用于胰島素產生細胞的方法、組合物及生長與分化因子的制作方法

專利名稱：用于胰島素產生細胞的方法、組合物及生長與分化因子的制作方法
技術領域：
本發明涉及使非胰島素產生胰細胞轉化為干細胞的培養基、培養模式、培養條件和方法，所述干細胞能被增殖和分化為胰激素產生細胞。
相關技術描述選擇性地控制非胰島素產生胰細胞，例如腺泡細胞或導管細胞擴展和轉化為胰島素產生細胞的能力，將創造新的糖尿病治療方案，該方案避免現行糖尿病治療的許多缺點。
糖尿病是一種由喪失將葡萄糖轉運到身體細胞中的能力而引起的疾病，或者是因為沒有產生足夠的胰島素，或者是因為減少了對胰島素的應答。在健康人中，血糖微小升高刺激胰島素的產生和分泌，其作用是增加葡萄糖攝入細胞，使血糖恢復到最佳水平。胰島素刺激肝和骨骼肌細胞從血液中吸收葡萄糖并將其轉化為能量貯藏分子糖原。它還刺激骨骼肌纖維從血液中吸收氨基酸并將它們轉化為蛋白質，以及它作用于脂肪細胞刺激脂肪的合成。在糖尿病中，血流可被葡萄糖飽和，但葡萄糖不能到達細胞內需要和利用它的位置。結果身體細胞缺乏需要的能量，導致許多患受控不好的胰島素依賴性糖尿病患者的消瘦外觀。
在發現胰島素及其作為糖尿病的治療以前，唯一的出路是饑餓，可預測接著是死亡。用胰島素治療的今天，在過高劑量胰島素的情況下，死亡仍會發生，過高劑量胰島素導致極度低血糖和昏迷，然后死亡，除非通過葡萄糖的攝取而被逆轉。在太低劑量胰島素的情況下，死亡也仍會發生，太低劑量胰島素導致酮酸中毒，如果不適當治療，在緊急情況下也將導致昏迷和死亡。
雖然因為現在有適用于糖尿病的治療，糖尿病通常不是一種致命的疾病，但沒有一種標準的治療能夠取代身體的胰島素微小量—微小量地產生和葡萄糖代謝的精確控制。結果，糖尿病人中的平均血糖水平一般仍然太高。長期高血糖水平隨時間引起許多長期并發癥。糖尿病是失明、腎衰竭、心臟病或中風的過早發展、壞疽并切除、陽痿的主要原因，而且它減少患者總估計壽命一至二十年。
糖尿病是世界上最常見的慢性疾病之一。在美國，糖尿病影響了大約一千六百萬人-45歲以上成年人群的12％還多。新病例數以每年約150,000增加。除了那些患有臨床糖尿病的人以外，表現出異常葡萄糖耐受癥狀的大約有二千萬人。這些人是邊緣的糖尿病人，在那些正常人和那些清楚為糖尿病人之間的中間。他們中的許多人早晚將發展為糖尿病而且一些估計糖尿病的潛在數目高達三千六百萬或45歲以上成年人群的25～30％。
糖尿病及其并發癥對現代社會具有較大的社會經濟學影響。現在在美國花費在衛生保健上的費用是大約7000億美元，其中大約1000億被花費用于治療糖尿病及其并發癥。因為糖尿病的發病率正在提高，糖尿病保健的成本將占總衛生保健支出的不斷增加部分，除非及時采取措施迎接挑戰。糖尿病的醫療、情感和財政代價是巨大的，并且隨著那些患糖尿病的人數增加而增加。
可以將糖尿病細分為兩種不同類型1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病以很少或沒有循環胰島素為特征并且它最常見于兒童或早期青少年。它是由胰島產生胰島素的β細胞的破壞引起的。因為對β細胞的自動免疫攻擊導致所述破壞，1型糖尿病具有遺傳誘因，它由一些還未鑒別的環境事件，例如病毒感染，或非感染劑的作用(毒素或食物)觸發，該事件激發免疫系統對患者胰中的β細胞反應并且損壞患者胰中的β細胞。現認為導致1型糖尿病事件的致病順序由幾步組成。第一，認為遺傳易感性是致病過程開始的基礎要件。第二，由病毒或非感染劑，例如毒素或食物介導的環境損害激發第三步，在遺傳易感個體胰島中的炎性反應(胰島炎)。第四步是β細胞的改變或轉換，使得它們不再被免疫系統認為是“自己”，而是被看作是外來細胞或“非自己”。最后一步是針對“作為靶的”β細胞的完全損壞免疫應答的發展，其中細胞介導的免疫機制與細胞毒性抗體在產生胰島素的β細胞的破壞中相互配合。盡管這種免疫攻擊，一段時間內，新β細胞的產生是快的，足以位于被免疫系統破壞之前，從而存在大量的β細胞以控制血糖水平。但是，逐步地，β細胞的數目下降。當β細胞數降至臨界水平(正常的10％)時，不能再控制血糖水平，以及進展為胰島素產生的完全衰竭幾乎是不可避免。現認為，β細胞的再產生持續幾年，甚至在功能胰島素產生停止以后，但當所述細胞發展成熟時，它們被破壞。
為了生存，患有1型糖尿病的人必須每天進行多次胰島素注射并且每天多次通過刺破他們的手指取血測試他們的血糖。胰島素的每天多次注射不足以模擬身體的微小量—微小量的胰島素產生和葡萄糖代謝的精確控制。血糖水平通常比正常更高，引起并發癥，包括失明、心臟病發作、腎衰竭、中風、神經損傷，和切除術。即使用胰島素，糖尿病人的平均壽命比健康人少15-20年。
2型糖尿病通常出現在中年或中年后，特別影響那些超重的人。但是，在過去的幾年間，年輕成年人中2型糖尿病的發病率顯著地增加。在最近幾年中，2型糖尿病發作的年齡已從40歲降至30歲，那些肥胖人成為這種疾病新的更年輕的受害者。在2型糖尿病中，正常需要胰島素的身體細胞喪失了他們的敏感性并且不能對胰島素正常應答。通過由胰β細胞產生額外的胰島素可克服這種胰島素耐受達許多年。但是，最終，由于升高的血糖水平，β細胞不得不產生大量的過量胰島素，所以它們逐漸地衰竭。最后，過度工作的β細胞死亡以及胰島素分泌停止，同時帶來血糖升高至足夠的水平，只能通過外源性胰島素注射來控制它。高血壓和異常膽固醇水平通常伴隨2型糖尿病。這些狀況，與高血糖一起，增加了心臟病發作、中風和導致切除術的腿部循環阻滯的風險。治療2型糖尿病的藥物包括起減少從腸的葡萄糖吸收或者由肝臟的葡萄糖產生作用的一些藥物和直接刺激β細胞產生更多胰島素的其他藥物。但是，高水平葡萄糖對β細胞是毒性的，引起功能的進行性下降和細胞死亡。因此，許多2型糖尿病患者最終需要外源性胰島素。最近令人不安的發現是最終需要胰島素治療的2型糖尿病人的估計從20％增加至40％。
糖尿病的另一種形式被稱為年輕人成熟發作糖尿病(MODY)。這種形式的糖尿病是由于在胰島素產生細胞中的遺傳誤差，該誤差限制它加工通過特異性葡萄糖受體進入該這種細胞的葡萄糖的能力。MODY患者中的β細胞不能響應葡萄糖正確地產生胰島素，導致高血糖癥并且需要治療，該治療最終也需要胰島素注射。
目前可適用于胰島素依賴性糖尿病的醫學治療限于胰島素施用和用整個胰或胰部分的胰移植。到目前為止，胰島素治療比胰移植更流行，通常需要通過多次皮下注射，或通過連續皮下注射給予胰島素。常規胰島素治療涉及一天施用一次或兩次注射中效胰島素，添加或不添加小量常規胰島素。多次皮下胰島素注射技術涉及中效或長效胰島素的施用，然后在晚上和/或早晨作為單劑量在每次飯前一起給予常規胰島素。連續皮下胰島素輸注涉及小的電池驅動泵的應用，該泵通常通過27規格的蝶型針將胰島素皮下遞送至腹壁。用這種治療樣式，整個白天和晚上以基礎速率，程序化的飯前以增加速率連續地遞送胰島素。在這些方法的每一種中，需要患者頻繁地檢測他的或她的血糖水平并且必要時調整胰島素劑量。但是，控制血糖并不簡單。盡管嚴格注意維持健康飲食、運動方案和總是注射合適量的胰島素，但許多其它因素能不利地影響一個人的血糖控制，包括應激、激素變化、生長期、疾病或感染以及疲勞。患有1型糖尿病的人必須經常對生命威脅性低血糖和高血糖反應作好準備。胰島素依賴性糖尿病是一種生命威脅性疾病，它需要永不終止的警惕。
相比于胰島素施用，已知整個胰移植或胰部分的移植治愈了患者中的糖尿病。但是，由于需要終生的免疫抑制治療，通常僅在需要腎移植時進行胰移植，使單純胰移植成為相對少見的手術。雖然胰移植在幫助胰島素依賴性糖尿病人改善他們的血糖至他們不再需要胰島素注射和減少長期并發癥方面非常成功，但對整個胰移植來說有許多缺點。最重要地，進行胰移植涉及大手術并且需要終生應用免疫抑制藥物以防止身體的免疫系統破壞作為外來移植物的胰。不用這些藥物，幾天間胰就被破壞。服用這些免疫抑制藥物的風險是感染和腫瘤發病率的增加，二者各自都可以是生命威脅性的。手術操作中的內在風險，為防止移植排斥患者終生免疫抑制的需要以及與這種侵害性操作有關的發病率和死亡率，說明與整個胰移植用于治療糖尿病有關的嚴重缺點。因此，對胰島素注射和胰移植的替代將滿足巨大的公眾健康需要。
胰島移植是比整個胰移植更簡單(和更安全)得多的操作并且通過取代失去的β細胞能獲得相同效果。胰島素產生性β細胞存在于散布在整個胰中的朗格漢斯胰島，一個橫向位于胃后面的延長腺中。胰將1.5-3升含有用于消化的酶和酶原的堿液分泌到膽總管中。從組織學上看，胰由三類功能細胞組成a)將它們的酶分泌到腔中的外分泌細胞，b)將所述酶攜帶至腸的導管細胞，和c)將它們的激素分泌到血流中的內分泌細胞。所述外分泌部分被排列為許多含有稱為腺泡細胞的柱狀至錐狀上皮細胞的小腺(腺泡)。腺泡細胞占大約80％胰細胞并且負責將消化酶，例如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶、彈性蛋白酶和各種其它蛋白分泌到胰管系統中。所述胰管系統由相互聯系的導管的錯綜、支流樣網絡組成，這些導管排出每種分泌腺泡、向前排入更大的導管，最后排入主胰管。胰管系統的襯上皮細胞由導管細胞、占大約10％胰細胞的細胞型組成。導管細胞形態學從排出分泌腺泡的精細胚根中的立方型變化至主導管系統中高、柱狀粘液分泌型。
胰的內分泌部分由約一百萬個小內分泌腺，即散布在整個外分泌胰中的朗格漢斯胰島組成。雖然胰島細胞僅占大約2％胰細胞，但胰島細胞通過適當地分泌胰島素負責維持血糖水平并且是胰中最重要的細胞。按照所分泌的內分泌激素的類型分類，有七類胰島細胞。胰島β細胞產生胰島素。如上文所討論的，當沒有足夠的β細胞，或沒有足夠的胰島素分泌時，不管潛在的原因，導致糖尿病。將糖尿病患者中的胰島β細胞重構至足以恢復正常葡萄糖響應胰島素產生的數目，將解決與胰島素注射和大器官移植有關的問題。
在局部麻醉下，胰島移植門診操作允許病人在通過小導管將2-3毫升純胰島細胞的等效體輸送到肝臟時完全保留意識。操作后不久患者可以回家或者恢復常規活動。因此，移植胰島而不移植整個胰或其部分提供了許多繞開整個器官移植風險的方式。但是，缺乏適用于移植的胰島細胞在胰島細胞移植中仍然是一個未解決的問題。因為胰島僅構成整個胰的約2％，將它們與不產生胰島素的胰余下部分分離花費約6小時。雖然自動化的分離方法使從一個胰中分離足夠移植到一個患者中的胰島成為可能，但如與以前進行一次移植需要5或6個器官相反，對胰島的需要仍然超過從尸體收獲目前可獲得的器官供應。在美國，由于低器官供體率和不斷增加的胰島素依賴性糖尿病發生的結合，僅有大約6,000份胰適用于移植的胰或胰島細胞分離，同時每年被診斷為胰島素依賴性糖尿病的新病例數大約有35,000(Hering，B.J.& Ricordi，C.(1999)Graft 2，12-27)。
解決嚴重胰島細胞缺乏問題的一個方案是其它細胞的遺傳改造以產生胰島素。遺傳改造其它細胞以產生胰島素已經在肌肉和肝臟細胞中表現出一些成功，所述細胞能夠被修飾以產生胰島素的前體，胰島素原。但是，改進這些遺傳工程細胞中的胰島素分泌將仍然需要相當大的研究努力以及它們的低胰島素產生使它們還不適用于移植。另一種策略，異體移植，即從一個物種到另一個物種的器官(在糖尿病的情況下，或組織或細胞)移植要成為人移植胰島素注射的可靠替代面臨許多基本障礙。與異體移植有關的風險包括朊病毒例如引起瘋牛病(牛海綿形腦病或BSE)的那些的轉移，以及動物逆轉錄病毒例如PoERV(豬內源性逆轉錄病毒)的傳遞。另一個障礙是超急性排斥的問題。從進化角度看，移植中涉及的兩個物種相距越遠，當將一個物種的器官移植到另一個物種中時排斥過程越快和越嚴重并且需要更強和更大風險的免疫抑制。涉及遺傳改造動物胰島以使它們更不可能死于免疫系統攻擊和破壞的策略具有干預沉默人內源性逆轉錄病毒序列(HERVs)的風險，大量所述序列分布在整個人基因組中。通過重組這些序列的激活以及跟著發生的HERV蛋白表達可導致癌或免疫系統功能失調(Romano等，Stem Cells 2000；1819-39)。最后，動物和人器官和細胞在許多方面不同在它們的解剖或結構，激素的產生，過濾速率，酶和其它化學物質的分泌和吸收方面，在它們的對疾病的耐受，和預計壽命方面。
