含有糖蛋白Ⅵ結構域的免疫粘附素的制作方法

專利名稱：含有糖蛋白Ⅵ結構域的免疫粘附素的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有特定糖蛋白VI結構域的免疫粘附素。本發明的免疫粘附素可以通過以二聚體形式提供免疫粘附素的特定方法獲得。本發明還涉及具有糖蛋白VI的免疫粘附素用于制備預防特定病人群體中動脈內血栓形成的藥物的用途。此外，本發明還涉及具有糖蛋白VI的免疫粘附素用于制備預防和治療動脈粥樣硬化發展(atheroprogression)的藥物的用途。本發明還涉及具有糖蛋白VI的免疫粘附素用于制備預防和治療糖尿病患者動脈粥樣硬化慢性發展的藥物的用途。本發明還涉及由GPVI介導的血小板與活性血管內損傷粘附的抑制劑的體外和體內篩選方法。
急性冠狀動脈或頸動脈綜合征是西方社會導致死亡的主要原因。即使是在從這樣的心血管事件中首次存活下來，許多病人仍然患有象血管內血栓形成這樣導致進一步心肌梗死或中風的危及生命的并發癥。
血管內血栓形成是血小板在血管內凝集的結果，血管內的血流由此可能被嚴重減弱或者甚至完全阻斷。特別地，動脈粥樣硬化斑塊的破壞引發一串級聯事件使動脈血栓形成和下游組織缺血達到高峰、導致象心肌梗死或缺血性中風這樣的疾病。血管損傷的第一個反應是循環血小板粘附于暴露的內皮下基質蛋白質，這啟動隨后的血小板凝集。內皮下層的大分子成分中原纖維狀膠原蛋白被視為最主要的血栓形成要素，因為它起著強血小板激活劑的作用并在體內和體外都支持血小板粘附(1-3)。
已被報道為推定的膠原蛋白受體的血小板膜蛋白可以分為那些通過與膠原蛋白結合型von Willebrand因子(vWf)而與膠原蛋白間接互作的血小板膜蛋白，包括GPIbα和整合蛋白αIIbβ3，和那些直接與膠原蛋白互作的血小板膜蛋白，包括GPVI、整合蛋白α2β1、和CD36(綜述于(2))。只是在最近，血小板糖蛋白VI(GPVI)已經被鑒定為主要的血小板膠原蛋白受體(4)。GPVI是一個60-65kDa的I型跨膜糖蛋白VI，它屬于免疫球蛋白超家族(5；6)。在人和小鼠血小板中GPVI與FcRγ-鏈在細胞表面形成復合物(7；8)。與GPVI結合的配體啟動Fc受體g鏈ITAM基序的酪氨酸磷酸化從而引發經Syk激酶、LAT、SLP-76、和磷脂酶C的下游信號(9-13)。GPVI缺陷的血小板在體外表現出喪失由膠原蛋白誘導的粘附和凝集(4；14)。同樣，功能阻斷型抗GPVI單克隆抗體會減弱由于對膠原蛋白或膠原蛋白相關蛋白CRP的應答而產生的離體血小板凝集，其中膠原蛋白相關肽CRP模擬了膠原蛋白的三螺旋(15；16)。
已知由血小板凝集而產生的并發癥問題可以通過施用血小板凝集抑制劑來進行解決。對于治療急性冠狀動脈綜合征，象ReoPro這樣的GP IIb/IIIa抑制劑顯著改善病人的情況。然而，最近的臨床試驗meta-分析揭示，盡管優化了抗血栓干涉但卻存有顯著的死亡或心肌梗死風險(Boersma E，Harrington RA，Moliterno DJ，White H，TherouxP，Van de Werf F，de Torbal A，Armstrong PW，Wallentin LC，Wilcox RG，Simes J，Califf RM，Topol EJ，Simoons ML.Plateletglycoprotein VI IIb/IIIa inhibitors in acute coronary syndromesa meta-analysis of all major randomised clinical trials.Lancet2002；359189-98)。這種治療方案的特別嚴重的副作用是出血并發癥。它們以2.4％在患者中出現，并且最嚴重的顱內出血形式以0.1％出現于被治療的患者中。已經揭示了幾種解釋次優效果和副作用的關于GP IIb/IIIa受體阻斷的機制缺陷(Dickfeld T，Ruf A，Pogatsa-Murray G，Muller I，Engelmann B，Taubitz W，Fischer J，Meier O，Gawaz M.Differential antiplatelet effects of variousglycoprotein IIb-IIIa antagonists.Thromb Res.2001；10153-64.Gawaz M，Neumann FJ，Schomig A.Evaluation of platelet membraneglycoprotein VIs in coronary artery diseaseconsequences fordiagnosis and therapy.Circulation.1999；99E1-E11)。
對血小板凝集的抑制導致對血小板凝集能力的總體損傷。相應地，不僅使不期望的血栓形成收到影響，還影響了血小板終止出血的一般能力。因此，施用血小板凝集抑制劑固有地會導致象出血這樣的可能進一步引起危及生命的并發癥的嚴重副作用。這些副作用對于糖尿病患者當然更成問題。
糖尿病是動脈粥樣硬化的主要風險因子。因此糖尿病在表現急性血管特別是冠狀動脈綜合征的患者中構成了一種增長的危及生命的并發癥、以及額外發病率的風險。伴有不穩定心絞痛的糖尿病患者比非糖尿病患者呈現更高的潰瘍斑和冠狀動脈內血栓形成發生率。(Biondo-Zoccai GGL；Abbate A；Liuzzo G，Biasucci LAtherothrombosis，inflammation，and diabetes.J Am Coll Cardiol41；1071-1077；2003)。
人們日益認識到血小板是動脈粥樣硬化進展的主要開關。升高的動脈粥樣硬化進展與升高的血小板應答及糖尿病之間的關聯迄今仍是未解決的問題。糖尿病人患急性血管并發癥不依賴于動脈粥樣硬化的程度，這一程度預示糖尿病急性血管并發癥和動脈粥樣硬化急性血管并發癥發展過程中血小板活化的幾種不同的目前未知的機制。
因此，本發明的問題是提供一種用于避免急性冠狀動脈或頸動脈綜合征后危及生命的并發癥并保持血液止血潛能的藥物。
本發明進一步的問題是，提供一種用于治療或預防動脈粥樣硬化進展的藥物。
本發明進一步的問題還是提供一種用于治療糖尿病、特別是糖尿病相關并發癥的藥物。
本發明進一步的問題是提供一種體外和體內篩選血小板與血管內損傷粘附的抑制劑的方法。
發明概述上述問題按照權利要求來解決。本發明提供第一項體內直接證據，該證據表明在血管損傷后的生理剪切壓力下GPVI實際上是血小板募集過程中嚴格必需的。在不同的內皮剝落小鼠模型中，GPVI抑制或缺失都實質上廢除了血小板-血管壁互作和血小板凝集，據此將GPVI鑒定為動脈血栓形成的主要決定因素。這預示著，對GPVI-配體互作的抑制預防動脈粥樣硬化過程中的動脈血栓形成。本發明利用GPVI的一種特異可溶形式的抗血栓形成潛力。更確切地，提供了一種融合蛋白，它含有GPVI細胞外結構域和人N-末端Fc標簽。人GPVI的這一可溶形式以高親和力與膠原蛋白特異結合，使血小板在體外與固定的膠原蛋白、在體內與血管損傷位點的粘附減弱。因此，本發明是以以下認識為基礎的動脈內血栓形成成為急性臨床并發癥的前提條件是血小板與血管壁中活性損傷的初始粘附。本發明人已經認識到，血小板經糖蛋白VI(GPVI)受體在血管壁損傷處與內皮下基質膠原蛋白的粘附是血栓形成的關鍵事件。因此，本發明融合蛋白對血小板粘附于內皮下基質膠原蛋白的抑制不僅能防止血小板粘附于活性損傷，而且能防止血小板在活性損傷處凝集。因此，可以有效地避免血管內血栓形成而不破壞血小板的一般凝集能力。
令人驚訝的是，根據內皮下層不同成分是象層粘連蛋白、纖連蛋白、von Willebrand因子(vWf)和膠原蛋白這樣的血小板配體或激活劑這一事實，可以通過對單個血小板受體的抑制來抑制血栓形成這一復雜過程。此外，血小板上的大量受體已被體外考察鑒定，但是在體內影響血小板粘附于損傷的相關受體或受體組合在之前是未知的。
本發明還基于這一認識GPVI是動脈粥樣硬化發展過程中血小板活性的主要介導物(meditor)。已經證實，對由膠原蛋白介導的GPVI活化的抑制會削弱易患動脈粥樣硬化的Apo e-/-小鼠中的動脈粥樣硬化進程(參見附圖16)。此外還證實，也傾向于患進行性動脈粥樣硬化和增強的血栓形成并發癥的糖尿病患者的血小板顯示GPVI-共受體Fc-受體的表達增強。因此，糖尿病患者的血小板或許在由于斑塊破裂或內皮脫落而暴露于內皮下血管層的膠原蛋白的地方顯示出對膠原蛋白刺激的增強應答，從而導致臨床觀察到不穩定心絞痛中增強的血栓形成并發癥。
本發明因此提供對患者，尤其是糖尿病患者中動脈粥樣硬化發展的治療。此外，本發明提供治療特別是糖尿病患者中象血管內血栓形成這樣的急性血管并發癥的藥物。免疫粘附素Fc-GPVI-nt是一種減弱動脈粥樣硬化進程以及減弱血小板經GPVI受體對膠原蛋白的增強應答的潛在治療工具。因此，Fc-GPVI-nt是一種用于治療動脈粥樣硬化且特別是治療糖尿病動脈粥樣硬化并發癥的藥物。
該發明提供了一種含有下列片段的融合蛋白(Fc-GPVI-nt)(a)糖蛋白VI(GPVI)細胞外結構域或其具有膠原蛋白結合功能的變體，和(b)免疫球蛋白的Fc結構域或其功能保守性部分。
該融合蛋白的特征在于附圖7所示的氨基酸序列。根據本發明的融合蛋白獲自或可以獲自以下方法(a)感染后2天收集已用編碼附圖7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela細胞培養物上清液；
(b)離心(3800g，30分鐘，4℃)步驟(a)的上清液；(c)過濾(0.45μm)步驟(b)的上清液；(d)加入一倍體積的硫酸銨使免疫粘附素沉淀，并于4℃攪拌過夜；(e)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質成團，(f)將步驟(e)中的成團蛋白質溶于0.1倍體積的PBS，并在PBS中4℃透析過夜；(g)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質溶液澄清；(h)將步驟(g)中的溶液上載至蛋白質A柱(HiTrapTM蛋白質AHP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用結合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0，0.02％ NaN3)洗滌柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脫緩沖液(100mM甘氨酸pH2.7)將級分洗脫；(l)用中和緩沖液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％ NaN3)中和洗脫的級分；(m)合并級分；(n)4℃下將合并的級分在PBS中透析過夜，(o)將透析產物等分并于-20℃冷凍。
在上述條件下，融合蛋白以共價連接的二聚體形式獲得，在非還原條件下用SDS-PAGE測定該二聚體的分子質量為160kDa。推測通過與GPVI片段相鄰的特定結構域中的鏈間半胱氨酸二硫鍵來形成融合蛋白的二聚化，GPVI片段的氨基酸序列如附圖7所示。融合蛋白的二聚體性質至少依賴在Fc部分和附圖7所含的GPVI部分間的特定區域的存在以及制備方法。實踐中將單體融合蛋白用作治療性試劑是沒有用的，因為為獲得相似的效果，與二聚體融合蛋白相比的單體融合蛋白的內部結合特性要求其以比二聚體融合蛋白高出約一個數量級的量施用，參見附圖9(e)。然而，從治療和經濟角度考慮，施用大量蛋白質是有問題的，尤其是對于慢性疾病的治療。
本發明的融合蛋白是一種免疫粘附素。它具有一個片段(a)，該片段具有血小板GPVI細胞外結構域的功能。所述GPVI可以是哺乳動物GPVI，優選為人GPVI。所述功能優選為與GPVI配體膠原蛋白結合。GPVI的整個細胞外結構域或其任何片段可用于所述的融合蛋白，前提是所述片段能與膠原蛋白結合。融合蛋白變體可以在所述融合蛋白的一或數個氨基酸處有修飾(例如糖基化、磷酸化、乙酰化、形成二硫鍵、生物素化、象熒光素標記這樣的顯色標記，等)。優選，變體是所述融合蛋白的同源物。用本文公開的方法可以容易地測試工程化變體與膠原蛋白結合的能力。最優選，將SEQ ID No1殘基1至267的多肽用作片段(a)。然而，也可以通過交換所選擇的氨基酸或通過截短所述序列而不剝奪所述功能來修飾所述多肽。
所述融合蛋白的片段(b)至少滿足以下目的從產生所述融合蛋白的細胞分泌融合蛋白、以能結合膠原蛋白的形式提供片段(例如折疊或凝集狀態)、親和純化所述融合蛋白、用抗體識別所述融合蛋白、當融合蛋白用作藥物時為其提供有利的特性。令人驚奇且最為重要的是，片段(b)允許所述融合蛋白在哺乳動物細胞中優選在人細胞中生產，并允許其以活性形式分泌至上清液中，即以能與膠原蛋白結合的形式。片段(b)最優選為免疫球蛋白的Fc結構域。適宜的免疫球蛋白是IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。IgG和IgA為優選。IgG為最優選。所述Fc結構域可以是整個Fc結構域或其功能保守性變體。如果一個Fc變體保留有至少一種上述所列的片段(b)的功能，那么它就是功能保守性的。最優選的是SEQ ID No.1殘基273至504的多肽。然而，這樣的多肽可以經修飾或截短而不使其喪失功能，這是一般常識。
本發明融合蛋白的片段(a)和(b)可通過接頭連接。接頭可由約1至100，優選1至10個氨基酸殘基組成。
最優選，所述融合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID No.1(本文稱作Fc-GPVI-nt)。
本發明進一步提供編碼本發明融合蛋白的核酸序列。所述核酸序列含有選自下組的序列(i)SEQ ID No2的核酸序列或其根據簡并密碼編碼相同多肽的變體；(ii)編碼與由SEQ ID No2編碼的多肽具有至少70％同源性的多肽的核酸序列；(iii)編碼至少300個氨基酸的多肽的核酸，其中具有至少100個氨基酸的片段其功能是結合膠原蛋白、具有至少200個氨基酸的片段其功能是作為Fc結構域；和(iv)編碼權利要求1的融合蛋白的核酸序列。
本發明進一步提供預防或治療動脈內血栓形成的藥物，該藥物包含含有糖蛋白VI細胞外結構域或其具有膠原蛋白結合功能的變體的蛋白質。優選地，所述蛋白質是本發明所述的融合蛋白質。如果所述藥物含有所述融合蛋白，所述藥物優選進一步包含適宜的載體。所述藥物優選經非腸道途徑、更優選經靜脈內給藥。正如已由本發明人所發現的，GPVI-膠原蛋白互作是血小板與受傷血管壁粘附的主要因素。本發明的融合蛋白能通過阻斷暴露于血液的膠原蛋白而不抑制血小板的其它功能，來阻止血小板在血管系統中與所述暴露于血液的膠原蛋白結合。
作為選擇，本發明的藥物可以包含編碼本發明所述融合蛋白的核酸以用于基因治療。所述核酸優選包含上述定義的核酸序列。所述核酸優選包含在載體中，優選為病毒載體。可以將編碼所述融合蛋白的載體導入病人的血管系統中，由此可以用其轉導例如內皮細胞。適宜用于基因治療的載體是本領域已知的。它們可以基于例如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒、或單純皰疹病毒。根據病人的需要，可以修飾載體使轉導細胞長期或短期表達融合蛋白。融合蛋白的Fc結構域使得融合蛋白由被轉導細胞能以活性形式分泌。
