血管化增強(qiáng)的移植構(gòu)造物的制作方法

專利名稱：血管化增強(qiáng)的移植構(gòu)造物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管化增強(qiáng)的粘膜下層組織衍生的移植物以及它們修復(fù)患病或受損組織的用途。更具體而言，本發(fā)明涉及已經(jīng)用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種的血管化增強(qiáng)的腸粘膜下層組織移植物，從而提高腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的修復(fù)能力。
背景技術(shù)：
和概述本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)受損或患病組織的組織移植構(gòu)造物，它包括用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種的脊椎動物粘膜下層-衍生的基質(zhì)。本發(fā)明所用的腸粘膜下層-衍生的基質(zhì)優(yōu)選包括高度保守的膠原、糖蛋白、蛋白聚糖、和糖胺聚糖。本發(fā)明所用的腸粘膜下層基質(zhì)來源于溫血脊椎動物的腸粘膜下層組織。
按照本發(fā)明制備的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物基本上是無細(xì)胞的基質(zhì)，提供類似體內(nèi)基質(zhì)環(huán)境的良好細(xì)胞生長基質(zhì)。腸粘膜下層組織的天然組成和構(gòu)型提供了一種獨(dú)特的細(xì)胞生長基質(zhì)，它可促進(jìn)體外細(xì)胞附著和增殖，并在體內(nèi)植入移植構(gòu)造物時(shí)誘導(dǎo)組織重塑。
作為組織移植材料，腸粘膜下層組織可誘導(dǎo)內(nèi)源性組織在植入到宿主中后生長(即，腸粘膜下層組織誘導(dǎo)重塑)。腸粘膜下層組織已經(jīng)成功用于血管移植物、膀胱和疝的修復(fù)、腱和韌帶的替換、和皮膚移植物中。作為組織移植物組分的腸粘膜下層的制備和使用在美國專利US 4,902,508中描述。當(dāng)用于這類應(yīng)用中時(shí)，腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物似乎不僅作為被移植構(gòu)造物替換的組織的生長或再生長的基質(zhì)起作用，而且可促進(jìn)或誘導(dǎo)內(nèi)源性組織的這種生長或再生長。腸粘膜下層組織以可植入片的形式或可注射的流體或凝膠形式使用，從而誘導(dǎo)內(nèi)源性組織的再生長。
本發(fā)明涉及腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物，它包括加入的內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，且本發(fā)明還涉及使用這些移植構(gòu)造物增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。血管化增強(qiáng)的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物是在將腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物植入或注射到宿主中前，通過用內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞前體(例如，祖細(xì)胞或干細(xì)胞)和至少一種附加的預(yù)選或預(yù)定的細(xì)胞類型體外接種腸粘膜下層組織而制備的。
其中一個(gè)實(shí)施方案提供一種用于修復(fù)患病或受損組織的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物。所述組織移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。
在另一實(shí)施方案中，提供血管化的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物用于修復(fù)患病或受損組織。所述組織移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)過一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，提供一種用于增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種腸粘膜下層組織，從而形成移植構(gòu)造物，然后將移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中需要修復(fù)的部位的步驟。
在另一實(shí)施方案中，提供一種用于增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種腸粘膜下層組織，體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)或成分的形成，然后將移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中需要修復(fù)的部位的步驟。
在這些方法實(shí)施方案的任何一個(gè)中，可用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，也可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織前，用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，或用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織。
可將內(nèi)皮細(xì)胞在腸粘膜下層組織上體外培養(yǎng)一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成，或?qū)?nèi)皮細(xì)胞在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠在沒有體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)的情況下，使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增(即，使內(nèi)皮細(xì)胞分裂至少一次)。可選擇性地，可在內(nèi)皮細(xì)胞沒有擴(kuò)增的情況下植入移植構(gòu)造物。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，在植入移植構(gòu)造物前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增(即，允許發(fā)展經(jīng)過至少一個(gè)細(xì)胞分裂周期)。
