作為甾類/非甾類抗炎、抗腫瘤和抗病毒活性分子載體的新化合物、組合物的制作方法

專利名稱：作為甾類/非甾類抗炎、抗腫瘤和抗病毒活性分子載體的新化合物、組合物的制作方法
優先權本申請要求2002年7月8日提交的美國臨時申請的60/395,190的優先權，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。
發明概述本發明涉及(a)由結構I表示的新化合物 其中M表示具有在炎性細胞內累積特性的大環內酯亞單位，V表示抗炎化合物，可以為甾類或非甾類亞單位或抗腫瘤藥亞單位或抗病毒化合物亞單位，并且L表示共價連接M和V的連接基；(b)所述化合物的藥學上可接受的鹽、前體藥物和溶劑化物；(c)這類化合物的制備方法和中間體；和(d)它們在治療人和動物炎癥、腫瘤和病毒疾病和病癥中的應用。
這類化合物可以作為前體藥物使用，前體藥物將所述化合物轉運入靶細胞并在這類靶細胞內釋放高于單獨化合物一般所達到的濃度的所述化合物；或這類化合物可以以如所給予的雜交形式具有活性。這些化合物及其應用由此是對增加上述活性組分中的一種或多種的有效性和/或功效和/或減少其副作用的技術問題的反應，通過將它們以雜交形式優先轉運至靶細胞或靶細胞鄰近處來實現。
背景技術：
傳統上可以將抗炎藥分類成甾類和非甾類。甾類抗炎化合物仍然是最有效治療炎性疾病和病癥的藥物，所述的疾病和病癥諸如哮喘、慢性阻塞性肺病；炎性鼻病，諸如過敏性鼻炎、鼻息肉；腸病，諸如克羅恩病、結腸炎、潰瘍性結腸炎；皮膚炎癥，諸如濕疹、牛皮癬、過敏性皮炎、神經性皮炎、瘙癢癥、結膜炎；自身免疫疾病，諸如類風濕性關節炎；和移植免疫抑制。此外，甾類用作治療各種惡性腫瘤的輔助化療劑，所述的惡性腫瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和其它造血系統的惡性腫瘤。除極佳的功效和有效性外，這類藥物還存在大量例如對碳水化合物代謝、鈣吸收、內源性皮質類固醇的分泌以及對垂體、腎上腺皮質和胸腺生理功能的不利副作用。近來研發的甾類對炎性疾病和過程高度有效，因為它們抑制許多炎癥介體，而其全身副作用得到減少。專利申請WO 94/13690、WO 94/14834、WO 92/13873和WO 92/13872中描述了用于局部施用在炎癥部位的所謂″軟″甾類或可水解皮質類固醇，而其全身副作用因″軟″甾類在血清中的不穩定性而得到減少，其中活性甾類快速水解成失活形式。然而，尚未發現作為用于控制諸如哮喘或克羅恩病這類疾病所需的在長期和持續治療中沒有不利作用的理想甾類。因此，對具有改善的治療特性和/或較少或較輕度副作用的甾類存在迫切需求。
具有不同作用機制的非甾類抗炎藥物對特定的炎癥介體起作用，由此提供治療作用。由于不僅在作用機制、而且在所抑制的特定炎癥介體方面存在差異，所以甾類和非甾類藥物具有不同的抗炎作用分布，由此對特定的病癥而言，某些藥物可能比其它藥物更為合適。此外，大部分非甾類抗炎藥物并非絕對具有特異性，并且在以較大劑量或長期使用時其應用伴隨有不利的副作用。已知許多非甾類抗炎藥物起內源性COX-1酶抑制劑的作用，而內源性COX-1酶在維持胃粘膜完整性方面極為重要。因此，這些藥物的應用通常導致胃粘膜受損乃至出血。(Warner T.D.《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)1999，96，7563-7568)。因此，選擇性抑制COX-2、而不抑制COX-1的活性劑對治療炎性疾病是優選的。另外，已知某些抗炎化合物(諸如茶堿)具有極窄的治療指數，其應用受限。
近來，FDA批準特異性阻斷COX-2的非甾類抗炎藥塞來考昔(celecoxib)用于治療類風濕性關節炎(Luong等《藥物治療學年鑒》(Ann.Pharmacother.)2000，34，743-760)。COX-2還在許多癌癥和癌前期損害中得到，并表達且存在選擇性COX-2抑制劑可以用于治療和預防結腸直腸癌和其它癌癥的確定證據(Taketo，M.M.，《國家癌癥研究院雜志》(J.Natl.Cancer Inst.)1998，90，1609-1620，Fournier等《細胞生物化學雜志》(J.Cell Biochem.)增刊2000，34，97-102)。
在1975年，將TNF-α定義為內毒素誘導并在體外和體內導致腫瘤壞死的血清因子(Carswell EA等，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1975，723666-3670)。除抗腫瘤作用外，TNF-α還具有許多其它在生物體內穩態和病理生理狀況方面重要的生物作用。TNF-α的主要來源為單核細胞-巨噬細胞、T-淋巴細胞和肥大細胞。
抗-TNF-α抗體(cA2)對患有類風濕性關節炎(RA)的患者具有治療作用這一發現(Elliott M等，《柳葉刀》(Lancet)，1994，3441105-1110)導致對尋找能夠作為RA的有效藥物的新TNF-α抑制劑的興趣增加。類風濕性關節炎是一種自身免疫性慢性炎癥疾病，其特征在于關節發生不可逆的病理改變。除RA療法外，TNF-α拮抗劑還可以用于許多病理狀況和疾病，諸如脊椎炎、骨關節炎、痛風和其它關節炎性疾病、膿毒癥、膿毒性休克、毒性休克綜合征、特應性皮炎、接觸性皮炎、牛皮癬、腎小球腎炎、紅斑狼瘡、硬皮病、哮喘、惡病質、慢性阻塞性非失調、充血性心力衰竭、胰島素抵抗、肺纖維化、多發性硬化、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、病毒感染和AIDS。
兩種不同的反錄病毒、即人免疫缺陷病毒(HIV)1型(HIV-1)或2型(HIV-2)在病原學上與免疫反應性疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關。HIV血清反應陽性個體開始無癥狀，而一般發生與AIDS相關的復合癥狀(ARC)，隨后發展成AIDS。受侵害個體表現出重度免疫抑制，其使他們先傾向于衰弱以及最終的致命的機會性感染。
AIDS病是HIV-1或HIV-2病毒按照其復雜的病毒生命周期產生的結果。病毒體的生命周期包括病毒體通過使病毒體保護外殼表面上的糖蛋白與淋巴細胞上的CD4糖蛋白結合而自身附著在宿主人T-4淋巴細胞免疫細胞上。一旦附著，病毒體則脫落其糖蛋白外殼、透入宿主細胞膜并且不包被其RNA。病毒體酶逆錄酶指導RNA轉錄成單鏈DNA的過程。病毒RNA被降解且生成第二DNA鏈。此時雙鏈DNA被整合入人細胞基因且這些基因用于病毒復制。RNA聚合酶將整合的病毒DNA轉錄成病毒mRNA。病毒RNA被翻譯成前體gag-pol融合多蛋白。然后該多蛋白被HIV蛋白酶裂解得到成熟病毒蛋白。因此，HIV蛋白酶與調節裂解過程級聯有關，而裂解過程導致病毒顆粒成熟成能夠具有完全傳染性的病毒。
擔負殺傷侵入的病毒體的典型人免疫系統負荷較重，因為病毒感染和殺傷免疫系統T細胞。此外，用于生成新病毒體顆粒的酶、即病毒逆錄酶并非極具特異性且產生轉錄錯誤，這種轉錄錯誤導致病毒保護外殼表面上的糖蛋白連續改變。這種特異性的缺乏降低了免疫系統的有效性，因為對一種糖蛋白特異性產生的抗體可能對另一種糖蛋白無作用，由此減少可用于抗擊病毒的抗體數量。病毒持續復制，而免疫反應系統持續衰弱。在大部分情況中，由于沒有治療介入，所以HIV使宿主免疫系統變衰弱，從而開始發生機會性感染。如果不給予抗病毒藥或免疫調節劑或兩者，那么可以導致死亡。
肝炎是主要由病毒且通常較少由某些藥物或毒素(例如醇)導致的肝部炎癥。病毒感染通常通過接觸污染的血液獲得。那些最可能接觸病毒的是共用污染針頭的靜脈內藥物使用者，不過，與患有一定形式肝炎的人發生性接觸也可以擴散這種疾病。在某些情況中，接觸污染血液的保健工作者和需要反復輸血的人已感染了一定形式的肝炎。
已經鑒定了三種主要類型的病毒性肝炎，即甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，不過，至少四種其它病毒可以導致肝炎。甲型肝炎是具有高度傳染性形式的肝炎且是這種疾病的最常見形式。甲型肝炎通常通過污染的食物或水傳播。甲型肝炎的癥狀通常與腸型流感的癥狀類似且大部分患有甲型肝炎的人會完全康復。
急性乙型肝炎可能是最嚴重形式的病毒性肝部感染。其癥狀與甲型肝炎非常相同，但癥狀更為嚴重且持續時間更長。甲型肝炎和乙型肝炎的初期癥狀包括食欲差、惡心、嘔吐和發熱。在肝炎后期，尿變深色且發生持續或復發性黃疸。約20％的肝炎病例最終發展成肝硬化(肝臟瘢痕形成)。可以通過評價肝功能的血液檢查診斷作為肝炎后果的肝硬化。由肝硬化侵害的肝臟最終也變脆弱。認為主要病原體是非甲和非乙型肝炎的丙型肝炎與甲型肝炎和乙型肝炎共有常見的癥狀且患者發生可以最終導致肝硬化的慢性感染。
腫瘤疾病是由自主的無法控制的細胞分裂導致的常見死亡原因。這種分裂可以由下列因素引起1.由致癌劑導致的基因突變；2.病毒；3.激活某些細胞類型有絲分裂的外部信號。
用各種有絲分裂和細胞代謝抑制劑治療腫瘤疾病。然而，特異性已經成為使用抗癌藥的主要問題。就抗癌藥而言，藥物需要區分癌性宿主細胞與非癌性宿主細胞。大批抗癌藥在這種水平上無差別。一般來說，抗癌藥具有負面的血液作用(例如終止有絲分裂和分解骨髓和淋巴樣組織中形成的成分)和免疫抑制作用(例如受抑的細胞計數)以及對上皮組織(例如腸粘膜)、生殖組織(例如精子發生異常)和神經系統的嚴重影響。P.Calabresi和B.A.ChabnerGoodman和Gilman《治療劑的藥理學基礎》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)(Pergamon Press，第8版)(pp.1209-1216)。成功使用化療劑作為抗癌藥還受到多藥物抗性現象的阻礙，所述的多藥物抗性為對廣泛結構不相關的細胞毒性抗癌化合物產生耐受性。J.H.Gerlach等，《癌癥調查》(Cancer Surveys)，525-46(1986)。在診斷時進行性藥物抗性的主要原因可能是腫瘤內的小群體藥物抗性細胞所致(例如突變體細胞)。J.H.Goldie和Andrew J.Coldman，《癌癥研究》(Cancer Research)，443643-3653(1984)。用單一藥物治療這類腫瘤首先會產生緩解，其中腫瘤在尺寸上萎縮作為殺傷主要藥物敏感性細胞的結果。由于殺傷了藥物敏感性細胞，所以剩余的藥物抗性細胞持續繁殖且最終控制腫瘤細胞群。最后，對癌癥的治療受到甚至同一種類型癌癥中存在顯著的異質性的阻礙。例如，某些癌癥具有侵入組織并表現出特征在于轉移的生長侵害過程的能力。這些腫瘤對患者而言一般愈后極差，并且仍然沒有鑒定這類腫瘤并從非侵害性癌中區分這類腫瘤的手段，臨床醫師難以改變療法和/或使其最優化。需要的是對各種腫瘤類型均可靠且特別適合于侵害性腫瘤的特異性抗癌手段。重要的是這種治療必須在最低宿主毒性下有效。因此，必須克服細胞減少活性藥物胞內量的能力以改善細胞靶向和/或改善抗癌藥的藥動學。
大環內酯類、諸如大環內酯類抗生素優選累積在給予這類分子的受試者的不同細胞中，尤其是在吞噬細胞中，諸如單核外周血細胞、多形核細胞、腹膜和肺泡巨噬細胞；以及支氣管肺泡上皮周圍的液體中(Glaude R.P.等《抗菌劑與化療》(Antimicrob.AgentsChemother.)，1989，33，277-282；Olsen K.M.等《抗菌劑與化療》(Antimicrob.Agents Chemother.)1996，40，2582-2585)。此外，描述了某些大環內酯類相對弱的炎性作用。例如，近來描述了紅霉素衍生物(Labro M.T.《抗菌藥與化療雜志》(J.Antimicrob.Chemother.)，1998，41，37-46；WO 00/42055)和阿奇霉素衍生物(EP 0283055)的抗炎作用。還從實驗性動物模型的體外和體內研究中得知了某些大環內酯類的抗炎作用，諸如zimosane-誘導的小鼠腹膜炎(Mikasa等《抗菌藥與化療雜志》(J.Antimicrob.Chemother.)1992，30，339-348)和內毒素-誘導的大鼠氣管中性白細胞累積(《免疫學雜志》(J.Immunol.)1997，159，3395-4005)。大環內酯類對細胞因子、諸如白細胞介素8(IL-8)(《美國呼吸疾病保健藥物標準雜志》(Am.J.Respir.Crit.Care Med.)1997，156，266-271)或白細胞介素5(IL-5)(EP 0775489和EP 0771564)的調節作用也是已知的。另外，大環內酯類有利的藥動學分布可以升高化合物的組織、例如在肝中的濃度或增加白細胞/血漿比值(Girard A.E.等，《抗菌劑與化療》(Antimicrob.Agents Chemother.)31 1987 1948-54；WidlfeuerA.等，《抗菌劑與化療》(Antimicrob.Agents Chemother.)40 1996，75-79)。
為了獲得對需要選擇活性的疾病具有改善/新活性性能的化合物，使幾種不同活性物質與不同類型的連接基連接。已經報導了紅霉素A衍生物和核酸堿基(尿嘧啶和胸腺嘧啶)或胸腺嘧啶-衍生的核苷的雜化物/軛合物/嵌合體(Costa A.M.等《四面體通訊》(TetrahedronLett.)41，2000，3371-3375)。然而，這類構建體沒有表現出對所需靶物的活性/選擇性。此外，尚未報導連接基為肽型的大環內酯構建體。
