血管化增強(qiáng)的移植構(gòu)造物的制作方法

專利名稱：血管化增強(qiáng)的移植構(gòu)造物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于基質(zhì)組分的血管化增強(qiáng)的組織移植物以及它們修復(fù)患病或受損組織的用途。更具體而言，本發(fā)明涉及血管化增強(qiáng)的組織移植物，它包括已經(jīng)用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種的基質(zhì)組分，從而提高組織移植構(gòu)造物的修復(fù)能力。
背景技術(shù)：
和概述本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)受損或患病組織的組織移植構(gòu)造物，它包括用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種的基質(zhì)組分。本發(fā)明所用的基質(zhì)組分選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原。所述基質(zhì)組分優(yōu)選包括高度保守的膠原、糖蛋白、蛋白聚糖、和糖胺聚糖。本發(fā)明所用的基質(zhì)組分來源于溫血脊椎動(dòng)物的組織。
按照本發(fā)明制備的組織移植構(gòu)造物基本上是無細(xì)胞的基質(zhì)，提供類似體內(nèi)基質(zhì)環(huán)境的良好細(xì)胞生長基質(zhì)。基質(zhì)組分的天然組成和構(gòu)型提供了一種獨(dú)特的細(xì)胞生長基質(zhì)，它可促進(jìn)體外細(xì)胞附著和增殖，并在體內(nèi)植入移植構(gòu)造物時(shí)誘導(dǎo)組織重塑。
作為組織移植材料，肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原可誘導(dǎo)內(nèi)源性組織在植入到宿主中后生長(即，移植材料誘導(dǎo)重塑)。當(dāng)用于這類應(yīng)用中時(shí)，組織移植構(gòu)造物似乎不僅作為被移植構(gòu)造物替換的組織的生長或再生長的基質(zhì)起作用，而且可促進(jìn)或誘導(dǎo)內(nèi)源性組織的這種生長或再生長。這些移植材料以可植入片的形式或可注射的流體或凝膠形式使用，從而誘導(dǎo)內(nèi)源性組織的再生長。
本發(fā)明涉及組織移植構(gòu)造物，它包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，此外還包括加入的內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。血管化提高的組織移植構(gòu)造物是在將組織移植構(gòu)造物植入或注射到宿主中前，通過用內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞前體(例如，祖細(xì)胞或干細(xì)胞)和至少一種附加的預(yù)選或預(yù)定的細(xì)胞類型體外接種基質(zhì)組分而制備的。
其中一個(gè)實(shí)施方案提供一種用于修復(fù)患病或受損組織的組織移植構(gòu)造物。所述組織移植構(gòu)造物包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。
在另一實(shí)施方案中，提供血管化的組織移植構(gòu)造物用于修復(fù)患病或受損組織。所述組織移植構(gòu)造物包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)在基質(zhì)組分上培養(yǎng)過一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，提供一種用于增強(qiáng)組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，從而形成移植構(gòu)造物，然后將移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中需要修復(fù)的部位的步驟。
在另一實(shí)施方案中，提供一種用于增強(qiáng)組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)或成分的形成，然后將移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中需要修復(fù)的部位的步驟。
在這些方法實(shí)施方案的任何一個(gè)中，可用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，也可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分前，用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，或用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分。
可將內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)組分上體外培養(yǎng)一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成，或?qū)?nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)培養(yǎng)物上培養(yǎng)一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠在沒有體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)的情況下，使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增(即，使內(nèi)皮細(xì)胞分裂至少一次)。可選擇性地，可在內(nèi)皮細(xì)胞沒有擴(kuò)增的情況下植入移植構(gòu)造物。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，在植入移植構(gòu)造物前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增(即，允許發(fā)展經(jīng)過至少一個(gè)細(xì)胞分裂周期)。