解決關于胰島細胞移植的組織可獲得性問題的另一種策略是胚胎干細胞或全能干細胞的分離。全能干細胞是能夠生長為身體中任何其它類型細胞的細胞，包括生長為整個生物。利用這類干細胞生長滿足糖尿病移植需要所需的胰島的問題在于它們從流產或體外受精的獲得具有固有的倫理和政治風險。而且，使全能干細胞分化為正常胰島素產生性細胞的技術從它們大量常規分化為將來所需要的胰島素產生性細胞看，該技術還不完美以及還不受控制。它們響應葡萄糖濃度(該濃度激發正常β細胞中的胰島素分泌)升高產生胰島素的能力，顯示它們不表現為正常胰島β細胞(Vogel，Science，2001 292615-617)。最后，為治療目的在患者中應用胚胎干細胞帶有腫瘤生長的內在危險。小鼠胚胎干細胞當被注射到成年小鼠中時是致瘤的，人胚胎干細胞當被注射到免疫機能不全的小鼠中時也證實相似的致瘤潛能。胚胎干細胞的潛在應用需要未分化干細胞與所想要的分化子代的精確分離，這是臨床應用防止潛在腫瘤形成的關鍵和還未完成的前提(Solter和Gearhart，Science 1999，2831468-1470)。
因此，存在對大量非致瘤人β細胞的重要未滿足的醫療需求以治療世界上數以百萬計的糖尿病患者。由輕易可得的原材料例如被轉化為臨床上有關干細胞的胰腺泡和導管細胞大規模生產人胰島素產生性β細胞的策略將克服目前方法所面臨的障礙。
根據從原代胰細胞開始，使它們轉化為胰島素產生性細胞調查現有技術，基于起始目的細胞，經驗歷史上分成三類胰島細胞、導管細胞或腺泡細胞。有許多從胰島細胞開始體外生長和擴展胰島細胞群的現有經驗。基本上所有這些方法分離純化的胰島并主要將它們置入貼壁培養系統，其中所述胰島失去它們的胰島表型，平鋪為單細胞以及生長至匯合。大多數體外誘導直接分化胰島細胞復制的努力表明有限的增殖胰島細胞群同時保持它們分化狀態的能力。匯集的這些研究的經驗在于，在大多數情況下，培養這些貼壁胰島細胞一段時間后，它們失去了它們的胰島表型并分化為更原始的細胞型，該細胞型不好表征但體外擴展一段時間。然而，因為培養物的失去，這些細胞不可避免地進入衰老。
現證明，使這些更原始的細胞再分化回分化的胰島非常困難(Nielson 92，Brelje 93，Bonner Weir 93，Otonkoski 91，Otonkoski94)。但是，在一種方法(Cornelius 97)中，允許將來自NOD小鼠的胰島培養物鋪板然后不更換培養基放置數周。不好鑒別的上皮細胞型的少數細胞是所有生存下來并可被生長出的細胞，它證實了增殖和在不同培養條件和試劑的狀態下被分化為胰島細胞的能力。所述的美國專利5,834,308和6,001,647，聲稱這些不好描述的上皮細胞為干細胞，該細胞需要這種培養以分離、生長和使它們發育為功能胰島素產生性細胞的方法。雖然用這種胰細胞貼壁培養的方法證實了干細胞的存在，但細胞饑餓至最小存活以及生長和分化為胰島細胞的技術是有問題的。這種方法需要胰島細胞的廣泛生長以達到生產用于糖尿病治療的大規模移植物所需要的水平。至今沒有證據表明，該方法可應用于人細胞以及可能擴大規模并同時保留臨床產品所需這些胰島細胞的分化表型。因此，我們轉向如本發明中所述的一種替代方法，它在以下方面顯著不同，它不從原代胰島細胞開始形成可被擴展和分化為胰島素產生性細胞的干細胞。取而代之的是，我們從非胰島素產生性胰細胞開始，使它們轉化為干細胞，該干細胞擴展然后分化為胰島細胞。
其它方法將胰島細胞置入MATRIGEL，膠原或瓊脂糖，而不是利用貼壁培養物(Kerr-Conte 96)。這導致膽囊管結構的形成，伴隨胰島組織的退化以及導管結構和導管表型的細胞的生長和分化。本申請的發明人也將分離的人胰島置入MATRIGEL并且證實導管細胞的誘導，所述導管細胞取代分化的胰島細胞群。不同的基質也能使胰島細胞轉化為導管細胞，特別是在HGF的存在下(Lefrbvre 98)，但還是不能產生胰島。雖然要求保護由這些結構形成的胰島細胞，但不清楚它們的來源是來自存在于起始細胞中的殘留胰島組織還是新的胰島素產生性細胞。導管結構和胰島細胞還可以從還沒有被特異鑒別的干細胞發育。
已被開發的下一種方法是從胰管細胞開始測定形成新胰島細胞的能力。它基于在被疾病或操作被誘導損傷的發育性胎兒胰和成人胰中的觀察，其中一個觀察到了芽出導管結構的新胰島的形成，它產生這樣一種觀念，即存在與導管結構有關的胰干細胞，該導管結構可被胎兒發育，或對成人胰中的胰島群的損傷或損失激活。
從來自小鼠和大鼠胰而不是來自人胰的分離和純化的導管結構開始(Fung，US 6,326,201)，單細胞開始體外形成單細胞層，該單細胞層主要為成纖維細胞和基質細胞的混合物。最終一些胰島素產生性細胞開始出現在這些貼壁培養物中，但在單細胞層中仍然是低水平。少數生長因子的添加最小化地增加單細胞層中的胰島素細胞數。但是，單細胞至被稱為非粘附細胞(NAC)的細胞群開始出現漂浮在含有胰島激素細胞型的單細胞層培養物上。在收獲前通過利用生長因子脈沖可增加這些NAC’s。他們還描述了pdx1陽性細胞，一些與作為β細胞所需的胰島素共染色，其它只具有pdx1染色，他們將其描述為祖細胞。上述NAC’s還能顯示出葡萄糖刺激的胰島素釋放。他們還能向單細胞層中添加不同的生長因子，誘導增殖和表型變化。他們描述了應用凝集素純化這些他們生產的祖細胞。因此，他們的結果支持來自大胰管的純化胰管細胞被去分化為祖細胞的能力，通過利用他們的特異方法，所述祖細胞能分化為胰島素產生性細胞。本發明在以下方面與Fung的工作顯著不同我們的起始胰細胞是人胰細胞而不是從純化的導管結構中分離的。事實上，他聲稱僅由胰管組織生產導管細胞，他將該胰管組織定義為包括主胰管、副胰管、背胰管和腹胰管。他將小頁間導管和閏管分別定義為他的胰管定義中不包括的單獨實體。我們的起始胰組織排除了他定義為胰管的組織，因為這些更大的結構和結構部分在細胞分離過程中被篩選出我們的制備物并且在原材料的組織切片中觀察不到。只有CK19染色陽性的胰管組織是位于腺泡細胞集合體內并且被腺泡細胞完全包圍的閏管。
因此，我們的起始胰細胞是腺泡細胞、被腺泡細胞包圍的閏管細胞和基質細胞的混合物，這些細胞是在從起始細胞混合物中純化胰島之后被收獲的，在胰起始細胞中余下非常少的胰島細胞。另外，我們的培養技術在不同的培養模式、多重培養基以及生長因子方面顯著不同，這些生長因子顯著不同，并被描述如下。
另一項工作是Bonner-Weir 2000的工作，該工作也從富含導管的胰組織開始，并陳述他們的方法實際上不對我們利用的起始胰細胞起作用。他們的培養方法還依賴于不是我們主要方法主題的MATRIGEL，以允許新細胞遷入和形成胰島素產生性細胞。
發展大量胰島素產生性細胞的第三種方法從腺泡細胞開始。用腺泡細胞的大多數早期工作是維持它在培養物中的表型以更好地了解這些細胞(Oliver 87，Brannon 88)。然后企圖了解胰癌細胞的來源，將注意轉到導管細胞和腺泡細胞明顯使表型變為一些類型導管細胞的能力，如所描述的。在膠原凝膠中培養腺泡細胞，Lisle & Losdon 1990描述了這種現象培養6-12天，腺泡細胞在這種培養物中失去它們的特異性細胞標記并獲得與導管細胞類似的標記(利用他們自己的單克隆抗體)，但后來隨著培養繼續，回復到它們的原始腺泡細胞標記。
再有，對胰癌感興趣的Hall & Limoine 1992，描述了腺泡細胞在塑料皿上的培養，由此細胞經過5-10天開始變化為開始表達導管細胞標記之一CK19，但到3周時死亡。Arias & Bendayan 1993在MATRIGEL上培養了大鼠和豚鼠腺泡細胞，維持了它們的腺泡表型，但到一周時損失細胞。向MATRIGEL中腺泡細胞的培養物中添加2％DMSO使表型變為導管樣細胞，該導管樣細胞在MATRIGEL內開始形成孢囊(cyst)和小管(tubule)。另外，當在孢囊結構中時，所述細胞開始表達CAII，被導管細胞用來釋放碳酸氫鹽和水的一種特異酶。蛋白質抑制劑阻止所述向導管樣表型的變化。看起來，MATRIGEL和DMSO的組合朝更原始階段向前推動了去分化的胰島細胞并進一步使它們分化為具有功能標記和形成三維結構能力的成熟導管細胞。提出了機制的問題是否涉及干細胞或是否這表示轉分化。
然后，Bouwens 1994研究了新生大鼠中潛在的導管細胞標記并描述，CK7是大胰管的標記而CK19在更小的導管，閏管，以及腺泡的泡心細胞中被表達。大鼠獨有的另一種標記，CK20，與CK19標記類似細胞。他還注意到，當增殖繼續進行時，一些鄰近擴展性胰島的細胞也表達CK19或CK20。檢查在平板上培養的小鼠胰細胞，Vila 1994證實，人腺泡細胞在開始時表達CK18，但隨時間，它們的表達變換為CK7和CK19，伴有淀粉酶水平下降。另外粘蛋白1表達和另一種導管細胞標記，CFTR(導管細胞的氯化物轉運蛋白的標記)升高。而且，提出了問題是否這種變化的機制表示轉分化或涉及干細胞。他們還發現，HGF和TGFa暴露都引起這些細胞增殖，這暗示干細胞可能引起胰島管惡性腫瘤以及可能在胰導管惡性腫瘤的發育中具有影響。但是，未觀察到胰島素產生。
Kerr-Conte 1996證實，將純化的人胰島置入MATRIGEL產生膽囊管樣結構，該結構含有小芽狀的胰島細胞。至于這些可明顯增殖的導管樣細胞的來源可能是什么，從這項工作中還不清楚，但沒有胰島細胞增殖的證據。而且，如前文所討論的，這表明這些可能使胰島細胞去分化為導管樣細胞，盡管分化的細胞不增殖，但這些細胞增殖的能力提高了這種可能性這些細胞代表干細胞。但是，未觀察到胰島素產生。
Bouwens 1998比較了轉分化的可能性與干細胞引起來自導管、腺泡或胰島分化細胞的去分化細胞增殖的干細胞作用。雖然由于表現出不同細胞類型表達的細胞標記，他贊成轉分化機制，但他的主要理由是因為這些細胞的確定性干細胞標記還沒有被發育，因此要特異性地鑒別它們是不可能的。然而，他承認，間接證據能輕易地提示干細胞的存在以及所述特異性標記僅僅是還沒有被完善。而且，在他的觀察中也未觀察到胰島素產生。
Kerr-Conte 2000和在美國專利申請(20020155598)中顯示，“多能胰干細胞”的存在是使終未分化的人胰細胞變為更原始細胞型的能力的主要原因，所述更原始細胞型具有擴展然后被分化為終未分化的另一種類型特異細胞的能力。作為這種干細胞的一種被認可的標記，她認為共表達CK19和pdx1的導管樣細胞(Fung類似地建議)是那些干細胞。她在貼壁培養物中培養了人腺泡細胞和導管細胞的混合物，所述培養物顯示淀粉酶的喪失，CK19的增加，以及pdx1在所得扁平為單細胞層的導管樣細胞中的表達增加。但是，她不能顯示向胰島素產生性細胞的轉化，卻能顯示神經內分泌細胞標記，嗜鉻粒蛋白A的新表達。事實上，她的pdx1和CK19染色細胞是胰島素產生性細胞的前體細胞的證據的聲稱與Fung和我們自己以及他們作為干細胞一致。但是她在她的專利申請中的聲稱，這些確實是胰島素產生性細胞，仍未被圖4和5中所表示的她自己的數據證明，這些數據沒有提供通過這些轉化的細胞增加胰島素產生的任何直接證據。因此，她證實了干細胞的存在但沒有證實它們向胰島素產生性細胞的分化。與本發明相比，這是一個顯著的區別，在本發明中我們清楚地證實了胰島素產生性細胞的產生。這兩個出版物中所描述的方法利用了胰島含量減少、在單細胞層中培養的單胰細胞，使腺泡表型轉變為被稱為導管前體的導管樣表型。根據她的定義，這些導管前體細胞具有被分化為胰島素產生性細胞的能力。她試圖通過將導管前體細胞置入MATRIGEL或膠原的基質再分化。她清楚地證實了導管前體細胞增殖的能力，但在專利申請中，沒有證實任何新胰島素產生性細胞的形成。
在她的技術與本發明中的技術之間存在顯著區別。該發明中的第一步，即使非胰島素產生性胰細胞的表型轉化為干細胞，除了利用幾種不同類型生長因子的貼壁培養以外，可在幾種不同的培養模式中利用幾種不同的培養基。如通過它經歷復制為中間、更原始細胞的能力證實，形成了干細胞，所述更原始的細胞攜帶至今被認可用來鑒別這種干細胞的獨特標記，這些標記是導管細胞標記如CK19和pdx1在復制細胞中的表達。她的第二步不產生胰島素產生性細胞。在我們的第二步中，然后通過不同的生長因子和條件組使這些干細胞分化為胰島素產生性細胞，在不同的細胞培養模式中再次證實。我們的發明還利用了比她的出版物和專利申請中所述的更復雜的生長和分化因子(表？？？)。下文還顯示了我們的新胰島素產生性細胞的正常組織學和功能。本發明中所用干細胞的定義是基于美國國家醫學圖書館(National Library of Medicine)的定義它是一種未終末分化的，經歷復制以及能分化為一種以上類型分化細胞的細胞。我們的實施例顯示，起始非胰島素產生性胰細胞在第一組培養條件下被轉化為復制并攜帶CK19和pdx1標記的干細胞。這些干細胞然后能被分化為激素產生性胰島細胞例如胰島素或胰高血糖素以及在如下文所述的各種分化條件下分化為導管結構。