引入我們的雜交分子作為連接基的肽連接基能夠使所述分子起前體藥物的作用，從而通過靶細胞內特異性溶酶體裂解釋放V部分。對其它小分子(在我們的由抗炎、抗腫瘤和抗病毒化合物的雜化物表示的情況中)和大分子或聚合物描述了類似的連接基(Duncan R.等Robinson J.R.和Lee V.H.(eds.)《控釋藥物轉運基礎和應用》(Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications)，第2版，1987 581-607，Subr V.等，《控釋研究雜志》(J.ControlledRel.)181992 123-132)。
發明詳述通式I表示的化合物與現有技術的化合物的區別在于，其結構使得它們能夠累積在以影響需要治療的炎性免疫反應或腫瘤或感染為靶的器官中和發生上述情況的細胞中。還可以升高抑制化合物在對照射敏感的腫瘤細胞內的胞內濃度。通式I化合物的治療作用由具有累積在免疫系統細胞、特別是吞噬細胞藥動學特性的大環內酯部分M產生。它使得式I化合物能夠主要通過″控制″補充至活性組分可以發揮其活性的炎癥或感染或惡性腫瘤部位的炎性極強的細胞內的大環內酯起作用，而并非僅在炎癥或腫瘤或感染部位起作用。按照這類方式，甾類或非甾類抗炎物質或抗癌藥或抗病毒化合物不利的全身副作用會明顯減少乃至消除(應注意甾類用作治療惡性腫瘤的輔助療法且本發明還關注具有抗腫瘤應用的甾類)。在局部或全身施用后，本發明的雜交分子(如果可釋放，則和/或其組成部分)快速累積在炎癥部位或腫瘤中或感染細胞或其附近。
近來我們已經發現了在這類炎性疾病、失調和病癥中發揮改善的治療作用的通式I中的某些化合物 上述結構中的符號M表示具有在炎性細胞中累積特性的大環內酯亞單位，S表示抗炎甾類亞單位，并且L表示共價連接M和S的連接基。我們擁有的普通未審國際專利申請PCT/HR02/00001(將該文獻的全部內容引入本文作為參考)中描述了帶有通過鏈L與9-二氫-9-脫氧-9a-氮雜-9a-高紅霉素的N/9a位或與脫-克拉定糖基阿奇霉素衍生物的C/3位或與去氧糖胺基糖(desozaminesugar)的C/2′位連接的甾類亞單位S的化合物。然而，迄今為止尚未描述帶有與9-二氫-9-脫氧-9a-氮雜-9a-高紅霉素的N/9a位上肽連接基連接的甾類亞單位的雜交化合物，它們也具有上述治療作用。也沒有描述帶有與N/9a位上肽連接基連接的非甾類/抗腫瘤/抗病毒亞單位的雜交化合物。也沒有描述帶有與抗病毒或抗腫瘤亞單位連接的大環內酯的雜交化合物。所有這類化合物均屬于本申請的主題。
本發明涉及(a)通式I表示的新″雜交″化合物 其中M表示具有在炎性細胞中累積特性的大環內酯亞單位，V表示如下所定義的抗炎甾類或非甾類亞單位或抗腫瘤或抗病毒亞單位，且L表示連接M和V的連接基；(b)含有上述化合物中的一種或多種的組合物，所述化合物的用量可有效抗炎或抗惡性腫瘤或抗病毒，并且由此治療涉及包括人在內的哺乳動物炎癥、惡性腫瘤或病毒感染的失調和病癥；和(c)使用這些化合物治療這類失調和病癥的方法。
本發明的化合物有利地提供了改善的治療作用和/或改善的副作用性能。
用于本發明雜化化合物的合適的大環內酯亞單位可以選自但不限于多元內酯環分子，其中″元″指的是環上的碳原子或雜原子，并且″多″是大于約10的原子數、優選10-約50、更優選12-、14-、15-、16-、17-和18-元內酯環的大環內酯類。特別優選14-和15-元環的大環內酯亞單位，最優選阿奇霉素及其衍生物和紅霉素及其衍生物。
大環內酯亞單位可以選自的分子的更具體的非限制性實例如下(i)大環內酯抗菌素，包括氮雜內酯類(azalides)，例如紅霉素、地紅霉素、阿奇霉素、9-二氫-9-脫氧-9a-氮雜-9a-高紅霉素、HMR 3004、HMR 3647、HMR 3787、交沙霉素、紅霉胺(erythromycylamine)、ABT 773、氟紅霉素、克拉霉素、泰洛星、替米考星、竹桃霉素、脫碳霉糖泰樂菌素(desmycosin)、CP-163505、羅紅霉素、美奧卡霉素和洛他霉素及其衍生物，諸如酮內酯類(例如3-酮)；內酰胺類(例如8a-或9a-內酰胺類)和缺乏一個或多個糖部分的衍生物。
(ii)大環內酯免疫抑制劑，諸如FK 506、環孢菌素、兩性霉素和雷帕霉素；(iii)具有宿主細胞抑制特性的大環內酯抗真菌藥，諸如巴弗洛霉素、刀球骯霉素(concanamycin)、制霉菌素、那他霉素、克念菌素、非律平(filipin)、魯斯霉素(efruscomycin)、曲古霉素(trichomycin)。
用于合成上述并非商購的大環內酯類的方法和大環內酯的合成操作一般是本領域技術人員所公知的或可以在下列文獻中找到DenisA等《生物有機和藥物化學通訊)》(Bioorg.& Med.Chem.Lett)1999，9，3075-3080；Agouridas C.等《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)1998，41，4080-4100；和EP-00680967(1998)；Sun Or Y.等《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)2000，43，1045-1049；US-05747467(1998)；McFarland J.W.等《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)1997，40，1041-1045；Denis A.等《生物有機和藥物化學通訊》(Bioorg.& Med.Chem.Lett)1998，8，2427-2432；WO-09951616(1999)；Lartey等《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)1995，38，1793-1798；EP 0984019；WO 98/56801，將這些文獻的全部內容引入本文作為參考。
其它合適的大環內酯類是已知的，某些公開在下列文獻中Bryskier，A.J.等的《大環內酯類、化學、藥理學和臨床應用》(Macrolides，Chemistry，Pharmacology and Clinical Use)；Arnette BlackwellParis，1993，pp 485-491，14(R)-羥基克拉霉素、紅霉素-11，12-碳酸酯、三-O-乙酰基竹桃霉素、螺旋霉素、白霉素、麥迪霉素、rasaramycin，將該文獻的全部內容引入作為參考；Ma，Z.等《最新藥物化學-抗感染藥》(Current MedicinalChemisty-Anti-Infective Agents)，2002，1，15-34，也將該文獻的全部內容引入作為參考；苦霉素、那波霉素、HMR-3562、CP-654743、CP-605006、TE-802、TE-935、TE-943、TE-806、6，11-橋連的酮內酯類、CP-544372、FMA-199、A-179461；特別參見Bryskier等在487-491頁上描述的14-和16-元環的大環內酯類的結構和衍生物；和Ma等描述的各種酮內酯衍生物和合成，注意所有的結構表和所有的反應方案。與Ve軛合后的所有這些大環內酯類屬于本發明的范圍。上述特別具體命名或參照的大環內酯化合物是商購的或其合成方法是已知的。
重要的是大環內酯亞單位來源于具有累積在補充至炎癥部位的免疫系統細胞、尤其是吞噬細胞內特性的大環內酯。已知上述定義的大部分內酯環化合物具有這種特性。例如，14-元大環內酯類、諸如紅霉素及其衍生物、15-元大環內酯類、諸如阿奇霉素及其衍生物以及8a-和9a-內酰胺類及其衍生物、16-元大環內酯類、諸如替米考星和脫碳霉糖泰樂菌素和螺旋霉素。
累積在特定類細胞中的大環內酯類的其它實例可以在下列文獻中找到Pascual A.等《臨床微生物感染》(Clin.Microbiol.Infect.)2001，7，65-69.(“酮內酯HMR 3647在人吞噬和非吞噬細胞中的吸收和胞內活性”(Uptake and intracellular activity of ketolide HMR3647 in human phagocytic and non-phagocytic cells))；Hand W.L.等《國際抗菌藥雜志》(Int.J.Antimicrob.Agents)，2001，18，419-425.(“阿奇霉素在人多形核白細胞中累積和流出的特性和機制”(Characteristics and mechanisms of azithromycin accumulationand efflux in human polymorphonuclear leukocytes))；Amsden G.W.《國際抗菌藥雜志》(Int.J.Antimicrob.Agents)，2001，18，11-15.(“新一代大環內酯類定向于組織的抗菌素”(Advanced-generation macrolidestissue-directedantibiotics))；Johnson J.D.等《實驗室臨床藥物雜志》(J.Lab.Clin.Med.)1980，95，429-439.(“肺泡巨噬細胞的抗菌素吸收”(Antibiotic uptake by alveolar macrophages))；Wildfeuer A.等《抗菌藥與化療》(Antimicrob.Agents Chemother.)1996，40，75-79.(“體內條件下各種細胞對阿奇霉素的吸收及其胞內活性”(Uptake ofazithromycin by various cells和its intracellular activityunder in vivo conditions))；Scorneaux B.等《家禽科學》(Poult.Sci.)1998，77，1510-1521.(“替米考星在雞吞噬細胞中的胞內累積、亞細胞分布和流出”(Intracellular accumulation，subcellulardistribution，and efflux of in chicken phagocytes))；MtairagE.M.等《抗菌劑與化療雜志》(J.Antimicrob.Chemother.)1994，33，523-536。(“人中性白細胞體外地紅霉素和紅霉胺吸收的研究”(Investigation of dirithromycin and erythromycylamineuptake by human neutrophils in vitro))；Anderson R.等《抗菌劑與化療雜志》(J.Antimicrob.Chemother.)1988，22，923-933.(“新大環內酯抗菌藥克拉霉素(A-56268，TE-031)的細胞吸收和吞噬細胞內生物活性的體外評價”(An in-vitro evaluation of thecellular uptake and intraphagocytic bioactivity ofclarithromycin (A-56268，TE-031)，a new macrolideantimicrobial agent))；Tasaka Y.等《日本抗生素雜志》(Jpn.J.Antibiot.)1988，41，836-840.(“肺泡巨噬細胞的洛他霉素吸收”(Rokitamycin uptake by alveolar macrophages))；Harf R.等《抗菌劑與化療雜志》(J.Antimicrob.Chemother.)1988，22，135-140.(“肺泡巨噬細胞的螺旋霉素吸收”(Spiramycin uptake byalveolar macrophages))，將這些文獻的全部內容引入本文作為參考。2002年7月8日提交的美國臨時申請60/94,671和60/394,670中描述了可以也用于本發明上下文中的各種大環內酯連接復合物，將這些文獻的全部內容引入本文作為參考。
此外，補充至炎癥部位的免疫系統細胞、尤其是吞噬細胞內累積活性的存在易于由本發明領域的普通技術人員使用用于該目的的眾所周知的試驗之一測定。例如，可以使用Olsen，K.M.等在《抗菌劑與化療》(Anitmicrob.Agents & Chemother.)1996，40，2582-2585中所述的具體步驟。簡單的說，可以通過Ficoll-Hypaque離心從健康志愿者的靜脈血中獲得受測試的細胞、例如多形核白細胞，隨后進行2％葡聚糖沉降。通過滲透裂解除去紅細胞并通過錐蟲藍排除法評價PMN。另一方面，可以分離其它細胞級分并按照類似方式測試。將氚代的大環內酯化合物(例如10μM)與2.5×106個細胞一起保溫120分鐘(37℃，5％CO2，90％相對濕度)且隨后通過離心、例如通過硅油-石蠟層(86vol％14vol％)從含有化合物的上清液中除去細胞。例如，通過閃爍計數測定化合物的量，并且顯著高于背景的得分表明大環內酯累積在測試細胞中。參見Bryskier等《大環內酯、化學、藥理學和臨床應用》(Mcrolides，Chemistry，Pharmacology and Clinical Use)；Arnette BlackwellParis，1993 pp 375-386，381頁，第2欄，第3行。另一方面，不對該化合物進行放射性標記，而可以通過HPLC測定化合物的量。