在另一實(shí)施方案中，提供一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的方法。該方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種腸粘膜下層組織，從而形成移植構(gòu)造物的步驟。該方法還可進(jìn)一步包括在腸粘膜下層組織上體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，至少一種附加的細(xì)胞群包括未角化或角化的上皮細(xì)胞群或選自成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、多-潛能祖細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)、周細(xì)胞和成骨細(xì)胞的中胚層來源的細(xì)胞群。在各種實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和一種或多種這些附加的細(xì)胞類型接種腸粘膜下層組織(即，可用內(nèi)皮細(xì)胞和這些附加的細(xì)胞類型的一種、兩種、三種等接種腸粘膜下層組織)。
附圖簡述

圖1提供描述本發(fā)明移植構(gòu)造物的可選的制備方法的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種粘膜下層組織移植構(gòu)造物，它包括脊椎動物的腸粘膜下層組織或其它粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。所述無細(xì)胞的腸粘膜下層組織是用內(nèi)皮細(xì)胞和預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種的，并用于修復(fù)患病或受損組織。按照本發(fā)明，“受損組織”是指受到損害的、撕裂的、切斷的組織，或已經(jīng)手術(shù)除去或以其它方式從需要修復(fù)的部位失去的組織(例如，先天缺乏或畸形)。
用于本發(fā)明的內(nèi)皮細(xì)胞可來源于任何類型的內(nèi)皮細(xì)胞群，包括大血管、微血管、動脈、和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。不論是成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(例如，從器官或血管采集的)還是內(nèi)皮細(xì)胞前體(例如，祖細(xì)胞或干細(xì)胞)都可用于本發(fā)明。此外，內(nèi)皮細(xì)胞可從幼年或老年動物中采集，但優(yōu)選從幼年動物采集的內(nèi)皮細(xì)胞。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群可包括未-角化或角化的上皮細(xì)胞群或選自成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、多-潛能祖細(xì)胞、周細(xì)胞、成骨細(xì)胞、和任何其它適宜細(xì)胞類型的中胚層來源的細(xì)胞群。
與腸粘膜下層組織和內(nèi)皮細(xì)胞組合的附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群可以所要修復(fù)組織的細(xì)胞類型為基礎(chǔ)選擇。例如，如果要修復(fù)皮膚，預(yù)選的外源性細(xì)胞群可以是未角化的上皮細(xì)胞或如果要修復(fù)心臟組織，則預(yù)選的外源性細(xì)胞群可以是心肌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，使用從待治療患者中分離的自體細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，與腸粘膜下層組織和內(nèi)皮細(xì)胞組合的至少一種附加的預(yù)選的細(xì)胞群包括能夠分化成平滑肌細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。有利地，平滑肌細(xì)胞和/或平滑肌祖細(xì)胞可促進(jìn)(連同內(nèi)皮細(xì)胞)血管或血管樣結(jié)構(gòu)在移植構(gòu)造物中的形成。在另一實(shí)施方案中，附加的細(xì)胞類型可連同內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、和/或平滑肌祖細(xì)胞一起加入。
在另一實(shí)施方案中，至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群包括多-潛能祖細(xì)胞群。腸粘膜下層組織可誘導(dǎo)這些多-潛能祖細(xì)胞分化成幫助受損組織修復(fù)的細(xì)胞。有利地，可將用內(nèi)皮細(xì)胞群和多-潛能祖細(xì)胞群接種的腸粘膜下層組織植入到體內(nèi)多個(gè)不同的部位，且祖細(xì)胞將分化成對特殊環(huán)境較為適宜的細(xì)胞類型。例如包括內(nèi)皮細(xì)胞和多-潛能祖細(xì)胞的組分在腱或韌帶部位的植入可導(dǎo)致移植構(gòu)造物重塑成腱或韌帶。
和使用單獨(dú)的腸粘膜下層組織，或與除內(nèi)皮細(xì)胞外的細(xì)胞類型組合的腸粘膜下層組織作為治療劑相比，腸粘膜下層組織、內(nèi)皮細(xì)胞、和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群的組合所提供的組織移植構(gòu)造物在體外和/或體內(nèi)顯示出令人吃驚的增強(qiáng)的血管化，從而產(chǎn)生提高的傷口愈合能力和更好的組織功能恢復(fù)。
在各實(shí)施方案中，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，也可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織前，用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，或可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織(見圖1的各種舉例性實(shí)施方案)。
在其中一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織，并在將所述構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域之前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成?？稍谟脙?nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后以及在將移植構(gòu)造物體內(nèi)植入前的任何時(shí)間，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。因此，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增(即，允許發(fā)展經(jīng)過至少一個(gè)細(xì)胞分裂周期)。
可選擇性地，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，且可在植入移植物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，而不會誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)或成分的形成。在該實(shí)施方案中，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案中，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，且在內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下，稍后即植入移植物。