在另一實(shí)施方案中，提供一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的組織移植構(gòu)造物的方法。該方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，從而形成移植構(gòu)造物的步驟。該方法還可進(jìn)一步包括在基質(zhì)組分上體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，至少一種附加的細(xì)胞群包括未角化或角化的上皮細(xì)胞群或選自成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、多-潛能祖細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)、周細(xì)胞和成骨細(xì)胞的中胚層來源的細(xì)胞群。在各種實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和一種或多種這些附加的細(xì)胞類型接種基質(zhì)組分(即，可用內(nèi)皮細(xì)胞和這些附加的細(xì)胞類型的一種、兩種、三種等接種基質(zhì)組分)。
附圖簡述

圖1提供描述本發(fā)明移植構(gòu)造物的可選的制備方法的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種組織移植構(gòu)造物，它包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，而且還包括加入的內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。所述基質(zhì)組分是用內(nèi)皮細(xì)胞和預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種的，并用于修復(fù)患病或受損組織。按照本發(fā)明，“受損組織”是指受到損害的、撕裂的、切斷的組織，或已經(jīng)手術(shù)除去或以其它方式從需要修復(fù)的部位失去的組織(例如，先天缺乏或畸形)。
所述基質(zhì)組分可從來源于肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物的胞外基質(zhì)組分制備。然而，所述基質(zhì)組分還可從其它工程化的組織制備形成，例如，分離的基底膜層，或從可商業(yè)得到的已加工膠原組分、或純化的膠原組分制備。用于本發(fā)明的可商業(yè)得到的已加工膠原組分的例子是MATRIGEL、ALLODERM、INTEGRA、APPLIGRAF、DERMAGRAFT、和PERI-GUARD。MATRIGEL基底膜基質(zhì)(BectonDickinson)是腫瘤-衍生的基底膜組分，其是Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤的可溶性基底膜提取物，膠凝化形成重構(gòu)的基底膜。ALLODERM(Life Cell，Inc.)是來源于已被加工除去細(xì)胞的尸體真皮的組分。INTEGRA(Integra Life Sciences)是牛膠原和硫酸軟骨素的無細(xì)胞真皮組分。APPLIGRAF(Novartis)是已經(jīng)用人成纖維細(xì)胞和其它細(xì)胞和非細(xì)胞組分接種的含合成聚乳酸的組分，DERMAGRAFT是Vicryl篩骨架上人成纖維細(xì)胞的同種異體真皮移植物。PERI-GUARD(Bio-Vascular，Inc.)是從化學(xué)交聯(lián)的牛心包制備的組分。純化和已加工的膠原還可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)。(見，例如，美國專利6,127,143、5,814,328、5,108,424、和4,883,864)。
用于本發(fā)明的內(nèi)皮細(xì)胞可來源于任何類型的內(nèi)皮細(xì)胞群，包括大血管、微血管、動(dòng)脈、和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。不論是成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(例如，從器官或血管采集的)還是內(nèi)皮細(xì)胞前體(例如，祖細(xì)胞或干細(xì)胞)都可用于本發(fā)明。此外，內(nèi)皮細(xì)胞可從幼年或老年動(dòng)物中采集，但優(yōu)選從幼年動(dòng)物采集的內(nèi)皮細(xì)胞。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群可包括未-角化或角化的上皮細(xì)胞群或選自成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、多-潛能祖細(xì)胞、周細(xì)胞、成骨細(xì)胞、和任何其它適宜細(xì)胞類型的中胚層來源的細(xì)胞群。
與基質(zhì)組分和內(nèi)皮細(xì)胞組合的附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群可以所要修復(fù)組織的細(xì)胞類型為基礎(chǔ)選擇。例如，如果要修復(fù)皮膚，預(yù)選的外源性細(xì)胞群可以是未角化的上皮細(xì)胞或如果要修復(fù)心臟組織，則預(yù)選的外源性細(xì)胞群可以是心肌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，使用從待治療患者中分離的自體細(xì)胞接種基質(zhì)組分。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，與基質(zhì)組分和內(nèi)皮細(xì)胞組合的至少一種附加的預(yù)選的細(xì)胞群包括能夠分化成平滑肌細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。有利地，平滑肌細(xì)胞和/或平滑肌祖細(xì)胞可促進(jìn)(連同內(nèi)皮細(xì)胞)血管或血管樣結(jié)構(gòu)在移植構(gòu)造物中的形成。在另一實(shí)施方案中，附加的細(xì)胞類型可連同內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、和/或平滑肌祖細(xì)胞一起加入。