本發明進一步提供體外篩選糖蛋白VI與膠原蛋白結合的抑制劑的方法，包括(i)提供暴露膠原蛋白的表面；(ii)在預先確定的允許所述融合蛋白與所述表面結合的條件下，將所述表面的一部分與本發明的融合蛋白接觸；(iii)在與步驟(ii)相同的條件下將所述表面的另一部分與所述融合蛋白在測試化合物存在下進行接觸；(iv)確定在所述測試化合物不存在和存在的情況下，與所述表面結合的所述融合蛋白的量；(v)如果與所述測試化合物不存在時相比該測試化合物存在時所述融合蛋白與所述表面的結合更少，則將該測試化合物鑒定為抑制劑；和(vi)可選地測定所述抑制劑對血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
步驟(i)的表面可以是用膠原蛋白包被的玻璃或塑料表面。所述表面的部分可以是滴定板或多孔板的板孔。暴露膠原蛋白的表面可以容易地如實施例中所述通過用膠原蛋白包被玻璃或塑料表面來制備。膠原蛋白包被的板或多孔板也可從商業獲得。在步驟(ii)中，將預先確定量的所述融合蛋白與所述表面的第一個部分在允許融合蛋白與該表面結合的條件(特別是pH、緩沖液、溫度)下接觸。優選地，根據允許與所述表面的優化結合來選擇條件。在步驟(iii)中，在預先確定量或濃度的測試化合物存在下，將表面另一部分與和步驟(ii)中相同量的融合蛋白、以及在相同條件下進行接觸。可以使用測試化合物的不只一種量或濃度。步驟(iv)的所述確定優選包括，洗滌根據步驟(ii)和(iii)進行接觸的所述表面部分一或多次以去除未結合的融合蛋白。之后可以通過例如測定與融合蛋白結合的熒光標記(例如熒光素、羅丹明，等)的熒光來確定已結合的融合蛋白的量。作為選擇，已結合的融合蛋白可以用針對所述融合蛋白的抗體檢測，其中所述抗體可以用熒光標記。作為選擇，抗體可以用能產生顯色或發光反應產物的酶(例如堿性磷酸酶、過氧化物酶、螢光素酶)標記。最方便的是，該融合蛋白可以用顯色標記進行標記，這樣與膠原蛋白結合后該標記會改變其光吸收或放射特征。在這種實施方式中，不需要洗去未結合的融合蛋白。
在步驟(v)中，可以鑒定抑制劑。已鑒定的抑制劑或其已選擇部分可用作改進該抑制劑的引導結構。這樣的引導結構可用化學方法進行修飾，經修飾的結構可再用該篩選方法進行測試。具有改進特性的經修飾結構或測試化合物可進行選擇或可選地進一步經化學方法改變。以這種方式，可以實現對抑制劑的重復改進。用本發明篩選方法鑒定的抑制劑有用作對抗血栓形成和動脈粥樣硬化的潛在藥物的價值。
在步驟(vi)中，所述抑制劑對血小板凝集和/或血小板激活的功能效應可根據下述方法進行測定，例如活體熒光顯微術。
依賴于所測試的測試化合物數量，可以小、中或大規模實施所述篩選方法。如果要測試許多測試化合物(例如化合物文庫)，篩選方法優選采用高通量篩選形式(HTS)。對于HTS，優選用熒光標記的融合蛋白檢測已結合的融合蛋白量。
也可用上述篩選方法篩選抑制GPVI與膠原蛋白結合的抗體，特別是對抗GPVI細胞外結構域的抗體。這樣的抗體篩選可以與例如產生單克隆抗體的雜交瘤技術或其它任一產生抗體的技術相結合，由此優選將本發明的融合蛋白用作抗原。雜交瘤細胞上清液中的抗體可用作所述測試化合物。
本發明進一步提供用本發明的融合蛋白作為免疫原產生的抗體。此外，提供了針對GPVI的抗體用于制備預防血小板在活性動脈粥樣硬化損傷中粘附于暴露的內皮下基質膠原蛋白而作為急性冠狀動脈或頸動脈綜合征啟動開關的藥物的用途。這樣的適應癥可以根據下述進行診斷。優選地，病人進一步以患有不穩定動脈粥樣硬化斑塊為特征。所述藥物優選經非腸道途徑給藥。優選地，所述抗體為單克隆抗體。這樣的抗體可以例如用本發明的融合蛋白作為免疫原進行制備。
此外，本發明提供體外篩選由GPVI介導的血小板與活性血管內損傷粘附的抑制劑的方法，所述方法包括步驟(i)提供暴露膠原蛋白的表面；(ii)在預先確定的允許血小板粘附于膠原蛋白的條件下，將所述表面與血小板接觸；(iii)在測試化合物存在下測定血小板的粘附；和(iv)如果與所述測試化合物不存在時相比該測試化合物存在時血小板與膠原蛋白的粘附更少，則將該測試化合物鑒定為GPVI的抑制劑；和(v)可選地測定所述抑制劑對血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
該方法中使用的血小板可以根據已知的方法分離(參見實施例7)。它們可以分離自象小鼠、大鼠、兔、豬等這樣的哺乳動物血液。優選地，它們分離自人。所述血小板可以用例如象熒光素這樣的熒光染料標記。血小板對所述表面的粘附可以根據實施例中描述的進行測定。該方法的測試化合物可以是有機小分子。優選地，該方法的測試化合物是在上述篩選GPVI與膠原蛋白結合的抑制劑的方法中鑒定的抑制劑。以這種方式，可以顯著減少將要用血小板篩選的化合物數量，而且可以提高發現對血小板有功能的抑制劑的可能性。
也提供了體內篩選由GPVI介導的血小板與活性血管內損傷粘附的抑制劑的方法，所述方法包括步驟(i)提供活性血管內損傷的體內模型；(ii)在測試化合物存在下測定血小板與活性血管內損傷的粘附，和(iii)如果與測試化合物不存在時相比在測試化合物存在下血小板與活性血管內損傷的粘附更少，則將該測試化合物鑒定為GPVI的抑制劑。
所述體內模型可以是適宜的哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔，等。優選為小鼠。在測試化合物存在和不存在下測定血小板與活性血管內損傷的粘附之前，將優選已用熒光標記的血小板導入模型。所述測試化合物優選已經在上述體外篩選方法之一中鑒定為抑制劑。用實施例8中所述的體內熒光顯微術實施血小板與活性血管內損傷的粘附。
本發明還提供融合蛋白用于制備治療糖尿病的藥物的用途，該融合蛋白包括(a)糖蛋白VI細胞外結構域或其具有膠原蛋白結合功能的變體，和(b)免疫球蛋白的Fc結構域或其功能保守性部分。
用于制備治療糖尿病的藥物的融合蛋白優選為二聚體融合蛋白。為提供二聚化的可能性，在本發明的融合蛋白結構域(a)和(b)間必需存在鉸鏈區。該鉸鏈區對于允許多肽鏈的適宜定向和鏈間二硫鍵的形成是必需的。因此，鉸鏈區必需具備充足的長度并包含半胱氨酸殘基，優選至少兩個半胱氨酸殘基。優選地，該融合蛋白包含SEQ IDNo1的殘基1至267。該融合蛋白用于治療糖尿病的急性并發癥或治療糖尿病患者中的慢性動脈粥樣硬化進程。優選地，該融合蛋白為Fc-GPVI-nt。
本發明還提供制備本發明融合蛋白(Fc-GPVI-nt)的方法，它包括以下步驟(a)感染后2天收集已用編碼附圖7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela細胞培養物上清液；(b)離心(3800g，30分鐘，4℃)步驟(a)的上清液；(c)過濾(0.45μm)步驟(b)的上清液；(d)加入一倍體積的硫酸銨(761g/l)使免疫粘附素沉淀，并于4℃攪拌過夜；(e)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質成團，(f)將步驟(e)中的成團蛋白質溶于0.1倍體積的PBS，并在PBS中4℃透析過夜；(g)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質溶液澄清；(h)將步驟(g)中的溶液上載至蛋白質A柱(HiTrapTM蛋白質AHP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用結合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0，0.02％ NaN3)洗滌柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脫緩沖液(100mM甘氨酸pH2.7)將級分洗脫；(l)用中和緩沖液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％ NaN3)中和洗脫的級分；(m)合并級分；(n)4℃下將合并的級分在PBS中透析過夜，(o)將透析產物等分并于-20℃冷凍。


附圖1C57BL6/J小鼠體內總頸動脈血管損傷后血小板的粘附和凝集。(a)血管損傷前(左列)和2小時后(右列)的頸動脈掃描電鏡顯微圖。內皮剝落誘導血小板粘附和凝集，導致血小板富集(左下圖)的血栓形成。(b)血管損傷5分鐘后用體內原位頸總動脈熒光顯微術調查血小板-內皮細胞互作(黑柱)。以沒有血管損傷的動物作對照(空柱)。左和右列分別概括了各組八個試驗的瞬間和穩定血小板粘附。血小板根據它們與所述24內皮細胞系的相互作用進行分類，并以每mm2的血管表面給出。平均值±s.e.m.，星號表示與對照相比的顯著差異，P＜0.05。(c)血管損傷后的血小板凝集根據體內熒光顯微術測定(黑柱)。以沒有血管損傷的動物作對照(空柱)。平均值±s.e.m.，各組n＝8，星號表示與野生型小鼠相比的顯著差異，P＜0.05。顯微照片(右)顯示對照動物中(上圖)或血管損傷后(下圖)的典型熒光顯微鏡圖像。白箭頭指示粘附的血小板。
附圖2對GPVI的抑制廢除了血管損傷后的血小板粘附和凝集。(a)用活體內視頻熒光顯微鏡檢測血管損傷后的血小板粘附。熒光血小板與50μg/ml抗-GPVI(JAQ1)Fab片段或對照大鼠IgG預孵育。未經mAb預孵育的血小板用作對照。左圖和右圖分別概括了瞬間和穩定血小板粘附。平均值±s.e.m.，各組n＝8，星號表示與對照相比的顯著差異，P＜0.05。(b)圖示了在初始粘連/緩慢表面易位后形成不可逆粘附的血小板百分數。(c)體內血管損傷后的血小板凝集。根據用所述的熒光顯微鏡評估與tyrodes、無關大鼠IgG、或抗-GPVI Fab(JAQ1)預孵育的血小板凝集。平均值±s.e.m.，各組n＝8，星號表示與對照相比的顯著差異，P＜0.05。(d)顯微照片顯示闡明在不存在或存在抗GPVI Fab(JAQ1)或對照IgG時血小板粘附的代表性體內熒光顯微鏡圖形。
附圖3GPVI缺陷型小鼠中內皮脫落后的血小板粘附。(a)經JAQ1處理的小鼠缺乏GPVI。上圖將經無關對照IgG(左)或抗GPVI(JAQ1)(右)預處理的小鼠的血小板于室溫下與FITC標記的JAQ1和PE標記的抗小鼠CD41孵育10分鐘，并直接在FACScanTM上分析。給出了每組3只小鼠的代表性點雜交印跡。下圖在非還原條件下用SDS-PAGE對三個對照IgG或JAQ1處理的小鼠的全血小板溶解產物進行分離，并用FITC-標記的JAQ1進行免疫印跡，之后與HRP-標記的兔抗-FITC mAb孵育。(b)對照動物(上圖)或GPVI缺失小鼠(下圖)中血管損傷2小時后的頸動脈掃描電子顯微圖。對照動物中內皮脫落誘導了血小板粘附和血小板凝集。相反，在GPVI缺失小鼠中只有非常少的血小板沿受損血管壁附著。沿剝落區可見內皮下膠原蛋白纖維。(c)血小板粘連和穩定的血小板粘附，(d)初始粘連向穩定捕獲的轉換(粘連的血小板的百分數)，和(e)在GPVI缺陷(JAQ1預處理的小鼠)或對照IgG預處理的小鼠中測定了頸動脈血管損傷后的血小板凝集(詳見材料和方法)。該圖概括了各組八個試驗中的血小板粘附(瞬間的和穩定的)以及血小板凝集。平均值±s.e.m.，星號指示與對照IgG相比的顯著差異，P＜0.05。(f)顯微照片顯示，闡明GPVI缺陷(JAQI)和對照IgG處理的小鼠中血小板粘附的代表性體內熒光顯微鏡圖形。
附圖4離體評估在生理流條件下血小板對經膠原蛋白包被的玻璃蓋玻片表面的粘附。左圖在生理流條件下調查來自經無關對照IgG免疫粘附素(對照)(左)或抗GPVI免疫粘附素(Fc-GPVI-nt)(右)預處理小鼠的血小板。在各試驗末期經FACS對洗滌過的蓋玻片計數來評估血小板數量。流式條件下于30秒后評估作為血小板粘附第一步的血小板粘連(tethering)，5分鐘后評估穩定的血小板粘附。(詳見實施例6)。圖版概括了各組八個試驗中的瞬間和穩定血小板粘附。平均值±s.e.m.，星號指示與對照IgG相比的顯著差異，P＜0.05。
附圖5在一項以ELISA為基礎的檢測中監控Fc-GPVI-nt與膠原蛋白的相互作用。調查了由GPVI細胞外結構域和IgG Fc部分組成的免疫粘附素Fc-GPVI-nt與經膠原蛋白包被的板間的粘附，其中Fc-GPVI-nt和濃度逐漸升高(0.5μg到10μg)。用針對Fc-GPVI-nt的Fc部分的并且經過氧化物酶標記的二級抗體將這一結合可視化。最后用ELISA探測過氧化物酶。在該代表性試驗中，Fc-GPVI-nt與膠原蛋白的結合用充分的親和力進行控制，在μg濃度處達到飽和。
附圖6用抑制性抗小鼠GPVI抗體JAQ1證實Fc-GPVI-nt與膠原蛋白間的相互作用和篩選GPVI抑制劑的可能性。Fc-GPVI-nt(2μg/孔)與膠原蛋白包被的ELISA板間的粘附被顯示為特異性的單獨免疫粘附素Fc-nt不顯示任何結合。因此，這為以上升至高通量能力的潛力來篩選針對GPVI抑制劑提供了以ELISA為基礎的檢測方法。
附圖7Fc-GPVI-nt的氨基酸序列SEQ ID No1。
附圖8免疫粘附素Fc-GPVI-nt的DNA序列SEQ ID No.2。堿基1至807編碼GPVI細胞外結構域。堿基817至1515編碼IgG的Fc部分。
附圖9GPVI-Fc的表征。(a)上圖Fc-GPVI-nt和缺少細胞外GPVI結構域的對照Fc用于還原條件下的SDS-PAGE。考馬斯藍染色(左)以及與過氧化物酶耦聯的山羊抗人Fc抗體的免疫印跡(右)將Fc-GPVI-nt分子量鑒定為～80kDa。中圖用抗-GPVI單克隆抗體5C4與Fc、Fc-GPVI-nt、或人血小板進行的免疫印跡。5C4檢測到了腺病毒表達的Fc-GPVI-nt融合蛋白和血小板GPVI，但是不檢測對照Fc。下圖還原(右)和非還原(左)條件下的分子量。盡管在還原條件下Fc-GPVI-nt的分子量約為80kDa，在非還原條件下完整nt鑒定為～160kDa的蛋白質。(b-d)Fc-GPVI-nt膠原蛋白互作的表征。(b)用不同濃度的可溶Fc-GPVI-nt和固定化膠原蛋白(10μg/ml)完成結合檢測以定義Fc-GPVI-nt-膠原蛋白互作。結合的Fc-GPVI-nt用抗-Fc mAb抗體(1∶10000稀釋)進行了檢測，并以相對于在10μg/mlFc-GPVI-nt處觀察到的結合給出。Fc-GPVI-nt以可飽和方式與膠原蛋白結合。平均值±s.e.m.，n＝6個Fc-GPVI-nt濃度，星號指示與0μg/ml Fc-GPVI-nt相比的顯著差異，P＜0.05。(c，左圖)顯示Fc-GPVI-nt(20μg/ml)與各種底物的結合。Fc-GPVI-nt與BSA(10μg/ml)或vWF(10μg/ml)的結合以GPVI-二聚體與固定化膠原蛋白的結合的百分數給出。BSA或vWF未出現與Fc-GPVI-nt的結合，這支持Fc-GPVI-nt的結合特異性。平均值±s.e.m.，星號指示與膠原蛋白相比的顯著差異，P＜0.05。(c，右圖)圖示了Fc-GPVI-nt(20μg/ml)或Fc(20μg/ml)與固定化膠原蛋白(10μg/ml)的結合。結合的Fc-GPVI-nt或Fc用抗-Fc mAb抗體(1∶10000稀釋)進行了檢測，并以相對于觀察到的Fc-GPVI-nt結合給出。只有Fc-GPVI-nt，而不是Fc或抗-Fc mAb與固定化的膠原蛋白結合。平均值±s.e.m.，各組n＝8，星號指示與Fc-GPVI-nt結合的顯著差異，P＜0.05。(d)Fc-GPVI-nt(20μg/ml)與不同濃度的可溶膠原蛋白預孵育10分鐘。孵育后洗滌板，并用過氧化物酶耦聯的山羊抗人IgG抗體(1∶10000稀釋)檢測Fc-GPVI-nt結合。Fc-GPVI-nt的結合以相對于不存在可溶膠原蛋白時觀察到的結合給出。可溶性膠原蛋白以劑量依賴方式抑制GPVI-Fc-二聚體-二聚體與固定化膠原蛋白的結合。平均值±s.e.m.，n＝3個膠原蛋白濃度，星號指示與0mg/ml膠原蛋白相比的顯著差異，P＜0.05。(e)通過直接比較來評估GPVI-Fc融合蛋白單體形式與Fc-GPVI-nt間的結合親和力差異。在用1型膠原蛋白包被的ELISA板上評估單體和二聚體的結合。升高的GPVI融合蛋白濃度以可飽和方式與膠原蛋白結合。此處，親和評估給出了一個LinewaverBurke圖(e)。單體GPVI融合蛋白的親和力比等摩爾濃度二聚體形式Fc-GPVI-nt約低10倍。