在選擇性實(shí)施方案中，可用附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，并在植入移植構(gòu)造物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)預(yù)選的細(xì)胞群，從而使預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增(即，使細(xì)胞分裂至少一次)。在該實(shí)施方案中，可在用預(yù)選細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后以及體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。因此，根據(jù)植入移植物前在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域前，內(nèi)皮細(xì)胞可擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
在另一實(shí)施方案中，可在用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織前，用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織，且在內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下，稍后即植入移植物。
在另一實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織。在該實(shí)施方案中，可在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，從而使兩個(gè)細(xì)胞群擴(kuò)增，或在兩個(gè)細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下植入移植物。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
腸粘膜下層組織可有利地提供一種生理環(huán)境，支持在腸粘膜下層組織上體外培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖和分化。因此，可將細(xì)胞接種在腸粘膜下層組織上，并按照下面所述使用本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)，從而生產(chǎn)用于植入到需要它的宿主中的組織移植物。
腸粘膜下層組織提供支持細(xì)胞生長的基質(zhì)的能力可在植入到宿主中前，提供使內(nèi)皮細(xì)胞群和/或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群擴(kuò)增的機(jī)會。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則這種擴(kuò)增可在植入前導(dǎo)致血管或血管-樣結(jié)構(gòu)的形成(即，移植構(gòu)造物的體外潛在的血管化)，從而在植入移植構(gòu)造物后，立即提高移植物的傷口愈合能力。植入移植構(gòu)造物前的血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成或，可選擇性地，植入移植構(gòu)造物前的內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增可提高植入后的移植物的傷口愈合能力，如通過促進(jìn)在腸粘膜下層組織片近腔(abluminal)側(cè)上生長的細(xì)胞的分化和遷移，并通過促進(jìn)這些細(xì)胞在粘膜下層組織自身內(nèi)的增殖而實(shí)現(xiàn)。
植入前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)加入的內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群的實(shí)施方案中，細(xì)胞是在有利于細(xì)胞生長的條件下，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)的。所培養(yǎng)的細(xì)胞可與腸粘膜下層組織直接或間接接觸(例如，流體連通)。有利于細(xì)胞生長的條件是環(huán)境條件，如無菌技術(shù)、溫度(例如，約37℃)和營養(yǎng)供給，這些對于在目前組織和細(xì)胞培養(yǎng)所接受的過程下進(jìn)行的細(xì)胞生長而言，被認(rèn)為是最佳的。雖然最佳培養(yǎng)條件取決于特定的細(xì)胞類型，但細(xì)胞生長條件通常是本領(lǐng)域熟知的。
本發(fā)明的腸粘膜下層組織可以各種形式被用作移植材料，并在植入移植物前，用于體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞類型。這些形式包括片樣構(gòu)型、凝膠形式、流化組分(例如，通過粉碎或消化組織)、和提取物，用于加入本領(lǐng)域-認(rèn)可的細(xì)胞/組織培養(yǎng)基。腸粘膜下層組織或其成分可提供用于細(xì)胞粘附的表面和/或可誘導(dǎo)分化和/或增殖。在組織/細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中使用之前，優(yōu)選將腸粘膜下層組織滅菌，然而，如果細(xì)胞培養(yǎng)基中包含抗生素的話，也可使用未滅菌的腸粘膜下層組織。
按照本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施方案，腸粘膜下層的組織移植構(gòu)造物(其中腸粘膜下層是從肌層和至少腸粘膜下層組織的粘膜層的腔部分剝離的)被用作移植材料，并在植入移植構(gòu)造物前，用于體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞類型。以這種方式剝離的腸粘膜下層組織可按照本發(fā)明以片的形式、凝膠的形式或作為流化組分，如消化物或提取物的形式使用。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，植入移植構(gòu)造物前，在有利于細(xì)胞增殖以用于細(xì)胞培養(yǎng)的條件下，在脊椎動物的腸粘膜下層組織片上直接接種細(xì)胞。腸粘膜下層組織的多孔性使細(xì)胞營養(yǎng)物在基質(zhì)中擴(kuò)散。因此，細(xì)胞可被接種在腸粘膜下層組織片的腔和/或近腔面上并培養(yǎng)。腔面是面向器官腔的表面，且在體內(nèi)通常與內(nèi)粘膜層相鄰，而近腔面是遠(yuǎn)離器官腔的腸粘膜下層表面，且通常與體內(nèi)的平滑肌組織接觸。
在脊椎動物的腸粘膜下層組織的固體片上培養(yǎng)的細(xì)胞顯示出不同的生長模式，并根據(jù)細(xì)胞在腸粘膜下層片的哪一側(cè)生長，與腸粘膜下層生長基質(zhì)的相互作用也不同。在本發(fā)明腸粘膜下層組織片上培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的組織學(xué)檢查揭示了接種在近腔面上的內(nèi)皮細(xì)胞不僅沿著腸粘膜下層組織的表面生長/增殖，而且它們還更容易遷移到腸粘膜下層組織自身內(nèi)并增殖。腸粘膜下層組織的腔面包括較之近腔側(cè)更致密的基質(zhì)，并因此，細(xì)胞不太可能穿透腔面。接種在腸粘膜下層組織腔面上的細(xì)胞與基質(zhì)粘附，但通常不會穿透基質(zhì)表面。