在另一實(shí)施方案中，至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群包括多-潛能祖細(xì)胞群?；|(zhì)組分可誘導(dǎo)這些多-潛能祖細(xì)胞分化成幫助受損組織修復(fù)的細(xì)胞。有利地，可將用內(nèi)皮細(xì)胞群和多-潛能祖細(xì)胞群接種的基質(zhì)組分植入到體內(nèi)多個(gè)不同的部位，且祖細(xì)胞將分化成對特殊環(huán)境較為適宜的細(xì)胞類型。例如，包括內(nèi)皮細(xì)胞和多-潛能祖細(xì)胞的組分在腱或韌帶部位的植入可導(dǎo)致移植構(gòu)造物重塑成腱或韌帶。
和使用與單獨(dú)的內(nèi)皮細(xì)胞組合的單獨(dú)的基質(zhì)組分，或與除內(nèi)皮細(xì)胞外的細(xì)胞類型組合的單獨(dú)的基質(zhì)組分作為治療劑相比，基質(zhì)組分、內(nèi)皮細(xì)胞、和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群的組合所提供的組織移植構(gòu)造物在體外和/或體內(nèi)顯示出令人吃驚的提高的血管化，從而產(chǎn)生提高的傷口愈合能力和更好的組織功能恢復(fù)。
在各實(shí)施方案中，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，也可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分前，用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，或可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分(見圖1的各種舉例性實(shí)施方案)。
在其中一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分，并在將所述構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域之前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后以及在將移植構(gòu)造物體內(nèi)植入前的任何時(shí)間，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。因此，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增(即，允許發(fā)展經(jīng)過至少一個(gè)細(xì)胞分裂周期)。
可選擇性地，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，且可在植入移植物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，而不會誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)或成分的形成。在該實(shí)施方案中，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案中，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，且在內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下，稍后即植入基質(zhì)組分。
在選擇性實(shí)施方案中，可用附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，并在植入移植構(gòu)造物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選的細(xì)胞群，從而使預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增(即，使細(xì)胞分裂至少一次)。在該實(shí)施方案中，可在用預(yù)選細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后以及體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。因此，根據(jù)植入移植物前在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響的區(qū)域前，內(nèi)皮細(xì)胞可擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
在另一實(shí)施方案中，可在用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分前，用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分，且在內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下，稍后即植入移植物。
在另一實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分。在該實(shí)施方案中，可在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，從而使兩個(gè)細(xì)胞群擴(kuò)增，或在兩個(gè)細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下植入移植物。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分可有利地提供一種生理環(huán)境，支持在基質(zhì)組分上體外培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖和分化。因此，可將細(xì)胞接種在基質(zhì)組分上，并按下面所述使用本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)，從而生產(chǎn)用于植入到需要它的宿主中的組織移植物。