定義這些定義的許多的一般出處是OMIM，National Center forBiotechnology Information，National Library of Medicine，National Institute of Health。
腺泡細胞—胰細胞，占胰的80％并產生許多不同的酶，包括淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和許多其它酶。通過它們的酶含量，通過特異的細胞角蛋白例如CK18，以及通過抗表面唾酸糖蛋白的凝集素可鑒別腺泡細胞。腺泡細胞形成胰中被稱為腺泡的球形結構單元，腺泡由極化的細胞組成，該極化的細胞將它們的酶產物釋放到位于每個腺泡中心的小、中央化的閏管中。在初級細胞檢查的任何時候，許多腺泡細胞含有兩個核。
導管細胞—胰細胞，占胰的10％，界定更大的小葉間導管和小葉內導管以及最小的閏管，從腺泡中排出胰酶。導管細胞還產生碳酸氫鹽和水以稀釋酶和從這些導管結構釋放到腸中后改變腸pH。通過細胞角蛋白亞型例如CK19和通過負責酸氫鹽產生的酶可鑒別導管細胞。
胰島細胞—內分泌細胞，占胰的2％并作為被稱為胰島的單獨的細胞集合體(aggregate)存在，含有制造不同激素的不同細胞型。為所述胰島集合體50-60％的β細胞制造允許葡萄糖進入身體大多數細胞的胰島素。為所述胰島30％的α細胞制造在禁食期間被釋放的胰高血糖素，以允許葡萄糖從肝臟的送遞以維持正常血糖。胰島細胞10％的δ細胞制造精細協調葡萄糖水平的促生長素抑制素。胰多肽產生性細胞(胰島細胞的5-10％)釋放它們的改變外分泌和胃腸功能的激素。除這些主要的胰島細胞型以外，還有其它制造許多其它激素的胰島細胞型，其它激素包括GIP、VIP、胃泌素、鈴蟾肽和其它。另外，所述胰島含有作為富含毛細管床網狀(fenestrated)的內皮，每種胰島細胞將它的激素產物釋放到毛細管床中。
胰細胞—含有腺泡、導管和胰島細胞類型以及支持細胞和血管細胞的來自人供體(或其它哺乳動物物種)的初級胰細胞。
胰島缺失(islet-depleted)的胰細胞—利用不連續或連續密度梯度從消化的胰細胞的懸液中分離胰島后余下的細胞。該種群主要由具有腺泡集合體內小百分比的閏管的腺泡細胞(＞90％)、血管和神經組織，以及殘留量的污染性胰島物質組成。
胰腺泡—將它們的酶產物排空到中央腺泡區的任何小球形腺泡細胞結構，中央腺泡區排空到閏胰管中。
閏管—來自胰的細管或腺泡的導管，它排到小葉內導管內。
小葉內導管—從閏管收集胰汁并排到小葉間導管內的導管。
小葉間導管—從小葉內導管收集胰汁并排到胰管內的導管。
胰管—導管中最大的，包括主胰管、副胰管、背胰管和腹胰管。
干細胞—未末端分化，能進行復制以及能分化為一種以上類型分化細胞的細胞。
細胞生長—是細胞DNA的復制，接著是可通過BrdU或含氚胸苷摻合或KI67證實的胞質分裂。
細胞擴展—用來定義細胞的數目，該細胞已進行細胞分裂并增加它們的數目和總量，而不是通過過度生長簡單地增大。
增殖—新部分或子代的快速和重復產生(如在通過快速連續的細胞分裂的細胞群中)。
細胞過度生長—用來定義增加它們細胞容積的增大細胞，而不是通過細胞分裂生長。
細胞周期—細胞生長周期。在細胞周期中的細胞離開靜止期(G0期)，復制它們的內容物并分裂成兩個。
分化—用來表明，細胞從先祖水平或更基礎或一般化功能至更特異功能。
轉分化—用來表明，細胞從確定功能水平轉變為另一種水平。
去分化—用來表明，細胞從確定功能水平至較不確定功能水平或基礎細胞。
全能的—能夠發育為完全生物或分化為任何它的細胞或組織。
多能的—1發育潛能不固定具有發育可塑性例如多能細胞或多能胚胎組織。2能夠影響一種以上的器官或組織。
生長因子(GF)—包括可誘導細胞復制的許多化合物。有一般的生長因子例如表皮生長因子(EGF)和血管內皮生長因子(VEGF)。還有它們的作用更特異的生長因子。(例如胰島素樣生長因子1(IGF1)對胰島的作用，或促紅細胞素對紅血細胞祖細胞的作用)。
分化因子(DF)—包括可誘導細胞型特異分化的許多化合物。用于胰島細胞、腺泡細胞和導管細胞的特異分化因子。用于腺泡細胞的例子是地塞米松。
去分化因子(DDF)—包括用于胰島細胞、腺泡細胞和導管細胞的許多因子，它們允許細胞失去分化的功能和轉變為譜系中更低的功能水平。
基質—用來定義水凝膠或可聚合物質，它們使細胞保持在適當的位置，用于在不同條件下的培養。這些包括MATRIGEL、膠原、藻酸鹽和其他。
組織培養瓶、皿或平板基層—用來定義特定類型的塑料或玻璃表面，該表面成形為用于生長細胞的組織培養瓶、培養皿或培養板。制備這些表面以便它們促進或阻礙貼壁或非貼壁細胞生長。
包被的培養瓶、皿或平板表面—被化合物薄層包被的細胞培養皿。
懸浮培養—在不存在任何來自化合物薄層或任何基質的支持下，將細胞懸浮在組織培養基中。
α-生育酚—幾種脂溶性維生素的任何一種，這些脂溶性維生素化學上是生育酚類，在各種脊椎動物的營養中是必需的，脊椎動物中它們的缺乏與不生育、肌肉中退化性改變或血管異常有關，特別存在于小麥胚芽、植物油、卵黃和綠葉蔬菜中或合成制造，以及主要在動物飼料中和作為抗氧化劑被使用。
脫鐵運鐵蛋白—由少突神經膠質細胞產生的蛋白質，它對細胞存活來說是必需的并且參與細胞分化。
心房肽—一種強排鈉利尿和血管舒張肽或衍生自共同前體并由心房分泌的不同大小低分子量肽的混合物。所有這些肽共同具有一段大約20個氨基酸的序列。
生物素—尤其存在于酵母、肝臟和卵黃中的維生素B復合體的無色晶體生長維生素C10H16N2O3S。
BSA—(牛)血清白蛋白，是一種占大約一半血清蛋白質的單體蛋白質。在體內，它在穩定細胞外液容積中起作用和起類固醇、脂肪酸和一些激素載體的作用。
C鈉尿肽(CNP)—一種22個氨基酸的肽，為排鈉利尿肽家族中的一員。它來自內皮和腎細胞源，具有選擇性心血管作用。
CAII-II型碳酸酐酶，被導管細胞用來產生碳酸氫鹽的酶，其被分泌到胰管中以中和由胃產生的十二指腸中的酸。
泛酸鈣—白色粉末狀鹽C18H32CaN2O10，合成制造并用作泛酸的來源。
肉堿—季銨化合物C7H15NO3，特別存在于脊椎動物肌肉中并參與脂肪酸跨線粒體膜的轉移。
過氧化氫酶—由具有高鐵血紅素基團的蛋白質復合物組成并催化過氧化氫分解成水和氧的酶。
CCK—縮膽囊素，是一種腦和腸肽。在腸中，它誘導胰酶釋放和膽囊收縮。它具有刺激胰島素分泌的能力。CCK肽以多種分子形式(例如，硫酸化CCK8、未硫酸化CCK8和CCK4)存在，各自由CCK基因產物的不同轉錄后加工產生。
CFTR—囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)，起氯離子通道的作用。已發現CFTR基因中的突變引起囊性纖維化。CFTR中的突變影響胰、腸腺、膽汁樹、支氣管腺和汗腺中的外分泌功能。
CGRPα，(降鈣素基因相關肽)—測定血液中激素降鈣素的量的試劑。
霍亂毒素B亞單位—霍亂毒素的無毒性亞單位B對蛋白質復合物是重要的，因為它允許蛋白質通過神經節苷脂GM1的五糖鏈與細胞表面結合。
CK19—細胞角蛋白19，是已知最小(40-kD)的酸性角蛋白，水不溶性中間絲家族中的一員。不同的細胞角蛋白可被用作鑒別某些類型上皮和上皮腫瘤的標記。CK19角蛋白存在于許多類型上皮細胞中，包括許多導管上皮和腺上皮。在胰中，它存在于導管上皮中，在內分泌和外分泌細胞中不存在。
CK19+細胞—在培養中的上皮細胞中，特別是，在來自胰組織的“中間的”或轉分化細胞中表達細胞角蛋白19。
皮質類固醇—各種腎皮質甾類(例如皮質酮、可的松和醛固酮)中的任何一種，基于它們主要生物活性，將它們分為糖皮質類固醇和鹽皮質類固醇。
皮質酮—腎皮質的無色晶體皮質類固醇C21H30O4，它在蛋白質和碳水化合物代謝中是重要的。
皮質酮(Reichstein’s物質H)—腎皮質的無色晶體皮質類固醇C21H30O4，它在蛋白質和碳水化合物代謝中是重要的。
C-肽—c-肽(“連接”肽)是一種在胰島素原轉化為成熟胰島素后釋放的短多肽。它的分子量是3,582Da。
Cyclodextran—2-羥基丙基-β-環糊精。一種促進疏水性物質溶解的組織培養基添加劑。
DIF-1/Differanisole A—分化-誘導因子-1(DIF-1)是分離自盤基網柄菌屬(Dictyostelium)的氯化己芬酮(hexaphenone)。DIF-1在多種類型哺乳動物腫瘤細胞中表現出抗腫瘤活性，盡管潛在的機制還不知道。Dictyostelium discoideum的形態發生素，DIF-1的結構與Differanisole A的結構密切相似，已從簡單真核生物，Chaetomium的代謝物中分離了Differanisole A，作為鼠和人未分化腫瘤細胞的分化誘導劑。
DL-α-生育酚乙酸酯—具有高維生素E效能的生育酚C29H50O2。
DMF(n-n-二甲基甲酰胺)—影響細胞分化。酸化速率的抑制可能是由于減少的代謝性酸產生。H+產生和轉運的改變促成它對細胞分化的作用。
DMSO—二甲基亞砜(CH3)2SO—它是一種已知誘導細胞分化的試劑，也是一種溶劑，還是一種用于冷凍活細胞的冷凍保護劑，還是一種用于治療間隙膀胱炎的抗炎劑。
DMSO(二甲基亞砜)—一種用于治療間隙膀胱炎的抗炎劑(CH3)2SO。
EGF—表皮生長因子，是一種用于許多外胚層和中胚層起源的培養細胞的強促有絲分裂因子，體內對特異細胞的分化具有顯著作用，成熟EGF是一種由53個氨基酸組成和分子量為約6,000的單鏈多肽。
內皮縮血管肽1—由21個氨基酸殘基組成的多種多肽中的任何一種，在不同細胞和組織中產生這些多肽，它們在調節血管舒縮活性、細胞增殖和激素產生中起作用，以及與血管疾病的發展有關聯。
乙醇胺—無色液體氨基醇C2H7NO，特別用作脂肪和油的溶劑，—也稱為單乙醇胺。
Exendin 4—GLP-1的長效類似物FACS—熒光激活的細胞分選術
FCS—胎牛血清。從未出生的牛回收的血清。
FGF—FGF超家族由23個已知成員組成，他們全部含有一個保守的120個氨基酸的區域。最初認為FGFs具有增殖活性；現在認為它們在發育、血管發生、血細胞形成和腫瘤發生中起作用。幾乎所有的FGFs同種型都具有激活其它同種型的受體的能力。這解釋了由不同FGF亞型產生的類似效果。
FGF2—成纖維細胞生長因子2(FGF-堿性的)是一種廣譜促有絲分裂、血管發生和神經營養因子，它在許多組織和細胞型中被低水平表達。現認為FGF2與許多生理和病理過程，包括肢發育、血管發生、創傷愈合和腫瘤生長有關聯。
半乳糖—一種光學活性糖C6H12O6，比葡萄糖溶解性更差和甜度更小，已知呈右旋、左旋和外消旋形式。
GLP-1—胰高血糖素樣肽1是一種衍生自前胰高血糖素原分子的30個氨基酸的肽。GLP-1增強葡萄糖分泌和合成。它使胰β細胞“有葡萄糖活性”并可適用于非胰島素依賴性糖尿病的治療。
GLP-2—GLP-2是一種33個氨基酸的胰高血糖素原衍生的肽。GLP-2通過對胃游動性與養分吸收、隱窩細胞增殖和凋亡和腸通透性的作用維持腸粘膜上皮細胞的完整性。
葡萄糖—一種光學活性糖C6H12O6，它具有醛式羰基。對所有植物和動物細胞而言，碳水化合物，特別是葡萄糖的斷裂是能量的主要來源。在糖尿病中，將葡萄糖轉運到身體細胞中的能力減小。血糖水平異常地高(高血糖)。升高的血糖可導致酮酸中毒，導致昏迷和死亡。較輕微的高血糖引起侵害眼、腎、神經和血管的長期并發癥。
谷胱甘肽—含有谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸各一個氨基酸殘基的肽C10H17N3O6S，它廣泛存在于植物和動物組織中，并在生物氧化-還原過程中和作為輔酶起非常重要的作用。
生長激素—生長激素(GH)由腺垂體腺合成。人生長激素的分子量為22,005并含有191個氨基酸殘基，具有2個二硫鍵。生長激素的主要生物作用是出生后的生長控制。它的影響主要由胰島素樣生長因子介導。
GRP(胃泌素釋放肽)—胃泌素釋放肽受體(GRP-R)能引起許多，但不是所有能表達該受體的細胞的增殖。
Hb9—同源異型框9是以序列特異方式結合DNA的蛋白質家族中的一員，這些蛋白質與發育和成體組織中基因表達的控制有關聯。
HGF—肝細胞生長因子(也稱為分散因子或hepatopoietin A)具有一系列靶，除上皮細胞例如肝細胞以外還包括內皮細胞和黑色素細胞。它影響多樣組織、介導胚胎中決定肝臟和肌肉發育的胎盤生長發育以及B-細胞增殖和生長。