在植入移植構(gòu)造物前接種在腸粘膜下層組織上的內(nèi)皮細(xì)胞和/或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群可在有營養(yǎng)物，包括礦物質(zhì)、氨基酸、糖、肽、蛋白、或糖蛋白、如層連蛋白和纖連蛋白、和/或生長因子如表皮生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉(zhuǎn)化生長因子β、成纖維細(xì)胞生長因子、或其它血清生長因子存在的條件下生長。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，流化或粉末形式的腸粘膜下層組織可用于補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基，從而提高支持并誘導(dǎo)細(xì)胞體外增殖的能力，并誘導(dǎo)體內(nèi)重塑。在有可商業(yè)得到的細(xì)胞培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(含血清或不含血清)存在的條件下，使細(xì)胞在腸粘膜下層組織上生長。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，與腸粘膜下層組織和內(nèi)皮細(xì)胞組合的至少一種附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以是平滑肌細(xì)胞和/或能夠分化成平滑肌細(xì)胞的祖細(xì)胞，從而促進(jìn)(連同內(nèi)皮細(xì)胞)血管或血管樣結(jié)構(gòu)在移植構(gòu)造物中形成。已知用肝素酶處理平滑肌細(xì)胞可誘導(dǎo)增殖細(xì)胞的表型改變性質(zhì)。因此，在用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種預(yù)選的外源性細(xì)胞群，包括平滑肌細(xì)胞群和/或平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織的實(shí)施方案中，肝素酶可包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中。例如，來源于肝素鞘氨醇桿菌的4個(gè)單位/ml的肝素酶可短時(shí)間(例如，6小時(shí))包含在培養(yǎng)基中或可持續(xù)存在于培養(yǎng)基中。
還已知作為細(xì)胞的亞匯合單層被接種在基質(zhì)上的平滑肌細(xì)胞經(jīng)歷與分裂能力相關(guān)的表型改變。如果將平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的匯合單層共同培養(yǎng)，則表型改變被抑制。因此，在用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種預(yù)選的外源性細(xì)胞群，包括平滑肌細(xì)胞群和/或平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織的實(shí)施方案中，可將加入的內(nèi)皮細(xì)胞接種在腸粘膜下層組織上，從而使細(xì)胞與腸粘膜下層組織粘附作為細(xì)胞的亞匯合單層。在另一實(shí)施方案中，可將內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、和/或平滑肌祖細(xì)胞接種在腸粘膜下層組織上，這樣細(xì)胞就可與腸粘膜下層組織粘附作為細(xì)胞的亞匯合單層。
已經(jīng)很好地證明了腸粘膜下層能夠在植入后，立即在很多體內(nèi)微環(huán)境(例如，腱、韌帶、骨、關(guān)節(jié)軟骨、動脈、和靜脈)中誘導(dǎo)宿主組織增殖、重塑和適宜組織結(jié)構(gòu)的再生。用于誘導(dǎo)內(nèi)源性組織形成的、片形式和流化形式的這種腸粘膜下層組織的使用在美國專利U.S.Nos.5,281,422，和5,275,826中描述并要求保護(hù)，其內(nèi)容引入此處作為參考。因此，本發(fā)明的腸粘膜下層組織移植物被體內(nèi)植入，從而誘導(dǎo)需要修復(fù)的受損組織重塑。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所要求保護(hù)的包括腸粘膜下層組織、加入的內(nèi)皮細(xì)胞、和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群的組合物可被包封在生物適合性基質(zhì)中，用于植入到宿主中。包封的基質(zhì)可被構(gòu)造成使?fàn)I養(yǎng)物擴(kuò)散至包封的細(xì)胞，同時(shí)使包封細(xì)胞的產(chǎn)物從包封的細(xì)胞擴(kuò)散至宿主細(xì)胞。用于包封活細(xì)胞的適宜的生物相容性聚合物是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。例如，聚賴氨酸/藻酸鹽包封過程先前已經(jīng)由F.Lim和A.Sun(Science，Vol.210，pp.908-910)描述。事實(shí)上，按照本發(fā)明，脊椎動物的腸粘膜下層本身可被有利地用于包封腸粘膜下層基質(zhì)上的細(xì)胞，作為人工器官植入。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種腸粘膜下層組織，并將移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中需要修復(fù)的部位。在該方法的其中一個(gè)實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織，并在將所述構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在用內(nèi)皮細(xì)胞接種移植物后且在體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，可用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。因此，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在腸粘膜下層上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
可選擇性地，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，并在植入移植物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，從而使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增而不會誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在該實(shí)施方案中，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案中，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，且隨后即植入移植物，而內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增。