選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分提供支持細(xì)胞生長的基質(zhì)的能力可在植入到宿主中前，提供使內(nèi)皮細(xì)胞群和/或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群擴(kuò)增的機(jī)會。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則這種擴(kuò)增可在植入前導(dǎo)致血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成(即，移植構(gòu)造物的體外潛在的血管化)，從而在植入移植構(gòu)造物后，立即提高移植物的傷口愈合能力。植入移植構(gòu)造物前的血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成或，可選擇性地，植入移植構(gòu)造物前的內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增可提高植入后的移植物的傷口愈合能力，如通過促進(jìn)在移植構(gòu)造物表面上生長的細(xì)胞的分化和遷移，并通過促進(jìn)細(xì)胞在移植構(gòu)造物內(nèi)的增殖而實(shí)現(xiàn)。
植入前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)加入的內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群的實(shí)施方案中，細(xì)胞是在有利于細(xì)胞生長的條件下，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)的。所培養(yǎng)的細(xì)胞可與基質(zhì)組分直接或間接接觸(例如，流體連通)。有利于細(xì)胞生長的條件是環(huán)境條件，如無菌技術(shù)、溫度(例如，約37℃)和營養(yǎng)供給，這些對于在目前組織和細(xì)胞培養(yǎng)所接受的過程下進(jìn)行的細(xì)胞生長而言，被認(rèn)為是最佳的。雖然最佳培養(yǎng)條件取決于特定的細(xì)胞類型，但細(xì)胞生長條件通常是本領(lǐng)域熟知的。
本發(fā)明的基質(zhì)組分可以各種形式被用作移植材料，并在植入移植構(gòu)造物前，用于體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞類型。這些形式包括片樣構(gòu)型、凝膠形式、流化組分(例如，通過粉碎或消化組織)、和提取物，用于加入本領(lǐng)域-認(rèn)可的細(xì)胞/組織培養(yǎng)基。基質(zhì)組分或其成分可提供用于細(xì)胞粘附的表面和/或可誘導(dǎo)分化和/或增殖。在組織/細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中使用之前，優(yōu)選將基質(zhì)組分滅菌，然而，如果細(xì)胞培養(yǎng)基中包含抗生素的話，也可使用未滅菌的組分。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，植入移植構(gòu)造物前，在有利于細(xì)胞增殖以用于細(xì)胞培養(yǎng)的條件下，在肝基底膜組織片上直接接種細(xì)胞。這種組織的多孔性使細(xì)胞營養(yǎng)物在基質(zhì)中擴(kuò)散。因此，細(xì)胞可被接種在肝基底膜任一側(cè)上并培養(yǎng)。
在植入移植構(gòu)造物前接種在基質(zhì)組分上的內(nèi)皮細(xì)胞和/或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群可在有營養(yǎng)物，包括礦物質(zhì)、氨基酸、糖、肽、蛋白、或糖蛋白、如層連蛋白和纖連蛋白、和/或生長因子如表皮生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉(zhuǎn)化生長因子β、成纖維細(xì)胞生長因子、或其它血清生長因子存在的條件下生長。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，流化或粉末形式的基質(zhì)組分可用于補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基，從而提高支持并誘導(dǎo)細(xì)胞體外增殖的能力，并誘導(dǎo)體內(nèi)重塑。在有可商業(yè)得到的細(xì)胞培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(含血清或不含血清)存在的條件下，使細(xì)胞在基質(zhì)組分上生長。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，與基質(zhì)組分和內(nèi)皮細(xì)胞組合的至少一種附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以是平滑肌細(xì)胞和/或能夠分化成平滑肌細(xì)胞的祖細(xì)胞，從而促進(jìn)(連同內(nèi)皮細(xì)胞)血管或血管樣結(jié)構(gòu)在移植構(gòu)造物中形成。已知用肝素酶處理平滑肌細(xì)胞可誘導(dǎo)增殖細(xì)胞的表型改變性質(zhì)。因此，在用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種預(yù)選的外源性細(xì)胞群，包括平滑肌細(xì)胞群和/或平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群接種基質(zhì)組分的實(shí)施方案中，肝素酶可包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中。例如，來源于肝素鞘氨醇桿菌的4個(gè)單位/ml的肝素酶可短時(shí)間(例如，6小時(shí))包含在培養(yǎng)基中或可持續(xù)存在于培養(yǎng)基中。