可以使用的其它試驗方法公開在Bryskier，A.J.等的《大環內酯、化學、藥理學和臨床應用》(Mcrolides，Chemistry，Pharmacologyand Clinical Use)；Arnette BlackwellParis，1993pp 375-386中，將該文獻引入作為參考。特別參見380-381頁上的吞噬細胞吸收測定和381、383和385頁以及382和383頁上的表對大環內酯類吸收和定位的具體描述。
本發明在某些優選的實施方案中涉及通式I表示的化合物、其鹽和溶劑化物，其中M特別表示14-或15-元內酯環的大環內酯亞單位，最優選通式II表示的化合物 其中(i)Z和W獨立為 或鍵，其中Rt和Rs獨立為氫或烷基(優選甲基或H)；RM為OH、ORP、烷氧基或取代的烷氧基(Syn或Anti構型或其混合物形式)；RN為H、RP、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基或-C(＝X)-NRtRs；
X為O或S；條件是Z和W不能同時為 或鍵；(ii)U和Y獨立為H、鹵素、烷基或羥基烷基(優選H、甲基或羥甲基)；(iii)R1為羥基、ORP、-O-S2或＝O；(iv)S1為如下通式糖苷配基環C/5位上的糖部分(例如去氧糖胺(desozamine)基團) 其中R8和R9均為氫或一起形成鍵或R9為氫且R8為-N(CH3)Ry，其中Ry為RP、RZ或-C(O)RZ，其中RZ為氫或環烷基(優選環己基)或烷基(優選C1-C7烷基)或鏈烯基(優選C2-C7-鏈烯基)或炔基(優選C2-C7-炔基)芳基或雜芳基或被C1-C7-烷基或C2-C7-鏈烯基或C2-C7-炔基、芳基或雜芳基取代的烷基(Ry優選為氫、甲基或乙基)；R10為氫或RP；(v)S2為如下通式的糖苷配基環C/3位上的糖部分(例如為克拉定糖基) 其中
R3’為氫或甲基；且R11和R12獨立為氫，R11可以為RP或R11和R12共同形成鍵；(vi)R2為H、羥基、ORP、烷氧基(優選C1-C4烷氧基，最優選甲氧基)、取代的烷氧基；(vii)A為H或甲基；(viii)B為甲基或環氧；(ix)E為H或鹵素(優選氟)；(x)R3為羥基、ORP或烷氧基(優選C1-C4烷氧基，最優選甲氧基)、取代的烷氧基，或R3為可以與R5合并成″橋″(例如環碳酸酯或環氨基甲酸酯)的基團；或如果W或Z為 那么R3為可以與W或Z合并成″橋″(例如環氨基甲酸酯)的基團；(xi)R4為C1-C4烷基(優選甲基)；(xii)R5為氫、羥基、ORP、C1-C4-烷氧基、取代的烷氧基或可以與R3合并成橋(例如環碳酸酯或環氨基甲酸酯)的基團；(xiii)R6為H或C1-C4烷基(優選甲基或乙基)；其中亞單位M含有連接位置，它通過該位置經連接基L與亞單位D連接；所述的連接位置位于下列基團中的一個或多個上a位于S1、S2或糖苷配基氧上的任意活性羥基、N或環氧基，條件是S2(或條件是S2和S1)被裂解；b位于Z或W上的活性＞N-RN、-NRtRs或＝O基團；c位于R1、R2、R3和R5中任意一個上的活性羥基；d可以首先被衍生成羥基或-NRtRs基團，然后與L的全部或部分連接的任意其它基團(例如，OH→＝O→環氧→ 一個或多個RP基團可以獨立地存在于通式II的大環內酯亞單位上，其中RP表示保護基，其可以選自烷基(優選甲基)、烷酰基(優選乙酰基)、烷氧羰基(優選甲氧羰基或叔丁氧羰基)、芳基甲氧羰基(優選芐氧羰基)、芳酰基(優選苯甲酰基)、芳烷基(優選芐基)、烷基甲硅烷基(優選三甲基甲硅烷基)或烷基甲硅烷基烷氧基烷基(優選三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)。可以通過常規技術除去氨基保護基。因此，可以通過溶劑解、例如通過在酸性或堿性條件下水解除去例如酰基，如烷酰基、烷氧羰基或芳酰基。可以在有催化劑、諸如鈀/活性炭存在的情況下通過氫解裂解芳基甲氧羰基(芐氧羰基)。
可以將L選為通式IV表示的連接基X1-(CH2)m-Q-(CH2)n-X2IV其中X1選自-CH2-、-OC(＝O)-、-C(＝O)-、＝NO-、-OC(＝O)NH-或-C(＝O)NH-；X2選自-NH-、-CH2-、-NHC(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)-或-O；Q為-NH-或-CH2-或不存在；其中-CH2-或-NH-基團各自可以任選被C1-C7-烷基、C2-C7-鏈烯基、C2-C7-炔基、C(O)RX、C(O)ORX、C(O)NHRX取代，其中RX可以為C1-C7-烷基、芳基或雜芳基；符號m和n獨立為0-4的整數，條件是如果Q＝NH，那么n不能為0。
L表示具有約2-約50個彼此連接的氨基酸的多肽連接基，優選三肽或四肽，諸如Gly-Phe-Leu、Gly-Gly-Phe、Gly-Phe-Phe、Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Ala、Gly-Leu-Phe、Gly-Leu-Ala、Ala-Val-Ala、Gly-Gly-Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Ala-Leu、Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Phe-Leu、Gly-Leu-Leu-Gly、Gly-Phe-Tyr-Ala、Gly-Phe-Gly-Phe、Ala-Gly-Val-Phe、Gly-Phe-Phe-Gly，并不限于此。
優選的L由通式Gly-(W)p-Gly表示，其中p為0-3的整數且W為任意的氨基酸或任意氨基酸的組合。
在V為甾類或非甾類抗炎亞單位的情況中，L僅為肽連接基。
V可以表示抗炎甾類或非甾類化合物亞單位或抗腫瘤或抗病毒化合物亞單位。
當V為甾類亞單位時，優選通式X (ii)其中Ra和Rb彼此獨立為氫或鹵素；Rc為羥基、烷氧基(優選甲氧基)、烷基、硫代氨基甲酰基、氨基甲酰基或價鍵；Rd和Re彼此獨立為氫、OH、CH3或C1-C4烷氧基(優選甲氧基或正丙氧基)或各自為與其它基團(任選烷基或鏈烯基單取代或二取代的)(優選2，2-二甲基或2-一丙基或反式-丙烯基環)形成1，3-二氧戊環的基團或價鍵；Rf為氫、羥基、氯或與它所連接的碳原子一起形成酮基的＝O；Rj為氫或氯及其藥學上可接受的鹽和溶劑化物。
另一方面，本發明為WO 94/14834中公開的甾類亞單位，其中它們帶有基團＞CH-S(O)n-Rc而不是基團＞CH-C(O)-Rc，其中n為0-2的整數。參見WO 94/14834，將該文獻的全部內容引入作為參考，尤其是pp2-3。
更一般而言，用作甾類亞單位源的甾類包括、但不限于皮質類固醇(諸如糖皮質激素和鹽皮質激素)和雄激素。皮質類固醇的非限制性實例包括皮質醇、可的松、氯倍他索、氫化可的松、氟氫可的松、氟氫縮松、氟米松、氟尼縮松、氟輕松、醋酸氟輕松、氟可龍、氟米龍、潑尼松、潑尼松龍、6-α-甲潑尼龍、曲安西龍、阿氯米松、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、地塞米松、安西奈德、可的伐唑、地奈德、去羥米松、二氟可龍、二氟潑尼酯、fluclorolone和二氯松、fluperinidene、氟替卡松、哈西奈德、甲潑尼松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑那唑啉、潑尼立定、替可的松、曲安西龍及它們的酸性衍生物，例如醋酸、丙酸、二丙酸、戊酸、磷酸、異煙酸、間磺基苯甲酸、tebutate和半琥珀酸衍生物)。
V可以為非甾類抗炎亞單位，即非甾類抗炎藥(NSAID)的部分，包括那些抑制環加氧酶的部分，所述的酶可以導致前列腺素和某些自體激素抑制劑的生物合成，包括各種環加氧酶的各種同工酶(包括、但不限于環加氧酶-1和-2)抑制劑；且作為環加氧酶和脂氧化酶抑制劑涉及非甾類抗炎藥(NSAID)，諸如商購的NSAID醋氯芬酸、阿西美辛、對乙酰氨基酚、醋氨沙洛、乙酰水楊酸、乙酰基-水楊-2-氨基-4-甲基吡啶-酸、5-氨基乙酰水楊酸、阿氯芬酸、氨洛芬、氨芬酸、氨基安替比林、安吡昔康、阿尼利定、芐達酸、苯噁洛芬、柏莫洛芬、α-沒藥醇(α-bisabolol)、溴芬酸、5-溴水楊酸乙酸酯、溴水楊苷、布氯酸、丁布芬、卡洛芬、塞來考昔(celexocib)、chromoglycate、桂美辛、clindanac、氯吡酸、雙氯芬酸鈉、二氟尼柳、地他唑、屈噁昔康、恩芬那酸、依托度酸、依托芬那酯、聯苯乙酸、芬布芬、芬克洛酸、芬度柳、非諾洛芬、芬替酸、非普地醇、flufenac、氟芬那酸、氟尼辛、氟諾洛芬、氟比洛芬、glutametacin、水楊酸乙二醇酯、異丁芬酸、布洛芬、異丁普生、吲哚美辛、吲哚洛芬、三苯唑酸、伊索克酸、伊索昔康、酮洛芬、酮咯酸、氯諾昔康、洛索洛芬、甲氧芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、5-氨基水楊酸、甲嗪酸、莫苯唑酸、孟魯司特、萘丁美酮、萘普生、尼氟酸、尼美舒利、奧沙拉秦、奧沙西羅、噁丙嗪、羥布宗、對乙酰氨基酚、帕沙米特、哌立索唑、苯乙酰水楊酸酯(苯乙酰水楊酸酯(phenyl-acethyl-salicylate))、保泰松、水楊酸苯酯、吡拉唑酸、吡羅西康、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸、reserveratol、醋水楊胺、水楊酰胺、水楊酰胺-O-乙酸(salicylamide-O-acetyl acid)、水楊酰硫酸酯(salicysulphuricacid)、水楊苷、水楊酰胺、雙水楊酯、舒林酸、舒洛芬、suxibutazone、他莫昔芬、替諾昔康、噻洛芬酸、噻拉米特、ticlopridine、替諾立定、托芬那酸、托美丁、tropesin、聯苯丁酸、希莫洛芬、扎托洛芬、佐美酸、托莫普羅、扎魯司特和環孢菌素。其它NSAID類和特定的NSAID化合物公開在美國專利US 6,297,260中，將該文獻全部引入作為參考(尤其是在其權利要求1的一般通式和其中包含的對NSAID的具體目錄中)；且thiazulidene NSAID公開在國際專利申請WO 01/87890中，將該文獻的全部內容引入本文作為參考)。
優選的NSAID為乙酰水楊酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、舒洛芬、氟尼辛、雙氯芬酸鈉和托美丁。
V可以表示抗病毒化合物，包括阿昔洛韋、泛昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋、拉米夫定、利托那韋、茚地那韋、奈韋拉平、齊多夫定、去羥肌苷、司他夫定、阿巴卡韋、扎西他濱、氨普奈韋、利巴韋林和金剛烷，但不限于此。優選的抗病毒化合物為齊多夫定、去羥肌苷和司他夫定。V抗炎表示抗腫瘤藥，包括bicaluatnide、喜樹堿、雌莫司汀磷酸酯、氟他胺、氮芥、塞替派、異環磷酰胺、羥基脲、博來霉素、紫杉醇、洛莫司汀、伊立替康、甲氨蝶呤、長春瑞濱、阿那曲唑(anastrazole)、氟尿苷、美法侖、長春新堿、長春堿、絲裂霉素、諾龍、戈舍瑞林、亮丙立德、曲普瑞林、氨魯米特、米托坦、順鉑、苯丁酸氮芥、噴司他丁、克拉屈濱、白消安、依托泊苷、米托蒽醌、伊達比星、環磷酰胺、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarbine)、環磷酰胺、多柔比星、柔紅霉素、替尼泊苷和他莫昔芬，但不限于此。優選的抗腫瘤藥為甲氨蝶呤、紫杉醇、喜樹堿、多柔比星、泰索帝和托泊替康。
本文中包含的通式中的黑體鍵表示位于紙面水平上；繪制的虛線鍵(dash-drawn bonds)表示位于紙面水平下，而虛線(broken line)表示可以位于紙面水平下或其上的鍵。平行實線和虛線表示單鍵或雙鍵。除非本文另有說明，下列術語具有下文對其所解釋的含義″烷基″指的是1-10個碳原子、更優選1-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和一價烴基。優選的直鏈或支鏈烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基和叔丁基。最優選甲基。烷基可以被至多5個取代基取代，包括鹵素(優選氟或氯)、羥基、烷氧基(優選甲氧基或乙氧基)、酰基、酰氨基、氰基、氨基、N-(C1-C4)烷氨基(優選N-甲氨基或N-乙氨基)、N，N-二(C1-C4-烷基)氨基(優選二甲氨基或二乙氨基)、芳基(優選苯基)或雜芳基、硫代羰基氨基、酰氧基、氨基、脒基、烷基脒基、硫代脒基、氨基酰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、芳基、雜芳基、芳氧基、芳氧基芳基、硝基、羧基、羧基烷基、羧基取代的烷基、羧基-環烷基、羧基取代的環烷基、羧基芳基、羧基取代的芳基、羧基雜芳基、羧基取代的雜芳基、羧基雜環基、羧基取代的雜環基、環烷基、環烷氧基、雜芳氧基、雜環基氧基和氧基羰基氨基。這類取代的烷基屬于本發明″烷基″的定義范圍。本發明烷基的定義可以擴展至其它帶有烷基部分的基團，諸如烷氧基。
″鏈烯基″指的是2-10且優選2-6個碳原子的含有至少一個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈一價烴基。鏈烯基可以被與烷基相同的基團取代且這類任選取代的鏈烯基包括在術語″鏈烯基″中。優選乙烯基、丙烯基、丁烯基和環己烯基。