附圖10Fc-GPVI-nt抑制CD 62P在人血小板上的激活，這一激活被看作通過提高膠原蛋白的劑量從α顆粒釋放細胞內遞質的參數。人血小板分離自全血并與PE標記的抗-CD 62抗體孵育(詳見材料和方法)。在Becton Dickenson FACS裝置中檢測熒光。示出代表性柱形圖。在對照Fc蛋白(100μg/ml；藍線)存在下，從0至10μg/ml逐漸升高的膠原蛋白濃度誘導了熒光的轉變。在Fc-GPVI-nt(100μg/ml；紅線)存在下，熒光的轉變及由此的CD 62P激活被顯著抑制。
附圖11Fc-GPVI-nt對由膠原蛋白介導的血小板凝集和內源遞質從致密和α顆粒中釋放的特異性抑制。(a)將人血小板與對照Fc(80μg/ml)或Fc-GPVI-nt(80μg/ml)孵育。用膠原蛋白(1μg/ml)或ADP(5μM)或TRAP(10μM)誘導血小板凝集，并于攪拌條件下在凝集測量器(aggregometer)中測定凝集(詳見材料和方法)。作了三次從n＝5個不同血液供體的測定。平均值±s.e.m以相對于不含融合蛋白的對照凝集的凝集百分比給出。(b)與對照Fc(80μg/ml)或Fc-MGPVI-nt(80μg/ml)孵育后在同一探測器中同時測定ATP釋放。ATP釋放量以不含融合蛋白的對照的百分比給出。(c)在基本條件下、并用膠原蛋白(20μg/ml)刺激后用特異于人PDMGF的ELISA系統測定人血小板中的PDMGF釋放(詳見材料和方法)。與對照Fc的預孵育對從經膠原蛋白刺激的血小板中釋放PDMGF沒有顯著影響，而Fc-MGPVI-nt(100μg/ml)顯著降低PDMGF釋放。在未經刺激的血小板中未出現對PDMGF釋放的抑制。
附圖12Fc-GPVI-nt對離體人類血液的流血時間沒有顯著影響。ADP/膠原蛋白刺激和腎上腺素/膠原蛋白刺激后在PFA-100裝置中離體測定人血液的流血時間。Fc-GPVI-nt(5和20μg/ml)和Fc(5和20μg/ml)不會延長流血時間，而兩種條件下治療相關濃度(5μg/ml)的ReoProR最大限度地延長流血時間。概括了從n＝4個血液供體三次測定的平均值±s.e.m.。
附圖13Fc-GPVI-nt在流式條件(flow condition)下抑制血小板粘附于固定化的膠原蛋白。人血小板(2×108細胞/ml)分離自全血(詳見材料和方法)。將板用固定化的膠原蛋白(10μg/ml)或vWF(10μg/ml)包被。在平行板流式腔中在Fc-GPVI-nt或缺乏細胞外GPVI結構域的Fc(200μg/ml)存在下檢測血小板與包被板的粘附。Fc-GPVI-nt對血小板粘附的抑制以對照(Fc對照)的百分比給出。在剪切率分別為500秒-1和1000秒-1時，Fc-GPVI-nt顯著削弱血小板在固定化膠原蛋白上的粘附。相反，Fc-GPVI-nt未影響血小板在固定化vWF上的粘附。平均值±s.e.m.，各組n＝4，星號指示與對照Fc相比的顯著差異，P＜0.05。下圖顯示代表性的顯微圖像。
附圖14腹膜內注射至小鼠體內后，Fc-GPVI-nt具有延長的血漿半衰期以及有利的藥物代謝動力學。用特異性抗Fc抗體和ELISA測定Fc-GPVI-nt的血液濃度(詳情請參見材料和方法)。(a)單次Fc-GPVI-nt腹膜內注射(4μg/g)導致Fc-GPVI-nt在24小時后快速達到峰值血液濃度，其后Fc-GPVI-nt血液濃度緩慢降落。示范了來自10種動物的平均值±s.e.m.。(b)重復腹膜內應用(10μg/g；每周兩次)導致Fc-GPVI-nt在小鼠體內連續累積超過28天。示范了來自6種動物的平均值±s.e.m.。(c)每只小鼠靜脈內單劑量注射30μgFc-GPVI-nt(1μg/g體重)、60μg(2μg/g體重)和100μg Fc-GPVI-nt(3μg/g體重)導致劑量依賴性的免疫粘附素血漿濃度升高。在這些小鼠體內兩個較高劑量下的血漿濃度在5至60分鐘時達到延長的提升水平，24小時后足夠有效清除膠原蛋白及由此有效抑制血小板上GPVI受體的激活。示范了來自5種動物的平均值±s.e.m.。
附圖15Fc-GPVI-nt在體內對血小板粘附和凝集的效果。(a)小鼠(各組n＝6)用2mg/kg或4mg/kg Fc-GPVI-nt靜脈內處理。將經Integrilin(0,2mg/kg)處理的小鼠用作陽性對照(n＝8)。根據所述方法(參見材料和方法)測定流血時間。與對照動物相比Fc-GPVI-nt融合蛋白未曾提高尾部流血時間。在經Integrilin處理的小鼠，尾部流血時間被大大延長。**P＜0.05vs.對照。(b)對GPVI的抑制廢除了血管損傷后血小板的粘附和凝集。用活體視頻熒光顯微術測定血管損傷后的血小板粘附。小鼠用1或2mg/kg Fc-GPVI-nt或等摩爾量的對照Fc預處理。左和右圖分別概括了血小板粘連和穩定血小板粘附。平均值±s.e.m.，各組n＝5，星號指示與Fc相比的顯著差異，P＜0.05。(c)Fc-GPVI-nt對體內血管損傷后血栓形成的影響。根據所述用熒光顯微術評估了血小板血栓數量(右)和總血栓區域(左)。平均值±s.e.m.，各組n＝5，星號指示與Fc相比的顯著差異，P＜0.05。(d)顯微照片顯示代表性的體內熒光顯微圖像，這些圖像圖示了在1或2mg/kg Fc-GPVI-nt或對照Fc存在下的血小板粘附。標尺代表50μm。(e)在經Fc或Fc-GPVI-nt處理過的動物中血管損傷1小時后的頸動脈掃描電鏡圖。在經Fc處理過的小鼠中，內皮脫落誘導血小板粘附和血小板凝集。相反，在經Fc-GPVI-nt處理過的小鼠中僅有非常少的血小板沿受損血管壁附著。沿脫落區域可見內皮下膠原蛋白纖維。標尺代表10μm。(f)Fc-GPVI-nt特異性結合于頸動脈內皮下層。在經過氧化物酶耦聯的山羊抗人IgG抗體染色的頸動脈切片上檢測到Fc-GPVI-nt與內皮下層的這一結合。將獲自經Fc-處理的小鼠的頸動脈用作對照。根據棕色染色的指示，在內皮下層檢測到了Fc-GPVI-nt而非Fc對照蛋白。原始放大100倍。
附圖16Fc-GPVI-nt顯著減弱apo e-/-敲除小鼠體內的動脈粥樣硬化進程。Apo e-/-小鼠用Fc-GPVI-nt(4μg/g)或對照Fc(4μg/g)腹膜內處理四周，每周兩次。用蘇丹紅對大血管染色以使粥樣斑和斑塊形成可視化后，mortem后調查動脈粥樣硬化進程。在對照動物中，特別是分支區域中的紅色指示頸動脈標本廣泛的斑塊形成。在經Fc-GPVI-nt處理的動物中，apo e-/-小鼠頸動脈中的動脈粥樣硬化幾乎完全被廢除了。顯示了用Fc-GPVI-nt(左側)處理四周后的apoe-/-小鼠和用對照Fc蛋白(右側)處理四周后的apo e-/-小鼠的有代表性的肉眼可見的整個頸動脈血管標本。
附圖17從糖尿病患者新鮮分離的血小板顯示降低的纖維蛋白原受體(CD61，頂部)表達、和增強的Fc受體(CD32，中間)表達以及由此而增強的GPVI的表達。CD32表達與GPVI表達(由特異性單克隆抗體4C9檢測)間的相關性顯示在人血小板上(底部)。人血小板分離自糖尿病患者的全血，并與熒光標記的抗-CD61和抗CD32抗體或FITC標記的4C9抗體孵育。在Becton Dickenson FACScalibur裝置中檢測熒光。概括了來自n＝11名患糖尿病的病人和來自n＝363名未患糖尿病的病人的平均值+/-s.e.m.。計算CD32熒光與4C9熒光的相關性，相關系數r＝0.516。
附圖18基于Fc-GPVI-nt的單體融合蛋白的氨基酸序列。
發明詳述以前的一種假說曾提出，與von vWf結合的血小板糖蛋白VI(GP)Ib將流動的血小板招募至受傷血管壁(Ruggeri，Z.M.Mechanismsinitiating platelet thrombus formation.Thromb.Haemost.1997；78，611-616)，而內皮下纖維狀膠原蛋白支持血小板的穩定粘附和激活(van Zanten，G.H.等人，Increased platelet deposition onatherosclerotic coronary arteries.J Clin.Invest 1994；93，615-632；Clemetson，K.J.& Clemetson，J.M.Platelet collagenreceptors.Thromb.Haemost.2001，86，189-197)。然而，本發明通過對小鼠頸動脈的熒光電子顯微術證實，內皮糜爛后對主要血小板膠原蛋白受體GPVI的抑制或使其缺失反而廢除血小板-血管壁間的互作。出乎意料的是，對GPVI的抑制使血小板在內皮下層上的粘連和粘附降低約89％。此外，在這些條件下基本上廢除了對血小板的穩定捕獲和凝集。在這些過程中嚴格需要GPVI，這在GPVI缺陷型小鼠中得到證實，這些小鼠中血小板也未能附著和凝集到受損血管壁上。這些發現揭示了GPVI在引發血小板附著至血管損傷部位中的一種意想不到的作用，并明確地將血小板-膠原蛋白互作鑒定為由動脈血小板誘導的動脈粥樣硬化并發癥的主要決定因素。
GPVI通常作為內皮下基質膠原蛋白的受體起作用，這一事實已經得到描述(Moroi M，Jung SM，Okuma M，Shinmyozu K.A patient withplatelets deficient in glycoprotein VI that lack bothcollagen-induced aggregation and adhesion.J Clin Invest 1989；841440-1445)。這些作者描述了體外源自GPVI受體缺陷病人的血小板的特征。然而，膠原蛋白與GPVI受體在體內環境中的互作的生理重要性、以及GPVI受體對血管損傷后粘附的相對貢獻是未知的。特別是，不知道對該受體的抑制會抑制血管內血栓形成中的關鍵步驟——即血小板粘連。本發明揭示了，GPVI受體是血小板在體內經內皮下基質膠原蛋白粘附至內皮下層的必需受體。在各種其它血小板表面受體蛋白例如GPIb(von Willebrand受體)、αIIβ3整合素受體、α2β1整合素或GPV受體中，我們已經令人驚訝地將GPVI受體鑒定為介導血小板粘附至血管壁的必需受體。由于血小板粘附是在生理剪切壓力下血小板凝集和動脈內血栓形成的第一個且最為重要的步驟，因此以下導致動脈內阻塞的有害效果是心肌梗死或腦中風臨床綜合征的功能性基礎。在慢性情況下，血小板和內皮的相互作用促進動脈粥樣硬化的早期步驟。我們的發明還第一次顯示，GPVI受體在幾個血小板表面蛋白的復雜種類中對最初的血小板粘附和動脈粥樣硬化發展中的慢性血小板-內皮互作起關鍵作用。
WO 01/16321和WO 01/00810公開了人GPVI受體的DNA和蛋白質序列。然而，內皮損傷對血小板粘附和激活的重要性還未曾在體內背景中得到證實。
US 6,383,779公開了GPVI融合蛋白。然而，該文獻并未公開二聚體融合蛋白或GPVI的任何治療效果。
近來，調查了體外灌注的條件下人造膠原蛋白上的血小板-膠原蛋白互作的不同相(Moroi M，Jung SM，Shinmyozu K，Tzomiyama Y，Ordinas A和Diaz-Ricart M.Analysis of platelet adhesion tocollagen-coated surface under flow conditionsthe involvementof glycoprotein VI in the platelet adhesion.Blood 1997；882081-2092)。該研究的作者已經指出剪切壓力條件下膠原蛋白-GPVI互作的重要性。然而，在該體外人工環境下無法研究內皮下基質膠原蛋白與粘附的相關性。作為他們的體外模型的有限相關性的結果，上述研究的作者得出結論認為，GPVI受體涉及血小板激活而不涉及血小板對內皮的粘附。相反，von Willebrand GPIb受體顯著涉及血小板-內皮下層互作。在一份對現有文獻的綜述里，這些作者匯集了所有可獲得的關于血小板-膠原蛋白互作的信息。之前，Moroi M和Jung，SM(Platelet receptors for collagen.Thromb.Haemost.1997；78439-444)已經討論了為血小板粘附和血栓形成而發生的膠原蛋白纖維與血小板上不同的膠原蛋白受體間的互作。然而，作者并未預計在臨床相關的體內環境中GPVI受體對于粘附的相關作用，因為他們不能確認不同膠原蛋白受體對粘附過程的重要性。
因此，本發明提供抑制血小板-內皮下層互作和血小板粘附相關靶物而不激發出不期望的出血并發癥副作用這一問題的解決辦法。除了熟知的經GPVI受體的膠原蛋白-血小板互作，我們可以提供根據體內血小板粘附測定的天然內皮下基質與血小板互作的資料。接著，我們可以證實GPVI-內皮互作作為血管內血栓形成最初步驟對于血小板粘附的重要性。因此，我們的發明解決用有效的抗血小板藥物治療血小板粘附的重要問題而不帶有不期望的副作用問題。
進一步，本發明提供一種免疫粘附素(本發明的融合蛋白)。在一個特定實施方式中，該免疫粘附素由GPVI受體細胞外結構域和IgG免疫球蛋白(Fc-GPVI-nt)的Fc部分一起組成。這一新融合蛋白以約50％的以前公開的GPVI原始DNA序列為基礎。該免疫粘附素的蛋白質結構是新的，因為該重組融合蛋白不形成象GPVI受體那樣的膜蛋白，而是一種由各自宿主細胞釋放的可溶的、免疫球蛋白樣免疫粘附素。該免疫粘附素可以阻斷膠原蛋白與GPVI的配體-受體互作。我們的結果證實，該免疫粘附素對由膠原蛋白刺激誘導的血小板主要生理功能有顯著影響。膠原蛋白誘導的凝集、粘附和釋放功能能被該免疫粘附素以與特異性單克隆抗體相同的程度抑制。然而，這一機制是不同的抗體通過與GPVI受體的配體結合位點直接結合來抑制GPVI激活，而該免疫粘附素清除GPVI配體膠原蛋白并由此防止由配體介導的GPVI激活。
本發明的免疫粘附素是新的GPVI抑制劑。它具有通過配體清除而選擇性抑制由GPVI介導的效應的激活支路的優勢。次級效應，象由抗體介導的對GPVI受體內化的效應，被阻止。Fc-GPVI-nt可用于治療由帶有斑塊破裂或內皮損傷的不穩定動脈粥樣硬化斑塊引起的動脈粥樣硬化并發癥。因此，免疫粘附素Fc-GPVI-nt用作由膠原蛋白介導的GPVI激活的治療性抑制劑而不影響GPVI受體對相關信號系統的內在活性。
此外，GPVI免疫粘附素用作抗體選擇的一種理想的表位。Fc部分使得可以對蛋白質進行方便的純化以及將其固定到表面以對抗體文庫(即通過噬菌體展示)進行大規模抗體選擇。這一選擇可以選擇性篩選針對具有與天然蛋白質相似的結構、代表完整蛋白的相關表位的抗體。
最后，Fc-GPVI-nt是篩選GPVI受體激活的抑制劑的重要工具。我們已經建立了一種以ELISA-為基礎、通過以經膠原蛋白預包被的板為配體模擬膠原蛋白GPVI互作的體外檢測方法。這種檢測方法也可以用熒光標記的Fc-GPVI-nt進行，且由此可以擴展為高通量形式。這種檢測方法可以通過熒光測定來篩選抑制性抗體或具有抑制GPVI功能的潛力的小分子。用這種無細胞篩選檢測方法，已經為藥物測試建立了一種可高通量化的熒光篩選檢測方法的原型方法。
基于近來通過血管內超聲或核磁共振成像在成像技術中的發展，有可能鑒定動脈粥樣硬化患者是否處于象急性冠狀動脈或頸動脈綜合征這樣的急性臨床并發癥的危險之中，由此急性損傷會成為患者血管內血栓形成的可能原因。因而，借助本發明有可能通過施用含有針對血小板糖蛋白VI(GPVI)的抗體來預防血管內血栓形成而不帶有不期望的副作用。