在本方法的選擇性實(shí)施方案中，可用附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，并在植入移植構(gòu)造物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)預(yù)選的細(xì)胞群，從而使預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增。在該實(shí)施方案中，可在用預(yù)選細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后且體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。因此，根據(jù)植入移植物前通過在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)細(xì)胞而使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域之前，內(nèi)皮細(xì)胞可能擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可能包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
在另一實(shí)施方案中，可在用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后，用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織，且可隨后即植入移植物，而內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織。在該實(shí)施方案中，可在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，從而使兩種細(xì)胞群擴(kuò)增，或可在兩種細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下植入移植物。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
本發(fā)明還提供一種用于修復(fù)患病或受損組織的血管化腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物。血管化移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中已經(jīng)在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，提供一種增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種腸粘膜下層組織，在腸粘膜下層組織上體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和附加的細(xì)胞群一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成，并將移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中需要修復(fù)的部位。
腸粘膜下層組織移植物可用最初較小的細(xì)胞群接種，它們可在植入前體外擴(kuò)增。有利地，用內(nèi)皮細(xì)胞接種可在腸粘膜下層組織上體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞后，立即誘導(dǎo)移植物的血管化。此外，還可用平滑肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞或其它細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞接種腸粘膜下層組織，從而促進(jìn)血管化。
在該實(shí)施方案中，用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織，并在將所述構(gòu)造物植入到患病區(qū)域中前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后且體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。因此，根據(jù)植入移植物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
在選擇性實(shí)施方案中，可用附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織，并在植入移植構(gòu)造物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群，從而使預(yù)選細(xì)胞群擴(kuò)增。在該實(shí)施方案中，用預(yù)選細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。在該實(shí)施方案中，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織。在該實(shí)施方案中，在植入移植物前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群和內(nèi)皮細(xì)胞，從而使兩種細(xì)胞群擴(kuò)增。
還提供了一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的方法。該方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種腸粘膜下層組織，從而形成移植構(gòu)造物。該方法還可包括在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)形成。
例如，用于本發(fā)明的腸粘膜下層的制備方法在美國專利US.Nos.4,902,508中描述?？傊?，腸粘膜下層組織是從脊椎動物的腸制備的，優(yōu)選從豬、羊或牛采集，但不排除其它物種。在這點(diǎn)上，腸粘膜下層組織通常是異種的(即，來源于不同物種)，但也可以是同種異體的(即，來源于同一物種的不同的成員)或自體的(即來源于同一動物或個(gè)體)。
在制備用于本發(fā)明中的腸粘膜下層組織的其中一個(gè)方法中，使用縱向擦拭動作摩擦組織，從而除去外層，包括平滑肌組織，和最內(nèi)層，即至少粘膜的腔部分。因此，腸粘膜下層組織是從肌層和至少粘膜的腔部分剝離的。用鹽水沖洗腸粘膜下層并任選滅菌；它可以水化或脫水狀態(tài)貯藏。可將凍干或風(fēng)干的腸粘膜下層再水化，并用于本發(fā)明中而不會損失生物學(xué)活性。作為起始材料的天然腸粘膜下層是相對無細(xì)胞的膠原基質(zhì)，且本發(fā)明優(yōu)選的腸粘膜下層組分是無完整細(xì)胞的膠原基質(zhì)(即，腸粘膜下層組分是無細(xì)胞的)。
為形成用于本發(fā)明組織移植物中的腸粘膜下層的多層片，多層腸粘膜下層可相互重疊?？墒褂帽绢I(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將各層彼此固定，包括使用縫線和生物相容性粘合劑如膠原粘合糊劑?？蛇x擇性地，可在脫水條件下，通過壓緊重疊區(qū)而將各層融合在一起，任選加熱，如美國專利US No.5,711,969所述，其內(nèi)容引入此處作為參考。