還已知作為細(xì)胞的亞匯合單層被接種在基質(zhì)上的平滑肌細(xì)胞經(jīng)歷與分裂能力相關(guān)的表型改變。如果將平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的匯合單層共同培養(yǎng)，則表型改變被抑制。因此，在用內(nèi)皮細(xì)胞和至少一種預(yù)選的外源性細(xì)胞群，包括平滑肌細(xì)胞群和/或平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群接種基質(zhì)組分的實(shí)施方案中，可將加入的內(nèi)皮細(xì)胞接種在基質(zhì)組分上，從而使細(xì)胞與基質(zhì)組分粘附作為細(xì)胞的亞匯合單層。在另一實(shí)施方案中，可將內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、和/或平滑肌祖細(xì)胞接種在基質(zhì)組分上，這樣細(xì)胞就可與基質(zhì)組分粘附作為細(xì)胞的亞匯合單層。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所要求保護(hù)的包括基質(zhì)組分、加入的內(nèi)皮細(xì)胞、和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群的組合物可被包封在生物適合性基質(zhì)中，用于植入到宿主中。包封的基質(zhì)可被構(gòu)造成使?fàn)I養(yǎng)物擴(kuò)散至包封的細(xì)胞，同時(shí)使包封細(xì)胞的產(chǎn)物從包封的細(xì)胞擴(kuò)散至宿主細(xì)胞。用于包封活細(xì)胞的適宜的生物相容性聚合物是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。例如，聚賴氨酸/藻酸鹽包封過程先前已經(jīng)由F.Lim和A.Sun(Science，Vol.210，pp.908-910)描述。事實(shí)上，按照本發(fā)明，肝基底膜本身可被有利地用于包封基質(zhì)上的細(xì)胞，作為人工器官植入。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于增強(qiáng)組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，從而形成移植構(gòu)造物，并將移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中需要修復(fù)的部位。在該方法的其中一個(gè)實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分，并在將所述構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在用內(nèi)皮細(xì)胞接種移植物后且在體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，可用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。因此，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
可選擇性地，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，并在植入移植物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，從而使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增而不會誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在該實(shí)施方案中，根據(jù)植入移植構(gòu)造物前在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案中，可在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，且隨后即植入移植物，而內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增。
在本方法的選擇性實(shí)施方案中，可用附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，并在植入移植構(gòu)造物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選的細(xì)胞群，從而使預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增。在該實(shí)施方案中，可在用預(yù)選細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后且體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。因此，根據(jù)植入移植物前通過在基質(zhì)組分上培養(yǎng)細(xì)胞而使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增的時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域之前，內(nèi)皮細(xì)胞可能擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可能包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
在另一實(shí)施方案中，可在用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后，用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分，且可隨后即植入移植物，而內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群沒有擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分。在該實(shí)施方案中，可在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，從而使兩種細(xì)胞群擴(kuò)增，或可在兩種細(xì)胞群沒有擴(kuò)增的情況下植入移植物。如果內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增，則內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增可包括或不包括血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