活性損傷是以內皮下基質膠原蛋白的暴露和血小板活化為特征的。可以通過例如血管內超聲或溫度記錄(例如，Fayed和Fuster，Clinical imaging of the high-risk or vulnerable atheroscleroticplaque.Circulation 2001；89305-316)或核磁共振成像(Helft等人，Progression and Regression of Atherosclerotic Lesions.Circulation 2002；105993-998)來調查這樣的損傷的出現。這樣的損傷在急性冠狀動脈或頸動脈綜合征患者中是極有可能產生的，例如心肌梗死或中風這樣的急性臨床并發癥的復發風險是很高的，這種風險隨著與首次事件的時間間距延長逐漸降低。
因此，本發明提供一種治療患有急性冠狀動脈或頸動脈綜合征的病人的方法，所述方法包括以下步驟以避免血管內血栓形成(a)確定病人體內存在或不存在活性血管內損傷；和(b)如果存在血管內損傷則用針對血小板糖蛋白VI(GPVI)的抗體治療病人。
此外，基于本發明，有可能治療由于復雜動脈粥樣硬化斑塊破裂而處于血管內血栓形成風險的病人。這一破裂還會使內皮下膠原蛋白基質暴露。動脈內血栓形成的一個后果是，上述重要的、危及生命的臨床綜合征阻斷對重要器官的灌注。
本發明還提供治療患有慢性動脈粥樣硬化綜合征的病人的方法，所述方法包括以下步驟以避免血管內血栓形成(a)確定病人體內存在或不存在動脈粥樣硬化進程發作；和(b)如果存在血管內損傷則用針對血小板糖蛋白VI(GPVI)的抗體治療病人。
因此，基于本發明，有可能治療處于動脈粥樣硬化風險的病人。為預防動脈粥樣硬化發展，用本發明的融合蛋白治療病人以預防血小板與暴露的內皮下膠原蛋白間的互作。本發明的融合蛋白阻斷血管壁(例如內皮下層)中的GPVI血小板受體的配體，這樣就可以抑制血小板與暴露的膠原蛋白間的互作。
本發明的融合蛋白可以是凍干粉末形式，在將其施用給病人之前將之分散在適宜的藥學可接受液體載體中。如果對急性并發癥的治療優選經動脈內或靜脈內給藥，本發明的融合蛋白也可以被整合入適宜經非腸道途徑給藥的藥物組合物。這樣的組合物通常包括融合蛋白和藥學可接受載體。藥學可接受載體包括在藥物給藥上相容的溶劑、分散介質、抗細菌和抗真菌劑以及等滲劑。本發明包括生產治療慢性或急性心血管疾病的藥物組合物的方法。這樣的方法包括將藥學可接受載體與本發明融合蛋白配制在一起。對于急性心血管疾病的治療，組合物優選經靜脈內或動脈內給藥。對于慢性心血管疾病的治療，組合物也可以經皮下或腹膜內給藥。這樣的組合物可以進一步包括其它的活性化合物，例如另外的多肽(例如胰島素)或治療性活性小分子。因此，本發明進一步包括通過將藥學可接受載體和本發明的融合蛋白以及一或多種其它的活性化合物例如胰島素配制在一起而制備藥物組合物的方法。對于融合蛋白和胰島素的共同配制以治療糖尿病患者，優選其劑量形式允許分別儲存不同的蛋白，而僅在該組合物施用前完成蛋白質的混合。因此，考慮了應用多室注射器。本發明的藥物組合物被配制成與目的非腸道給藥途徑相容。非腸道給藥途徑的例子包括，例如動脈內和靜脈內給藥。用于非腸道給藥的溶液或懸液可以包括無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、聚乙二醇、固定油、丙三醇、丙二醇、TWEEN或其它合成溶劑；抗細菌劑，例如芐基醇或羥苯甲酸甲酯；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸或重亞硫酸鈉；緩沖液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽，和調節滲透壓的試劑，例如氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、甘露糖。pH可以用酸或堿調節，例如鹽酸或氫氧化鈉。非腸道制劑可以封裝在用玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小藥瓶中。適于可注射用途的藥物組合物包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對于靜脈內注射，適宜載體包括生理鹽水、抑菌水、或磷酸鹽緩沖液(PBS)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、和液體聚乙二醇)的溶劑或分散介質，及其適宜的混合物。可以通過，例如利用卵磷脂包被、保持分散液中所需的顆粒大小、以及使用表面活性劑，來保持適當的流動性。可以用各種抗細菌或抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞，及類似，來實現對微生物作用的預防。在許多情況下，優選組合物中包括等滲劑，例如，糖類、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠，來延長對可注射組合物的吸收。根據需要，可以將活性化合物(例如，多肽或抗體)以所需量同以上列舉成分的一或多種組合整合進適宜的溶劑接著過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。一般，通過將活性化合物整合進無菌載體來制備分散液，該無菌載體含有基本分散介質和所需的以上列舉的其它成分。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，優選的制備方法是真空干燥和凍干，該法從其預先無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何其它想要的成分的粉末。特別有利的是以劑量單位形式配制口服或非腸道途徑的組合物。劑量單位形式是適于以單元劑量施用給病人的獨立單位。各單位含有產生預期治療效應的預先確定量的活性化合物以及所需的藥物載體。治療急性并發癥的融合蛋白有效治療劑量(即，有效劑量)是從0.05至5mg/kg體重，優選0.1至2mg/kg體重，更優選0.1至1mg/kg體重。治療慢性動脈粥樣硬化發展的融合蛋白有效治療劑量(即，有效劑量)是從0.5至6mg/kg體重，優選1至5mg/kg體重，更優選2至5mg/kg體重。用治療有效量的融合蛋白對對象進行的治療可包括單次治療，優選，可包括一系列治療。在優選實施例中，針對慢性動脈粥樣硬化進程以0.5至6mg/kg體重，優選1至5mg/kg體重，更優選2至5mg/kg體重，每周至少兩次用本發明融合蛋白治療對象。
調查血小板-膠原蛋白互作和由抑制劑調節的方法血小板凝集和ATP釋放用0.2至4μg/ml升高濃度的I型牛膠原蛋白刺激小鼠血小板富集的血漿，引發2至95％的劑量依賴型凝集和劑量依賴型的0至1.66nM ATP釋放。選擇膠原蛋白的半最大濃度進行進一步試驗。將特異性抗小鼠GPVI抗體JAQ1(50μg/ml和100μg/ml)與小鼠血小板富集的血漿孵育幾乎完全廢除了用2μg膠原蛋白/ml(對50μg JAQ12+/-0.7；對100μg JAQ11.5+/-0.3％)刺激后的血小板凝集。此外，ATP釋放以劑量依賴方式被抑制至1.09nM ATP(10μg抗體/ml)或全部廢除(50和100μg抗體/ml)。
類似地，用GPVI的免疫粘附素(Fc-GPVI-nt)(50μg/ml和100μg/ml)孵育小鼠血小板富集的血漿幾乎完全廢除了用2μg膠原蛋白/ml(對50μg Fc-GPVI-nt2+/-0.7；對100μg Fc-GPVI-nt1.5+/-0.3％)刺激后的血小板凝集，而且ATP釋放為0nM ATP。
因此，免疫粘附素通過清除天然GPVI配體膠原蛋白而充分抑制GPVI激活。正如由ATP釋放所測定的，關鍵的血小板功能凝集和血小板釋放機制都可能被Fc-GPVI-nt影響。
生理流條件下由GPVI介導的粘附(流式腔)在流式腔中測試生理剪切條件下的血小板粘附。加入Fc-GPVI-nt免疫粘附素將初始和穩定的血小板粘附抑制了60％(參見附圖4)。
GPVI結合檢測在以ELISA為基礎的熒光檢測法中檢測Fc-GPVI-nt對膠原蛋白包被的板的粘附。在0.2至10μg濃度的Fc-GPVI-nt下，免疫粘附素Fc-GPVI-nt的結合以劑量依賴的方式上升至飽和水平(請參見附圖5)。通過比較Fc-GPVI-nt的結合與空免疫粘附素Fc-nt或未包被塑料表面的結合證實了特異性(參見附圖6)。
在血管損傷處體內調查血小板粘附和凝集作為急性血管事件中血小板激活關鍵步驟的方法為測試體內損傷粘附過程中血小板-膠原蛋白互作的生物學重要性，評估了小鼠頸動脈血管損傷后的血小板-血管壁互作。對這一重要血管床的血管損傷可以用作動脈粥樣硬化最初步驟，例如動脈粥樣硬化早期階段的內皮損傷或伴隨膠原蛋白纖維從內皮下層暴露的動脈粥樣硬化后期階段的斑塊破裂，的模型。此外，該模型允許對血管損傷后的并發癥進行研究。小的內皮損傷導致伴隨著之后的血小板粘附和凝集步驟的對血小板的最大激活。在進一步的步驟中，血小板凝集可以導致頸動脈栓塞和之后的缺血性腦中風。因此，這一試驗設置用作患有涉及導致急性冠狀動脈綜合征和中風的斑塊破裂和內皮損傷的不穩定動脈粥樣硬化的病人亞組的相關體內模型。
根據掃描電子顯微術的評估，持續緊扎頸動脈5分鐘導致內皮細胞層完全喪失并引發血小板在損傷部位粘附(附圖1a)。體內熒光顯微術可用于直接將血管損傷后的血小板聚集的動力過程可視化并定量。內皮剝落后的最初幾分鐘無數血小板粘連至血管壁(4620±205血小板/mm2)。事實上所有與內皮下層建立聯系的血小板最初都表現“停止-啟動”型的緩慢表面易位(Savage，B.，Saldivar，E.&Ruggeri，Z.M.Initiation of platelet adhesion by arrest ontofibrinogen or translocation on von Willebrand factor.Cell1996；84，289-297)。而我們在88％的全部血小板中觀察到從最初的緩慢表面易位向不可逆血小板粘附的轉變(4182±253血小板/mm2)(附圖1b)，只在12％中保持瞬間的血小板捕獲(543±32血小板/mm2)。一旦建立了穩定的捕獲，附著的血小板就從血循環中招募另外的血小板，導致凝集形成(附圖1c)。用固定化的膠原蛋白在體外獲得了與血小板募集相似的特征。相反，生理條件下僅有極少血小板被粘連到完整血管壁(P＜0.05vs.血管損傷)，而且實際上100％的這些血小板都從這些血管壁轉移而未產生穩定捕獲(P＜0.05vs.血管損傷，附圖1a-c)。
將GPVI鑒定為體內血管損傷的血小板中的新型相關靶蛋白涉及種種不同受體和信號途徑的血小板-血管壁互作的高度復雜性使得難于體內抑制這一過程。除了經von Willebrand因子(vWF)與膠原蛋白間接互作的GPIb-V-I-X和αIIbβ3整合素之外，已經在血小板上鑒定了大量膠原蛋白受體，包括最重要的α2β1整合素(Santoro，S.A.Identification of a 160,000 dalton platelet membraneprotein that mediates the initial divalent cation-dependentadhesion of platelets to collagen.Cell 1986；46，913-920)、GPV(Moog，S.等人，Platelet glycoprotein VI V binds to collagenand participates in platelet adhesion and aggregation.Blood2001；98，1038-1046)、和GPVI(Moroi M.，Jung，S.M.，Okuma，M.& Shinmyozu，K.A patient with platelets deficient inglycoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation andadhesion.J Clia.Invest 84，1440-1445)。在幾份關于在體外起作用的不同信號系統的報告中，現在也已經討論了GPVI(Gibbins，J.M.，Okuma，M.，Farndale，R.，Barnes，M.& Watson，S.P.glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets whichunderlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptorgamma-chain.FEBS Lett.1997；413，255-259；Nieswandt，B.等人，Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion ofplatelet glycoprotein VI in mice.J.Exp.Med.2001；193，459-469，Nieswandt，B.等人，Glycoprotein VI but not α2β1integrinis essential for platelet interaction with collagen.EMBO J2001；20，2120-2130)。
為直接測試血小板-膠原蛋白互作在動脈血栓形成中的體內相關性，我們在體內抑制或缺失了GPVI。單克隆抗體(mAb)JAQ1阻斷小鼠GPVI上的主要膠原蛋白結合位點(Schulte，V.等人，Evidence fortwo distinct epitopes within collagen for activation of murineplatelets.J Biol.Chem.2001；276，364-368)，并在高剪切流條件下幾乎完全抑制血小板向固定化纖維狀膠原蛋白的穩定粘附(Nieswandt，B.等人，glycoprotein VI but not alpha2beta1integrin is essential for platelet interaction with collagen.EMBO J 2001；20，2120-2130)。為研究GPVI-膠原蛋白互作在動脈血栓形成中的血小板粘附/凝集動力學過程中的重要性，使小鼠接受用JAQ1 Fab片段或同型匹配的對照IgG預孵育的同源、熒光標記血小板，并如上述誘導頸動脈損傷。非常出人意料的是，我們發現對GPVI的抑制使正常頸動脈內皮剝落后的初始血小板粘連減少了89％(P＜0.05vs.對照IgG，附圖2a)，這一過程被認為主要由GPIbα與固定的vWF間的互作所介導(Goto，S.，Ikeda，Y.，Saldivar，E.& Ruggeri，Z.M.Distinct mechanisms of platelet aggregation as a consequenceof different shearing flow conditions.J.Clin.Invest.1998；101，479-486；Sixma，J.J.，van Zanten，G.H.，Banga，J.D.，Nieuwenhuls，H.K.& de Groot，P.G.Platelet adhesion.Semin.Hematol.1995；32，89-98)。此外，JAQ1使穩定的血小板捕獲減少了93％(附圖2a)。我們只在58％的那些已與內皮下層建立初始接觸的血小板中觀察到從最初的粘連/緩慢表面易位向不可逆血小板粘附的轉變(與用對照IgG預處理的血小板的89％相比，P＜0.05，附圖2b)。用JAQ1 Fab片段預處理血小板后基本上未見附著血小板的凝集，但在對照中不是這樣(P＜0.05vs.對照，附圖2c和d)。這些資料證明，直接的血小板-膠原蛋白互作對于在血管損傷部位的初始血小板粘連和之后的穩定血小板粘附和凝集是關鍵的。此外，這些發現顯示，GPVI是這一過程中的關鍵調節因子，而其它表面受體，最重要的GPIb-V-IX和α2β1，在體內不足以在內皮下層上引發血小板粘附和凝集。