用于組織移植物中的腸粘膜下層可使用常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌，包括戊二醛鞣制、酸性pH下的甲醛鞣制、環(huán)氧乙烷處理、環(huán)氧丙烷處理、等離子氣體滅菌、γ射線照射、電子束和過乙酸滅菌。優(yōu)選的滅菌技術(shù)包括使腸粘膜下層組織暴露于過乙酸、1-4Mrads γ射線照射(更優(yōu)選1-2.5Mrads γ射線照射)或等離子氣體滅菌；過乙酸滅菌是最優(yōu)選的滅菌方法。通常，腸粘膜下層組織經(jīng)過兩個(gè)或更多滅菌過程。將腸粘膜下層組織滅菌后，例如通過化學(xué)處理，可將所述組織包裝并使用電子束或γ射線照射滅菌技術(shù)再次滅菌。通常，在將移植物滅菌后，將細(xì)胞加入到移植組織中。還可使用在美國專利US No.6,206,931中描述的滅菌技術(shù)，其引入此處作為參考。
還已知腸粘膜下層可通過粉碎和/或酶消化而被流化，且不會損失它的生物學(xué)活性，用于，例如，本發(fā)明的組織移植物中。見美國專利US No.6,264,992 B1，其內(nèi)容引入此處作為參考。更具體而言，可用酶處理天然或流化的腸粘膜下層組分一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠溶解腸粘膜下層成分的全部或大部分。優(yōu)選，用可水解腸粘膜下層結(jié)構(gòu)成分的酶消化腸粘膜下層，從而產(chǎn)生腸粘膜下層成分的混懸液或均勻溶液。腸粘膜下層可用蛋白酶(例如，膠原酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶)、糖胺聚糖酶或蛋白酶與糖胺聚糖酶的組合進(jìn)行酶處理。任選地，可單獨(dú)使用其它適宜的酶，或與蛋白酶和糖胺聚糖酶聯(lián)合使用?？扇芜x過濾組織消化物，從而提供部分溶解的腸粘膜下層的均勻溶液。
用于本發(fā)明組織移植物中的流化腸粘膜下層的粘度可通過控制腸粘膜下層成分的濃度及水化程度而操縱?？蓪⒄扯日{(diào)節(jié)至25℃下的約2-約300,000cps。更高粘度的制品，例如，凝膠，可通過透析消化的物質(zhì)，然后調(diào)節(jié)這種溶液的pH至約5.0-約9.0而由腸粘膜下層消化液制備。
腸粘膜下層組織提取物的制備在PCT申請No.PCT/US97/22721的實(shí)施例3中描述，其在1998年6月18日作為WO 98/25964公開，其內(nèi)容引入此處作為參考。流化形式或凝膠形式的腸粘膜下層組分，和腸粘膜下層的提取物可保留生物活性劑，如生長因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β、TGFβ-相關(guān)蛋白以及成纖維細(xì)胞生長因子。
本發(fā)明還考慮了粉末形式腸粘膜下層的使用。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，粉末形式的腸粘膜下層是通過在液氮下粉碎腸粘膜下層，從而產(chǎn)生0.1-1mm2大小的顆粒而制備的。然后將顆粒狀組分冷凍干燥過夜并滅菌，形成固體、基本無水的顆粒狀復(fù)合物?？蛇x擇性地，可通過將粉碎腸粘膜下層的混懸液或溶液干燥而從流化的腸粘膜下層而形成粉末形式的腸粘膜下層。粉末形式的腸粘膜下層組織還可與，例如，組織移植物的其它成分，如細(xì)胞和生長因子結(jié)合用于本發(fā)明中。
實(shí)施例1流化的腸粘膜下層的制備按照美國專利US 4,902,508和4,956,178先前所述以及上面所述內(nèi)容自剛安樂死的豬(Delphi Indiana)采集并制備小腸粘膜下層。在液氮下粉碎腸粘膜下層并于使用前在-80℃貯藏。所述材料的部分消化是通過將5g粉末狀組織加入到100ml含有溶于0.5M醋酸中的0.1％胃蛋白酶的溶液中，并在4℃下消化72小時(shí)而進(jìn)行的。部分消化后，4℃下12,000rpm離心混懸液20分鐘，棄去不溶性顆粒。4℃下，多次更換0.01M醋酸而透析上清液(MWCO 3500)。通過向腸粘膜下層組織的水解產(chǎn)物中加入氯仿(5ml氯仿加入900ml 0.01M醋酸)而將溶液滅菌。額外更換兩次無菌的0.01M醋酸而繼續(xù)透析腸粘膜下層組織，從而除去氯仿。然后將透析包的內(nèi)含物無菌轉(zhuǎn)移到無菌容器中。4℃下貯藏所得的流化組分。所述流化的腸粘膜下層組分是通過將流化組分與其它組分如細(xì)胞和生長因子混合而用于本發(fā)明的移植構(gòu)造物中的。
實(shí)施例2腸粘膜下層凝膠組分的制備為了制備凝膠形式的腸粘膜下層，將8ml流化的腸粘膜下層與1.2ml 10xPBS緩沖液(含5mg/L酚紅的10x磷酸鹽緩沖生理鹽水)混合；加入0.04N HCl(約1.6ml)調(diào)節(jié)pH至6.6-7.4，然后加入0.05NNaOH(約1.2ml)，改變pH至＞8。用水將終體積調(diào)節(jié)至12ml。將所得混合物與移植構(gòu)造物的其它組分如細(xì)胞和生長因子混合，用于植入到脊椎動物宿主中。
實(shí)施例3腸粘膜下層提取物的制備用于這些研究的提取緩沖液包括4M胍和2M尿素，每個(gè)都是在50mMTris-HCl，pH 7.4中制備的。4℃下，將粉末形式的腸粘膜下層混懸在適當(dāng)?shù)奶崛【彌_液(25％w/v)中，所述提取緩沖液包含均為1mM的苯甲基磺基氟化物、N-乙基馬來酰亞胺、和芐脒(蛋白酶抑制劑)，用力攪拌24小時(shí)。然后在4℃下，12,000×g離心提取混合物30分鐘，并收集上清液。在提取緩沖液中簡單洗滌不溶性物質(zhì)，離心，并將洗滌液與原始上清液混合。在Spectrapor管(MWCO 3500，SpectrumMedical Industries，Los Angeles，CA)中，用30個(gè)體積的去離子水充分透析上清液(72小時(shí)更換9次)。12,000×g離心透析液除去所有不溶性物質(zhì)，所述上清液立即用于和移植構(gòu)造物的其它組分混合或凍干貯藏。
實(shí)施例4腸粘膜下層組織的滅菌因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)必須在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行，因此如果培養(yǎng)系統(tǒng)中不包括抗生素，那么在植入移植構(gòu)造物前，必須以無菌方式制備腸粘膜下層組織以用作細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。已經(jīng)對若干滅菌方法進(jìn)行研究以評價(jià)滅菌對腸粘膜下層組織生物向親嗜性的影響。優(yōu)選不會明顯減弱組織機(jī)械強(qiáng)度和生物親嗜性的滅菌技術(shù)。已經(jīng)評價(jià)過下列用于腸粘膜下層的滅菌方法過乙酸滅菌、1.0(或低于1.0)-2.5Mrad γ射線照射、1.0Mrad γ射線照射、Exspor(Alcide，Norfolk，CT)滅菌、e-束、甲醛和這些滅菌方法的各種組合。γ射線照射是用60鈷-γ室在水化的腸粘膜下層組織上進(jìn)行的。Exspor滅菌是按照制造商的說明，使用10∶1比例的滅菌劑體積(ml)腸粘膜下層(g)進(jìn)行的。
將各種細(xì)胞類型(例如，IMR-90、FR、HT-29、RPEC)接種在滅菌的腸粘膜下層上，并在第1、3、7和14天分析它們的生長特性。對于所有細(xì)胞類型獲得的結(jié)果表明通過γ射線照射或過乙酸處理滅菌的腸粘膜下層衍生的生長基質(zhì)可支持細(xì)胞某種程度的粘附和生長。然而，接種在過乙酸滅菌的腸粘膜下層衍生的基質(zhì)上的細(xì)胞表現(xiàn)出粘附增加、存活增加、和增殖及分化速率提高。優(yōu)選的滅菌方法包括過乙酸處理，接著用γ射線照射或e-束進(jìn)行最終的滅菌。