本發(fā)明還提供一種用于修復(fù)患病或受損組織的血管化組織移植構(gòu)造物。血管化移植構(gòu)造物包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，而且還包括加入的內(nèi)皮細(xì)胞，和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中已經(jīng)在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，提供一種增強(qiáng)組織移植構(gòu)造物體內(nèi)血管化的方法。該方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，在基質(zhì)組分上體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和附加的細(xì)胞群一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成，并將移植構(gòu)造物植入到需要修復(fù)部位的脊椎中。
本發(fā)明的基質(zhì)組分可用最初較小的細(xì)胞群接種，它們可在植入前體外擴(kuò)增。有利地，用內(nèi)皮細(xì)胞接種可在基質(zhì)組分上體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞后，立即誘導(dǎo)移植物的血管化。此外，還可用平滑肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞或其它細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞接種基質(zhì)組分，從而促進(jìn)血管化。
在該實(shí)施方案中，用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分，并在將所述構(gòu)造物植入到患病區(qū)域中前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后且體內(nèi)植入移植物前的任何時(shí)間，用至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。因此，根據(jù)植入移植物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群時(shí)間的不同，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，附加的預(yù)選的細(xì)胞群可以擴(kuò)增或沒有擴(kuò)增。
在選擇性實(shí)施方案中，可用附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種基質(zhì)組分，并在植入移植構(gòu)造物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)預(yù)選細(xì)胞群，從而使預(yù)選細(xì)胞群擴(kuò)增。在該實(shí)施方案中，用預(yù)選細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。在該實(shí)施方案中，在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠使內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，可用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分。在該實(shí)施方案中，在植入移植物前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群和內(nèi)皮細(xì)胞，從而使兩種細(xì)胞群擴(kuò)增。
還提供了一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的組織移植構(gòu)造物的方法。該方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，從而形成移植構(gòu)造物。該方法還可包括在將移植構(gòu)造物植入到受影響區(qū)域中前，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)形成。
所述基質(zhì)組分可從肝基底膜(LBM)制造，該肝基底膜(LBM)是通過從脊椎動(dòng)物肝臟組織的天然伴隨的細(xì)胞成分中分離LBM而制備的。下面描述的制備技術(shù)提供一種胞外基質(zhì)組分，它主要是由基本上沒有任何細(xì)胞成分的LBM組成。
用于本發(fā)明基質(zhì)組分中的基底膜通常是從自動(dòng)物采集的肝臟組織制備的，所述動(dòng)物被飼養(yǎng)用于肉食生產(chǎn)，包括，例如，豬、牛、和羊或其它脊椎動(dòng)物。因此，用于本發(fā)明組分制備的肝臟組織的商業(yè)來源較為便宜。當(dāng)LBM組分用于本發(fā)明的送遞系統(tǒng)時(shí)，所述組分不會誘導(dǎo)不利的宿主免疫反應(yīng)。
為了制備無細(xì)胞的LBM組分，用細(xì)胞解離溶液處理肝臟組織一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠從胞外成分釋放肝臟組織的細(xì)胞成分，而基本上不會破壞胞外成分，并從胞外成分中分離細(xì)胞成分。通常所述細(xì)胞解離溶液包括離液劑或酶或兩者。
制備LBM的第一步是將肝臟組織段切成片(例如，條或片)，從而增加肝臟組織的表面積-體積比?？蓪⒏闻K組織切成一系列均具有約50-約500微米、更優(yōu)選約250-約300微米厚度的片。新采集的肝臟組織可使用標(biāo)準(zhǔn)的肉類切片機(jī)切片，或可將組織冷凍并用低溫切片機(jī)切片。然后用溶液處理肝臟組織薄片，從相關(guān)的胞外基底膜基質(zhì)中釋放肝細(xì)胞成分。