為了排除該效應是以其它受體，例如GPIb-V-IX，通過表面結合的JAQ1形成的空間損害為基礎的這一可能性，我們通過在血管損傷前五天注射JAQ1產生了GPVI-缺陷型小鼠。正如之前的報道，這樣的處理基本上導致GPVI的完全喪失，例如通過循環血小板上的GPVI的內化和蛋白酶降解，從而產生與“GPVI敲除”類似的表型至少兩個星期(Nieswandt，B.等人，Long-term antithrombotic protection byin vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice.J.Exp.Med.2001；193，459-469)。如附圖3a中所示例的，注射100μg/小鼠的JAQ1后第五天在來自經JAQ1處理的小鼠的血小板中檢測不到GPVI，但對照IgG卻不，盡管在兩組小鼠中所有其它受測試受體，包括GPIb-V-IX、αIIbβ3、和α2β1，的表面表達和功能都未改變，這證實了早些時候的結果(數據未給出，Nieswandt，B.等人，Long-termantithrombotic protection by in vivo depletion of plateletglycoprotein VI in mice.J.Exp.Med.2001；193，459-469)。
如掃描電子顯微術所示，總頸動脈內皮剝落后的血小板粘附和凝集在GPVI缺型小鼠中基本缺失，但在IgG預處理小鼠中卻不(附圖3b)。接著，將體內視頻熒光顯微術用于定義GPVI缺陷小鼠中血管損傷后的血小板粘附動力學(附圖3c-f)。GPVI的喪失使血小板在血管損傷處的粘連/緩慢表面易位顯著減少(與IgG預處理的小鼠相比減少83％，P＜0.05)。這一GPVI非依賴的緩慢表面易位需要vWF-GPIbα-互作，因為將血小板與針對GPIbα的功能阻斷型mAb(p0p/B)的Fab片段預孵育會將其取消，這證明GPIbα在這一過程中的關鍵作用(未顯示)。GPVI缺乏時，與對照(IgG-處理)相比，穩定的血小板粘附被降低約90％，但是基本上不存在附著血小板的凝集(附圖3b-f)。我們僅在所有最初粘連至損傷位點的血小板的58％中看到從血小板粘連到穩定血小板粘附的轉變(與經對照mAb-預處理的血小板的89％相比，P＜0.05，附圖3d)，指示GPIbα-依賴性的表面易位不足以促進穩定的血小板粘附和之后的凝集。
GPVI阻斷對血小板粘連的具有深遠意義的抑制是令人驚訝的，并暗示著這種受體在血小板向血管損傷穩定粘附的最初始階段中具有之前未曾被識別的功能。纖維狀膠原蛋白是人動脈粥樣硬化損傷的主要組分(Rekhter，M.D.Collagen synthesis in atherosclerosistoomuch and not enough.Cardiovasc.Res.1999；41，376-384；Rekhter，M.D.等人，Type I collagen gene expression in humanatherosclerosis.Localization to specific plaque regions.Am.J Pathol.1993；143，1634-1648)；被增強的膠原蛋白合成(通過內膜平滑肌細胞和成纖維細胞)在動脈粥樣硬化形成過程中顯著促進腔室變窄(Opsahl，W.P.，DeLuca，D.J.& Ehrhart，L.A.Acceleratedrates of collagen synthesis in atherosclerotic arteriesquantified in vivo.Arteriosclerosis 1987；7，470-476)。斑塊破裂和裂隙(自發發生的或在氣囊血管形成術后發生的)導致膠原蛋白纖維暴露于血流。
本發明首次教導這樣的內皮下層膠原蛋白是動脈血栓形成的主要開關，并揭示了膠原蛋白受體GPVI在將血小板募集至受傷血管壁中的意料不到的功能。在提高的剪切力條件下的血小板粘連和緩慢表面易位過程已知大部分依賴于GPIbα與固定的vWF的互作。然而，由于還需要有功能的GPVI，因此這一互作尚不足以在體內建立最初的血小板-血管壁互作(附圖2和3)。因此，GPIbα和GPVI都必需共同作用以將血小板招募至內皮下層。在血小板粘連過程中，GPVI的連接可將αIIbβ3和α2β1整合素從低親和力狀態轉變為高親和力狀態。αIIbβ3和α2β1之后都共同作用以促進之后血小板在膠原蛋白上的穩定捕獲，而αIIbβ3對于隨后的附著血小板的凝集很重要。因此，在血小板和內皮下層膠原蛋白最初接觸過程中的GPVI連接提供了對隨后的穩定血小板粘附和凝集很重要的激活信號。重要的是，GPIbα占位或在側邊聚集(在GPIbα-依賴的表面易位過程中)，其在體外誘導低水平的αIIbβ3整合素激活(Kasirer-Friede，A.等人，Lateral clustering of plateletGPIb-IX complexes leads to up-regulation of the adhesivefunction of Integrin IIb 3.J.Biol.Chem.2002；Vol 27711949-11956)，但在體內不足以促進血小板粘附。
本發明因此已經鑒定了抑制血小板附著至內皮下層的重要受體。阻斷GPVI與暴露的膠原蛋白相互作用的抗體能特異性抑制血栓形成的所有主要階段，即，在動脈損傷部位的血小板粘連、穩定粘附、和凝集(例如在急性冠狀動脈綜合征過程中)。由對GPVI的抑制或消耗而實現的這一意義重大的保護作用確立了對GPVI-膠原蛋白互作的選擇性藥理學調節以控制病理動脈粥樣硬化損傷的發作和發展的重要性。
動脈粥樣硬化斑塊破裂后，內皮下膠原蛋白的暴露是引發血小板在損傷位點粘附和凝集的主要開關，隨后是動脈血栓形成(1；24；25)。最近已被克隆(5；6)的血小板糖蛋白GPVI已被本發明鑒定為主要的血小板膠原蛋白受體(4)，其在體外(22)和體內(病理)生理條件下(3)都介導血小板粘附。因此，如本發明所示，通過特異性融合蛋白Fc-GPVI-nt對血小板粘附的體外和體內抑制活性，對GPVI的抑制會阻止患嚴重動脈粥樣硬化的病人中血小板募集和動脈血栓的形成。
用腺病毒表達系統在HELA細胞中表達Fc-GPVI-nt融合蛋白得到可溶性Fc-GPVI-nt。GPVI可溶形式的表征揭示，Fc-GPVI-nt以分子量約為160kDa的二聚體分泌。相應地，Miura和同事近來報道，GPVI-Fc-二聚體以二聚體存在，其中兩個GPVI-Fc-二聚體分子通過各分子Fc結構域中的Cys形成的二硫鍵交聯(21)。重要的是，已經報道，只有GPVI的二聚體形式，而不是GPVI細胞外結構域單體，表現膠原蛋白結合親和力并減弱膠原蛋白誘導的血小板凝集(21)。
為定義GPVI-Fc-二聚體-膠原蛋白互作完成了結合檢測。可溶性GPVI以可飽和方式與固定化的膠原蛋白結合。與纖維狀膠原蛋白結合的GPVI-Fc-二聚體是高親和性的，因為它對固定化的vWF或BSA不發生結合。此外，與固定化膠原蛋白結合的GPVI能被可溶性膠原蛋白抑制。需要高濃度的可溶膠原蛋白來阻斷GPVI-Fc-二聚體結合，這指示融合蛋白以高親和力與固定化的膠原蛋白結合。相應地，已經報道了GPVI-膠原蛋白互作的高結合和解離常數(KD約為5.8×10-7M)(21)。
較早時候已證實，可溶性Fc-GPVI-nt能減弱對以高親和力與GPVI結合的膠原蛋白或convulxin(蛇毒素)應答的血小板激活和凝集(6；21；27)。除了血小板凝集，GPVI還關鍵地參與血小板對膠原蛋白的粘附過程(3；22)。因此，在本研究中我們體外測試了在生理流條件下Fc-GPVI-nt對血小板粘附的效應。我們顯示，可溶性Fc-GPVI-nt在體外低和高剪切條件下以劑量依賴方式抑制血小板粘附。在Fc-GPVI-nt而非對照Fc肽存在下，基本上未出現附著血小板的凝集，表明GPVI通過固定化的膠原蛋白促成血小板粘附和之后的激活這兩個過程。GPVI以受體密度依賴方式進行膠原蛋白應答(即粘附和凝集)(22)。相應地，已經報道，如果轉染RBL-2H3細胞的GPVI表達降低超過50％，則這些細胞中缺乏由膠原蛋白誘導的凝集(8；22)。雖然由于已經報道了在小樣本群體中GPVI受體密度的低可變性(22)，仍然可以預計對膠原蛋白-GPVI結合約50％的抑制足以減弱血小板向已暴露膠原蛋白的募集。在本研究中，需要1mg/kg Fc-GPVI-nt的劑量來誘導流體條件下對血小板粘附的顯著抑制，這支持在各膠原蛋白纖維中具有多個GPVI結合位點的想法。需要類似量的功能阻斷型抗-GPVI抗體來減弱體內血小板-血管壁損傷(3)。
纖維狀膠原蛋白是正常血管壁中，以及動脈粥樣硬化損傷中的主要成分(28)。動脈粥樣硬化斑塊的破裂或裂隙導致膠原蛋白纖維暴露于循環血小板。如以前所報道的，GPVI-膠原蛋白互作本質上參與血管損傷后的動脈血栓形成(3)。這里我們證實了動脈損傷后可溶性Fc-GPVI-nt對血小板募集的體內效應。內皮剝落由對該頸動脈的可逆扎緊誘導，根據描述的，血小板附著的動力學過程通過活體視頻熒光顯微術進行監視(3)。我們首次體內證實了，可溶性Fc-GPVI-nt減弱內皮剝落后的穩定血小板粘連、粘附和血小板凝集。Fc-GPVI-nt對血小板募集的抑制是劑量依賴型的。除了阻止血小板的穩定捕獲之外，Fc-GPVI-nt還顯著降低在內皮剝落部位的初始血小板粘連/緩慢表面易位。我們早前已經證實，對GPIba或GPVI的抑制以相似的程度減弱血小板粘連程度(3)，這支持了GPVI和GPIbα互作需要接觸作用以促進血小板向內皮下膠原蛋白的粘連(2；29-31)。實際上，已經報道的GPVI-配體互作的高結合解離率(“on”-and“off”-rates)(22)與GPVI作為粘連受體的作用是一致的。
本發明將Fc-GPVI-nt鑒定為減弱血管損傷后動脈血栓形成的藥物中的活性成分。這個概念得到用組織化學所證實的Fc-GPVI-nt靶向血管損傷部位的已暴露內皮下層這一觀察結果的進一步支持。這暗示著，對GPVI-膠原蛋白互作的抑制可能被限制在血管損傷位點，而對血小板功能的延長的系統性抑制受到未結合Fc-GPVI-nt的預計的短半衰期的限制。相反，施用針對GPVI的單克隆抗體不可避免地導致對所有循環血小板上的GPVI的系統性抑制。而且，施用Fc-GPVI-nt并不影響血小板計數。相反，抗-GPVI mAbs可能最終導致免疫血小板減少癥或循環血小板上GPVI完全喪失(14；32)，從而妨礙它們在臨床實踐中的用途。因此，與以抗-GPVI mAb為基礎的策略相比，Fc-GPVI-nt療法將可能具有較低的臨床出血風險。
血管損傷位點的血小板粘附和凝集對于止血是關鍵的，但可能導致動脈粥樣硬化環境下動脈阻塞以及例如冠狀動脈血栓形成和心肌梗死這樣的沉積性疾病。靜脈內GPIIb-IIIa受體抑制劑的應用顯著改善了進行冠狀動脈支架術的病人的臨床成功率(33-35)。然而，已經報道嚴重的流血并發癥妨礙了用阿昔單抗進行治療的病人的成功率(36)。本發明證實，Fc-GPVI-nt對GPVI-膠原蛋白互作的抑制足以在體外和體內都顯著降低血小板粘附；然而，GPVI的可溶形式只適度延長尾部出血時間。類似地，在帶有GPVI缺陷型血小板的病人中已經報道了中度的出血疾病(37)，這指示甚至在完全缺失GPVI時凝固和止血也是有效的。這種差異可能部分由這一事實引起對GPVI的抑制或缺失不干擾對膠原蛋白以外的血小板激動劑，例如ADP、組織因子或凝血酶，應答而產生的血小板凝集。相反，對GPIIb-IIIa的直接抑制，例如通過7E3或其人源化衍生物，阻斷了纖維蛋白原與血小板的結合——它是血小板凝集的關鍵過程，并顯著減弱血小板對大多數目前已知的激動劑的凝集。因此，與以抗-GPIIb-IIIa為基礎的策略相比，Fc-GPVI-nt療法將可能具有較低的臨床出血風險。
總之，本發明首先提供體內證明在體外流式條件下以及在體內小鼠頸動脈中的內皮剝落后，Fc-GPVI-nt減弱血小板粘附。這進一步支持了這一概念GPVI-膠原蛋白互作在血栓形成的所有階段，即在動脈損傷(例如急性冠狀動脈綜合征)部位的血小板粘連、穩定粘附、和凝集，中都起著重要作用。本發明進一步支持這一概念GPVI在動脈粥樣硬化進程中起重要作用。此外，本發明首次顯示GPVI和糖尿病間的因果關系。
參照以下特定實施例，本發明現將得到更進一步的詳細描述。
實施例動物。特定無病C57BL6/J小鼠來自Charles River(Sulzfeld，Germany)。用12周齡的雄性小鼠進行試驗。對動物進行的所有試驗程序都已經過德國動物保護立法會(German legislation onprotection of animals)批準。
單克隆抗體。根據所述產生單克隆抗體(mAb)抗GPVI(JAQ1)和抗GPIbα(p0p/B)和源自JAQ和p0p/B的Fab片段(Bergmeier，W.，Rackebrandt，K.，Schroder，W.，Zirngibl，H.& Nieswandt，B.Structural and functional characterization of the mouse vonWillebrand factor receptor GPIb-IX with novel monoclonalantibodies.Blood 2000；95，886-893；Nieswandt，B.，Bergmeier，W.，Rackebrandt，K.，Gessner，J.E.& Zirngibl，H.Identification ofcritical antigen-specific mechanisms in the development ofimmune thrombocytopenic purpura in mice.Blood 2000；96，2520-2527)。無關對照大鼠IgG獲自Pharmingen(Hamburg，Germany)。
GPVI-缺陷型小鼠的產生。
為產生缺失GPVI的小鼠，用100μg JAQ1 i.c.注射C57BL6/J野生型小鼠。注射mAb后第五天將動物用于血小板粘附體內評估。用Western印跡分析和流式細胞術核實血小板上GPVI表達的缺失。
流式細胞術用改良Tyrodes-HEPES緩沖液(134mM NaCl，0.34mM Na2HPO4，2.9mM KCl，12mM NaHCO3，20mM HEPES，5mM葡萄糖，和1mM MgCl2，pH6.6)以1∶30稀釋獲自野生型C57BL6/J小鼠或GPVI-清除型小鼠的肝素化全血。將樣品與用熒光團標記的mAb抗-GPVI(JAQ1)和抗-CD41在室溫下孵育10分鐘，并直接在FACScanTM(Becton Dickinson)上進行分析。
可溶性人和鼠GPVI的克隆、病毒表達和純化。為產生人GPVI的可溶形式，根據下面實施例1至3對人GPVI細胞外結構域進行克隆并將其與人免疫球蛋白Fc結構域融合。制備編碼GPVI-Fc-融合蛋白或對照Fc的腺病毒構建物以產生重組蛋白。用人HELA細胞系以分泌可溶形式表達GPVI-Fc和對照Fc以防止錯誤折疊和被表達蛋白的非糖基化。