HNF3α—肝細胞核因子3，α。叉頭類轉錄因子中的一員。HNF 3A和HNF3B二者都在內胚層起源的組織，即胃、腸、肝臟和肺中被表達。HNF3家族的所有成員以及HNF4G和HNF6在胰β細胞中被表達。
HNF6—在小鼠發育過程中，Hnf6在作為外分泌和內分泌胰細胞的前體的上皮細胞中被表達。在hnf6缺乏的胚胎中，外分泌胰好像正常但內分泌細胞分化受損。Neurogenin-3，一種測定內分泌細胞前體必需的轉錄因子的表達幾乎被廢除。在生命中的后期，內分泌細胞的數目增加但胰島的結構被干擾，以及β細胞缺乏葡萄糖轉運蛋白-2表達。成年hnf6缺乏小鼠為糖尿病鼠。這提示，hnf6控制前體階段胚胎胰內分泌分化并正向調節內分泌原基因ngn3。
HuSA—人血清白蛋白—參見BSA(牛血清白蛋白)。
IBMX—3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，抑制環AMP磷酸二酯酶的化合物，它引起β細胞釋放胰島素。
IGF1—胰島素樣生長因子-1。IGF1和IGF2二者都具有與胰島素原的顯著結構同源。
IGF2—胰島素樣生長因子-2。IGF1和IGF2二者都具有與胰島素原的顯著結構同源。
Johe’s N2—為支持多潛能CNS干細胞而配制的無血清培養基，補充有各種生長和分化因子。
KGF—角質細胞生長因子或FGF-7一種28kDa，單鏈分泌型糖蛋白，它具有限制于上皮細胞的靶特異性。已知表達FGF-7的成體細胞包括成纖維細胞、T細胞、平滑肌細胞和卵巢膜細胞。在胚胎中，在整個間充質的許多發育階段發現了KGF。
Ki67—一種細胞增殖標記。這種未知功能的蛋白質在細胞周期間的G1期被表達；它具有60-90分鐘的半衰期。
催乳激素—刺激乳汁產生的任何激素(例如催乳素)。
層粘連蛋白—一種糖蛋白，它是結締組織基底膜的組分并促進細胞粘著。
亮氨酸-腦啡肽—一種天然肽神經遞質。最初從豬腦中分離的天然鴉片五肽。亮氨酸-腦啡肽(YGGFL)和甲硫氨酸-腦啡肽(YGGFM)特別強地與d型鴉片受體結合。
亞油酸(Linoleic acid)—一種液體未飽和脂肪酸C18H32O2，它特別以半干油(如花生油)的形式存在并且對一些動物的營養是必需的—也被稱為亞油酸(linolic acid)。
亞麻酸—一種液體未飽和脂肪酸C18H30O2，它特別以干油(如亞麻子油)的形式存在并且對一些動物的營養是必需的。
甲硫氨酸-腦啡肽—一種天然肽神經遞質。最初從豬腦中分離的天然鴉片五肽。亮氨酸-腦啡肽(YGGFL)和甲硫氨酸-腦啡肽(YGGFM)特別強地與d型鴉片受體結合。
Muc-1-1型粘蛋白，通常由特殊胰管細胞分泌的粘蛋白的主要類型。
肌醇—一種生物活性肌醇，它不是光學活性的，是維生素B復合體的組分和親脂劑，它廣泛存在于植物、微生物和包括人的高等動物中—也被稱為肌醇(mesoinositol)。
N2—Johe’s N2培養基。
Neuro—神經基質培養基，一種中性細胞培養基。
NGF—神經生長因子，是一種12.5kDa，120個氨基酸殘基長的非糖基化多肽。它作為前肽原被合成；它被加工過的形式是120個氨基酸的片段。NGF的典型形式是25kDa，無二硫鍵連接的同型二聚體。已知神經生長因子調節交感神經元和某些感覺神經元的生長和分化。
煙酰胺—煙酰胺(煙酸酰胺)，一種苦味晶體堿性酰胺C6H6N2O，它是維生素B復合體的成員，由煙酸形成并在活生物中被轉化成煙酸，通常作為輔酶的組分天然存在，以及與煙酸類似地被應用。
PCNA+細胞—用抗增殖細胞核抗原標記的細胞。增殖細胞核抗原最初與細胞的增殖態相關。更近來的證據表明，PCNA可能還與DNA修復相關。
PDGF—血小板衍生生長因子。一種在凝血時由血小板釋放的因子，被顯示能促進各種類型細胞的生長。后來從血小板純化了這種因子并命名為血小板衍生生長因子(PDGF)。現已知PDGF由除血小板以外的許多細胞型產生并且發現它是幾乎所有間充質衍生細胞，即血液、肌肉、骨/軟骨，和結締組織細胞的促分裂原。
pdx-1—胰十二指腸同源框因子-1，PDX-1，是胰發育、胰島細胞分化和β細胞功能的維持所需要的。也被稱為胰島素促進因子-1(IPF1)或IDX1或促生長素抑制素轉錄因子-1(STF1)。PDX-1似乎是起外分泌和內分泌胰發育程序表達的主控開關的作用，如通過基因破壞研究揭示的，在該研究中所述基因的靶向缺失導致無胰表型。最初在外分泌和內分泌細胞中都表達PXDX-1；隨著胰形態發生繼續，它限制于一些導管細胞和胰島的β和δ細胞。PDX-1還在成體細胞中起作用，調節胰島素和促生長素抑制素基因。PDX1基因中的突變能引起胰發育不全，年輕人的成熟發作糖尿病和可能引起II型糖尿病。
胎盤催乳素—這種肽激素在結構上、免疫學上和功能上與垂體生長激素類似。它由胎盤合胞滋養層合成。
孕酮—雌甾類性激素C21H30O2，它由黃體分泌以形成植入的子宮內膜，以后在懷孕期間由胎盤分泌以防止發育性胚胎或胎兒的排斥，它以合成形式作為出生控制丸被用于治療月經紊亂和減輕一些不育癥的情況。
胰島素原—胰島素的前體。胰島素衍生自折疊、由兩個二硫鍵連接的單鏈前體。通過酶切除連接A鏈的氨基端與B鏈的羧基端的部分使胰島素原轉化成胰島素。
促乳素—一種與生長激素結構非常相似的生長因子。
PTF1—參見PDX-1。
PTHRP—甲狀旁腺相關蛋白。
腐胺—微毒的晶體尸堿C4H12N2，它是通過鳥氨酸的去羧基化而形成的，廣泛但小量存在于活物中，特別存在于腐敗的肉中。
Reg1—再生胰島衍生蛋白Laos，也被稱為胰石蛋白。
視黃酸(維生素A)—細胞分化的局部調節劑。它在發育肢中具有許多功能，在低等脊椎動物中調節肢再生中的關鍵事件。
乙酸視黃酯—維生素A的衍生物。
硒(亞硒酸)—一種化學上類似硫和碲的非金屬元素，當通過吃一些生長在土壤中的植物而被消化時，在許多動物中引起中毒，它在土壤中大量存在并且以同素異形形式存在，其中灰色穩定形式的導電性隨其照明的強度變化而變化，因而被用于電子裝置中。
Sonic Hedgehog(小鼠，重組的)—在包括腦、骨、皮膚、生殖腺和肺的許多細胞型的發育中起非常重要的作用。
大豆胰蛋白酶抑制劑(I-S型)—一種含有198個氨基酸殘基的高分子量蛋白質(大約22,500)。大豆胰蛋白酶抑制劑抑制蛋白水解活性但不抑制彈性水解(elastolytic)活性。
P物質—P物質是受傷害感受傳入的高強度刺激時在初級傳入-二級神經元突觸釋放的優勢神經肽。通過NK1受體的激活(參見傷害感受部分中的表)，P物質產生二級神經元緩慢、持續時間長的去極化。這導致對傷害感受器刺激的突觸后反應的增強，由此起傷害感受傳遞的強度編碼機制的作用。
超氧化物歧化酶(SOD)—一種含金屬的抗氧化酶，它潛在地減少在正常代謝細胞對氧和過氧化氫加工過程中形成的有害氧自由基。
TGFα和β—轉化生長因子(TGFs)是生物活性多肽，它們可逆地在培養細胞上賦予轉化表型。α-TGF表現出與表皮生長因子大約40％序列同源性。TGFβ是一種多功能肽，它在許多細胞型中控制增殖、分化和其它功能。TGFB與TGFA在誘導轉化中協同作用。它還起負自分泌生長因子的作用。TGFB激活和信號傳導的失調可導致細胞凋亡。許多細胞合成TGFB以及幾乎它們全部具有這種肽的特異受體。TGFB1、TGFB2和TGFB3全部通過相同受體信號系統發揮作用。
TGFβsRII(2型可溶解受體)—TGFβ調節細胞的生長和增殖，阻止許多細胞型的生長。TGF-β受體包括1型和2型亞單位，這兩種亞單位是絲氨酸-蘇氨酸激酶并且通過轉錄調節劑的SMAD家族進行信號傳導。TGF-β信號傳導中的缺陷，包括SMADs中的突變，與人類中的癌有關。
轉錄因子(TF)—轉錄因子與DNA中的特異調節序列結合并調控RNA聚合酶的活性。這是調節DNA中編碼的基因被復制或轉錄為信息RNA過程的關鍵步驟。正常情況下，許多不同轉錄因子的相互作用決定不同細胞型的特異表型。轉錄因子可以為基因表達的正或負調節劑。PDX1、neurogenin 3(ngn3)、Pax4、Pax6和其它是那些參與胰發育和分化的轉錄因子的實例。
運鐵蛋白—在體內能夠與鐵離子結合并轉運鐵的血漿中的β球蛋白。
三碘甲腺原氨酸—一種晶體含碘激素C15H12I3NO4，它是一種由甲狀腺素衍生的氨基酸并呈其可溶鈉鹽形式尤其被用于治療甲狀腺功能減退和代謝機能不全—也被稱為碘塞羅寧(liothyronine)，T3。
三碘甲腺原氨酸(T3)—一種晶體含碘激素C15H12I3NO4，它是一種由甲狀腺素衍生的氨基酸并呈其可溶鈉鹽形式尤其被用于治療甲狀腺功能減退和代謝機能不全。
Trolox(可溶性維生素E)—維生素E的細胞可透性、水可溶性衍生物，具有強抗氧化性質。防止大鼠胸腺細胞中的過硝酸鹽介導的氧化應激和細胞凋亡。
血管活性腸肽(VIP)—一種測定血清中VIP量的試劑。
VEGF—血管內皮生長因子—VEGF是一種肝素結合糖蛋白，它以45kDa的同型二聚體被分泌。是內皮細胞最重要的生長和存活因子之一。它在結構上與血小板衍生生長因子有關。VEGF誘導血管發生和內皮細胞增殖并且它在調節血管發生中起重要作用。許多類型細胞，但通常不是內皮細胞它們本身，分泌VEGF。
硫酸鋅—鋅是一種重要的痕量礦物質并且為細胞分裂、細胞生長和創傷愈合必需酶的活性所需。鋅還參與碳水化合物的代謝。胰β細胞具有高鋅含量。
發明概述在一種實施方案中，本發明涉及一種使分化的非激素產生胰細胞轉化為分化的激素產生細胞的方法，該方法包括步驟a)在一定條件下在第一細胞培養系統中用第一細胞培養基培養分化的非激素產生胰細胞，所述第一細胞培養基包含基礎培養基、有或無血清，以及有或無生長因子，在該條件下分化的非激素產生胰細胞轉化為干細胞；和b)在一定條件下在第二細胞培養系統中用第二細胞培養基培養所述干細胞，所述第二細胞培養基包含選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組包括下列化合物β動物纖維素(Betacellulin)、活化素A、BMP-2、TGF-β SRII、DMSO、SonicHedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；以及其中B組包括下列化合物活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態發生蛋白(BMP-2)、骨形態發生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽(caerulein)、降鈣素基因相關肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質酮(Reichstein’s物質H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內皮縮血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGFBB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細胞培養物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E，在此條件下，所述干細胞分化為激素產生細胞。
在一種優選的實施方案中，所述第二細胞培養基包括選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
在一種更優選的實施方案中，所述第二細胞培養基包括選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
在還一種更優選的實施方案中，所述第二細胞培養基包括選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
在還一種更優選的實施方案中，所述第二細胞培養基包括選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
在還一種更優選的實施方案中，所述第二細胞培養基包括選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