可用含酶，例如，蛋白酶，如胰蛋白酶或胃蛋白酶的溶液處理肝臟組織。由于LBM的膠原結(jié)構(gòu)和希望使膜結(jié)構(gòu)在細(xì)胞解離過程中的降解最小，應(yīng)將細(xì)胞解離所用的酶溶液中的膠原特異性酶活性減到最小。此外，通常還可用鈣螯合劑或離液劑(例如，Triton X-100)處理肝臟組織。因此，肝臟組織是通過將組織的片或條混懸于含酶和離液劑的細(xì)胞解離溶液中而處理的。然而，細(xì)胞解離還可在沒有用酶處理組織的情況下，使用鈣螯合劑或離液劑進(jìn)行。
細(xì)胞解離可通過在攪拌下將肝臟組織切片混懸于含有約0.05重量％-約2重量％、更優(yōu)選約0.1重量％-約1重量％的蛋白酶溶液中進(jìn)行，所述溶液還可任選含有離液劑或鈣螯合劑，它們的用量可有效使細(xì)胞從基底膜的釋放和分離達(dá)到最佳，且基本上不會降解膜基質(zhì)。
使肝臟組織與細(xì)胞解離溶液接觸一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠從基質(zhì)中釋放所有細(xì)胞后，用鹽水沖洗所得LBM一次或多次，并任選以冷凍的水化狀態(tài)或部分脫水的狀態(tài)貯藏直到使用。細(xì)胞解離可能需要若干次處理以從基底膜中基本上釋放出所有細(xì)胞。還可將所得LBM制劑進(jìn)一步處理以除去或抑制任何殘留的酶活性。例如，可將所得基底膜加熱或用一種或多種蛋白酶抑制劑處理。
在另一實(shí)施方案中，可如下制備LBM。使用標(biāo)準(zhǔn)肉類切片機(jī)將新采集的肝臟組織切成一系列均具有約50-約2000微米厚度的片，或?qū)⒔M織冷凍并用肉類切片機(jī)或低溫切片機(jī)切片。然后用例如去離子水、鹽水、或緩沖溶液沖洗肝臟組織一次或多次，并任選以冷凍的水化狀態(tài)或部分脫水的狀態(tài)貯藏直到使用。例如，可用去離子水、生理鹽水、或緩沖液沖洗肝臟的片或條3次共30分鐘。然后例如使用篩濾去肝臟切片的沖洗溶液，且可在濾網(wǎng)上揉搓各肝臟切片，或用超聲加快肝細(xì)胞的裂解并且機(jī)械解離肝基底膜中的肝細(xì)胞和肝細(xì)胞片段。
然后使肝臟組織薄片與含蛋白酶，如胰蛋白酶的溶液接觸，從伴隨的胞外基底膜基質(zhì)釋放肝細(xì)胞和其它成分。由于肝基底膜的膠原結(jié)構(gòu)和希望使膜結(jié)構(gòu)在細(xì)胞解離過程中的降解減到最小，應(yīng)將蛋白酶消化步驟中所用的酶溶液中的膠原特異性酶活性減到最小。通常還可使肝臟組織與鈣螯合劑如EDTA接觸，同時(shí)進(jìn)行蛋白酶處理。
在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白酶消化步驟是通過使肝臟組織切片與溶液接觸而進(jìn)行的，任選同時(shí)進(jìn)行攪拌，所述溶液含有0.02重量％的胰蛋白酶和約0.05重量％濃度的EDTA。所述蛋白酶消化步驟優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行加熱，通常是在約37℃下。上述沖洗和機(jī)械解離步驟可在蛋白酶消化步驟后重復(fù)進(jìn)行。
然后使肝臟切片與含有非-變性洗滌劑的溶液接觸。該步驟優(yōu)選在室溫下進(jìn)行，且任選同時(shí)進(jìn)行攪拌。所述非-變性洗滌劑優(yōu)選3％Triton X-100。上述沖洗步驟在使肝切片與非-變性洗滌劑接觸以除去大多數(shù)(如果不是全部)非-變性洗滌劑后重復(fù)。根據(jù)需要可重復(fù)機(jī)械解離步驟。
用非-變性洗滌劑處理后，使肝臟切片與含變性洗滌劑的溶液接觸。該步驟優(yōu)選在室溫下進(jìn)行且任選同時(shí)進(jìn)行攪拌。所述變性洗滌劑優(yōu)選4％脫氧膽酸鹽。然后按照上面所述充分沖洗LBM，以除去盡量多的殘留的洗滌劑，并可貯藏LBM(例如，4℃下，在去離子水中)直到再次使用或可在純化步驟后立即使用。
制備后，可按照美國專利US 5,275,826所述，采用與流化粘膜下層制備相似的方式將LBM流化，該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入此處作為參考。LBM是通過撕、切、磨、剪切等粉碎的。雖然通過使肝基底膜混懸液在高速(高剪切)攪拌器中經(jīng)過處理并脫水，如果需要，通過離心并倒出多余的水也可獲得較好的結(jié)果，但優(yōu)選以冷凍或凍干狀態(tài)研磨肝基底膜。此外，可通過用蛋白酶，例如膠原酶和或其它適宜的酶，如聚糖酶，或其它可破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分的酶進(jìn)行一段時(shí)間的酶消化而將粉碎的流化組織溶解，這段時(shí)間足夠使組織溶解并形成基本上均勻的溶液。
用于本發(fā)明透皮或透粘膜藥物送遞的流化LBM的粘度可通過控制LBM成分的濃度和水化程度而操縱?？蓪⒄扯日{(diào)節(jié)至25℃下的約2-約300,000cps。更高粘度的制劑，例如，凝膠可通過透析消化的物質(zhì)，然后調(diào)節(jié)溶液的pH至約5.0-約9.0而從LBM消化溶液制備。
LBM還可以提取物的形式制備。簡單的說，4℃下，攪拌下將LBM混懸于提取緩沖液中約24小時(shí)。然后在4℃下，以12,000xg離心提取混合物約30分鐘并收集上清液。然后用提取緩沖液洗滌不溶性物質(zhì)，并重復(fù)離心步驟，將洗滌液與原始上清液混合。用去離子水充分透析上清液(MWCO約3500)，以12,000xg離心透析液。上清液可立即使用或冷凍干燥貯藏。
粉末形式的LBM也可用于本發(fā)明中。粉末形式是通過在液氮下粉碎所述組織而產(chǎn)生0.1-1mm2大小的顆粒而制備的。然后將顆粒狀組分冷凍干燥過夜并滅菌，形成固體、基本無水的顆粒狀復(fù)合物。可選擇性地，可通過將粉碎LBM的混懸液或溶液干燥而從流化的LBM形成粉末形式的LBM。在植入本發(fā)明的移植構(gòu)造物前，粉末形式或流化形式或凝膠或提取物形式的LBM可用于體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和預(yù)選的細(xì)胞群。