實(shí)施例5用過乙酸將腸粘膜下層組織滅菌室溫下，將腸粘膜下層組織浸泡在10∶1(ml過乙酸溶液∶g腸粘膜下層組織)或更大比例的過乙酸/乙醇溶液中2小時(shí)。所述過乙酸/乙醇溶液包含4％乙醇、0.1％(體積∶體積)過乙酸和剩余的水。0.1％過乙酸組分是可商業(yè)得到的35％過乙酸母液的稀釋液，正如表1中所定義的。優(yōu)選，振搖轉(zhuǎn)子上的浸泡在過乙酸溶液中的腸粘膜下層組織。2小時(shí)后，倒出過乙酸溶液并用等量的乳酸鹽林格氏溶液或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)更換，并浸泡(同時(shí)振搖)15分鐘。使腸粘膜下層組織經(jīng)過4次或更多次的用乳酸鹽林格氏溶液或PBS洗滌、然后用無菌水再沖洗15分鐘的循環(huán)。
表135％過乙酸溶液的化學(xué)組成組分重量％過乙酸35.5過氧化氫 6.8乙酸 39.3硫酸 1.0水17.4乙酰基過氧化物0.0穩(wěn)定劑500PPM典型的活性氧分析，重量％過乙酸的活性氧7.47H2O2的活性氧 2.40總的活性氧10.67實(shí)施例6內(nèi)皮細(xì)胞的生長小腸粘膜下層是按照美國專利US 4,902,508中所述從剛處死的豬采集并制備的。經(jīng)由各種技術(shù)(γ射線照射、過乙酸等)滅菌后，將小腸粘膜下層組織夾在聚丙烯框架內(nèi)，產(chǎn)生平坦的表面區(qū)域(50mm2)用于細(xì)胞生長。將框架浸沒在組織培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基營養(yǎng)物進(jìn)入腸粘膜下層組織的表面。將內(nèi)皮細(xì)胞(3×104個(gè)細(xì)胞/腸粘膜下層組織切片)接種在腸粘膜下層組織上，然后放在37℃的5％CO2、95％空氣的培養(yǎng)箱中。各個(gè)時(shí)間周期后，將接種的腸粘膜下層組織固定在10％中性緩沖福爾馬林中，包埋在石蠟中，并切片(6μm)。進(jìn)行各種組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色過程，從而確定細(xì)胞生長特性。利用這些過程觀察血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種用于修復(fù)患病或受損組織的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括選自角化上皮細(xì)胞、未角化上皮細(xì)胞、和中胚層來源細(xì)胞的細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞群。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述腸粘膜下層組織是從肌層和至少所述腸組織的粘膜層的腔部分剝離的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，它還包括肝素酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，它還包括選自血管內(nèi)皮細(xì)胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉(zhuǎn)化生長因子β、和血清生長因子的生長因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織。
11.一種用于增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的體內(nèi)血管化的方法，所述方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種所述腸粘膜下層組織；并將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中需要修復(fù)的部位。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括選自角化上皮細(xì)胞、未角化上皮細(xì)胞、和中胚層-來源細(xì)胞的細(xì)胞群。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞群。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述腸粘膜下層組織是從肌層和至少所述腸組織的粘膜層的腔部分剝離的。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述移植構(gòu)造物還包括肝素酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述移植構(gòu)造物還包括選自血管內(nèi)皮細(xì)胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉(zhuǎn)化生長因子β、和血清生長因子的生長因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括在所述腸粘膜下層組織上培養(yǎng)所述內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠在將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中之前體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。
21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種腸粘膜下層組織。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)接種腸粘膜下層組織。
25.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，其中在植入移植構(gòu)造物前，內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的細(xì)胞群均沒有擴(kuò)增。
26.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠使內(nèi)皮細(xì)胞在沒有體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)的情況下擴(kuò)增，并在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)附加的預(yù)選的細(xì)胞群一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠在將移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中前，使附加的預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增。
27.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠使內(nèi)皮細(xì)胞在沒有體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)的情況下擴(kuò)增。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述附加的預(yù)選的細(xì)胞群在植入移植構(gòu)造物前沒有擴(kuò)增。