在一種實施方案中，本發明涉及一種將干細胞培養為分化的激素產生細胞的方法，該方法包括在細胞培養系統中用細胞培養基培養所述干細胞，其中所述干細胞被分化為激素產生性細胞以及其中所述培養基包括無血清的基礎培養基并且還包括選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組包括下列化合物β動物纖維素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；以及其中組B包括下列化合物活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態發生蛋白(BMP-2)、骨形態發生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質酮(Reichstein’s物質H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內皮縮血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細胞培養物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
在一種優選的實施方案中，所述細胞培養基包括選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
在還一種優選的實施方案中，所述細胞培養基包括選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
在還一種優選的實施方案中，所述細胞培養基包括選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
在還一種優選的實施方案中，所述細胞培養基包括選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
在還一種優選的實施方案中，所述細胞培養基包括選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
附圖簡要說明

圖1.從在組合陣列的生長和分化因子的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放。供體#2212、#2278和#3023。
圖2.從在組合陣列的生長和分化因子的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放的刺激指數。供體#2212、#2278和#3023。
圖3.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放。供體#2212圖4.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放的刺激指數。供體#2212圖5.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放。供體#2278圖6.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放的刺激指數。供體#2278圖7.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放。供體#3023圖8.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放的刺激指數。供體#3023圖9.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放。供體#3036圖10.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的胰島素釋放的刺激指數。供體#3036圖11.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養的細胞中的C-肽釋放的刺激指數。供體#3036圖12.從在前四種生長和分化因子組合(I-L)的存在下，在貼壁培養物中培養的細胞中的C-肽釋放。
圖13.在第二層30因子篩選中測定的，在前六種生長和分化因子組合的存在下，在貼壁培養物中培養的細胞的每孔胰島素原陽性細胞數。
本發明和優選實施方案詳述在一種實施方案中，本發明涉及一種由不產生激素的分化細胞型生產激素產生細胞的方法。優選地，所述分化細胞型是胰細胞。優選地，所述細胞是胰島缺失的胰細胞。更優選地，所述分化細胞型是非激素產生胰細胞。
在本發明一方面中產生的激素產生細胞優選產生由胰島細胞產生的激素的一種或多種。更優選地，所述激素產生細胞產生胰島素。
因此，本發明的優選方面是用于非激素產生胰細胞大規模擴展和非激素產生胰細胞大規模轉化成激素產生細胞的方法和組合物。優選地，所產生的激素是胰島素，但其它激素也被包含在本發明內，特別是來自胰島細胞的激素。
在另一種優選的實施方案中，本發明提供適用于使胰非激素產生胰細胞轉化為激素產生細胞的方法的組合物。
表5和6列出了可被添加到培養基中的因子，它包括潛在的生長因子和潛在的分化因子。為本公開目的，可相互交換使用術語“因子”、“組分”和“補充物”。
這些組分、因子和補充物包括但不限于活化素A、心房肽、β動物纖維素(Betacellulin)、骨形態發生蛋白(BMP-2)、骨形態發生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質酮(Reichstein’s物質H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內皮縮血管肽1、Exendin4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細胞培養物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
關于活化素A，優選的濃度是0.125-1.5ng/ml；還更優選的濃度是0.25-1ng/ml；還更優選的濃度是0.375-0.75ng/ml；還更優選的濃度是0.45-0.6ng/ml；和最優選的濃度是0.5ng/ml。
關于心房肽，優選的濃度是38.25-459ng/ml；還更優選的濃度是76.5-306ng/ml；還更優選的濃度是114.75-229.5ng/ml；還更優選的濃度是137.7-183.6ng/ml；和最優選的濃度是153ng/ml。
關于β動物纖維素，優選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優選的濃度是5ng/ml。
關于骨形態發生蛋白(BMP-2)，優選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優選的濃度是5ng/ml。
關于骨形態發生蛋白(BMP-4)，優選的濃度是0.125-1.5ng/ml；還更優選的濃度是0.25-1ng/ml；還更優選的濃度是0.375-0.75ng/ml；還更優選的濃度是0.45-0.6ng/ml；和最優選的濃度是0.5ng/ml。
關于C鈉尿肽(CNP)，優選的濃度是27.4625-329.55ng/ml；還更優選的濃度是54.925-219.7ng/ml；還更優選的濃度是82.3875-164.775ng/ml；還更優選的濃度是98.865-131.82ng/ml；和最優選的濃度是109.85ng/ml。
關于雨蛙肽，優選的濃度是7.5-90ng/ml；還更優選的濃度是15-60ng/ml；還更優選的濃度是22.5-45ng/ml；還更優選的濃度是27-36ng/ml；和最優選的濃度是30ng/ml。
關于降鈣素基因相關肽(CGRP-α)，優選的濃度是47.625-571.5ng/ml；還更優選的濃度是95.25-381ng/ml；還更優選的濃度是142.875-285.75ng/ml；還更優選的濃度是171.45-228.6ng/ml；和最優選的濃度是190.5ng/ml。
關于縮膽囊素(CCK8-酰胺)，優選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優選的濃度是25ng/ml。
關于縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)，優選的濃度是1.425-17.1ng/ml；還更優選的濃度是2.85-11.4ng/ml；還更優選的濃度是4.275-8.55ng/ml；還更優選的濃度是5.13-6.84ng/ml；和最優選的濃度是5.7ng/ml。
關于縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)，優選的濃度是3.125-37.5ng/ml；還更優選的濃度是6.25-25ng/ml；還更優選的濃度是9.375-18.75ng/ml；還更優選的濃度是11.25-15ng/ml；和最優選的濃度是12.5ng/ml。
關于皮質酮(Reichstein’s物質H)，優選的濃度是0.5-6ng/ml；還更優選的濃度是1-4ng/ml；還更優選的濃度是1.5-3ng/ml；還更優選的濃度是1.8-2.4ng/ml；和最優選的濃度是2ng/ml。
關于地塞米松，優選的濃度是0.5-6ng/ml；還更優選的濃度是1-4ng/ml；還更優選的濃度是1.5-3ng/ml；還更優選的濃度是1.8-2.4ng/ml；和最優選的濃度是2ng/ml。
關于DIF-1，優選的濃度是75-900ng/ml；還更優選的濃度是150-600ng/ml；還更優選的濃度是225-450ng/ml；還更優選的濃度是270-360ng/ml；和最優選的濃度是300ng/ml。
關于Differanisole A，優選的濃度是75-900ng/ml；還更優選的濃度是150-600ng/ml；還更優選的濃度是225-450ng/ml；還更優選的濃度是270-360ng/ml；和最優選的濃度是300ng/ml。
關于二甲亞砜(DMSO)，優選的濃度是0.25-3ng/ml；還更優選的濃度是0.5-2ng/ml；還更優選的濃度是0.75-1.5ng/ml；還更優選的濃度是0.9-1.2ng/ml；和最優選的濃度是1ng/ml。
關于EGF，優選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優選的濃度是5ng/ml。
關于內皮縮血管肽1，優選的濃度是125-1500ng/ml；還更優選的濃度是250-1000ng/ml；還更優選的濃度是375-750ng/ml；還更優選的濃度是450-600ng/ml；和最優選的濃度是500ng/ml。
關于Exendin 4，優選的濃度是5.25-63ng/ml；還更優選的濃度是10.5-42ng/ml；還更優選的濃度是15.75-31.5ng/ml；還更優選的濃度是18.9-25.2ng/ml；和最優選的濃度是21ng/ml。
關于FGF酸式，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于FGF2，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于FGF7，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于FGFb，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于胃泌素I，優選的濃度是0.008038-0.09645ng/ml；還更優選的濃度是0.016075-0.0643ng/ml；還更優選的濃度是0.024113-0.048225ng/ml；還更優選的濃度是0.028935-0.03858ng/ml；和最優選的濃度是0.03215ng/ml。
關于胃泌素釋放肽(GRP)，優選的濃度是35.75-429ng/ml；還更優選的濃度是71.5-286ng/ml；還更優選的濃度是107.25-214.5ng/ml；還更優選的濃度是128.7-171.6ng/ml；和最優選的濃度是143ng/ml。
關于胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，優選的濃度是8.25-99ng/ml；還更優選的濃度是16.5-66ng/ml；還更優選的濃度是24.75-49.5ng/ml；還更優選的濃度是29.7-39.6ng/ml；和最優選的濃度是33ng/ml。