實施例1免疫粘附素GPVI(Fc-GPVI-nt)的克隆通過產生同時具有GPVI n-末端部分和IgG Fc部分的重組融合蛋白，我們構造了GPVI受體免疫粘附素，其中GPVI n-末端部分編碼GPVI細胞外結構域。用正向引物5′-cgcggggcggccgcgagt-ccaaatcttgtgacaaaac-3′和反向引物5′-gcgggaagctttcatttacccggagacagggag-3′進行PCR從人心臟cDNA文庫(Clonetech，Palo Alto，CA)擴增得到Fc。用Expand HighFidelity PCR Sytem(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)在58℃退火溫度下進行20循環以完成PCR反應。將PCR片段克隆進帶有NotI/HindIII的質粒pADTrack CMV，并通過測序對序列進行核查(MediGenomix，Martinsried，Germany)。
為克隆人GPVI細胞外結構域，根據制造商的程序從培養的巨核細胞分離RNA(RNeasy Mini試劑盒；Qiagen，Hilden，Germany)，并用2μg RNA在37℃過夜完成反轉錄(Omniscript RT試劑盒；Qiagen)。將100ng反應物用做模板，用引物5′-gcggggagatctaccaccatgtctccatccccgacc-3′和5′-cgcggggcggccgccgttgcccttggtgtagtac-3′進行hGPVI的PCR擴增反應。用Expand High Fidelity PCR Sytem(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)在54℃退火溫度下進行24循環以完成PCR反應。將PCR片段克隆進帶有BgIII/NotI的質粒pDATrackCMV，并通過測序對序列進行核查。
基于Fc-GPVI-nt的單體融合蛋白的構建用引物對5′-cgcggggcggccgcccagcacctgaactcctg-3′和5′-cgcggggatatctcatttacccggagacagggag-3′和模板pADTrack CMVgpVI-Fc，PCR擴增Fc單體片段。用Expand High Fidelity PCR Sytem(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)在58℃退火溫度下進行20循環以完成PCR反應。如上所述克隆Fc單體PCR片段(NotI/EcoRV)和來自pADTrack CMV gpVI-Fc(BglII/NotI)的gpVI片段。
實施例2產生Fc-GPVI-nt的腺病毒(Ad-Fc-GPVI-nt)質粒pADTrack CMV Fc-GPVI-nt用PmeI(New England Biolabs，Beverly，MA)線性化過夜，去磷酸化并純化(GFX DNA and GelPurification Kit；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。為進行重組，用1μg線性化的質粒和0.1μg pAdeasy1共轉化電感受態大腸桿菌BJ5183(Stratagene，La Jolla，California)，轉化條件為2500V，200Ω和25μFD(E.coli-pulser；Biorad，Heidelberg，Germany)，鋪平板并于37℃培養過夜。微量制備帶有PacI的質粒-DNA后核查克隆，并將陽性克隆重新轉化進大腸桿菌DH5α。
為轉染(Effectene Transfection reagent；Qiagen，Hilden，Germany)293細胞，用PacI消化質粒-DNA。細胞培養7天，通過刮取收集并離心。將離心物重懸于Dulbecco’s PBS中，并經四次反復凍(-80℃)融(37℃)循環將細胞裂解。離心除去細胞碎片，裂解物保存于-80℃。
為重組病毒的斑點選擇，室溫下將293細胞在含有不同稀釋倍數轉染裂解物的Dulbeccos PBS中輕輕攪動感染1小時。感染后，用含0.5％瓊脂糖的生長培養基(改良Eagles培養基2×和Gibco LifeTechnologies #21935的1∶1混合物，補加了20％血清、2×青霉素/鏈霉素、2×L-谷胺酰胺和溶于水中的1％瓊脂糖，Seacam)覆蓋細胞。感染后5～14天，監視細胞層斑塊的形成，用巴斯德吸管挑取斑塊，重懸于0.5ml Dulbeccos PBS，并保存于-80℃。斑塊進一步用于在293細胞上的擴增循環。
表達穩定CHO的人gpVI-Fc單體的構建根據實施例2產生表達單體的細胞。
實施例3Fc-GPVI-nt蛋白質和Fc對照免疫粘附素的純化感染后2天收集Ad-Fc-GPVI-nt-感染的Hela細胞培養物上清液，離心(3800g，30分鐘，4℃)并過濾(0.45μm)。加入1倍體積的硫酸銨(761g/l)使免疫粘附素沉淀，4℃攪拌過夜。離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質成團，溶于0.1倍體積的PBS，并在PBS中4℃透析過夜。離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質溶液澄清，并將其上載至蛋白質A柱(HiTrapTMprotein A HP，Amersham PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden)。用結合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0，0.02％ NaN3)洗滌柱直至OD280＜0.01，并用洗脫緩沖液(100mM甘氨酸pH2.7)洗脫。用中和緩沖液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％NaN3)中和洗脫的級分，收集，在PBS中4℃透析過夜，等量分裝并冷凍于-20℃。
根據考馬斯藍染色、或用過氧化物酶綴合的山羊抗-人Fc抗體或抗-GPVI mAb 5C4做的免疫印跡檢測，Fc-GPVI-nt蛋白在SDS-PAGE中的還原條件下分子量為～80kDa(附圖1a，上圖和中圖)。相反，在非還原條件下鑒定到了～160kDa的蛋白質(附圖1a，下圖)，這支持了這一想法GPVI-Fc僅以二聚體形式獲得(21)。
實施例4GPVI抑制劑篩選檢測試驗在100μl 50mM Tris/HCl pH8.0中，用1μg/孔膠原蛋白(I型，牛；BD Bioscience，Bedford，MA)于4℃包被ELISA板(Immulon2HB，Dynx Technologies，Chantilly，VA)過夜。將板用250μl/孔PBS/0.05％Tween 20(PBST)洗滌兩次，并用250μl/孔Roti-Block(Roth，Karlsruhe，Germany)封閉過夜。將板用250μl/孔PBST洗滌兩次。加入100μl溶于PBST中的Fc-GPVI-nt(理想的是2μg/孔)，并將板在室溫下孵育1小時。用250μl PBST洗滌五次后，加入100μl以1∶10000稀釋的過氧化物酶綴合的山羊抗-人IgG抗體(Dianova，Hamburg，Germany)，于室溫下孵育1小時。用250μl PBST重復洗滌后，加入100μl檢測試劑(BM Blue POD Substrate；Roche，Mannheim，Germany)，并孵育15分鐘。加入100μl 1M H2SO4使反應終止，于450nm處測定板，對照波長為690nm。為篩選潛在的抑制劑，將測試化合物以不同濃度加到100μl PBST孵育物中。
實施例5血小板凝集和發光測定用兩通道Chronolog凝集測定計(Nobis，Germany)于37℃在檸檬酸化血液樣品中通過光學凝集測定來評估離體或體外血小板凝集。通過離心(200g，20分鐘)從檸檬酸化的全血制備血小板富集的血漿。用自體同源血漿將最終的血小板計數調節至2×108血小板/ml。基線調節后，加入0.2至4μg/ml的膠原蛋白(I型，牛)，記錄凝集5分鐘。同時，用螢火蟲發光測定法記錄ATP釋放。用50μg/ml單克隆GPVI抗體JAQ1孵育15分鐘。
實施例6GPVI/膠原蛋白互作的體外血小板粘附試驗從ACD(20％終濃度)血液制備血小板富集的血漿，并用HepesTyrode(pH6.5)將其調節至終濃度108血小板/ml。蓋玻片用不同濃度的各種粘附蛋白(膠原蛋白、vWF)單層包被。在產生自玻璃蓋玻片的灌注室中完成灌注研究。在代表低介質流的500/s剪切速率下和代表高剪切速率的2000/s下完成灌注。37℃下測定粘附20分鐘，之后用自動注射器泵在固定的壁剪切速率下抽室5分鐘。灌注后用HepesTyrode輕輕洗滌從室中取出的蓋玻片。用Hepes Tyrode反復洗滌蓋玻片直至完全去除粘附的血小板。用FACS測定法定量分析懸浮血小板。根據標準流式細胞程序通過分析表面標記(CD41；CD61和CD62P)的表達對血小板功能狀態的分析作進一步評估。
實施例7為活體顯微檢查制備血小板血小板(野生型，或GPVI-缺陷型)分離自所述的(Massberg，S.等人，Platelet-endothelial cell interactions duringischemia/reperfusionthe role of P-selectin.Blood 1998；92，507-515)全血，并用5-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(DCF)。將DCF-標記的血小板懸浮液調節至終濃度200×106血小板/250μl。在指明的地方，用50μg/ml抗-GPVI(JAQ1)Fab片段、或抗GPIbα(p0p/B)Fab片段將熒光野生型血小板預孵育10分鐘。之后，將經過預處理的血小板和Fab片段一起注入野生型受體小鼠，頸動脈損傷前或后用體內視頻顯微術評估血小板粘附，如下述。
實施例8通過活體顯微術估測血小板粘附和凝集。
腹膜內注射咪達唑侖(5mg/kg體重，Ratiopharm，Ulm，Germany)、美托咪定(0.5mg/kg體重，Pfizer，Karlsruhe，Germany)、和芬太尼(0.05mg/kg體重，CuraMed Pharma GmbH，Munich，Germany)溶液麻醉野生型C57BL6/J或GPVI-缺陷型小鼠。將聚乙烯導管(Portex，Hythe，England)植入右頸靜脈，并經靜脈內注入熒光血小板(200×106/250μl)。將右總頸7動脈分離出來，并在頸動脈二分叉處緊扎5分鐘，以誘導血管損傷。血管損傷之前及之后借助對右總頸動脈的體內視頻顯微術將熒光血小板原位可視化。用帶100W HBO水銀燈落射顯微鏡燈的Zeiss Axiotech顯微鏡(20×水浸物鏡，W20×/0.5，Zeiss)監視血小板-血管壁互作。用計算機輔助圖像分析程序(Cap Image 7.4，Dr.Zeintl，Heidelberg，Germany)評估所有視頻記錄的圖像。將瞬間附著的血小板定義為以顯著低于中線速度的速度穿過血管假想垂直線的細胞；它們的數量以每mm2內皮表面的細胞數表示。通過10秒鐘內未移動或未從內皮表面脫離的細胞進行計數來估算附著的血小板數量。還定量了在血管損傷處凝集的血小板數量，并以每mm2表示。
實施例9掃描電子顯微術。
活體視頻熒光顯微術后，用PBS(37℃)灌注頸動脈1分鐘，之后用磷酸緩沖的戊二醛(1％vol/vol)灌注固定。將頸動脈切離，縱向切開，浸沒在1％PBS-緩沖的戊二醛中進一步固定12小時，在乙醇中脫水，并用CO2做臨界點干燥處理。之后，將頸動脈樣本內腔暴露定向，用碳染料封固，噴鉑包被，并用場發射掃描電子顯微鏡(JSM-6300F，Jeol Ltd.，Tokyo，Japan)檢查。
實施例10對與固定化膠原蛋白結合的Fc-GPVI-nt的評估。檢測Fc-GPVI-nt與固定化膠原蛋白的結合。用1μg膠原蛋白(I型，牛；BD Bioscience，Bedford，MA)在100μl包被緩沖液(1.59g/l Na2CO3，2.93g/l NaHCO3，0.2g/l NaN3，pH9.6)中將ELISA板(Immulon2HB，Dynx Technologies，Chantilly，VA)在4℃包被過夜。板用250μl/孔PBS/0.05％ Tween 20(PBST)洗滌兩次，并用250μl/孔Roti-Block(Roth，Karlsruhe，Germany)封閉過夜。板用250μl/孔PBST洗滌兩次，之后添加3.0、6.0、12.5、25.0、50.0或100μg/ml溶于PBST的Fc-GPVI-nt，室溫下將板孵育1小時。在指明的地方，Fc-GPVI-nt(20μg/ml)與可溶性膠原蛋白預孵育10分鐘。孵育后將板用250μl PBST洗滌五次，并以1∶10000稀釋加入特異性的過氧化物酶綴合的山羊抗-人IgG抗體Fcγ片段(109-035-098；Dianova，Hamburg，Germany)，室溫下孵育一小時。用250μl PBST洗滌五次后，加入100μl探測試劑(BM Blue POD Substrate；Roche，Mannheim，Germany)，孵育至10分鐘。加入100μl 1M H2SO4使反應終止，在450nm處測定板，參照波長為690nm。
Fc-GPVI-nt與固定化膠原蛋白的結合表現劑量依賴和可飽和方式(附圖9b)。在6.0μg/ml的Fc-GPVI-nt終濃度處觀察到半最大膠原蛋白結合。GPVI-Fc未出現對BSA、vWF(附圖9c，左圖)或Poly-L-Lysin(未顯示)的結合，這支持了Fc-GPVI-nt結合的特異性。此外，在相同條件下我們未探測到缺少外部GPVI結構域的對照Fc結構域的顯著結合(附圖9c，右圖)。
為進一步說明GPVI-結合的特異性，我們測試了可溶性纖維狀膠原蛋白與固定化膠原蛋白競爭結合Fc-GPVI-nt的能力。可溶性膠原蛋白以劑量依賴方式抑制Fc-GPVI-nt與固定化膠原蛋白的結合(附圖9d)。將Fc-GPVI-nt結合降低超過50％需要濃度為100μg/ml的可溶膠原蛋白。這些資料共同表明，Fc-GPVI-nt與膠原蛋白的結合是特異性的，而且是以高親和力為特征的。
實施例11針對人GPVI的單克隆抗體的產生。基本根據(17)所述產生單克隆抗體。用腺病毒表達的人Fc-GPVI-nt融合蛋白免疫Lou/C大鼠。用Fc-GPVI-nt或GPVI結構域缺失的Fc在固相免疫檢測中篩選雜交瘤上清液。篩選鑒定了與Fc-GPVI-nt特異性結合但不與缺失外部GPVI結構域的Fc結合的雜交瘤5C4上清液。用大鼠Ig類別(抗-IgM)和IgG亞類特異性小鼠mAbs確定了免疫球蛋白類別。用蛋白質G-瓊脂糖凝膠(Protein G-Sepharose)柱純化單克隆抗體。通過針對Fc-GPVI-nt和對照Fc的免疫印跡核實了5C4的抗體特異性。5C4單克隆抗體探測到腺病毒表達的Fc-GPVI-nt，但不探測對照Fc。此外，從獲自人的血小板的裂解液中回收人GPVI。此外，如流式細胞術所證實的，5C4特異性與血小板表面結合，而不與白細胞或紅細胞結合(未顯示)。
實施例12對CD62P外化的FACS測定。從志愿者收集人檸檬酸鹽血液。2000rpm 4℃離心洗滌(PBS 1×；pH7.2)并重懸之后產生血小板富集的血漿(PRP)。將稀釋于含有0.1％疊氮化鈉和2％胎牛血清(FBS)、2mM CaCl2的染色緩沖液(1×PBS(w/o Ca2+和Mg+)中的PRP，在Fc-GPVI-nt(100μg/ml)或等摩爾濃度對照Fc存在下，與馬1型膠原蛋白孵育(0；2；5和10μg/ml；Nobis)。加入用熒光團過氧化物酶標記的抗CD62P抗體(Immunotech)。用BectonDickenson FACScalibur裝置完成FACS測定。
根據CD62P外化的指示，提高的膠原蛋白濃度導致血小板從α顆粒分泌。根據FACS所檢測的，膠原蛋白與Fc-GPVI-nt的共孵育使CD62P的外化鈍化(附圖10)。