″炔基″指的是帶有2-10且優選2-6個碳原子的直鏈或支鏈且含有至少一個且優選不超過三個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈一價烴基。炔基可以被與烷基相同的基團取代且這些取代的基團屬于該炔基的定義中。優選乙炔基、丙炔基和丁炔基。
″環烷基″指的是帶有3-8個碳原子的含有任選與芳基或雜芳基稠合的單環的環狀基團。環烷基可以被如下對″芳基″所述的取代基取代且取代的環烷基屬于該″環烷基″的定義范圍。優選的環烷基為環戊基和環己基。
″芳基″指的是帶有6-14個碳原子的含有單環、諸如苯基或多稠合環、諸如萘基的不飽和芳族碳環基。芳基可以任選進一步與脂族基團或芳基稠合或可以被一個或多個取代基取代，諸如鹵素(氟、氯和/或溴)、羥基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基或芳氧基、C1-C7烷硫基或芳硫基、烷基磺酰基、氰基或伯氨基或非伯氨基。
″雜芳基″指的是含有2-10個碳原子和1-4個雜原子、諸如O、S或N的單環或二環芳烴環。雜芳環可以任選與另一個雜芳基、芳基或脂族環狀基團稠合。該類的實例為呋喃、噻吩、吡咯、咪唑、吲哚、呲啶、噁唑、噻唑、吡咯、呲唑、四唑、嘧啶、呲嗪和三嗪，優選呋喃、吡咯、吡啶和吲哚。該術語包括被如對上述芳基所述相同的取代基取代的基團。
″雜環基″指的是含有單環或多環以及1-10個碳原子和1-4個選自氮、硫或氧的雜原子的飽和或不飽和基團，其中在稠合環系中，另一個環或其它環可以為芳基或雜芳基。雜環基可以被如對烷基所述的取代基取代且由此取代的雜環基屬于本定義的范圍。
″氨基酸″指的是含有氨基和羧酸基團的任意化合物。氨基基團可以出現在與羧基官能基相鄰的位置上、諸如α-氨基酸上或該分子內的任意位置上。氨基酸還可以含有其它官能基，諸如氨基、硫、羧基、甲酰胺、咪唑等。氨基酸可以為合成或天然存在的或修飾的天然存在的氨基酸，諸如正纈氨酸或正亮氨酸。
符號K在上下文需要時有時指與M或V連接的L基團的部分。
在制備結構I表示的具有特定藥理活性的化合物中，制備某些新化合物作為制備具有藥理活性的化合物的中間體。本發明還涉及這類中間體。
本發明還包括本發明化合物的藥學上可接受的鹽。本發明化合物的藥學上合適的鹽包括與無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸或硫酸)或有機酸(例如酒石酸、乙酸、甲磺酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、乳酸、富馬酸、苯甲酸、琥珀酸、甲磺酸、草酸和對甲苯磺酸)形成的鹽。
本發明還包括通式I化合物的前體藥物，即在對哺乳動物受試者給藥時在體內釋放通式(I)的活性母體藥物的化合物。通過修飾存在于通式I化合物上的官能基制備通式I化合物的前體藥物，按照這類方式使所述的修飾物可以在體內被裂解以釋放母體化合物。前體藥物包括通式I的化合物，其中通式I化合物的羥基、氨基或羧基與任意可以在體內被裂解而分別重新生成羥基、氨基或羧基的基團結合。前體藥物的實例包括但不限于通式I化合物的酯類(例如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)或在接觸生理pH時或通過酶作用被轉化成活性母體藥物的任意其它衍生物。在本段落的內容中，″前體藥物″不指釋放V部分的本發明的雜化物(如本說明書其它地方所述的)，而指V部分的衍生物(其可以釋放大環內酯或保持與大環內酯連接)。連接或釋放狀態的V部分衍生物隨后可以轉化成游離形式或與大環內酯連接的活性母體藥物。
本發明還包括通式I化合物或其鹽的溶劑化物(優選水合物)。
通式I的化合物帶有一個或多個手性中心且隨各取代基性質的不同，它們還可以具有幾何異構體。在原子空間排列上不同的異構體稱作″立體異構體″。彼此不為鏡像的立體異構體稱作″非對映體″且那些彼此為不能重疊的鏡像的稱作″對映體″。當化合物帶有一個手性中心時，出現一對對映體是可能的。對映體的特征可以在于其不對稱中心的絕對構型且由Cahn和Prelog的R--和S--順序法則描述或通過分子繞偏振光面旋轉的方式描述并命名為右旋或左旋(即分別稱作(+)或(-)-異構體)。手性化合物可以作為單個對映體或作為對映體混合物存在。含有等比例的對映體的混合物稱作″外消旋混合物″。本發明包括通式I化合物的所有各異構體。在本說明書和權利要求中對特定化合物的描述或命名用以包括各對映體及其混合物，否則就是其外消旋物。用于測定立體異構體的立體化學及其拆分的方法是本領域眾所周知的。
本發明還包括遇到的syn-anti型立體異構體及其混合物，此時存在肟或類似基團。將與肟的末端雙鍵原子連接的最高Cahn IngoldPrelog優先順序法則的基團與肟的羥基比較。將該立體異構體命名為Z(zusammen＝共同)或Syn，條件是肟羥基位于通過C＝N雙鍵的參考面的同側上作為最優先基團；將另一種立體異構體命名為E(entgegen＝相反)或Anti。
″藥學上可接受的賦形劑″指的是用于制備一般安全、無毒性且既無生物上又無其它不需要的作用的藥物組合物的賦形劑且包括對獸藥應用和人藥應用而言可接受的賦形劑。本申請中所用的″藥學上可接受的賦形劑″包括一種和一種以上這類賦形劑。
″治療(Treating)″或″治療(treatment)″狀態、失調或病癥包括(1)預防或延緩在哺乳動物中發生的狀態、失調或病癥的臨床癥狀的表現，所述的哺乳動物可以患有或傾向于所述的狀態、失調或病癥，但尚未發生或出現所述狀態、失調或病癥的臨床或亞臨床癥狀；(2)抑制狀態、失調或病癥，即阻止或減緩疾病或其至少一種臨床或亞臨床癥狀的發生；或(3)減輕疾病，即使狀態、失調或病癥或其至少一種臨床或亞臨床癥狀退化。
對治療的受試者的有益性或具有統計學意義或至少對患者或臨床醫師而言是可感受到的。
″治療有效量″指的是當對哺乳動物給藥治療狀態、失調或病癥時足以進行這類治療(該措詞如上述所定義)的用量。″治療有效量″隨化合物、疾病及其嚴重程度和所治療哺乳動物的身體情況和反應性的不同而改變。
急性炎癥的四種傳統癥狀為患病區域發紅、升溫、腫脹和疼痛且患病器官功能喪失。
與具體病癥相關的炎癥癥狀和征候包括·類風濕性關節炎-涉及的關節疼痛、腫脹、溫熱和觸痛；全身性強直和晨僵；·胰島素依賴性糖尿病-胰島炎；該病可以導致各種與炎性成分相關的并發癥，包括視網膜病、神經病、腎病；冠狀動脈疾病、外周血管疾病和腦血管疾病；·自身免疫性甲狀腺炎-虛弱、便秘、氣短、面部、手和足浮腫(puffiness)、外周性水腫、心律過緩；·多發性硬化-痙攣狀態、視力模糊、眩暈、肢體虛弱、感覺異常；·眼色素層視網膜炎-夜視力下降、周邊視力降低；·紅斑狼瘡-關節痛、疹、光敏感性、發熱、肌痛、手和足浮腫、尿液分析異常(血尿、管型尿(cylinduria)、蛋白尿)、腎小球腎炎、認知功能障礙、血管血栓形成、心包炎；·硬皮病-雷諾氏病；手、臂、腿和面部腫脹；皮膚增厚；手指和膝疼痛、腫脹強直、胃腸功能障礙、限制性肺病；心包炎；腎衰竭；·具有炎性成分的其它關節炎性疾病，諸如類風濕性脊椎炎、骨關節炎、膿毒性關節炎和多關節炎-發熱、疼痛、腫脹、觸痛；·其它炎性腦病，諸如腦膜炎、阿爾茨海默病、AIDS癡呆性腦炎-畏光、認知功能障礙、記憶損失；·其它炎性的眼部炎癥，諸如視網膜炎-視力下降；·炎性皮膚病，諸如濕疹、其它皮炎(例如特應性皮炎、接觸性皮炎)、牛皮癬、UV照射誘發的灼傷(日光射線和類似的UV源)-紅斑、疼痛、脫屑、腫脹、觸痛；·炎癥性腸病，諸如克羅恩病、潰瘍性結腸炎-疼痛、腹瀉、便秘、直腸出血、發熱、關節炎；·哮喘-氣短、喘鳴；·其它過敏性疾病，諸如過敏性鼻炎-噴嚏、癢、鼻漏；·與急性哮喘相關的疾病，諸如中風后的損傷-感覺缺失、運動喪失、認知喪失；·因心肌缺血導致的心臟組織損傷-疼痛、氣短；·肺損傷，諸如發生成人呼吸窘迫綜合征的肺損傷-氣短、換氣過度、氧合作用下降、肺浸潤；·伴有感染的炎癥，諸如膿毒癥、膿毒性休克、中毒性休克綜合征-發熱、呼吸衰竭、心動過速、低血壓、白細胞增多；
·其它與特定器官或組織相關的炎性疾病，諸如腎炎(例如腎小球腎炎)-少尿、尿液分析異常；附件炎-發熱、疼痛、觸痛、白細胞增多；痛風-涉及的關節疼痛、觸痛、腫脹和紅斑、血清和/或尿的尿酸升高；膽囊炎-腹痛和觸痛、發熱、惡心、白細胞增多；慢性阻塞性肺病-氣短、喘鳴；充血性心力衰竭-氣短、啰音、外周性水腫；II型糖尿病-晚期器官并發癥，包括心血管、眼、腎和周圍血管疾病；肺纖維化-換氣過度、氣短、氧合作用下降；血管疾病，諸如動脈粥樣硬化和再狹窄-疼痛、感覺喪失、脈搏下降、功能喪失；和導致移植物排斥的同種異體免疫-疼痛、觸痛、發熱。
亞臨床癥狀包括、但不限于用于炎癥的診斷標記，其表現可以先于臨床表現。一類亞臨床癥狀為免疫學癥狀，諸如促炎淋巴樣細胞在器官或組織中的侵入或累積或識別對器官或組織特異性的病原體或抗原的活化促炎淋巴樣細胞局部或周圍的存在。可以通過本領域中公知的技術測定淋巴樣細胞的活化。
″轉運″至宿主內特定部位的活性組分的治療有效量指的是在特定部位產生治療上有效的活性組分的血藥濃度。例如，可以通過對宿主局部或全身給予活性組分達到上述目的。具體的病毒性疾病包括病毒性肝炎(甲型、乙型、丙型、戊型)、流感、病毒性肺炎、病毒性支氣管炎、皰疹感染(單純皰疹病毒、EB病毒(傳染性單核細胞增多癥)、帶狀皰疹)、脊髓灰質炎、AIDS(HIV感染)、成人T-細胞白血病(ATL)、乳頭狀瘤、麻疹、風疹、幼兒急疹、傳染性紅斑、病毒性腦炎、病毒性脊髓炎、巨細胞病毒感染、流行性腮腺炎、水痘、狂犬病、病毒性腸炎、病毒性心肌炎、病毒性心包炎等。
與具體病癥相關的病毒感染的癥狀和征候包括病毒負荷、病毒復制、病毒活性、病毒血癥、病毒特異性抗原、病毒RNA或DNA、逆錄酶活性、宿主中的抗病毒CTL活性、T-細胞或CD4+細胞計數(對HIV而言)。癌癥包括、但不限于下列癌非小細胞肺癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病、成纖維細胞、腎癌、黑素瘤、前列腺癌、CNS癌、骨/肌肉、淋巴瘤和血癌。
與具體病癥相關的瘤形成癥狀和征候包括腫瘤負荷、腫瘤大小、受侵害的器官重量、腫瘤復發、受試者存活時間、緩解時間和程度、癌細胞生長、癌細胞存活、編程性細胞死亡指數、轉移程度和比例、與特定類型瘤形成相關的生物標記、增殖標記、相關癌基因的活化、與腫瘤相關的受體功能的調節異常、腫瘤特異性抗原和與腫瘤相關的血管發生。
識別對器官或組織具有特異性病原體或抗原的活化促炎淋巴樣細胞局部或周圍存在病毒感染或瘤形成的亞臨床癥狀。可以通過本領域中公知的技術測定淋巴樣細胞的活化。其它亞臨床癥狀包括在疾病發生的任何臨床征候前的各種替代標記(諸如上述各類中的那些)的存在和/或量。此外，感染和瘤形成通常伴有腫瘤部位上免疫系統活性增加，所以炎癥征候在此也適用。
在通式II表示的化合物中，優選Z和W共同為-N(RN)C(O)-、-C(O)N(RN)-、＞C-NRsRt、-C(O)-、＞C-N-RM-、-CH2NRN-或-NRNCH2-，最優選-NCH3CH2-、-NHCH2-、-CH2NH-、-C(O)NH、-NHCO-；Rs、Rt為甲基或H；RM為OH或甲氧基；X為O；RN為H、甲基或-C(＝X)-NRsRt；A為H或甲基；U、Y為H、F、甲基或羥甲基；R1為羥基、-O-S2或＝O；R2為H、羥基或甲氧基；
R3為OH、甲氧基或與W或Z形成環氨基甲酸酯橋的基團；R4為甲基；R5為H、OH、甲氧基或與R3形成環碳酸酯或環氨基甲酸酯橋的基團；連接鍵通過N/9a或N/8a位上Z的氮或通過均位于S2糖C/4″位上R12的碳或R11的氧；R6為H、甲基或乙基；R8為H、N(CH3)2、NH(CH3)N(CH3)CH2CH3；R9為H；連接位置優選位于C/3位上或通過S1糖C/3′位上或C/11位或W或Z上的氨基或通過S2糖C/4″位。
還優選通式I中的化合物，其中M具有通式II且(i)Z為NCH3，W為CH2，R2為羥基；或(ii)Z為NH，W為＝CO且R2為甲氧基。(該段中所述的化合物可以滿足或可以不滿足前一部分中剩余的上述優選條件，但優選它們滿足這些條件。)本發明的另一個方面涉及通式I表示的化合物的制備方法。一般來說，可以通過下列方式獲得通式I的化合物首先使鏈的一端與大環內酯連接，然后使該鏈的另一端與V連接；或首先使鏈的一端與V連接，然后使該鏈的另一端與大環內酯連接；或最后，使該鏈的一個部分與大環內酯連接，而使該鏈的另一個部分與V連接，然后使鏈部分的末端以化學方式連接形成鏈L。
本領域技術人員可以理解需要使用用于制備通式I化合物的中間體的被保護的衍生物。可以通過本領域中公知的方法對官能基進行保護和脫保護。羥基或氨基可以被任意羥基或氨基保護基保護，例如，如Green T.W.；Wuts P.G.M.在《有機合成中的保護基》(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)John Wiley和Sons，New York，1999中所述。另外參見上述有關通式I的保護基的討論。可以通過常規技術除去氨基保護基。例如，可以通過溶劑解、例如通過在酸性或堿性條件下水解除去酰基、諸如烷酰基、烷氧羰基和芳酰基。可以在有催化劑、諸如鈀/活性炭存在的情況下通過氫解裂解芳基甲氧羰基(例如芐氧羰基)。