關于葡萄糖，優選的濃度是270-3240ng/ml；還更優選的濃度是540-2160ng/ml；還更優選的濃度是810-1620ng/ml；還更優選的濃度是972-1296ng/ml；和最優選的濃度是1080ng/ml。
關于生長激素，優選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優選的濃度是25ng/ml。
關于肝細胞生長因子(HGF)，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于IGF-1，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于IGF-2，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于胰島素，優選的濃度是2375-28500ng/ml；還更優選的濃度是4750-19000ng/ml；還更優選的濃度是7125-14250ng/ml；還更優選的濃度是8550-11400ng/ml；和最優選的濃度是9500ng/ml。
關于KGF，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于催乳激素，優選的濃度是12.5-150ng/ml；還更優選的濃度是25-100ng/ml；還更優選的濃度是37.5-75ng/ml；還更優選的濃度是45-60ng/ml；和最優選的濃度是50ng/ml。
關于層粘連蛋白，優選的濃度是562.5-6750ng/ml；還更優選的濃度是1125-4500ng/ml；還更優選的濃度是1687.5-3375ng/ml；還更優選的濃度是2025-2700ng/ml；和最優選的濃度是2250ng/ml。
關于亮氨酸-腦啡肽，優選的濃度是0.75-9ng/ml；還更優選的濃度是1.5-6ng/ml；還更優選的濃度是2.25-4.5ng/ml；還更優選的濃度是2.7-3.6ng/ml；和最優選的濃度是3ng/ml。
關于白血病抑制因子(LIF)，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于甲硫氨酸-腦啡肽，優選的濃度是0.75-9ng/ml；還更優選的濃度是1.5-6ng/ml；還更優選的濃度是2.25-4.5ng/ml；還更優選的濃度是2.7-3.6ng/ml；和最優選的濃度是3ng/ml。
關于正丁酸，優選的濃度是1135-13620ng/ml；還更優選的濃度是2270-9080ng/ml；還更優選的濃度是3405-6810ng/ml；還更優選的濃度是4086-5448ng/ml；和最優選的濃度是4540ng/ml。
關于神經生長因子(β-NGF)，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于煙酰胺，優選的濃度是152500-1830000ng/ml；還更優選的濃度是305000-1220000ng/ml；還更優選的濃度是457500-915000ng/ml；還更優選的濃度是549000-732000ng/ml；和最優選的濃度是610000ng/ml。
關于n-n-二甲基甲酰胺(DMF)，優選的濃度是0.25-3×10-6％；還更優選的濃度是0.5-2×10-6％；還更優選的濃度是0.75-1.5×10-6％；還更優選的濃度是0.9-1.2×10-6％；和最優選的濃度是1×10-6％。
關于甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)，優選的濃度是51.5-618ng/ml；還更優選的濃度是103-412ng/ml；還更優選的濃度是154.5-309ng/ml；還更優選的濃度是185.4-247.2ng/ml；和最優選的濃度是206ng/ml。
關于PDGF AA+PDGF BB混合物，優選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優選的濃度是5ng/ml。
關于PIGF(胎盤GF)，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于孕酮，優選的濃度是0.75-9ng/ml；還更優選的濃度是1.5-6ng/ml；還更優選的濃度是2.25-4.5ng/ml；還更優選的濃度是2.7-3.6ng/ml；和最優選的濃度是3ng/ml。
關于促乳素，優選的濃度是0.3-3.6ng/ml；還更優選的濃度是0.6-2.4ng/ml；還更優選的濃度是0.9-1.8ng/ml；還更優選的濃度是1.08-1.44ng/ml；和最優選的濃度是1.2ng/ml。
關于腐胺二氫氯化物γ照射的細胞培養物，優選的濃度是0.025-0.3ng/ml；還更優選的濃度是0.05-0.2ng/ml；還更優選的濃度是0.075-0.15ng/ml；還更優選的濃度是0.09-0.12ng/ml；和最優選的濃度是0.1ng/ml。
關于REG1，優選的濃度是8.1375-97.65ng/ml；還更優選的濃度是16.275-65.1ng/ml；還更優選的濃度是24.4125-48.825ng/ml；還更優選的濃度是29.295-39.06ng/ml；和最優選的濃度是32.55ng/ml。
關于視黃酸，優選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優選的濃度是25ng/ml。
關于硒(亞硒酸)，優選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優選的濃度是25ng/ml。
關于Sonic Hedgehog，優選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優選的濃度是25ng/ml。
關于大豆胰蛋白酶抑制劑，優選的濃度是250-3000ng/ml；還更優選的濃度是500-2000ng/ml；還更優選的濃度是750-1500ng/ml；還更優選的濃度是900-1200ng/ml；和最優選的濃度是1000ng/ml。
關于P物質，優選的濃度是1250-15000ng/ml；還更優選的濃度是2500-10000ng/ml；還更優選的濃度是3750-7500ng/ml；還更優選的濃度是4500-6000ng/ml；和最優選的濃度是5000ng/ml。
關于超氧化物歧化酶(SOD)，優選的濃度是2.5-30IU/ml；還更優選的濃度是5-20IU/ml；還更優選的濃度是7.5-15IU/ml；還更優選的濃度是9-12IU/ml；和最優選的濃度是10IU/ml。
關于TGF-α，優選的濃度是0.25-3ng/ml；還更優選的濃度是0.5-2ng/ml；還更優選的濃度是0.75-1.5ng/ml；還更優選的濃度是0.9-1.2ng/ml；和最優選的濃度是1ng/ml。
關于TGF-βsRII，優選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優選的濃度是5ng/ml。
關于TGF-β1，優選的濃度是0.125-1.5ng/ml；還更優選的濃度是0.25-1ng/ml；還更優選的濃度是0.375-0.75ng/ml；還更優選的濃度是0.45-0.6ng/ml；和最優選的濃度是0.5ng/ml。
關于運鐵蛋白，優選的濃度是687.5-8250ng/ml；還更優選的濃度是1375-5500ng/ml；還更優選的濃度是2062.5-4125ng/ml；還更優選的濃度是2475-3300ng/ml；和最優選的濃度是2750ng/ml。
關于三碘甲腺原氨酸(T3)，優選的濃度是8.375-100.5ng/ml；還更優選的濃度是16.75-67ng/ml；還更優選的濃度是25.125-50.25ng/ml；還更優選的濃度是30.15-40.2ng/ml；和最優選的濃度是33.5ng/ml。
關于Trolox，優選的濃度是156.25-1875ng/ml；還更優選的濃度是312.5-1250ng/ml；還更優選的濃度是468.75-937.5ng/ml；還更優選的濃度是562.5-750ng/ml；和最優選的濃度是625ng/ml。
關于血管活性腸肽(VIP)，優選的濃度是16.625-199.5ng/ml；還更優選的濃度是33.25-133ng/ml；還更優選的濃度是49.875-99.75ng/ml；還更優選的濃度是59.85-79.8ng/ml；和最優選的濃度是66.5ng/ml。
關于VEGF，優選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優選的濃度是2.5ng/ml。
關于維生素A，優選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優選的濃度是25ng/ml。
關于可溶性維生素E，優選的濃度是156.25-1875ng/ml；還更優選的濃度是312.5-1250ng/ml；還更優選的濃度是468.75-937.5ng/ml；還更優選的濃度是562.5-750ng/ml；和最優選的濃度是625ng/ml。
在一種實施方案中，在細胞培養基中用懸浮、貼壁或基質的模式培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1任一欄中所列的化合物。更優選地，所述培養模式是MATRIGEL，膠原、水凝膠或其它可交聯凝膠基質。更優選地，所述培養模式是水凝膠基質。最優選地，所述培養模式是藻酸鹽基質。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，A欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少28種。最優選地，所述培養基含有表1，A欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，B欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少30種。更優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少31種。最優選地，所述培養基含有表1，B欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，C欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少27種。最優選地，所述培養基含有表1，C欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，D欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少23種。最優選地，所述培養基含有表1，D欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，E欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少30種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少31種。更優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少32種。最優選地，所述培養基含有表1，E欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，F欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少30種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少31種。更優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列因子和補充物的至少32種。最優選地，所述培養基含有表1，F欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，G欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少29種。