實施例13血小板凝集和ATP釋放。如上述產生PRP。在全血凝集測定計(Whole-Blood-Aggregometer)500VS(Chrono-LogCorporation)中測定凝集。用Thyrodes-HEPES緩沖液(2.5mmol/lHEPES，150mmol/l NaCl，12mmol/l NaHCO3，2,5mmol/l KCl，1mmol/lMgCl2，2mmol/l CaCl2，5,5mmol D-Glucose，1mg/ml BSA，pH7.4)將來自PRP的血小板細胞數調節至1.0×108細胞/ml。添加Chrono-Lume #395(Chrono-Log Corporation)以進行ATP測定。將激動劑加入血小板，吸入凝集測定計中，在所定義的攪拌條件下開始凝集。根據由于血小板凝結而發生的光傳播改變來測定凝集，并將其標準化成內部標準。在Chrono-Lume的ATP特征波長處測定ATP釋放，并根據制造商的說明將其標準化成內部標準。
Fc-GPVI-nt特異性抑制由膠原蛋白介導的激動劑刺激(附圖11a &b)引起的血小板凝集和ATP釋放。ADP-和凝血酶-介導的(TRAP 10μM)血小板凝集和ATP釋放不受Fc-GPVI-nt的影響。
實施例14人血小板的PDGF釋放。如上所述制備來自人志愿者的PRP。根據制造商的說明用試劑盒系統(R&D Systems #DHD00B)測定PDGF從人血小板的釋放。在對照條件和Fc-GPVI-nt(100μg/ml)或等摩爾濃度對照Fc存在下用1型膠原蛋白(20μg/ml；Nobis)刺激PDGF釋放。將PDGF釋放標準化為制造商的標準探針。
作為內源遞質從血小板α顆粒釋放的指示的PDGF釋放在膠原蛋白刺激后也被鈍化(Fig 11c)。
實施例15Fc-GPVI-nt體外對人全血流血時間的效應。用PFA-100裝置(Dade-Behring)測定體外流血時間。將800μl人全血注入PFA-100裝置。根據制造商的說明，用經ADP/膠原蛋白和腎上腺素/膠原蛋白包被的測定細胞來測定流血時間。
不同激動劑刺激后，濃度升高的Fc-GPVI-nt未顯著延長體外(PFA-100裝置)流血時間。相反，治療相關濃度的ReoPro在PFA-100裝置中最大程度地延長了流血時間(Fig 12)實施例16流式條件下可溶性GPVI對血小板粘附于固定化膠原蛋白的效果。如(18)所述，人血小板分離自ADC-抗凝結全血。將洗滌過的血小板重懸于Tyrodes-HEPES緩沖液(2.5mmol/l HEPES，150mmol/l NaCl，12mmol/l NaHCO3，2,5mmol/l KCl，1mmol/l MgCl2，2mmol/l CaCl2，5,5mmol D-Glucose，1mg/ml BSA，pH7.4)以獲得2×108細胞/ml的血小板計數。在200μg/ml Fc-GPVI-nt或對照Fc存在下在平行板流式腔中測定血小板對經固定化膠原蛋白包被的板的粘附。
GPVI在體外血小板向固定化膠原蛋白的募集過程中起重要作用(22)。我們在體外測定了剪切條件下Fc-GPVI-nt對人血小板向固定化膠原蛋白粘附的效果。正如他人在早前的報道(23)中所述，血小板在低(500秒-1)或高(1000秒-1)剪切速率下都穩定粘附于固定化膠原蛋白而形成血栓(附圖13)。可溶性Fc-GPVI-nt，而非缺乏外部GPVI結構域的對照Fc，在剪切速率500秒-1和1000秒-1時分別將血小板向固定化膠原蛋白的粘附顯著減弱37和44％(附圖13)。抑制是特異性的，因為Fc-GPVI-nt不影響血小板向固定化vWF的粘附。
實施例17Fc-GPVI-nt血漿濃度的測定用定量測定人IgG的IMMUNO-TEK ELISA系統(ZeptoMetrix Corporation；Cat #0801182)來完成。使用了針對Fc-GPVI-nt的Fc部分的特異性過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG抗體(Dianova)。根據制造商的說明書在用PBS-T進行的幾個洗滌步驟之后，加入過氧化物酶底物(BM Blue POD，Roche)，并在ELISA檢測讀取器(Tecan Sunrise)中于450特征性nm波長處進行測定。通過與內部人IgG標準進行比較對Fc-GPVI-nt濃度進行定量。Fc-GPVI-nt在體內顯示令人滿意的藥物代謝動力學。小鼠腹膜內單次注射后24小時可以測得高血漿水平，融合蛋白的半衰期超過96小時(附圖14a)。重復腹膜內注射導致融合蛋白在血液中聚集(附圖14b)，這暗示著長期應用于慢性疾病治療的令人滿意的動力學。以提高的劑量單次靜脈內注射Fc-GPVI-nt后，5至60分鐘直至14小時后可探測到劑量依賴型血漿Fc-GPVI-nt濃度(附圖14c)。
實施例18為離體熒光顯微術制備鼠血小板。如早前(19)報道的，鼠血小板分離自全血，并用5-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(DCF)標記。將DCF標記的血小板懸浮液調節至終濃度200×106血小板/250μl。如下述，頸動脈損傷之前和之后借助體內視頻顯微術評估鼠血小板粘附。
實施例19頸動脈緊扎以及借助活體顯微術所作的血小板粘附和凝集評估。如早前(3)所報道的，完成內皮剝落后的血小板募集。簡言之，腹膜內注射咪達唑侖(5mg/kg體重，Ratiopharm，Ulm，Germany)、美托咪定(0.5mg/kg體重，Pfizer，Karlsruhe，Germany)、和芬太尼(0.05mg/kg體重，CuraMed Pharma GmbH，Munich，Germany)溶液麻醉野生型C57BL6/J小鼠。在指明的地方，經靜脈內注射Fc-GPVI-nt(1或2mg/kg體重)或與2mg/kg Fc-GPVI-nt等摩爾量的對照Fc。之后，通過在頸動脈二分叉附近緊扎5分鐘誘導內皮脫落。誘導血管損傷后，經植入右側頸靜脈的聚乙烯導管(Portex，Hythe，England)靜脈內注入熒光血小板(200×106/250μl)。借助帶100WHBO水銀燈落射顯微鏡燈的Zeiss Axiotech顯微鏡(20×水浸物鏡，W20×/0.5，Zeiss)通過對右側頸總動脈的體內視頻顯微術將熒光血小板原位可視化。用計算機輔助圖像分析程序(Cap Image 7.4，Dr.Zeintl，Heidelberg，Germany(19；20))評估所有視頻記錄的圖像。將粘連的血小板定義為所有與血管壁建立初始接觸、之后緩慢表面易位(以顯著低于中線速度的速度)或穩定粘附的細胞；它們的數量以每mm2內皮表面的細胞數表示。通過對10秒鐘內未移動或未從內皮表面脫離的細胞進行計數來估算附著血小板的數量。還定量了在血管損傷處凝集的血小板數量，并以每mm2表示。此外，還用Cap Image7.4評估了總血栓面積。
實施例20掃描電子顯微術。活體視頻熒光顯微術后，用PBS(37℃)灌注各組三只動物頸動脈一分鐘，之后用磷酸緩沖的戊二醛(1％vol/vol)灌注固定。切出頸動脈，縱向切開，浸沒在1％PBS-緩沖的戊二醛中進一步固定12小時，在乙醇中脫水，并用CO2做臨界點干燥處理。之后，將頸動脈樣本內腔暴露定向，用碳染料封固，噴鉑包被，并用場發射掃描電子顯微術檢查(JSM-6300F，Jeol Ltd.，Tokyo，Japan)。
實施例21通過免疫組織化學對體內Fc-GPVI-nt結合的評估。將經過Fc-GPVI-nt處理的小鼠頸動脈快速冷凍并包埋入cryoblock(medite，Medizintechnik GmbH，Burgdorf，Germany)。在經特異性過氧化物酶綴合的山羊抗-人IgG抗體Fcγ片段染色的5μm低溫保持切片上測定Fc-GPVI-nt對內皮和內皮下層的結合(109-035-098；Dianova，Hamburg，Germany)。將獲自經Fc處理的小鼠的頸動脈作為對照。
實施例22可溶性GPVI對體內血小板計數、流血時間和血小板粘附的影響。
用2mg/kg或4mg/kg Fc-GPVI-nt或等摩爾劑量的缺失外部GPVI結構域的對照Fc處理動物。甚至以最高劑量4mg/kg注入Fc-GPVI-nt或對照Fc也未顯著影響外周血小板計數。此外，與對照動物相比，Fc-GPVI-nt融合蛋白未誘導出任何尾部出血時間的顯著延長(附圖15a)。用PBS處理的小鼠的絕對出血時間是1.9±0.9，用2mg/kg或4mg/kg Fc-GPVI-nt處理的小鼠中絕對出血時間為2.9±1.9分鐘和4.6±0.6分鐘。相反，在經Integrilin(0.2mg每kg IV)處理的動物中，出血時間被大大延長(42.6±21.6)。
小鼠頸動脈損傷模型中Fc-GPVI-nt對血小板募集的影響可以用活體熒光顯微術進行研究。如上所述，用1mg/kg或2mg/kg Fc-GPVI-nt或等摩爾量缺少外部GPVI結構域的對照Fc處理小鼠。注入Fc-GPVI-nt或對照Fc后，如之前(3)報道的，通過緊扎誘導小鼠頸動脈內皮脫落。持續結扎頸動脈導致內皮細胞層的完全脫落。借助體內熒光顯微術將血小板粘附直接可視化并定量(19；20)(附圖15d)。在對照(經Fc處理的)小鼠中，在內皮脫落后最初的幾分鐘內無數血小板粘連至血管壁(12.026±1.115粘連的血小板/mm2)。與內皮下層建立接觸的血小板最初表現緩慢的表面易位，表面易位后常常出現隨后的血小板牢固粘附和凝集(5.494±874附著的血小板/mm2和114±17血小板血栓/mm2)。相反，在Fc-GPVI-nt存在下，血小板向血管損傷處的募集被劇烈減弱。與經Fc-處理的動物相比，用1mg/kg或2mg/kgFc-GPVI-nt預處理后血小板粘連被降低65和71％(P＜0.05vs.對照)。同時，穩定血小板粘附以劑量依賴方式被降低(施用1mg/kg或2mg/kg Fc-GPVI-nt后分別降低49和65％；P＜0.05vs.對照)。同樣，在經過2mg/kg Fc-GPVI-nt融合蛋白處理的動物中，基本上未出現附著血小板的凝集(P＜0.05vs.對照Fc，附圖15b-d)。掃描電子顯微術還清楚地證實，在經Fc-GPVI-nt處理而非FC預處理的小鼠中，基本上未出現總頸動脈內皮脫落后的血小板粘附和凝集(附圖15e)。為了證實損傷位點處Fc-GPVI-nt的存在，體內顯微術后將頸動脈切離，并用過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG抗體進行免疫組織化學研究。在經Fc-GPVI-nt-處理的小鼠中，在血管損傷的腔面處檢測到了Fc-GPVI-nt(附圖15f)。這些資料共同證實了，Fc-GPVI-nt特異性與體內血管損傷位點結合，并防止隨后的血小板募集。
可溶性GPVI對動脈粥樣硬化的影響。四周齡apoE-/-小鼠(TheJackson Laboratory)飼用0.25％膽固醇飲食(Harlan Research diets)六周。兩周后，對四只apoE-/-小鼠用Fc-GPVI-nt(200μg每只小鼠)每周注射兩次，同時繼續膽固醇飲食。采用類似的方案對四只apoE-/-小鼠注射對照Fc蛋白質(200μg)每周兩次，將它們用作對照小鼠。為評估斑塊形成，將動物殺死，并從動物中仔細分離出血管樹。整個主動脈和頸動脈標本用0.9％氯化鈉沖洗并固定。完整的血管標本用SUDAN III紅染色以評估斑塊形成，并在顯微鏡下觀察。用Fc-GPVI-nt對易患動脈粥樣硬化的apoE-/-敲除小鼠處理四周顯著削弱動脈粥樣硬化進程(附圖16)。
實施例23糖尿病患者血小板上的CD61和CD32表面表達的FACS測定。從111名患糖尿病的病人或363名非糖尿病患者收集人檸檬酸鹽血液。4℃ 2000rpm離心和洗滌程序(PBS 1×，pH7.2)并重懸后產生血小板富集的血漿(PRP)。加入用熒光團過氧化物酶(Immunotech)標記的抗CD61和抗CD32抗體或FITC標記的抗單克隆抗-GPVI抗體4C9。用Becton Dickenson FACScalibur裝置完成FACS測定。用熒光定量表面表達。計算CD32熒光和4C9熒光的相關性，相關系數r＝0.516。
統計分析。用Mann-Whitney Rank Sum Test完成組平均值間的比較。數據代表平均值±s.e.m.。P＜0.05的值視為顯著。
參考文獻1.Baumgartner，H.R.1977.Platelet interaction withcollagen fibrils in flowing blood.I.Reaction of humanplatelets with alpha chymotrypsin-digested subendothelium.Thromb Haemost 371-16.
2.Clemetson，K.J.和Clemetson，J.M.2001.Plateletcollagen receptors.Thromb.Haemost.86189-197.
3.Massberg，S.，Gawaz，M.，Gruner，S.，Schulte，V.，Konrad，I.，Zohlnh fer，D.，Heinzmann，U.，和Nieswandt，B.2003.A crucial role of glycoprotein VI for platelet recruitment tothe injured arterial wall in vivo.J.Exp.Med.19741-49.
4.Moroi，M.，Jung，S.M.，Okuma，M.，和Shinmyozu，K.1989.Apatient with platelets deficient in glycoprotein VI that lackboth collagen-induced aggregation and adhesion.J Clin.Invest841440-1445.
5.Clemetson，J.M.，Polgar，J.，Magnenat，E.，Wells，T.N.，和Clemetson，K.J.1999.The platelet collagen receptorglycoprotein VI is a member of the immunoglobulin superfamilyclosely related to FcalphaR and the natural killer receptors.J Biol.Chem.27429019-29024.
6.Jandrot-Perrus，M.，Busfield，S.，Lagrue，A.H.，Xiong，X.，Debili，N.，Chickering，T.，Le Couedic，J.P.，Goodearl，A.，Dussault，B.，Fraser，C.等人2000.Cloning，characterization，and functional studies of human and mouse glycoprotein VIaplatelet-specific collagen receptor from the immunoglobulinsuperfamily.Blood 961798-1807.
7.Gibbins，J.M.，Okuma，M.，Farndale，R.，Barnes，M.，和Watson，S.P.1997.Glycoprotein VI is the collagen receptor inplatelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fcreceptor gamma-chain.FEBS Lett.413255-259.