更具體地說，可以通過下列方法制備通式I中的化合物a)可以通過使通式VI化合物與通式VIIa表示的大環內酯的游離氨基反應生成通式I的化合物，其中X2為-NHC(O)-，其中通式VI的結構式如下 其中L1表示離去基團(諸如羥基)，且通式VIIa的結構式如下 其中K是與大環內酯亞單位連接的連接分子L的部分。
該反應一般與具有活化羧酸基能力的酸性衍生物進行，諸如鹵化物、混合的酸酐類且尤其是碳化二亞胺類，諸如-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳環二亞胺(EDC)和苯并三唑類。該反應在室溫和惰性氣體、諸如氮或氬氣環境中并有堿、諸如有機堿(例如三乙胺)存在的情況下進行。該反應可能需要幾小時至幾天才能完成。
例如，當L為-K-NH2時，可以通過將大環內酯環上的＞NH基團衍生成＞N-K-NH2基團并使衍生的大環內酯如下所示與通式VI的化合物反應生成通式I的化合物。
例如，當通式II的大環內酯亞單位上的＞NH基團連接在C/3′或N/9a位上時可以進行該反應。
通式VI表示的化合物是商購的或它們可以通過包括本領域中公知的方法之一來源于亞單位V。
通式VIIa的原料大環內酯的制備描述在PCT HR 02/0001中，將該文獻的全部內容引入作為參考。另外參見美國專利US4,474,768和Bright，G.M.等《抗菌素雜志》(J.Antibiot.)1988，41，1029-1047，將每篇文獻的全部內容引入作為參考。
b)可以通過使通式VI的化合物與通式VIIb表示的大環內酯的游離羥基反應生成通式I表示的化合物，其中X2為-OC(O)- 該反應一般與具有活化羧酸基能力的酸性衍生物進行，諸如鹵化物(諸如二氯化乙烯EDC))、混合的酸酐類且尤其是碳化二亞胺類。該反應一般在室溫和惰性氣體、諸如氮或氬氣環境中進行。該反應可能需要幾小時至幾天才能完成。
例如，當連接部分L為-K-O-時，可以通過(1)將大環內酯環上的＞NH基團衍生成＞N-K-OH基團和(2)使衍生的大環內酯如下所示與通式VI表示的化合物反應而生成通式I的化合物 連接基-K-OH可以如下所述與大環內酯的仲氮原子連接。使大環內酯與鏈烯酰基衍生物反應，諸如CH2＝CH(CH2)m-2C(O)O-烷基(例如，甲基丙烯酸酯)。然后諸如使用金屬氫化物(例如liAlH4)在無水有機溶劑中還原酯基(即-C(O)O-烷基)而得到含有連接基-K-OH的大環內酯(即M-K-OH)。該還原反應一般在低溫且優選在0℃或0℃以下進行。
例如，當＞NH基團連接在通式II表示的大環內酯亞單位的C/3′或N/9a位上時，也可以進行該反應。
通式VIIb的原料大環內酯是已知化合物或可以按照對類似化合物所述的步驟獲得，諸如描述在Costa，A.M.等《四面體通訊》(Tetrahedron Letters)2000，41，3371-3375中的方法，將該文獻引入本文作為參考。
c)可以通過使通式VIIc表示的大環內酯與通式VIb表示的化合物反應制備通式I表示的化合物，其中X1為-OC(O)-，Q位-NH-且X2為-NHC(O)-，
其中通式VIIc的結構式如下 其中通式VIb的結構式如下 從而得到 例如，當OH基團連接在通式II表示的大環內酯亞單位的C/6或C/4″位上時，可以進行該反應。
通過使相應的鹵代烷酰基氯與大環內酯上游離OH反應生成通式VIIc表示的大環內酯。
可以通過使適宜的胺(含有連接基-K-NH2)與通式VI的化合物反應生成通式VIb表示的化合物。
d)可以通過使通式VIId表示的大環內酯如下所示與通式VIb的化合物反應制備通式I表示的化合物，其中X1為-OC(O)NH-且X2為-NHC(O)-。
例如，當兩個游離OH基團連接在通式II表示的大環內酯亞單位的C/11或C/12位上時，可以進行該反應。
可以通過使含有兩個鄰位羥基取代基的大環內酯亞單位上的乙基碳酸酯反應生成通式VIId表示的反應劑大環內酯；e)可以通過使通式VIIe表示的大環內酯和通式VIa表示的化合物如下所示反應制備通式I表示的化合物，其中X1為-CH2-，Q為-NH-且X2為-NHC(O)-。
例如，當OH基團連接在通式II表示的大環內酯亞單位的C/4″位上時，可以進行該反應。
可以通過下列步驟生成通式VIIe表示的反應劑大環內酯氧化相應的含有羥基的大環內酯而得到取代基( 結構式)；轉化成環氧基( 結構式)；并用適宜的反應劑(例如乙二胺)裂解環氧基。
f)可以通過使含有離去基團L2(諸如Br)的通式VIIf表示的大環內酯和通式VIc表示的亞單位V如下所示反應制備通式I表示的化合物。

例如，可以通過裂解連接在用通式VIIf表示的大環內酯亞單位C/3-位上的糖基且然后使所述的大環內酯與L3-K-L2試劑反應制備通式VIIf的原料大環內酯，其中L2和L3為離去基團。
g)可以通過使含有離去基團L2(諸如Br)的通式VIIg表示的大環內酯和通式VIc的亞單位V如下所示反應制備通式I表示的化合物。
例如，可以通過使含有連接在通式II表示的大環內酯亞單位C/2′位上的游離OH的大環內酯與通式L3-C(O)-K-L2試劑反應制備通式VIIg的原料大環內酯，其中L2和L3為離去基團。
h)還可以通過使含有離去基團L2(諸如Br)的式VIIh大環內酯和通式VIc的亞單位V如下所示反應制備通式I表示的化合物。
i)還可以通過使由含有游離羥基的亞單位V制備的通式VIIIa表示的亞單位V與通式VIIa表示的大環內酯如下所示反應制備通式I表示的化合物(Huang C.M.等《化學與生物學》(Chem.& Biol.)2000，7，453-461；Hess S.等《生物有機與藥物化學》(Bioorg.& Med.Chem.)2001，9，1279-1291)。
j)還可以通過使由含有游離氨基的亞單位V制備的通式VIIIb(Pandori M.W.等《化學與生物學》(Chem.& Biol.)2002，9，567-573)或VIIIc(Hess S.等《生物有機與藥物化學》(Bioorg.& Med.Chem.)2001，9，1279-1291)表示的亞單位V與通式VIIa表示的大環內酯如下所示反應制備通式I表示的化合物。
下列實施例解釋了通式I化合物的制備方法且并不以任何方式來限定本發明。
可以按照Huang C.M.等在《化學與生物學》(Chemistry & Biology)，7，2000，453-461所述的步驟制備琥珀酸紫杉醇方案1)。
可以按照Kra lovec J.等在《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)32，1989，2426-2431所述的步驟制備γ-甲基-N′-[4-[N-[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]-N-甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸酯(2)(方案2)。
可以按照專利申請US4943579制備喜樹堿-20-O-半琥珀酸酯(方案3)。
可以按照Giammona G.等在《控釋雜志》(J.Control.Release)54，1998，321-331中所述的步驟制備5′-O-琥珀酰齊多夫定(m＝1)(方案4)。
方案1紫杉醇-大環內酯雜化物的合成方案2甲氨蝶呤-大環內酯雜化物的合成
方案3喜樹堿-大環內酯雜化物的合成
方案4齊多夫定(AZT)-大環內酯雜化物的合成 傳統上基于糖苷配基的取代模式將16-元環大環內酯類分成亞家族。該家族的主要原型以白霉素、螺旋霉素和泰洛星為代表。
泰洛星是有代表性的16-元大環內酯類，其含有帶有兩個雙鍵(tylonolide)和第三個糖取代基(β-D-mycinose)以及與5-羥基連接的二糖的高度取代的糖苷配基。從二糖中水解mycarose得到desmycarosyl-泰洛星(脫碳霉糖泰樂菌素)。
脫碳霉糖泰樂菌素上可能的修飾位置 例如，可以通過對C-20位醛基進行還原氨基化制備16-元環的大環內酯雜化物。
該反應還可以用于17-元氮雜內酯類，如8a-氮雜-高脫碳霉糖泰樂菌素及其衍生物(諸如二-和四氫衍生物)。

另一方面，16-元環大環內酯的衍生可以通過轉化雙鍵(例如環氧化)和使用合適的反應物(諸如二胺類)裂解環氧基而得到大環內酯(M-O-NH-K-NH2)來進行。
還可以用羥基胺鹽酸鹽修飾C/9位上的酮而得到肟且然后還原成胺。
當L為肽連接基時，下面的實例中解釋了通式I化合物的合成途經(V為帶有游離氨基的甾類、非甾類抗炎、抗病毒和抗腫瘤亞單位)
當L為肽連接基時，下面的實例中解釋了通式I化合物的合成途經(V為帶有游離羧基的甾類、非甾類抗炎、抗病毒和抗腫瘤亞單位)
可以通過使用一般公知的步驟制備通式I表示的化合物的鹽，諸如例如使結構I的化合物與相應的堿或酸在適宜溶劑或溶劑混合物、例如醚類(乙醚)或醇類(乙醇、丙醇或異丙醇)中反應。
本發明的另一個方面涉及通式I的化合物在治療特征在于不需要的炎癥免疫反應或與之相關的炎性疾病、失調和病癥中的應用，尤其是TNF-α和IL-1過度分泌誘導或與之相關的所有疾病和病癥(抗癌、抗病毒)。
可以通過本領域中公知的方法測定本發明化合物的治療有效量。由于可以將本發明的化合物比相應單獨的藥物更有效地轉運至所需部位，所以可以給予比抗炎、抗腫瘤和抗病毒藥物摩爾量更少量的化合物而仍然可以獲得相同的治療作用。此外，由于本發明的活性組分被靶物攝入，所以本發明的活性組分不再接觸其它組織，預計其給藥會產生較少的副作用，這使得允許增加最大耐受的抗炎、抗腫瘤和抗病毒用量。因此，下表僅用作指導。以摩爾為基準，化合物、其藥學上可接受的鹽、其溶劑化物或其前體藥物的治療有效量閾值一般等于或小于抗炎、抗腫瘤和抗病毒藥物的治療有效量。化合物、其藥學上可接受的鹽、其溶劑化物或其前體藥物的寬和優選有效量如下表中所示。
因此，例如，吲哚美辛的優選劑量范圍為50-200mg/天，相當于140-560μmol/天的范圍。相同的基于摩爾的范圍140-560mol的本發明雜化化合物為測定優選劑量范圍的起點。對該手段的精化也屬于本領域技術人員的范圍。
此外，本發明涉及藥物組合物，它含有有效量的本發明化合物和藥學上可接受的賦形劑、諸如載體或稀釋劑。
本發明藥物組合物的制備包括混合、成粒、壓片和溶解組分的步驟。化學載體可以是固體或液體形式。固體載體可以為乳糖、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、硬脂酸鎂、脂肪酸，并不限于此。液體載體可以為糖漿；油，諸如橄欖油、向日葵籽油或大豆油；水；或生理鹽水，并不限于此。類似地，載體還可以含有使活性成分緩釋的成分，諸如硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯。可以制備幾種劑型的藥物組合物。如果使用固體載體，那么這些劑型可以包括可以口服給藥的片劑、膠襄形片劑、硬膠囊、粉劑或顆粒，并不限于此。固體載體的量可以改變，但主要在25mg-1g的范圍。如果使用液體載體，那么制劑可以為糖漿劑、乳劑、軟膠囊或無菌可注射液體或非水液體混懸劑形式。
可以通過局部或全身給予本發明的化合物，例如口服、非腸道、皮下粘膜，例如口服、鼻內、直腸內和陰道內。″非腸道″指的是通過靜脈內、肌內或皮下途經。本發明化合物的相應制劑可以用于預防和治療(預防、延緩、抑制或減輕)因異常或不需要(過度、未調節或調節不良)的炎性免疫反應導致或與之相關的幾種失調(疾病和其它病理性炎癥情況)，所述的異常或不需要炎性免疫反應包括炎癥細胞因子或其它炎癥介體產生，包括但不限于TNF-α和IL-1β。這些疾病包括自身免疫疾病，諸如類風濕性關節炎、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎、多發性硬化、眼色素層視網膜炎、紅斑狼瘡、硬皮病；其它具有炎性成分的關節炎病，諸如類風濕性脊椎炎、骨關節炎、膿毒性關節炎和多關節炎；其它炎性腦病，諸如腦膜炎、阿爾茨海默病、AIDS癡呆性腦炎；其它炎性眼部炎癥，諸如視網膜炎；炎性皮膚病，諸如濕疹、其它皮炎(例如特異性皮炎、接觸性皮炎)、牛皮癬、UV照射誘發的灼傷(日光射線和類似的UV源)；炎癥性腸病，諸如克羅恩病、潰瘍性結腸炎；哮喘；其它過敏性疾病，諸如過敏性鼻炎；與急性哮喘相關的疾病，諸如中風后的大腦損傷；因心肌缺血導致的心臟組織損傷；肺損傷，諸如發生成人呼吸窘迫綜合征的肺損傷；伴有感染的炎癥，諸如膿毒癥、膿毒性休克、中毒性休克綜合征；其它與特定器官或組織相關的炎性疾病，諸如腎炎(例如腎小球腎炎)；附件炎；痛風；膽囊炎；慢性阻塞性肺病；充血性心力衰竭；II型糖尿病；肺纖維化；血管疾病，諸如動脈粥樣硬化和再狹窄；和導致移植物排斥的同種異體免疫。