29.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在腸粘膜下層組織上培養(yǎng)附加的預(yù)選的細(xì)胞群一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠在植入移植構(gòu)造物前，使預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞在植入移植構(gòu)造物前沒有擴(kuò)增。
31.根據(jù)權(quán)利要求22、23或24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述附加的預(yù)選的細(xì)胞群在植入移植構(gòu)造物前擴(kuò)增。
32.根據(jù)權(quán)利要求22、23或24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述附加的預(yù)選的細(xì)胞群在植入移植構(gòu)造物前沒有擴(kuò)增。
33.一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的方法，所述方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種所述腸粘膜下層組織的步驟。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包括在將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中之前，在所述腸粘膜下層組織上培養(yǎng)所述內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
35.一種用于增強(qiáng)腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的體內(nèi)血管化的方法，所述方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種所述腸粘膜下層組織。在所述腸粘膜下層組織上體外培養(yǎng)所述內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。并將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動物中需要修復(fù)的部位。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括選自角化上皮細(xì)胞、未角化上皮細(xì)胞、和中胚層-衍生細(xì)胞的細(xì)胞群。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞群。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種腸粘膜下層組織后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種腸粘膜下層組織。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)接種腸粘膜下層組織。
42.一種用于修復(fù)患病或受損組織的血管化腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)在所述腸粘膜下層組織上培養(yǎng)過一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
43.一種用于修復(fù)患病或受損組織的具有血管樣結(jié)構(gòu)的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述血管樣結(jié)構(gòu)在所述移植構(gòu)造物中形成的開始。
44.一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的具有血管樣結(jié)構(gòu)的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的方法，所述方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源細(xì)胞群體外接種所述腸粘膜下層組織的步驟，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述血管樣結(jié)構(gòu)在所述移植構(gòu)造物中形成的開始。
45.一種用于修復(fù)患病或受損組織的組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述粘膜下層組織是從肌層和至少所述組織的粘膜層的腔部分剝離的。
46.一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的組織移植構(gòu)造物的方法，所述方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源細(xì)胞群體外接種粘膜下層組織的步驟，其中所述粘膜下層組織是從肌層和至少所述組織的粘膜層的腔部分剝離的。
47.一種用于修復(fù)患病或受損組織的具有血管樣結(jié)構(gòu)的組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述血管樣結(jié)構(gòu)在所述移植構(gòu)造物中形成的開始。
48.一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的具有血管樣結(jié)構(gòu)的組織移植構(gòu)造物的方法，所述方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源細(xì)胞群體外接種粘膜下層組織的步驟，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述血管樣結(jié)構(gòu)在所述移植構(gòu)造物中形成的開始。
49.一種治療患者中患病或受損組織的方法，包括使用權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、42、43、45、或47任何一項(xiàng)所述的組織移植構(gòu)造物修復(fù)患病或受損組織。
全文摘要
提供一種用于修復(fù)患病或受損組織的腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物。所述移植構(gòu)造物包括脊椎動物的腸粘膜下層組織，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及可增強(qiáng)血管樣結(jié)構(gòu)在移植物中形成開始的至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。預(yù)選的細(xì)胞群可以是未－角化或角化的上皮細(xì)胞群或選自成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、多－潛能祖細(xì)胞、周細(xì)胞、成骨細(xì)胞、和任何其它適宜細(xì)胞類型的中胚層來源的細(xì)胞群，優(yōu)選以所修復(fù)組織為基礎(chǔ)選擇的細(xì)胞群。還提供了用于增強(qiáng)這些腸粘膜下層組織移植構(gòu)造物的體內(nèi)血管化和用于制備這些移植構(gòu)造物的方法。
文檔編號A61F2/44GK1713861SQ03815579
公開日2005年12月28日 申請日期2003年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月2日
發(fā)明者S·F·巴戴拉克 申請人:普渡研究基金會