8.Zheng，Y.M.，Liu，C.，Chen，H.，Locke，D.，Ryan，J.C.，和Kahn，M.L.2001.Expression of the platelet receptor GPVIconfers signaling via the Fc receptor gamma-chain in responseto the snake venom convulxin but not to collagen.J Biol.Chem.27612999-13006.
9.Suzuki-Inoue，K.，Tulasne，D.，Shen，Y.，Bori-Sanz，T.，Inoue，O.，Jung，S.M.，Moroi，M.，Andrews，R.K.，Berndt，M.C.，和Watson，S.P.2002.Association of Fyn and Lyn with the prolinerich domain of GPVI regulates intracellular signalling.JBiol.Chem..
10.Barnes，M.J.，Knight，C.G.，和Farndale，R.W.1998.Thecollagen-platelet interaction.Curr.Opin.Hematol.5314-320.
11.Falet，H.，Barkalow，K.L.，Pivniouk，V.I.，Barnes，M.J.，Geha，R.S.，and Hartwig，J.H.2000.Roles of SLP-76，phosphoinositide 3-kinase，和gelsolin in the platelet shapechanges initiated by the collagen receptor GPVI/FcR gamma-chaincomplex.Blood 963786-3792.
12.Pasquet，J.M.，Gross，B.，Quek，L.，Asazuma，N.，Zhang，W.，Sommers，C.L.，Schweighoffer，E.，Tybulewicz，V.，Judd，B.，Lee，J.R.等人1999.LAT is required for tyrosinephosphorylation of phospholipase cgamma2 and plateletactivation by the collagen receptor GPVI.Mol.Cell Biol.198326-8334.
13.Berlanga，O.，Tulasne，D.，Bori，T.，Snell，D.C.，Miura，Y.，Jung，S.，Moroi，M.，Frampton，J.，和Watson，S.P.2002.The Fc receptor gamma-chain is necessary和sufficient toinitiate signalling through glycoprotein VI in transfectedcells by the snake C-type lectin，convulxin.Eur.J.Biochem.2692951-2960.
14.Sugiyama，T.，Okuma，M.，Ushikubi，F.，Sensaki，S.，Kanaji，K.，和Uchino，H.1987.A novel platelet aggregatingfactor found in a patient with defective collagen-inducedplatelet aggregation和autoimmune thrombocytopenia.Blood691712-1720.
15.Sugiyama，T.，Ishibashi，T.，和Okuma，M.1993.Functionalrole of the antigen recognized by an antiplatelet antibodyspecific for a putative collagen receptor in platelet-collageninteraction.Int.J.Hematol.5899-104.
16.Schulte，V.，Snell，D.，Bergmeier，W.，Zirngibl，H.，Watson，S.P.，和Nieswandt，B.2001.Evidence for two distinctepitopes within collagen for activation of murine platelets.J Biol.Chem.276364-368.
17.Kremmer，E.，Kranz，B.R.，Hille，A.，Klein，K.，Eulitz，M.，Hoffmann-Fezer，G.，Feiden，W.，Herrmann，K.，Delecluse，H.J.，Delsol，G.等人1995.Rat monoclonal antibodies differentiatingbetween the Epstein-Barr virus nuclear antigens 2A(EBNA2A)and2B(EBNA2B).Virology 208336-342.
18.Dickfeld，T.，Lengyel，E.，May，A.E.，Massberg，S.，Brand，K.，Page，S.，Thielen，C.，Langenbrink，K.，和Gawaz，M.2001.Transient interaction of activated platelets with endothelialcells induces expression of monocyte-chemoattractant protein-1via a p38 mitogen-activated protein kinase mediated pathway.Implications for atherogenesis.Cardiovasc.Res.49189-199.
19.Massberg，S.，Enders，G.，Leiderer，R.，Eisenmenger，S.，Vestweber，D.，Krombach，F.，和Messmer，K.1998.Platelet-endothelial cell interactions duringischemia/reperfusionthe role of P-selectin.Blood92507-515.
20.Massberg，S.，Enders，G.，Matos，F.C.，Tomic，L.I.，Leiderer，R.，Eisenmenger，S.，Messmer，K.，和Krombach，F.1999.Fibrinogen deposition at the postischemic vessel wall promotesplatelet adhesion during ischemia-reperfusion in vivo.Blood943829-3838.
21.Miura，Y.，Takahashi，T.，Jung，S.M.，和Moroi，M.2002.Analysis of the interaction of platelet collagen receptorglycoprotein VI(GPVI)with collagen.A dimeric form of GPVI，but not the monomeric form，shows affinity to fibrous collagen.J.Biol.Chem.27746197-46204.
22.Chen，H.，Locke，D.，Liu，Y.，Liu，C.，和Kahn，M.L.2002.The platelet receptor GPVI mediates both adhesion and signalingresponses to collagen in a receptor density-dependent fashion.J Biol.Chem.2773011-3019.
23.Savage，B.，Almus-Jacobs，F.，和Ruggeri，Z.M.1998.Specific synergy of multiple substrate-receptor interactionsin platelet thrombus formation under flow.Cell 94657-666.
24.van Zanten，G.H.，de Graaf，S.，Slootweg，P.J.，Heijnen，H.F.，Connolly，T.M.，de Groot，P.G.，和Sixma，J.J.1994.Increased platelet deposition on atherosclerotic coronaryarteries.J Clin.Invest 93615-632.
25.Baumgartner，H.R.，Muggli，R.，Tschopp，T.B.，和Turitto，V.T.1976.Platelet adhesion，release and aggregationin flowing bloodeffects of surface properties and plateletfunction.Thromb.Haemost.35124-138.
27.Jandrot-Perrus，M.，Lagrue，A.H.，Okuma，M.，和Bon，C.1997.Adhesion and activation of human platelets induced byconvulxin involve glycoprotein VI and integrin alpha2beta1.JBiol.Chem.27227035-27041.
28.Rekhter，M.D.1999.Collagen synthesis inatherosclerosistoo much and not enough.Cardiovasc.Res.41376-384.
29.Ruggeri，Z.M.1997.Mechanisms initiating plateletthrombus formation.Thromb.Haemost.78611-616.
30.Goto，S.，Ikeda，Y.，Saldivar，E.，和Ruggeri，Z.M.1998.Distinct mechanisms of platelet aggregation as a consequenceof different shearing flow conditions.J.Clin.Invest.101479-486.
31.Sixma，J.J.，van Zanten，G.H.，Banga，J.D.，Nieuwenhuls，H.K.，和de Groot，P.G.1995.Platelet adhesion.Semin.Hematol 3289-98.
32.Nieswandt，B.，Schulte，V.，Bergmeier，W.，Mokhtari-Nejad，R.，Rackebrandt，K.，Cazenave，J.P.，Ohlmann，P.，Gachet，C.，and Zirngibl，H.2001.Long-term antithromboticprotection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI inmice.J Exp Med 193459-469.
33.Lincoff，A.M.，Califf，R.M.，和Topol，E.J.2000.Plateletglycoprotein IIb/IIIa receptor blockade in coronary arterydisease.J.Am.Coll.Cardiol.351103-1115.
34.Neumann，F.J.和Sch mig，A.1998.GlycoproteinIIb/IIIa receptor blockade with coronary stent placement.Semin.Interv.Cardiol.381-90.
35.Bertrand，M.E.，Rupprecht，H.J.，Urban，P.，Gershlick，A.H.，和Investigators，f.2000.Double-blind study ofthe safety of clopidogrel with and without a loading dose incombination with aspirin compared with ticlopidine incombination with aspirin after coronary stentingtheclopidogrel aspirin stent international cooperative study(CLASSICS).Circulation 102624-629.
36.Foster，R.H.和Wiseman，L.R.1998.Abciximab.Anupdated review of its use in ischaemic heart disease.Drugs56629-665.
37.Arai，M.，Yamamoto，N.，Moroi，M.，Akamatsu，N.，Fukutake，K.，和Tanoue，K.1995.Platelets with 10％ of the normalamount of glycoprotein VI have an impaired response to collagenthat results in a mild bleeding tendency.Br.J Haematol.89124-130.
權利要求
1.融合蛋白，包含(a)糖蛋白VI細胞外結構域或其具有膠原蛋白結合功能的變體，和(b)免疫球蛋白的Fc結構域或其功能保守性部分，它以附圖7所示的氨基酸序列為特征，此處的融合蛋白可獲自(a)感染后2天收集已用編碼附圖7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela細胞培養物上清液；(b)離心(3800g，30分鐘，4℃)步驟(a)的上清液；(c)過濾(0.45μm)步驟(b)的上清液；(d)加入一倍體積的硫酸銨(761g/l)使免疫粘附素沉淀，并于4℃攪拌過夜；(e)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質成團，(f)將步驟(e)中的成團蛋白質溶于0.1倍體積的PBS，并在PBS中4℃透析過夜；(g)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質溶液澄清；(h)將步驟(g)中的溶液上載至蛋白質A柱(HiTrapTM蛋白質A HP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用結合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0，0.02％NaN3)洗滌柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脫緩沖液(100mM甘氨酸pH2.7)將級分洗脫；(l)用中和緩沖液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％NaN3)中和洗脫的級分；(m)合并級分；(n)4℃下將合并的級分在PBS中透析過夜，(o)將透析產物等分并于-20℃冷凍。
2.選自下組的核酸序列(i)SEQ ID No2的核酸序列或其根據遺傳密碼的簡并性編碼相同多肽的變體；(ii)編碼與由SEQ ID No2編碼的多肽具有至少70％同源性的多肽的核酸序列；(iii)編碼至少300個氨基酸的多肽的核酸，其中具有至少100個氨基酸的片段其功能是結合膠原蛋白，具有至少200個氨基酸的片段其功能是作為Fc結構域；和(iv)編碼權利要求10的融合蛋白的核酸序列。
3.權利要求1所定義的融合蛋白用于制備預防病人中動脈內血栓形成的藥物的用途，所述病人的特征在于(i)已患有活性冠狀動脈或頸動脈綜合征和(ii)具有活性動脈內損傷。
4.根據權利要求3的用途，其中病人進一步的特征為患有不穩定動脈粥樣硬化斑塊。
5.根據權利要求3的用途，其中病人進一步的特征為患有慢性動脈粥樣硬化進程。
6.根據權利要求3、4或5中任一的用途，其中藥物經非腸道途徑給藥，優選以包含0.5至5.0mg/kg的劑量形式。
7.體內篩選由GPVI介導的血小板與活性血管內損傷粘附的抑制劑的方法，所述方法包括步驟(i)提供活性血管內損傷的體內模型；(ii)在測試化合物存在下測定血小板與活性血管內損傷的粘附，和(iii)如果與測試化合物不存在時相比在測試化合物存在下血小板與活性血管內損傷的粘附更少，則將該測試化合物鑒定為GPVI的抑制劑。
8.權利要求7的方法，其中所述模型為小鼠模型。
9.根據權利要求7或8的方法，其中用體內熒光顯微術實施血小板與活性血管內損傷的粘附。
10.權利要求9的方法，其中在測試化合物存在下測定血小板與活性血管內損傷的粘附之前，將熒光血小板導入所述模型。
11.體外篩選由GPVI介導的血小板與活性血管內損傷粘附的抑制劑的方法，所述方法包括步驟(i)提供暴露膠原蛋白的表面；(ii)在預先確定的允許血小板粘附于膠原蛋白的條件下，將所述表面與血小板接觸；(iii)在測試化合物存在下測定血小板的粘附；(iii)如果與所述測試化合物不存在時相比該測試化合物存在時血小板與膠原蛋白的粘附更少，則將該測試化合物鑒定為抑制劑；和(iv)可選地測定所述抑制劑對血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
12.預防或治療動脈內血栓形成的藥物，此藥物含有權利要求1的融合蛋白或病毒載體中的權利要求2定義的核酸。
13.體外篩選糖蛋白VI與膠原蛋白結合的抑制劑的方法，包括(i)提供暴露膠原蛋白的表面；(ii)在預先確定的允許權利要求1的融合蛋白與所述表面結合的條件下，將所述表面的一部分與所述融合蛋白接觸；(iii)在與步驟(ii)相同的條件下將所述表面的另一部分與所述融合蛋白在測試化合物存在下進行接觸；(iv)確定在所述測試化合物不存在和存在的情況下，與所述表面結合的所述融合蛋白的量；(v)如果與所述測試化合物不存在時相比該測試化合物存在時所述融合蛋白與所述表面的結合更少，則將該測試化合物鑒定為抑制劑；和(vi)可選地測定所述抑制劑對血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
14.權利要求13的方法，其中所述融合蛋白帶有熒光標記。
15.治療患有急性冠狀動脈或頸動脈綜合征的病人的方法，為避免動脈內血栓形成所述方法包括向病人施用權利要求1的融合蛋白、或病毒載體中的權利要求2所定義的核酸的步驟。
16.融合蛋白用于制備治療糖尿病的藥物的用途，該融合蛋白包括(a)糖蛋白VI細胞外結構域或其具有膠原蛋白結合功能的變體，和(b)免疫球蛋白的Fc結構域或其功能保守性部分。
17.根據權利要求16的用途，其中該藥物制備成用于治療急性糖尿病并發癥。
18.根據權利要求16至20任一項的用途，其中該藥物經靜脈內給藥，優選以含有0.5至5.0mg/kg所述融合蛋白的劑量形式給藥。
19.根據權利要求16的用途，其中該藥物制備成用于治療糖尿病患者的慢性動脈粥樣硬化進程。
20.根據權利要求16至19中任一項的用途，其中該藥物經皮下或腹膜內給藥，優選以含有1至6.0mg/kg所述融合蛋白的劑量形式給藥。
21.根據權利要求16至20中任一項的用途，其中該融合蛋白如權利要求中所定義。
22.根據權利要求16至20中任一項的用途，其中該融合蛋白為二聚體融合蛋白。
23.根據權利要求1的融合蛋白用于制備治療或預防動脈粥樣硬化的藥物的用途。
24.根據權利要求22的用途，其中該藥物經皮下或腹膜內給藥，優選以含有1至6.0mg/kg所述融合蛋白的劑量形式給藥。
25.制備如權利要求1所定義的融合蛋白的方法，它包括以下步驟(a)感染后2天收集已用編碼附圖7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela細胞培養物上清液；(b)離心(3800g，30分鐘，4℃)步驟(a)的上清液；(c)過濾(0.45μm)步驟(b)的上清液；(d)加入一倍體積的硫酸銨(761g/l)使免疫粘附素沉淀，并于4℃攪拌過夜；(e)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質成團，(f)將步驟(e)中的成團蛋白質溶于0.1倍體積的PBS，并在PBS中4℃透析過夜；(g)離心(3000g，30分鐘，4℃)使蛋白質溶液澄清；(h)將步驟(g)中的溶液上載至蛋白質A柱(HiTrapTM蛋白質A HP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用結合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0，0.02％NaN3)洗滌柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脫緩沖液(100mM甘氨酸pH2.7)將級分洗脫；(l)用中和緩沖液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％NaN3)中和洗脫的級分；(m)收集級分；(n)4℃下將收集的級分在PBS中透析過夜，(o)將透析產物等分并于-20℃冷凍。
全文摘要
本發明提供一種融合蛋白，它包括(a)糖蛋白VI細胞外結構域或其具有膠原蛋白結合功能的變體，和(b)免疫球蛋白的Fc結構域或其功能保守性部分。該融合蛋白的特征在于附圖7所示的氨基酸序列，而且該融合蛋白可獲自一種以特異二聚體形式提供該融合蛋白的方法。
文檔編號A61K38/00GK1668721SQ03817279
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月5日 優先權日2002年6月7日
發明者S·瑪斯彼爾格, M·伽瓦茲, A·布爾特曼, G·曼馳, M·安格爾, M·佩魯索 申請人:普羅克得有限公司