在下列體外和體內實驗中測定本發明化合物的生物活性2.結合人糖皮質激素受體的試驗通過反向聚合酶鏈反應克隆用于人糖皮質激素受體α同種型的基因(EMBL Acc.No.M10901)。按照制造商(Qiagen)的說明從人外周血淋巴細胞中獲得總RNA、在50℃時用AMV逆轉錄酶(Roche)經45分鐘轉錄成cDNA，并使用特異性引物1)5′ATATGGATCCCTGATGGACTCCAAAGAATCATTAACTCC3′；和2)5′ATATCTCGAGGGCAGTCACTTTTGATGAAACAGAAG3′和pfx聚合酶(Invitrogen)擴增基因，PCR條件為94℃下變性30秒，55℃下退火30秒，68℃下3分鐘，總計36個循環；最終的延伸步驟在68℃下進行7分鐘。將得到的反應產物克隆入Bluescript KS質粒(Stratagene)的XhoI/BamHI、通過雙脫氧熒光法與M13和M13rev引物(Microsynth)進行測序，然后將其克隆入pcDNA3.1hygro(+)質粒(Invitrogen Life Technologies)的XhoI/BamHI位點。將1×105個COS-1細胞接種在12-孔平板(Falcon)內含有10％FBS(Biowhitaker)的DMEM培養基(Invitrogen LifeTechnologies)中，并在37℃下和含有5％CO2的氣體環境中培養至70％融合。除去培養基且每孔加入在500μl DMEM中的1μg的DNA、7μl的PLUS試劑和2μl的Lipofectamine(Life Technologies)。在37℃下和含有5％CO2的氣體環境中保溫細胞并在5小時后加入相同體積的20％FBS/DMEM。24小時后，完全改變培養基。轉染后48小時，加入不同濃度的測試化合物和在DMEM培養基中的24nM[3H]地塞米松(Pharmacia)。將細胞在37℃下和含有5％CO2的氣體環境中保溫90分鐘、用PBS緩沖液(Sigma)洗滌3次、冷卻至4℃(pH＝7.4)且然后在Tris緩沖液(pH＝8.0)(Sigma)中用0.2％SDS(Sigma)裂解。在加入UltimaGold XR(Packard)閃爍液后，用Tricarb(Packard)β-閃爍計數器讀取殘余的放射性。
3.作為編程性細胞死亡誘導結果的小鼠T-細胞雜交瘤13增殖抑制的試驗在96-孔平板中，使用10％FBS制備一式三份的測試甾類在RPMI培養基(Instituted of Immunology，Zagreb)中的稀釋液。向該化合物溶液中加入20000個細胞/孔并在37℃下和含有5％CO2的氣體環境中保溫過夜，然后加入1μCi[3H]胸苷(Pharmacia)并將該混合物再保溫3小時。通過施加真空用GF/C濾器(Packard)收集細胞。在每孔上加入30μl Microscynt O閃爍液(Packard)并用β-閃爍計數器(Packard)測定引入的放射性。通過使用米非司酮(Sigma)拮抗增殖抑制作用證實糖皮質激素誘導編程性細胞死亡的特異性。
小鼠肺嗜曙紅細胞增多模型將體重為20-25g的雄性Balb/C小鼠隨機分組并在第0天和第14天通過腹膜內注射卵清蛋白(OVA，Sigma)致敏。在第20天時，通過i.n.(鼻內)施用OVA(陽性對照或試驗組)或PBS(陰性對照)對小鼠進行攻擊測試。鼻內施用OVA后48小時，麻醉動物并用1mL的PBS沖洗肺。將細胞在Cytospin 3細胞離心機(Shandon)中分離。用Diff-Quick(Dade)給細胞染色并通過對至少100個細胞進行微分計數測定嗜酸性細胞的百分比。
將氟替卡松和倍氯米松用作標準抗炎物質。
每天通過鼻內或腹膜內給予不同劑量的化合物，2天后進行激發性試驗并直到該試驗完成。將化合物作為在羧甲基纖維素或在乳糖溶液中的混懸液形式給藥。
大鼠皮質酮抑制和胸腺體積減小的模型將體重為200-250g的雄性Wistar大鼠隨機分組。通過皮下途經施用測試化合物和標準糖皮質激素，每天一次，持續3天。在第3天時，對大鼠施加寒冷壓力(4℃，1小時)、用硫噴妥(Thiopenetal)(Pliva Inc.)麻醉并用肝素取血。從每只動物體內摘除完整的胸腺并立即稱重。將血漿儲存在-70℃下至檢測為止。用氯仿(5mL)從1mL血漿或從在PBS中的皮質酮標準稀釋液中提取皮質酮，用0.1M NaOH洗滌干擾化合物并加入硫酸H2O∶C2H5OH＝8∶2∶1。60分鐘后測定熒光，激發/發射波長為470/530。
b)TNF-α和IL-1β在體外人外周血單核細胞中分泌的測定由用Ficoll-PaqueTMPlus(Amersham-Pharmacia)分離PBMC后的肝素化全血制備外周血單核細胞(PBMC)。為了測定TNF-α水平，在具有平底的微量滴定板(96孔，Falcon)中的RPMI 1640培養基內將總體積為200μl的3.5-5×104個細胞培養18-24小時，所述的培養基中補充了10％加熱失活的人AB血清(Croatian Centre For TransfusionMedicine，Zagreb)、100個單位/ml的青霉素、100mg/ml鏈霉素和20mM HEPES(Invitrogen Life Technologies)。在37℃和含有5％CO2的氣體環境以及90％濕度下保溫細胞。在陰性對照中，僅在培養基(NC)中培養細胞，而在陽性對照中，通過添加1μg/ml脂多糖(LPS，大腸桿菌血清型0111B4，SIGMA)(PC)刺激TNF-α分泌并在將它們加入到用LPS(TS)刺激的細胞培養物后測定測試物質對TNF-α分泌的作用。通過ELISA、按照制造商(R&D Systems)的建議測定細胞上清液中TNF-α的水平。測試靈敏度＜3pg/ml TNF-α。如對TNF-α測定所述進行IL-1β水平的測定，僅使用1×105個細胞/孔和0.1ng/ml的LPS。通過ELISA(R & D Systems)測定IL-1β水平。通過下列等式計算TNF-α或IL-1β產生的抑制百分比抑制％＝[1-(TS-NC)/(PC-NC)]×100。
將IC50值定義為抑制50％TNF-α產生的物質濃度。將表現出20μM或20μM以下濃度的IC-50的化合物視為具有活性。使用Graph PadPrism軟件計算IC-50。
c)RAW 264.7細胞TNF-α分泌的測定使細胞生長在37℃下含有5％CO2的氣體環境以及90％濕度下在DMEM培養基中的(Invitrogen Life Technologies)10％胎牛血清(FBS)中。將20 000個細胞/孔平板固定在96孔平板(Falcon)中。在陰性對照中，僅在培養基(NC)中培養細胞，而在陽性對照中，通過添加500pg/ml脂多糖(LPS，大腸桿菌血清型0111B4，SIGMA)(PC)刺激TNF-α分泌，并在將它們加入到用LPS(TS)刺激的細胞培養物后測定測試物質對TNF-α分泌的作用。通過ELISA、按照制造商(R&D Systems)的建議測定細胞上清液中TNF-α的水平。通過下列等式計算TNF-α產生的抑制百分比抑制％＝[1-(TS-NC)/(PC-NC)]×100。
將IC-50值定義為抑制50％TNF-α產生的物質濃度。將表現出10μM或10μM以下濃度的IC-50的化合物視為具有活性。
人前列腺素-H合酶-1(hPGH-1)和人前列腺素-H合酶-2(hPGH-2)抑制試驗使用PCR、應用來自人胎盤cDNA文庫(Stratagene)的Platinumpfx DNA聚合酶(Invitrogen Life Technologies)擴增編碼hPGH-1和hPGH-2的基因。用于PGH-1的引物序列為5′ATATAAGCTTGCGCCATGAGCCGGAGTCTTC3′和5′ATATGGATCCTCAGAGCTCTGTGGATGGTCGC3′；用于hPGH-2的引物序列為5′ATATAAGCTTGCTGCG ATGCTCGCCCGC3′和5′ATATGGATCCCTACAGTTCAGTTCAGTCGAACGTTC3′。將PCR產物克隆入pcDNA3.1 Hygro(+)質粒(Invitrogen Life Technologies)的HindIII和BamHI限制位點，通過測序證實序列。
對COS-7細胞(ATCC)進行轉染，在37℃下含有5％CO2的氣體環境以及90％濕度下，使細胞在24孔平板(Falcon)內的DMEM培養基中的(Invitrogen Life Technologies)中的10％胎牛血清(FBS)中生長至中完全融合。按照制造商的建議將1μg質粒DNA(含有PGH-1或PGH-2基因或pcDNA Hygro 3.1(+)的pcDNA Hygro 3.1(+)作為陰性對照樣品)與1，5μl Lipofectamine 2000(Invitrogen Life Technologies)合并。轉染后24-48小時，將在DMEM中的測試化合物加入到細胞中，但不除去培養基并在40分鐘后，加入花生四烯酸(Sigma)至終濃度為20μM。30分鐘后，取出上清液并用PGE-2試驗試劑盒(Cayman)按照制造商的說明測定PGE-2。在陰性對照中沒有檢測到PGE-2產生。
通過下列等式計算抑制％抑制％＝(1-樣品PGE-2濃度/陽性對照PGE-2濃度)*100d)小鼠體內LPS-誘導的TNF-α過度分泌的體內模型按照已經上述方法誘導小鼠體內TNF-α分泌(Badger AM等，J.Pharmac.And Env.Therap.，1996，2791453-1461)。在本試驗中，使用8-12周齡的分成6-10只動物一組的雄性Balb/C小鼠。僅用溶劑口服給藥治療動物(陰性對照和陽性對照中)或在用LPS(大腸桿菌血清型0111B4，Sigma)處理前30分鐘給予物質溶液，劑量為1-25μg/動物。2小時后通過腹膜內注射Roumpun(Bayer)和鹽酸氯胺酮(Parke-Davis)對動物實施安樂死。將每只動物的血樣取入“vacutainer”管(BectonDickinson)并按照制造商的建議分離血漿。通過ELISA(Biosource，R&D Systems)、按照制造商所述的方法測定血漿中的TNF-α水平。測試靈敏度＜3pg/ml TNF-α。通過下列等式計算TNF-α產生的抑制百分比抑制％＝[1-(TS-NC)/(PC-NC)]*100。
將在10mg/kg劑量下表現出30％或30％以上TNF-α產生抑制的化合物視為具有活性。
e)用于止痛活性的扭體試驗在本試驗中，通過將刺激劑、最常見的是乙酸注入小鼠腹腔誘發疼痛。動物具有指定試驗名稱的特征扭體反應(Collier HOJ等，《藥物與化療》(Pha rmac.Chemother.)，1968，32295-310；Fukawa K等，《藥理學方法雜志》(J.Pharmacol.Meth.)，1980，4251-259；Schweizer A等，《活性劑的作用》(Agents Actions)，1988，2329-31)。本試驗適合于測定化合物的止痛活性。方法使用8-12周齡的雄性Balb/C小鼠(Charles River，Italy)。對對照組在腹膜內給予0.6％濃度的乙酸前30分鐘口服給予甲基纖維素，而對驗組在腹膜內給予0.6％乙酸(體積0.1ml/10g)前30分鐘口服給予標準品(乙酰水楊酸)或在甲基纖維素中的測試物質。將小鼠各自置于玻璃漏斗中并在20分鐘期限中記錄每只動物扭體的次數。按照下列等式計算扭體抑制的百分比抑制％＝(對照組中扭體次數-試驗組中扭體次數的平均值)/對照組中扭體的次數×100。
將表現出與乙酰水楊酸相同活性或優于其活性的化合物視為具有活性。
LPS-誘發的小鼠休克的體內模型使用8-12周齡的雄性Balb/C小鼠(Charles River，Italy)。用無菌鹽水稀釋分離自粘質沙雷氏菌(Serratie marcessans)(Sigma，1-6136)的LPS。首先真皮內給予劑量為4μg/小鼠的LPS注射。18-24小時后，通過靜脈內給予200μg/小鼠劑量的LPS。按照上述方式對對照組給予兩次LPS注射。對試驗組在各自給予LPS前半小時口服所述物質。24小時后觀察存活率。
將在30mg/kg劑量下產生存活率為40％或更好存活率的化合物視為具有活性。
如果化合物在上述試驗中的至少兩種中表現出具有統計學顯著性(通過Student氏t-檢驗，p＜0.05)，那么認為這些化合物具有活性。所用化合物的摩爾量低于發揮如文獻中報導的輕度抗炎作用的大環內酯的閾值量(大約30μm)。
(ii)用于篩選對HIV復制的抑制作用的體外試驗HIV-1轉染T4-細胞系。預先證實MT-4(Koyanagi等《國際癌癥雜志》(Int.J.Cancer)，36，445-451，1985)對用作靶細胞系的HIV高度敏感。將抑制HIV-誘導的致細胞病變作用作為終點。使用分光光度法、通過MTT的原位減少估計HIV-和模擬-感染細胞的存活率。將50％細胞毒性濃度定義為將模擬-感染的對照樣品的吸收度降低50％的化合物濃度。將化合物在HIV-感染細胞中實現的保護百分比計算為使用指定濃度測試化合物在HIV-感染細胞中測定的光密度。測定細胞毒性作用和保護作用之比。
(iii)用于篩選對HCV復制的抑制作用的體外試驗使用Lohmann等報導的方法的改進方法測定新化合物的活性[V.Lohmann等《科學》(Science)，1999，285，110-113]。
將含有HCV復制子的細胞系用于證實新化合物抑制HCV復制子RNA在細胞中復制的能力。抑制HCV復制子RNA復制使細胞中復制子RNA減少，可以使用對這種RNA進行特異性定量的方法測定這種減少。
本試驗基于使用報道基因作為胞內HCV復制子RNA水平的單純示值讀數的構思。為了這一目的，將Renilla熒光素酶基因導入緊隨內部核糖體進入位點(IRES)序列后的復制子構建體NK5.1的第一開放可讀框(Krieger等，《病毒學雜志》(J.Virol.)754614)，并通過來自口蹄疫病毒的自切割肽2A與新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因融合(Ryan & Drew，EMBO Vol 13928-933)。在體外轉錄后，將RNA電穿孔入人肝細胞瘤Huh7細胞并分離和平展G418-抗性菌落。證實穩定選擇的細胞系含有復制HCV次基因組RNA，且復制子表達的Renilla熒光素酶活性反映了其在細胞中在RNA水平。