最優選地，所述培養基含有表1，G欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表1，H欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少30種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少31種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少32種。更優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少33種。最優選地，所述培養基含有表1，H欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中用懸浮、貼壁或基質的模式培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表2任一欄中所列的化合物。更優選地，所述培養模式是貼壁。最優選地，所述培養模式是藻酸鹽貼壁。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表2，I欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少30種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少31種。更優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少32種。最優選地，所述培養基含有表2，I欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表2，J欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少30種。更優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少31種。最優選地，所述培養基含有表2，J欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表2，K欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少29種。更優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少30種。最優選地，所述培養基含有表2，K欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細胞培養基中培養干細胞，所述培養基含有或不含血清，含有表2，L欄中所列出的化合物。優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少一種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少三種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少四種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少五種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少六種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少七種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少八種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少九種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少十種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少11種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少12種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少13種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少14種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少15種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少16種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少17種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少18種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少19種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少20種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少21種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少22種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少23種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少24種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少25種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少26種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少27種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少28種。更優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少29種。最優選地，所述培養基含有表2，L欄中所列出的全部因子和補充物。
實施例實施例1胰細胞的順序培養先在藻酸鹽中，然后懸浮培養在含有1.6％藻酸鹽，補充有導致干細胞產生的10％FBS、胰島素、運鐵蛋白、硒和EGF的由DMEM混合物和Ham’s F12營養混合物組成的培養基中，培養胰細胞6-12天。通過解聚作用從藻酸鹽珠中收獲干細胞，然后在補充有120種組合排列中的60種生長和分化因子的組合的基礎培養基中，在超低貼壁板(Costar)中懸浮培養11天。在培養期結束時，細胞進行24小時基礎葡萄糖培養基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+IBMX的攻擊。收獲上清液并用ELISA進行胰島素含量分析。洗滌并溶解細胞然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。通過從在單獨用葡萄糖或葡萄糖與IBMX組合刺激后的孔中上清液中的胰島素含量中減去用基礎培養基刺激的孔中的胰島素含量，計算“胰島素差”。單獨用葡萄糖刺激后產生的上清液的胰島素差為0.007-0.9908ng/孔，而用葡萄糖和IBMX刺激后的為0.0098-1.1523ng/孔。如通過所述胰島素差計算的，許多孔產生低水平的胰島素。與在添加組合排列中的因子以前測定的對照孔和在沒有另外的生長和分化因子的基礎培養基中培養的對照孔相比，少數孔產生顯著量的胰島素。
這些數據表明，為了促進胰干細胞向胰島素產生細胞的分化，選擇特定的生長和分化因子可與不同的培養模式結合使用。
實施例2干細胞的順序培養先在藻酸鹽中，然后貼壁培養在含有1.6％藻酸鹽，補充有導致干細胞產生的10％FBS、胰島素、運鐵蛋白、硒和EGF的由DMEM混合物和Ham’s F12養分混合物組成的培養基中，培養胰細胞6-12天。通過解聚作用從藻酸鹽珠中收獲干細胞，然后在補充有120種組合排列中的60種生長因子的組合的基礎培養基中，在貼壁培養物中，在膠原包被板上培養8天。在培養期結束時，細胞進行24小時基礎葡萄糖培養基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+1mM IBMX的攻擊。收獲上清液并用ELISA進行胰島素含量分析。洗滌并溶解細胞然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。通過從在單獨用葡萄糖或葡萄糖與IBMX組合刺激后的孔中上清液中的胰島素含量中減去用基礎培養基刺激的孔中的胰島素含量，計算“胰島素差”。單獨用葡萄糖刺激后產生的上清液的胰島素差為0.0019-0.9714ng/孔，而用葡萄糖和IBMX刺激后的為0.0052-0.9524ng/孔。如通過所述胰島素差計算的，許多孔產生低水平的胰島素。與在添加組合排列中的因子以前測定的對照孔和在沒有另外的生長和分化因子的基礎培養基中培養的對照孔相比，少數孔產生顯著量的胰島素。
這些數據表明，為了促進胰干細胞向胰島素產生細胞的分化，選擇特定的生長和分化因子可與不同的培養模式結合使用。
實施例3干細胞在藻酸鹽培養物中的培養在含有1.6％藻酸鹽的由補充有導致干細胞產生的10％FBS、胰島素、運鐵蛋白、硒和EGF的DMEM混合物和Ham’s F12養分混合物組成的培養基中，培養胰細胞6-12天。通過解聚作用從藻酸鹽珠中收獲干細胞，然后將其重新投入1.2％藻酸鹽珠并在補充有120種組合排列中的60種生長因子組合的基礎培養基中培養另外7-11天。在培養期結束時，使細胞進行基礎葡萄糖培養基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+1mM IBMX的24小時攻擊。收獲上清液并用ELISA進行胰島素和C-肽含量分析。將藻酸鹽珠解聚，洗滌并溶解細胞，然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。
用由雙份孔檢查的結果，檢查了來自4個利用來自4個不同人供體材料的重復實驗的胰島素和C-肽數據。通過將由在葡萄糖或葡萄糖和IBMX存在下孵育誘導的胰島素或C-肽水平與由在基礎培養基中孵育的孔產生的胰島素或C-肽水平進行比較，鑒別了表現出胰島素釋放一致刺激的孔。對所有孔進行胰島素測試以測定哪個孔的生長和分化因子的組合產生顯著刺激的胰島素釋放圖1中描繪了這些測試的結果。這些點圖顯示了組合排列中每孔在基礎葡萄糖、高葡萄糖或高葡萄糖加IBMX刺激后的胰島素含量。這些中的許多顯示了具有非常少胰島素的孔，一些孔表現出高胰島素基礎水平以及高刺激和其它孔具有顯著刺激釋放。為有助于挑選最好的孔組合，以基礎除高葡萄糖或以基礎除IBMX計算刺激指數。這些結果顯示在圖2中。利用這些結果，這些清楚地表明了最好孔的多種侯選孔。為測定哪些是所選八種最好的孔，進行了幾種另外的分析。
檢查四個利用來自四個不同供體的細胞的不同實驗表明，在這些實驗中，存在供體與供體之間的變異。通過來自所有供體的分析測定了八種最好的孔。接著對這些個體供體的每一個進行了比較。圖3中顯示了供體#2212中來自基礎與從IBMX刺激的胰島素釋放。與第0天相比，除孔A、D和E以外，每個最好的孔都具有刺激胰島素的顯著增加。來自這個供體的所有孔在一定程度上具有高基礎胰島素。將結果用刺激指數表示(圖4)表明，最好的孔B、C、F、G和H具有最高應答。檢查供體#2278的結果，在第0、7和14天，來自基礎、高葡萄糖或IBMX的胰島素釋放顯示了與對照孔的顯著差別(圖5)。因為導致所有最好孔低刺激指數的不清楚的原因，這種供體最好的孔都具有非常高的基礎胰島素(圖6)。檢查供體#3023的結果，在第0、7和14天，將來自最好孔的從基礎、高葡萄糖或高葡萄糖與IBMX的胰島素釋放與對照進行了比較(圖7)。這個供體具有較低的基礎胰島素釋放，基本上所有最好的孔具有顯著刺激的胰島素釋放。計算刺激指數(圖8)，這些還表明了從最好孔的顯著釋放。但是，各自具有不同因子組合的最好孔在胰島素釋放方面有區別。一些表明IBMX釋放高于葡萄糖(所期望的)，而其它的表明葡萄糖高于葡萄糖加IBMX。這提示，這些孔中的不同組合導致胰島素產生細胞具有不同的能力。檢查第四個供體(#3036)的結果，基礎胰島素水平低，在葡萄糖或葡萄糖加IBMX攻擊后，具有顯著刺激的胰島素釋放(圖9)。回頭看圖2中的孔，這些最好的孔明顯好于大多數的響應，來自其它供體的也是這種情況。刺激指數的檢查(圖10)表明，與單獨葡萄糖相比，同葡萄糖加IBMX產生自這個供體的胰島素產生細胞給出更高的響應。如圖11中所示，以C-肽的刺激指數對這些上清液進行了C-肽含量分析。
