃-201℃TLC(SiO2；乙酸乙酯10/AcOH 0.5)Rf酸＝0.6；Rf產物＝0.51H-NMR，(DMSO)3.4ppm(s，2H)；3.69ppm(s.，3H)；3.72ppm(s.，3H)；6.49ppm(s.，1H)；6.92ppm(s.，1H)；10.15(S.，1H)。
3)(E)-1，3-二氫-4-羥基亞芐基-5，6-二甲氧基-1H-吲哚-2-酮的合成 C17H15NO4，M.W.297.31將6.7g(36.9mmole，1eq.)1，3-二氫-5，6-二甲氧基-(1H)-吲哚-2-酮于室溫下溶于無水DMSO(50mL)中。向該溶液中加入4-羥基苯甲醛(5.41g，44.3mmole，1.2eq.)和哌啶(4.38g，44.3mmole，1.2eq.)，然后攪拌16小時。將該混合物傾倒入H2O(250mL)和HCl 0.5N(150mL)中，觀察到固態沉淀。將該溶液冷卻至5℃-10℃達1小時、過濾并于真空中于80℃干燥2小時。得到13g濕固體，然后從無水乙醇中結晶，得到6.77g終產物。
產率61.6％(mmol/mmol)m.p.238℃-240℃Rf(二氧化硅；乙酸乙酯100％)＝0.68。
1H-NMR，(DMSO)3.6ppm(s，3H)；3.8ppm(s.，3H)；6.5ppm(s.，1H)；6.9ppm(d.，2H，J＝8.6Hz)；10ppm(寬峰s.)；12.8ppm(s.)。
在2位的環內雙鍵的E構型借助1D NOE NMR實驗確定。
權利要求
1.化合物1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮或其無毒鹽或異構體在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途，所述腫瘤涉及選自Met、PDGF-R、FGF-R1、FGF-R3、Kit的酪氨酸激酶或Ret家族癌蛋白。
2.根據權利要求1中所述的用途，其中的藥物用于治療表達載有活化的序列突變的RET癌蛋白的腫瘤。
3.根據權利要求2中所述的用途，其中RET癌蛋白包括與MEN2相關的突變。
4.根據權利要求3中所述的用途，其中活化的序列突變為RET/MEN2A(C634R)、RET/MEN2A(C634W)和RET/MEN2B(M918T)。
5.根據權利要求2-4中所述的用途，其中的藥物用于治療髓樣甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、甲狀旁腺增生和腸神經節瘤。
6.根據權利要求1中所述的用途，其中的藥物用于治療帶有Met活化改變的腫瘤。
7.根據權利要求6中所述的用途，其中所述腫瘤源于上皮。
8.根據權利要求7中所述的用途，其中的藥物用于治療腎臟腫瘤。
9.根據權利要求1中所述的用途，其中的藥物用于治療表達組成型活化Kit的腫瘤。
10.根據權利要求9中所述的用途，其中Kit在序列突變或牽涉入自分泌環后被組成型活化。
11.根據權利要求9中所述的用途，其中的藥物用于治療胃腸間質腫瘤、小細胞肺癌、白血病或精原細胞瘤。
12.根據權利要求1中所述的用途，其中的藥物用于治療涉及PDGF-R的活化失控的腫瘤。
13.根據權利要求12中所述的用途，其中所述腫瘤為神經膠質瘤和隆凸性皮膚纖維肉瘤。
14.根據權利要求1中所述的用途，其中的藥物用于治療高度表達FGF-R1和/或其配體bFGF的腫瘤。
15.根據權利要求14中所述的用途，其中所述腫瘤為黑素瘤和神經膠質瘤。
16.根據權利要求1中所述的用途，其中的藥物用于治療表達組成型活化形式的FGF-R3的腫瘤。
17.根據權利要求16中所述的用途，其中所述腫瘤為多發性骨髓瘤、膀胱癌和子宮頸癌。
18.根據權利要求12和14中所述的用途，其中的藥物用于抑制腫瘤血管形成。
19.含有作為活性成分的化合物1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮或其可藥用鹽以及可藥用載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
20.根據權利要求19中所述的藥物組合物，其中所述可藥用載體或稀釋劑適合于口服或胃腸外施用。
21.根據權利要求19中所述的藥物組合物，其還包含不同于1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮的抗腫瘤或抗癌劑。
22.根據權利要求19中所述的藥物組合物，其中所述抗腫瘤或抗癌劑選自阿霉素、柔紅霉素、甲氨蝶呤、長春新堿、6-巰嘌呤、阿糖胞苷、環磷酰胺、5-FU、六甲密胺、卡鉑、順鉑、伊達比星、紫杉醇、多西他賽、拓撲替康、伊立替康、吉西他濱、L-PAM、BCNU和VP-16。
23.在分別的容器中含有化合物1，3-二氫-5，6-二甲氧基-3-[(4-羥苯基)亞甲基]-2H-吲哚-2-酮或其可藥用鹽以及抗癌或抗腫瘤劑的藥盒。
24.根據權利要求23中所述的藥盒，其中所述抗腫瘤或抗癌劑選自阿霉素、柔紅霉素、甲氨蝶呤、長春新堿、6-巰嘌呤、阿糖胞苷、環磷酰胺、5-FU、六甲密胺、卡鉑、順鉑、伊達比星、紫杉醇、多西他賽、拓撲替康、伊立替康、吉西他濱、L-PAM、BCNU和VP-16。
全文摘要
本發明公開了亞芳基2－吲哚酮衍生物用于治療涉及Met、PDGF－R、FGF－R1、FGF－R3和Kit酪氨酸激酶或Ret家族癌蛋白的腫瘤的用途。本發明還提供了包含亞芳基2－吲哚酮衍生物的藥物組合物以及在分別的容器中含有所述衍生物和抗癌或抗腫瘤劑的藥盒。
文檔編號A61K31/404GK1668298SQ03817335
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月22日 優先權日2002年7月23日
發明者C·蘭齊, G·卡西內利, G·庫庫魯, M·A·皮耶羅蒂, F·祖尼諾, E·門塔 申請人:歐洲細胞醫療有限責任公司, 國家腫瘤治療研究中心