就試驗過程而言，將在含有5％胎牛血清(FCS)(Invitrogen cat no.10106-169)的Dulbecco′s MEM Invitrogen cat no.3196 6-021)中培養的Renilla熒光素酶HCV復制子細胞以5000個細胞/孔平板固定在96-孔平板上并保溫過夜。24小時后，向細胞中加入在生長培養基中不同稀釋的化學化合物，然后在37℃下進一步保溫3天。將平板試驗一式兩份進行，一份為不透明的白色且一份為透明的，目的是平行測定化合物的活性和細胞毒性，從而確保觀察到的活性并非因對細胞增殖的減少作用所致。
在保溫結束時，收集白色平板上的細胞并通過使用雙重-熒光素酶報道基因檢測系統(Promega cat no.E1960)測定熒光素酶的活性。下面段落中所述的所有試劑均包括在制造商的試劑盒中且附帶的制造商的說明用于制備試劑。簡單的說，每孔用20μL PBS(磷酸緩沖鹽水；pH 7.0)洗滌細胞并用25μL 1x被動溶解緩沖液溶解，此后在室溫下保溫20分鐘。向每個孔中加入100微升的LAR II試劑。然后將平板插入微平板發光計(Packard)并將100μL Stop & Glo試劑注入每孔并測定發光。可以根據熒光素酶活性降低百分比與藥物濃度的關系圖計算將復制子水平相對于未處理的細胞的對照值減少50％所需的藥物濃度IC50。
抗腫瘤活性的體外試驗將EL-4細胞系用于體外篩選抗腫瘤活性。使細胞生長在37℃、5％CO2和90％相對濕度下補充了10％FBS(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)中。試驗在96孔平板上進行，化合物的稀釋度為10-5至10-10M且使用30000個細胞/孔。24小時處理后，加入3H標記的胸苷(Amersham)，持續4小時。用應用GF/C濾器(Packard)的細胞收集儀(Packard)收集細胞。加入閃爍液(Microscint 20，Packard)并對閃爍進行計數。
如下計算抑制作用抑制％＝(1-CPM樣品/CPM陽性對照)*100。L1210腹膜內腫瘤模型在第0天給DBA2小鼠(雄性9-12周，20-30g)腹膜內注射106個存活細胞。隨后在第1、2和3天用單劑量或多劑量通過腹膜內給予順鉑或雜化化合物治療動物。每天給單位稱重且每天觀察2次腫瘤生長的征候。如果體重降為低于原始體重的80％或如果觀察到其它嚴重的毒理學問題，則處死動物。在實驗結束時注意到了總體解剖學的改變。B16黑素瘤腹膜內模型給雄性C57BL/6 J小鼠經腹膜內(i.p)接種106個存活B16F10細胞。在第0天注射細胞并在隨后的1天經腹膜內注射作為單劑量或多劑量的游離順鉑或雜化化合物。如上所述監測動物。
B16黑素瘤皮下模型給雄性C57BL/6 J小鼠經皮下(s.c.)接種105個存活B16F10細胞。使腫瘤建立至面積約為50-70mm2，根據二正交直徑的產物測定。通過腹膜內或靜脈內注射2、5、10、15mg Pt/kg的游離順鉑或雜化化合物19-21來治療帶有皮下腫瘤的動物。
合成方法和實施例中間體的制備中間體A 將2-氯三苯甲基氯樹脂(1eq＝0,5mmol，600mg)放入安裝了粗玻璃料過濾器的玻璃柱上并在DCM中溶脹10分鐘。然后過濾樹脂并用DCM洗滌3次。在用DMF洗滌后，通過添加2.0mL 0.6M氨基酸在DMF中的溶液和0,630ml N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)給樹脂加載N-R-Fmoc-甘氨酸并混合。5分鐘后，加入0,315ml DIPEA。在混合50分鐘后，加入0,5ml量的甲醇。10分鐘后，過濾樹脂并用DCM、DMF和甲醇洗滌10次。
脫保護制備哌啶在DMF中的不同溶液并如下傾倒在珠上5％哌啶/DMF 10分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 15分鐘(大約10ml)50％哌啶/DMF 30分鐘(大約10ml)脫保護后，用DMF洗滌樹脂。
將第二種氨基酸Fmoc-亮氨酸(1060mg，3mmol)和2-(1 H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基糖醛酸鎓(uronium)六氟磷酸鹽(tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HBTU)溶于3mL DMF并快速加入0.216mL(5mmol)DIPEA，并且同時加入到反應管內的到單體/樹脂混合物中。
封端制備10eq(2,04ml)乙酸酐和10eq(3,48ml)DIPEA在5ml DMF中的溶液。將2,5ml該溶液加入到反應混合物中5分鐘。另起一段如下用哌啶在DMF中的溶液使第二種氨基酸脫保護30％哌啶/DMF 2分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 2分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 5分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 5分鐘(大約10ml)并用大量DMF洗滌。
對下列氨基酸重復相同的偶聯脫保護步驟第三種氨基酸Fmoc-苯丙氨酸1162mg，3mmolHBTU，1081mg/3ml DMFDIPEA，0,87ml；和第四種氨基酸Fmoc-甘氨酸，892mg，3mmolHBTU，1081mg/3ml DMFDI PEA，0,87ml；隨后過濾并用DMF洗滌。
向反應管內的四肽/樹脂混合物中加入地塞米松酸(567mg，3eq)、HBTU(540mg，3,8eq)和0,435ml DIPEA在3ml DMF中的混合物、混合并保持過夜。
封端將0,5ml乙酸酐和0,5ml DIPEA在3ml DMF中的溶液加入到反應混合物中5分鐘，隨后用DCM、DMF和MeOH洗滌并在真空下干燥。
從樹脂中裂解將10ml 50％三氟乙酸在DCM中的溶液傾倒在珠上并混合15分鐘。通過過濾除去試劑并用DCM洗滌珠2x。再使用10ml酸重復相同步驟。蒸發收集的溶劑以除去過量的TFA并加入一定量的乙醚。分離到60,1mg中間體A。MS(m/z)753.3[MH]+
實施例I化合物1(地塞米松-Gly-Phe-Leu-Gly-阿奇霉素) 在惰性氣體環境中將中間體A(57mg；0.076mmole)溶于干燥CH2Cl2(5mL)并在0℃下冷卻。加入0.115mL N，N-二異丙基乙胺和20,5mg 1-羥基苯并三唑，隨后添加化合物9-脫氧-9a-氮雜-9a-(γ-氨基丙基)-9a-高紅霉素A(60mg；0.076mmole)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(57,6mg，0,30mmol)。將該反應混合物在室溫下和氬氣流中攪拌24小時，然后在減壓條件下蒸發至小體積且用硅膠柱純化(洗脫劑CHCl3∶CH3OH∶NH4OH＝6∶1∶0.1)。得到14mg化合物1；MS(m/z)1527，3[MH]+.IR(cm-1)/KBr3415，2969，2939，2874，1664，1528，1458，1378，1262，1168，1107，1054，1013，959，894，803，702.
中間體B
將2-氯三苯甲基氯樹脂(1eq＝0,5mmol，600mg)放入安裝了粗玻璃料過濾器的玻璃柱上并在DCM中溶脹10分鐘。然后過濾樹脂并用DCM洗滌3次。在用DMF洗滌后，通過添加2.0mL 0.6M氨基酸在DMF中的溶液和0,630ml N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)給樹脂加載N-R-Fmoc-甘氨酸并混合。5分鐘后，加入0,315ml DIPEA。在混合50分鐘后，加入0,5ml量的甲醇。10分鐘后，過濾樹脂并用DCM、DMF和甲醇洗滌10次。
脫保護制備哌啶在DMF中的不同溶液并如下傾倒在珠上5％哌啶/DMF 10分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 15分鐘(大約10ml)50％哌啶/DMF 30分鐘(大約10ml)脫保護后，用DMF洗滌樹脂。
將第二種氨基酸Fmoc-亮氨酸(1060mg，3mmol)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基糖醛酸鎓六氟磷酸鹽(tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HBTU)溶于3mL DMF并快速加入0.216mL(5mmol)DIPEA，同時加入到反應管內的單體/樹脂混合物中。
封端制備10eq(2,04ml)乙酸酐和10eq(3,48ml)DIPEA在5ml DMF中的溶液。將2,5ml該溶液加入到反應混合物中5分鐘。
如下用哌啶在DMF中的溶液使第二種氨基酸脫保護30％哌啶/DMF 2分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 2分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 5分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 5分鐘(大約l0ml)并用大量DMF洗滌。
對下列氨基酸重復相同的偶聯脫保護步驟第三種氨基酸Fmoc-苯丙氨酸1162mg，3mmol
HBTU，1081mg/3ml DMFDIPEA，0,87ml；和第四種氨基酸Fmoc-甘氨酸，892mg，3mmolHBTU，1081mg/3ml DMFDIPEA，0,87ml；僅在偶聯第四種氨基酸后不除去Fmoc保護基。
過濾并用DMF洗滌后，從樹脂中取出產物將10ml50％三氟乙酸在DCM中的溶液傾倒在珠上并混合15分鐘。通過過濾除去試劑并用DCM洗滌珠2x。再使用10ml酸重復相同步驟。蒸發收集的溶劑以除去過量的TFA并加入一定量的乙醚。分離到109,1mg中間體B1。MS(m/z)715，6(MH)+ 中間體B1將2-氯三苯甲基氯樹脂(1eq＝0,352mmol，326mg)放入安裝了粗玻璃料過濾器的玻璃柱上并在DCM中溶脹10分鐘。然后過濾樹脂并用DCM洗滌3次。在用DMF洗滌后，通過添加溶于2mL DMF中的259mg(0,422mmol)和0,150ml N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)給樹脂加載化合物B1并混合。5分鐘后，加入0,230ml DIPEA。在混合50分鐘后，加入0,355ml量的甲醇。10分鐘后，過濾樹脂并用DCM、DMF和甲醇洗滌10次。
脫保護制備哌啶在DMF中的不同溶液并如下傾倒在珠上5％哌啶/DMF 10分鐘(大約10ml)30％哌啶/DMF 15分鐘(大約10ml)50％哌啶/DMF 30分鐘(大約10ml)脫保護后，用DMF洗滌樹脂。
將377mg(1,055mmol)吲哚美辛和533mg(1,41mmol)2-(1-H-苯并三唑-1基)-1，1，3，3-四甲基糖醛酸鎓六氟磷酸鹽(tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HBTU)溶于3mL DMF并快速加入0.602mL(3,52mmol)DIPEA，同時加入到反應管內的聚合物/樹脂混合物中。
封端將0,5ml乙酸酐和0,5ml DIPEA在3ml DMF中的溶液加入到反應混合物中5分鐘、過濾并用DCM、DMF和MeOH洗滌。
從樹脂中裂解將10ml 50％三氟乙酸在DCM中的溶液傾倒在珠上并混合15分鐘。通過過濾除去試劑并用DCM洗滌珠2x。再使用10ml酸重復相同步驟。蒸發收集的溶劑以除去過量的TFA并加入一定量的乙醚。分離到210,8mg產物、即中間體B。MS(m/z)732，66[MH]+實施例II化合物2(吲哚美辛-Gly-Phe-Leu-Gly-阿奇霉素) 在惰性氣體環境中將中間體B(200mg；0,27mmol)溶于干燥CH2Cl2(5mL)。加入0.416mL(2,14mmol)N，N-二異丙基乙胺和74mg(0,55mmol)1-羥基苯并三唑，隨后添加化合物9-脫氧-9a-氮雜-9a-(γ-氨基丙基)-9a-高紅霉素A(216,6mg；0.27mmole)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(188mg，1,09mmol)。將該反應混合物在室溫下和氬氣流中攪拌24小時，然后在減壓條件下蒸發至小體積并用硅膠柱純化(洗脫劑CHCl3∶CH3OH∶NH4OH＝6∶1∶0.1)。得到70mg化合物2；MS(m/z)1505，8[MH]+.IR(cm-1)/KBr3654，3633，3425，3084，2970，2936，1720，1652，1637，1545，1439，l368，1309，1230，1179，1111，1089，1055，1013，867，803，739，700，643.