總之，這些結果證實了含有不同生長和分化因子組合的孔之間的顯著差別以及供體與供體之間的變異。所選擇的最好孔不是最終答案，為了定義最佳組合需要另外的研究。
表1顯示了這些最好的幾個生長因子組合。
表1導致最好胰島素產生的培養基組成
實施例4在藻酸鹽中培養的細胞的培養基分析對在實施例3中由組合排列生產的由3個供體產生的上清液的胰島素含量的統計分析，導致影響胰島素產生和細胞生長的正和負效應物的清單，以及一致地好組合。
如通過這種組合系統所鑒別的，對干細胞向胰島素產生細胞的轉化具有潛在正作用的生長和分化因子，是β動物纖維素、BMP-2、雨蛙肽、硫酸化CCK8、霍亂毒素B亞單位、CNP、皮質酮、DMF、DMSO、EGF、Exendin 4、FGF-1、葡萄糖、GRP、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、甲硫氨酸-腦啡肽、NGFβ、煙酰胺、PDGF AA.BB、pTHRP、硒、SHH、P物質、TGFβsRII、運鐵蛋白、vEGF、VIP。
如通過這種組合系統所鑒別的，對干細胞向胰島素產生細胞的轉化具有潛在負作用的生長和分化因子，是活化素A、ANP、BMP-4、CCK8酰胺、CGRPα、地塞米松、DIF-1、內皮縮血管肽1、FGF-2、胃泌素I、GH、GLP-1、HGF、催乳激素、LIF、正丁酸、PIGF、孕酮、促乳素、腐胺、REG-1、視黃酸、SOD、大豆胰蛋白酶抑制劑、T3、TGFα、TGFβ、Trolox。
實施例5干細胞的順序培養先貼壁，然后貼壁培養在補充有120種組合排列的60種生長因子組合的基礎培養基中，在膠原包被板上培養干細胞另外8天，所述干細胞由在PCM中的膠原包被板上貼壁培養6-12天產生。或者在第一培養期后從膠原包被板取出細胞并將其在新鮮培養板上重新鋪板，然后在補充有120種組合排列的60種生長因子組合的基礎培養基中培養另外8天。在培養期結束時，使細胞進行基礎培養基或20mM葡萄糖的24小時攻擊。收獲上清并用ELISA進行胰島素或C-肽含量分析。洗滌并溶解細胞然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。
對來自3個獨立制備物，組成型產生胰島素或誘導產生胰島素葡萄糖刺激的孔的數據進行了統計分析并鑒別了“最好的孔”。表2中顯示了前四個“最好的孔”中生長因子的組成。
表2導致最好胰島素產生的培養基的組成
圖12表示由這種實驗產生的C-肽結果，表現出從顯示正響應的基礎、葡萄糖和葡萄糖加IBMX刺激的釋放。檢測收獲自個體孔樣品中的胰島素和DNA濃度的范圍，表明這是一種用于篩選生長和分化因子組合在胰細胞衍生的干細胞生長和分化中的作用的可行方法。
實施例6120種組合排列的進一步優化根據被誘導的胰島素產生或總胰島素產生，前面實施例中的數據鑒別了“最好的孔”。然后存在于“最好的培養基”中的成分可經歷第二層篩選以簡化和更好地定義誘導從干細胞產生的胰島素產生細胞最小數目的因子。或者，正效應物(實施例4)可經歷第二層篩選以獲得相同的結果。
在該實施例中，將培養基“L”的30種組分排列到60中因子排列中。將由在膠原上貼壁培養7天產生的干細胞置于篩選狀態中另外3、5或10天。在每個時間點，固定細胞并利用胰島素原特異抗體進行免疫組織化學處理。利用自動顯像分析，記數胰島素原陽性細胞的數目。圖13中顯示了第3、5和7天利用培養基M、N、O、P和Q的胰島素原陽性細胞的數目。這些培養基是第二層篩選中最有前途的。在所述圖中，將它們于與來自60種因子排列的最有前途培養基“L”進行比較。結論是，該實施例表明，可改善和改進上述60種因子組合排列。
實施例7基因芯片研究(DNA寡微陣列)基因芯片(BD Atlas陣列)的應用允許我們測量8,000個基因的相對表達水平(mRNA水平)。可利用該方法“指紋分析”或鑒別細胞型。分化胰細胞中mRNA表達的分析可能鑒別參與轉分化過程的基因。這種類型的比較將允許我們將起始胰細胞與中間干細胞，中間干細胞與激素產生細胞，以及這種最終產物與正常人胰島進行比較。
產生存在于人胰中不同細胞型的基因表達型的“指紋”的這類技術的利用將起兩個關鍵作用。也許這種分析最重要的作用將是清楚地定義在轉分化過程中產生的細胞的基因表達特征，從而在分子水平上定義這些細胞的獨有特征。這種分析的第二種作用將是提供改進我們研究方法的工具。所述分析將使我們了解胰島素產生表型如何被調節的機制。細胞表面標記的知識將有助于快速細胞鑒別以及提供從“不想要的”細胞中挑選出想要的細胞的手段。存在于這些細胞上的細胞信號分子和轉錄因子的信息將有助于生長因子的鑒別，其為要更有效地完成起始物質向能夠以與天然存在的β細胞相似的方式產生胰島素的細胞的轉化和擴展所需要的生長因子。雖然在公開可得的文獻和報道中可獲得一些關于胰細胞基因表達和表型的信息，但它們多數與非人類動物模型或胚胎發育有關。這些基因芯片研究對我們的申請和發現來說是特異的。
表3和4顯示了在PCM貼壁培養物中培養7天后比較的兩種胰島缺失、人胰細胞制備物的結果。借助標準方法分離RNA然后在比較微陣列中篩選。雖然在相同條件下培養上述兩種制備物，但判斷一種制備物是“優異的”，而判斷另一種是“好的”(以其后來產生C-肽的能力為標準)。在這些培養物中表達的大多數基因將是相同的，但將有一些被差異表達的基因。一些差異將是供體特異性的(例如MHC標記的差別)，而其它的可使我們了解決定“優異”與“好”結果的基因。
由各不同制備物表達的8,000個基因的檢查產生了一個大清單，它太長以至于不能包括。表3總結了那些我們認為可特別適用于我們的研究和獲得新胰島素產生細胞的目的基因。這些基因中的一些對分化過程是重要的，而其它是相關的并可能是成功干細胞形成的先兆。表4是大約90種“強表達”信息(信號強度為最大值的10-100％)的匯編。所述“強表達”信息特別適用于鑒別可被用于鑒別和分類不同細胞群體(腺泡與胰島或分化成功的與分化差的)的表面標記。另外，“強表達”基因的完全清單是很大的，因此只呈現了縮寫版本。
表3在“優異”制備物(2071)與“好”制備物(2078)中以比較不同水平表達的重要/有用基因一覽表。
表4培養7天后兩種細胞制備物中以高水平表達的潛在重要和/或有用基因一覽表。
權利要求
1.一種使分化的非激素產生胰細胞轉化為分化的激素產生細胞的方法，該方法包括a)在一定條件下，在第一細胞培養系統中用第一細胞培養基培養所述分化的非激素產生胰細胞，所述第一細胞培養基包含基礎培養基，有或無血清，以及有或無生長因子，在該條件下所述分化的非激素產生胰細胞轉化為干細胞；和b)在一定條件下，在第二細胞培養系統中用第二細胞培養基培養所述干細胞，在該條件下所述干細胞分化為激素產生細胞，所述第二細胞培養基包含選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組的化合物選自β動物纖維素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；其中B組的化合物選自活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態發生蛋白(BMP-2)、骨形態發生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質酮(Reichstein’s物質H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內皮縮血管肽1、Exendin 4、酸式FGF、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細胞培養物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
2.權利要求1的方法，其中所述第二細胞培養基包含選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
3.權利要求1的方法，其中所述第二細胞培養基包含選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
4.權利要求1的方法，其中所述第二細胞培養基包含選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
5.權利要求1的方法，其中所述第二細胞培養基包含選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
6.權利要求1的方法，其中所述第二細胞培養基包含選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
7.一種將干細胞培養為分化的激素產生細胞的方法，該方法包括在細胞培養系統中用細胞培養基培養所述干細胞，由此所述干細胞被分化為激素產生細胞，其中所述培養基包含無血清的基礎培養基和選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組的化合物選自β動物纖維素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；其中B組的化合物選自活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態發生蛋白(BMP-2)、骨形態發生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質酮(Reichstein’s物質H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內皮縮血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細胞培養物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
8.權利要求7的方法，其中所述細胞培養基包含選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
9.權利要求7的方法，其中所述細胞培養基包含選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
10.權利要求7的方法，其中所述細胞培養基包含選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
11.權利要求7的方法，其中所述細胞培養基包含選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
12.權利要求7的方法，其中所述細胞培養基包含選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
全文摘要
本發明公開了一種使分化的非激素產生胰細胞轉化為分化的激素產生細胞的方法。該方法包括兩個步驟第一，在使所述分化的非激素產生細胞轉化干細胞的條件下培養細胞；和第二，在為使干細胞分化為激素產生細胞而提供的條件下培養干細胞。本發明表明了呈現給所述干細胞以導致它們分化為激素產生細胞，特別是胰島素產生細胞的生長和分化因子。本發明提供了一種大量激素產生細胞例如胰島素產生細胞的新來源，這些細胞目前在治療性應用例如糖尿病的治療中不能得到。
文檔編號A61K35/12GK1668324SQ03817331
公開日2005年9月14日 申請日期2003年5月28日 優先權日2002年5月28日
發明者D·夏普, S·C·普里斯內爾, M·A·赫達蘭, P·D·哈蘭德, P·普里斯雷, M·克茨, C·麥克因特爾 申請人:諾沃塞爾公司, 貝克頓·迪金森公司