實施例III按照實施例I的一般步驟并取代其中適宜的反應物得到下列化合物 化合物3R1＝F；R2＝F；R3＝OH化合物4R1＝F；R2＝H；R3＝H化合物5R1＝F；R2＝F；R3＝H化合物6R1＝H；R2＝F；R3＝OH實施例IV
按照實施例II的一般步驟并取代其中適宜的反應物得到下列化合物V-Gly-Phe-Leu-Gly-M

實施例V化合物19在氬氣環境中向琥珀酸紫杉醇(1當量)在干燥CH2Cl2(5ml)中的溶液中加入9當量的三乙胺、2當量的1-羥基苯并三唑、1當量的9-脫氧-9a-氮雜-9a-(γ-氨基丙基)-9a-高紅霉素A和4當量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺鹽酸鹽。將該反應混合物在室溫下和氬氣流中攪拌24小時，然后在減壓條件下蒸發至小體積且用硅膠柱純化，使用氯仿、甲醇和氨作為洗脫劑。色譜產物的特征在于具有如下結構式
實施例VI化合物20在氬氣環境中向琥珀酸喜樹堿(1當量)在干燥CH2Cl2(5ml)中的溶液中加入9當量的三乙胺、2當量的1-羥基苯并三唑、1當量的9-脫氧-9a-氮雜-9a-(γ-氨基丙基)-9a-高紅霉素A和4當量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺鹽酸鹽。將該反應混合物在室溫下和氬氣流中攪拌24小時，然后在減壓條件下蒸發至小體積且用硅膠柱純化，使用氯仿、甲醇和氨作為洗脫劑。色譜產物的特征在于具有如下結構式
實施例VII化合物21在氬氣環境中向γ-甲基-N’-[4-[N-[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]-N-甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸酯(1當量)在干燥DMF中的溶液中加入2當量的1，1-羰基二咪唑(在5ml DMF中)。將該反應混合物在-5℃下攪拌24小時，然后加入1當量的在干燥DMF中的化合物9-脫氧-9a-氮雜-9a-(γ-羥基丙基)-9a-高紅霉素A。將該反應混合物在100℃下加熱48小時，然后蒸發并用硅膠柱純化，使用氯仿、甲醇和氨作為洗脫劑。色譜產物的特征在于具有如下結構式
實施例VIII化合物22在氬氣環境中向5′-O-琥珀酰齊多夫定(1當量)在干燥CH2Cl2(5ml)中的溶液中加入9當量的三乙胺、2當量的1-羥基苯并三唑、1當量的9-脫氧-9a-氮雜-9a-(γ-氨基丙基)-9a-高紅霉素A和4當量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亞胺鹽酸鹽。將該反應混合物在室溫下和氬氣流中攪拌24小時，然后在減壓條件下蒸發至小體積且用硅膠柱純化，使用氯仿、甲醇和氨作為洗脫劑。色譜產物的特征在于具有如下結構式
縮寫Pyr吡啶NEt3三乙胺4-PP4-吡咯并吡啶DMAP2，6-二甲氨基吡啶DIPEAN，N′-二異丙基乙胺DMF二甲基甲酰胺TFA三氟乙酸
權利要求
1.通式I的化合物及其藥學上可接受的鹽和溶劑化物及其各非對映異構體 其中M表示具有在炎性細胞內累積特性的大環內酯亞單位；V為抗炎甾類亞單位或非甾類抗炎亞單位或抗腫瘤亞單位或抗病毒亞單位，且L為與M和V各自共價連接的連接分子。
2.權利要求1的化合物，其中M表示通式II的基團 其中(i)Z和W獨立為＞C＝O、＞CH2、＞CH-NRtRs、＞N-RN或＞C＝N-RM或鍵，其中Rt和Rs獨立為氫或烷基；RM為羥基、烷氧基、取代的烷氧基或ORP；RN為氫、RP、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基或-C(X)-NRtRs；其中X為＝O或＝S；條件是Z和W不能同時為＞C＝O、＞CH2、＞CH-NRtRs、＞N-RN或＞C＝N-RM或鍵；(ii)U和Y獨立為氫、鹵素、烷基或羥基烷基；(iii)R1為羥基、ORP、-O-S2基團或＝O；(iv)S1為下式的糖部分 其中R8和R9均為氫或一起形成鍵，或R9為氫且R8為-N(CH3)Ry，其中Ry為RP、RZ或-C(O)RZ，其中RZ為氫或烷基或鏈烯基或炔基或環烷基或芳基或雜芳基或被C2-C7-烷基、C2-C7-鏈烯基、C2-C7-炔基、芳基或雜芳基取代的烷基；R10為氫或RP；(v)S2為下式的糖部分 其中R3’為氫或甲基；R11為氫、RP或O-R11為與R12和與C/4″碳原子形成＞C＝O或環氧基的基團；R12為氫或與O-R11和與C/4″碳原子形成＞C＝O或環氧基的基團；(vi)R2為氫、羥基、ORP或烷氧基；(vii)A為氫或甲基；(viii)B為甲基或環氧基；(ix)E為氫或鹵素；(x)R3為羥基、ORP、烷氧基或R3為與R5和與C/11和C/12碳原子形成環碳酸酯或環氨基甲酸酯的基團；或如果W或Z為＞N-RN，那么R3為與W或Z形成環氨基甲酸酯的基團；(xi)R4為C1-C4烷基；(xii)R5為氫、羥基、ORP、C1-C4-烷氧基或與R3和與C/11和C/12碳原子形成環碳酸酯或環氨基甲酸酯的基團；(xiii)R6為氫或C1-C4-烷基；其中M含有連接位置，它通過該位置經連接基L與V連接；條件是連接位置位于下列基團中的一個或多個上a)位于S1、S2或糖苷配基氧上的任意活性羥基、氮或環氧基，條件是S1或/和S2被裂解；b)位于Z或W上的活性＞N-RN或-NRtRs或＝O；c)位于R1、R2、R3和R5中任意一個上的活性羥基；d)可以首先被衍生成羥基或-NRtRs基團的任意其它基團；且RP為羥基或氨基保護基。
3.如權利要求1中所述的化合物，其中L表示通式IV組中的成員X1-(CH2)m-Q-(CH2)n-X2IV其中X1選自-CH2-、-C(O)-、OC(O)-、N-O-、-OC(O)NH-或-C(O)NH-；X2為-NH-或-NHC(O)-、-OC(O)-、-C(O)-、-O或-CH2-；Q為-NH-或-CH2-或不存在；其中-CH2-或-NH-基團各自可以任選被C1-C7-烷基、C2-C7-鏈烯基、C2-C7-炔基、C(O)RX、C(O)ORX、C(O)NHRX取代，其中RX可以為C1-C7-烷基、芳基或雜芳基；符號m和n獨立為0-4的整數，條件是如果Q為NH，那么n不能為0；且V僅為抗腫瘤亞單位或抗病毒亞單位。
4.權利要求1的化合物，其中L表示肽連接基，包含約2-約50個氨基酸的多肽。
5.如權利要求1中所述的化合物，其中V表示通式X組中的成員 其中Ra和Rb獨立地表示氫或鹵素；Rc為羥基、烷氧基、烷基、硫代氨基甲酰基、氨基甲酰基或價鍵；Rd和Re獨立地表示氫、羥基、甲基或C1-C4-烷氧基或各自為與另一個形成1，3-二氧戊環的基團或價鍵；Rf為氫、羥基、氯或與它所連接的碳原子形成酮基；Rj為氫或鹵素。
6.權利要求1的化合物，其中V來源于NSAID，所述的NSAID選自醋氯芬酸、阿西美辛、對乙酰氨基酚、醋氨沙洛、乙酰水楊酸、乙酰基-水楊-2-氨基-4-甲基吡啶-酸、5-氨基乙酰水楊酸、阿氯芬酸、氨洛芬、氨芬酸、氨基安替比林、安吡昔康、阿尼利定、芐達酸、苯噁洛芬、柏莫洛芬、α-沒藥醇、溴芬酸、5-溴水楊酸乙酸酯、溴水楊苷、布氯酸、丁布芬、卡洛芬、塞來考昔、chromoglycate、桂美辛、clindanac、氯吡酸、雙氯芬酸鈉、二氟尼柳、地他唑、屈噁昔康、恩芬那酸、依托度酸、依托芬那酯、聯苯乙酸、芬布芬、芬克洛酸、芬度柳、非諾洛芬、芬替酸、非普地醇、flufenac、氟芬那酸、氟尼辛、氟諾洛芬、氟比洛芬、glutametacin、水楊酸乙二醇酯、異丁芬酸、布洛芬、異丁普生、吲哚美辛、吲哚洛芬、三苯唑酸、伊索克酸、伊索昔康、酮洛芬、酮咯酸、氯諾昔康、洛索洛芬、甲氧芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、5-氨基水楊酸、甲嗪酸、莫苯唑酸、孟魯司特、萘丁美酮、萘普生、尼氟酸、尼美舒利、奧沙拉秦、奧沙西羅、噁丙嗪、羥布宗、對乙酰氨基酚、帕沙米特、哌立索唑、苯乙酰水楊酸酯、保泰松、水楊酸苯酯、吡拉唑酸、吡羅西康、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸、reserVeratol、醋水楊胺、水楊酰胺、水楊酰胺-O-乙酸、水楊酰硫酸酯、水楊苷、水楊酰胺、雙水楊酯、舒林酸、舒洛芬、suxibutazone、他莫昔芬、替諾昔康、噻洛芬酸、噻拉米特、ticlopridine、替諾立定、托芬那酸、托美丁、tropesin、聯苯丁酸、希莫洛芬、扎托洛芬、佐美酸、托莫普羅、扎魯司特和環孢菌素。
7.權利要求1的化合物，其中V來源于抗腫瘤化合物，所述的抗腫瘤化合物選自bicaluatnide、喜樹堿、雌莫司汀磷酸酯、氟他胺、氮芥、塞替派、異環磷酰胺、羥基脲、博來霉素、紫杉醇、洛莫司汀、伊立替康、甲氨蝶呤、長春瑞濱、阿那曲唑、氟尿苷、美法侖、長春新堿、長春堿、絲裂霉素、諾龍、戈舍瑞林、亮丙立德、曲普瑞林、氨魯米特、米托坦、順鉑、苯丁酸氮芥、噴司他丁、克拉屈濱、白消安、依托泊苷、米托蒽醌、伊達比星、環磷酰胺、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、環磷酰胺、多柔比星、柔紅霉素、替尼泊苷、他莫昔芬、泰索帝和托泊替康。
8.權利要求1的化合物，其中V來源于抗病毒化合物，所述的抗病毒化合物選自阿昔洛韋、泛昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋、拉米夫定、利托那韋、茚地那韋、奈韋拉平、齊多夫定、去羥肌苷、司他夫定、阿巴卡韋、扎西他濱、氨普奈韋、利巴韋林和金剛烷。
9.權利要求2的化合物，其中Z和W共同為-N(CH3)-CH2-、-NH-CH2-、-CH2-NH-、-C(O)-NH-或-NH-C(O)-；A和B為甲基；E為氫；R2為羥基或甲氧基；S1表示去氧糖胺糖，其中R8選自氫、甲基、氨基、C1-C6烷基氨基或C1-C6二烷氨基；R9和R10為氫；R1為羥基或O-S2基團，其中S2表示克拉定糖，其中R11為氫或O-R11為與R12和與C/4″碳原子形成＞C＝或環氧基的基團；R12為氫或與O-R11和與C/4″碳原子形成＞C＝O或環氧基的基團；R13為甲基；U為氫；Y為甲基；R6為羥基、甲基或乙基；R5為氫、羥基、甲氧基或與R3和與C/11和C/12碳原子形成環碳酸酯或環氨基甲酸酯橋的基團；R3為羥基或與W或Z形成環氨基甲酸酯橋的基團，或R3為與R5和與C/11和C/12碳原子形成環碳酸酯或環氨基甲酸酯橋的基團；R4為甲基；條件是連接鍵通過N/9a位上Z的氮或通過均在S2糖C/4″位上的R12的碳或R11的氧。
10.權利要求3的化合物，其中X1為-CH2-或-OC(O)-；X2為-NHC(O)-；Q為-NH-或不存在。
11.權利要求6的化合物，其中V來源于NSAID，所述的NSAID選自S-(+)-布洛芬、吲哚美辛、氟比洛芬、萘普生、酮洛芬、乙酰水楊酸、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、舒洛芬、氟尼辛、雙氯芬酸鈉和托美丁鈉。
12.權利要求7的化合物，其中V來源于抗腫瘤化合物，所述的抗腫瘤化合物選自甲氨蝶呤、紫杉醇、喜樹堿和多柔比星。
13.權利要求8的化合物，其中V來源于抗病毒化合物，所述的抗病毒化合物選自齊多夫定、去羥肌苷和司他夫定組成的組。
14.如下式的化合物
15.如下式的化合物
16.如下式的化合物
17.如下式的化合物
18.如下式的化合物
19.如下式的化合物
20.如下式的化合物
21.如下式的化合物
22.如下式的化合物
23.如下式的化合物
24.如下式的化合物
25.如下式的化合物
26.如下式的化合物
27.如下式的化合物
28.如下式的化合物
29.如下式的化合物
30.如下式的化合物
31.如下式的化合物
32.如下式的化合物
33.如下式的化合物
34.如下式的化合物
35.如下式的化合物
36.通式I化合物的制備方法 包括a)為了得到其中X2為-NHC(O)-的通式I化合物，使通式VI的化合物與通式VIIa表示的大環內酯游離氨基反應，其中通式VI如下 其中L1表示離去基團，且通式VIIa如下 b)為了得到其中X2為-OC(O)-的通式I化合物，使通式VI的化合物與通式VIIb表示的大環內酯游離羥基反應， c)為了得到其中X1為-OC(O)-、Q為-NH-且X2為-NHC(O)-的通式I化合物，使通式VIIc表示的大環內酯 與通式VIb表示的化合物的游離氨基反應， d)為了得到其中X1為-OC(O)NH-且X2為-NHC(O)-的通式I化合物，使通式VIId表示的大環內酯 與通式VIb表示的化合物的游離氨基反應；e)為了得到其中X1為-CH2-、Q為-NH-且X2為-NHC(O)-的通式I化合物，使通式VIIe表示的大環內酯 與通式VI的化合物反應；f)為了得到通式I的任意L化合物，使含有離去基團L2的通式VIIf或通式VIIg或通式VIIh表示的大環內酯與通式VIc表示的非甾類抗炎亞單位的游離羧酸反應，其中通式VIIf、通式VIIg、通式VIIh如下 其中通式VIc如下
37.藥物組合物，包含如權利要求1的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑化物以及藥學上可接受的稀釋劑或載體。
38.治療炎性疾病、失調和病癥的方法，所述炎性疾病、失調和病癥的特征在于不需要的炎性免疫反應或與之相關，尤其是TNF-α和IL-1過度分泌誘導或與之相關的疾病和病癥，該方法包括給予患有所述失調或病癥之一的對象權利要求1的化合物。
39.在需要的對象中治療與白細胞浸潤入發炎組織相關的炎性病癥或免疫或過敏性失調的方法，包括給予所述的對象治療有效量的通式I表示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
40.權利要求39的方法，其中所述的病癥或失調選自哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、支氣管炎和囊性纖維化。
41.權利要求39的方法，其中所述的炎性病癥或失調選自肺、關節、眼、腸、皮膚和心臟的炎性病癥或免疫失調。
42.權利要求39的方法，其中所述的炎性病癥或失調選自哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、支氣管炎、囊性纖維化、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎、痛風性關節炎、眼色素層炎、結膜炎、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、遠端直腸炎、牛皮癬、濕疹、皮炎、冠狀動脈梗死性損害、慢性炎癥、內毒素休克和平滑肌增生性失調。
43.減輕患病器官或組織炎癥的方法，包括將治療有效量的通式I表示的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物遞送至所述的器官或組織。
44.治療病毒性疾病、失調和病癥的方法，包括給予患有所述疾病或失調之一的對象有效量的權利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
45.權利要求44所述的方法，其中所述的病毒性疾病為HIV。
46.減輕病毒感染的征候或癥狀或標記的方法，包括給予存在所述征候或癥狀或標記的對象治療有效量的權利要求1的化合物。
47.治療病毒感染的癥狀或征候或標記的方法，包括給予存在所述征候或癥狀或標記的對象治療有效量的權利要求1的化合物。
48.權利要求47所述的方法，其中所述的癥狀或征候選自所述對象中的病毒負荷、病毒復制、病毒活性、病毒血癥、病毒特異性抗原、病毒RNA、病毒DNA、逆轉錄酶活性、抗病毒細胞毒性細胞活性和所述對象的T-細胞或CD4+細胞計數。
49.治療瘤形成的癥狀或征候或標記的方法，包括給予存在所述癥狀或征候的對象治療有效量的權利要求1的化合物。
50.權利要求49所述的方，其中所述瘤形成的癥狀或征候選自腫瘤負荷、腫瘤大小、患病器官重量、腫瘤復發、存活時間、對象緩解的時間長度或程度、癌細胞生長、癌細胞存活、編程性細胞死亡指數、轉移程度或轉移速率、與特定類型瘤形成相關的生物標記、增殖標記、與受體功能相關的腫瘤相關癌基因調節障礙的激活、腫瘤特異性抗原和與腫瘤相關的血管發生。
51.治療瘤形成的方法，包括給予患有瘤形成的對象治療有效量的權利要求1的化合物。
52.權利要求4所述的化合物，其中所述的多肽選自Gly-Phe-Leu、Gly-Gly-Phe、Gly-Phe-Phe、Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Ala、Gly-Leu-Phe、Gly-Leu-Ala、Ala-Val-Ala、Gly-Gly-Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Ala-Leu、Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Phe-Leu、Gly-Leu-Leu-Gly、Gly-Phe-Tyr-Ala、Gly-Phe-Gly-Phe、Ala-Gly-Val-Phe和Gly-Phe-Phe-Gly。
全文摘要
本發明涉及(a)通式I表示的新化合物，其中M表示來源于具有在炎性細胞內累積特性的大環內酯的大環內酯亞單位(大環內酯部分)，V表示抗炎甾類或非甾類亞單位或抗腫瘤或抗病毒亞單位，并且L表示共價連接M和V的連接基；(b)所述新化合物的藥學上可接受的鹽、前體藥物和溶劑化物；(c)其制備方法和中間體；和(d)它們在治療人和動物的炎性/腫瘤/病毒性疾病和病癥中的應用。
文檔編號A61K31/585GK1665831SQ03816097
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月8日 優先權日2002年7月8日
發明者M·默塞普, M·麥西克, L·托馬斯科維克, S·馬科維克 申請人:普利瓦研究院有限公司