MATRIGEL、ALLODERM、和INTEGRA、DERMAGRAFT、PERI-GUARD、和APPLIGRAF是可商業(yè)得到的已加工膠原組分。純化和已加工的膠原組分還可通過本領(lǐng)域已知的方案制備。例如，見美國專利US 6,127,143、5,814,328、5,108,424、和4,883,864，它們引入此處作為參考。
實(shí)施例1肝基底膜組分的制備實(shí)驗(yàn)中所用的2mM EDTA緩沖的離液溶液140mM NaCl5mMKCl0.8mM MgSO40.4mM KH2HPO42mMEDTA25mM NaHCO3過程肝臟切片的制備用低溫切片機(jī)將在-70℃冷凍的肝臟切成約50μ的厚度。然后使肝臟組織的切片經(jīng)過酶處理(0.1％胰蛋白酶)，其中使用上述的離液溶液(2mM EDTA)。
將肝臟切片放在5個(gè)50ml的試管中，每個(gè)試管都含有25ml緩沖的酶處理溶液。在37℃的水浴中孵育肝臟組織1小時(shí)，同時(shí)輕輕振搖。室溫下，采用攪拌/振搖，用PBS洗滌肝臟切片1小時(shí)。重復(fù)上述酶處理步驟3次。將冷凍組織切成1cm3，在液氮下用工業(yè)攪拌機(jī)粉碎成小于2mm2的顆粒并于使用前在-80℃貯藏。
肝基底膜提取物的制備用于這些研究的提取緩沖液包括4M胍和2M尿素，每個(gè)都是在50mMTris-HCl，pH7.4中制備的。4℃下，將粉末形式的肝基底膜混懸在適當(dāng)?shù)奶崛【彌_液(25％w/v)中，所述提取緩沖液包含均為1mM的苯甲基磺基氟化物、N-乙基馬來酰亞胺、和芐脒(蛋白酶抑制劑)，用力攪拌24小時(shí)。然后在4℃下，12,000xg離心提取混合物30分鐘，并收集上清液。在提取緩沖液中簡單洗滌不溶性物質(zhì)，離心，并將洗滌液與原始上清液混合。在Spectrapor管(MWCO 3500，Spectrum MedicalIndustries，Los Angeles，CA)中，用30個(gè)體積的去離子水充分透析上清液(72小時(shí)更換9次)。12,000xg離心透析液除去所有不溶性物質(zhì)，立即使用上清液或凍干貯藏。
流化的肝基底膜的制備上述粉碎材料的部分消化是通過將5g粉末狀組織加入到100ml含有溶于0.5M醋酸中的0.1％胃蛋白酶的溶液中，并在4℃下消化72小時(shí)而進(jìn)行的。部分消化后，4℃下12,000rpm離心混懸液20分鐘，棄去不溶性顆粒。4℃下，多次更換0.01M醋酸而透析上清液(MWCO3500)。通過向LBM水解產(chǎn)物中加入氯仿(5ml氯仿加入900ml 0.01M醋酸)而將溶液滅菌。額外更換兩次無菌的0.01M醋酸而繼續(xù)透析LBM，從而除去氯仿。然后將透析包的內(nèi)含物無菌轉(zhuǎn)移到無菌容器中。4℃下貯藏所得的流化組分。
肝基底膜凝膠組分的制備為了制備凝膠形式的LBM，將8ml流化LBM與1.2ml 10xPBS緩沖液(含5mg/L酚紅的10x磷酸鹽緩沖生理鹽水)混合；加入0.04N HCl(約1.6ml)調(diào)節(jié)pH至6.6-7.4，然后加入0.05N Na0H(約1.2ml)，改變pH至＞8。用水將終體積調(diào)節(jié)至12ml。
實(shí)施例2內(nèi)皮細(xì)胞的生長肝基底膜是按照上面所述制備的。經(jīng)由各種技術(shù)(γ射線照射、過乙酸等)滅菌后，將組織夾在聚丙烯框架內(nèi)，產(chǎn)生平坦的表面區(qū)域(50mm2)用于細(xì)胞生長。將框架浸沒在組織培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基營養(yǎng)物進(jìn)入肝基底膜的表面。將內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞(3×104個(gè)細(xì)胞/組織切片)接種在肝基底膜上，然后放在37℃的5％CO2、95％空氣的培養(yǎng)箱中。各個(gè)時(shí)間周期后，將接種的肝基底膜固定在10％中性緩沖福爾馬林中，包埋在石蠟中，并切片(6μm)。進(jìn)行各種組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色過程，從而確定細(xì)胞生長特性。利用這些過程觀察血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種用于修復(fù)患病或受損組織的具有血管樣結(jié)構(gòu)的組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述血管樣結(jié)構(gòu)在所述移植構(gòu)造物中形成的開始。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括選自角化上皮細(xì)胞、未角化上皮細(xì)胞、和中胚層來源細(xì)胞的細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞群。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括成纖維細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，它還包括肝素酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，它還包括選自血管內(nèi)皮細(xì)胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉(zhuǎn)化生長因子β、和血清生長因子的生長因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植構(gòu)造物，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分。
11.一種用于增強(qiáng)組織移植構(gòu)造物的體內(nèi)血管化的方法，所述方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，以形成移植構(gòu)造物，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述移植構(gòu)造物血管化的開始；并將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中需要修復(fù)的部位。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括選自角化上皮細(xì)胞、未角化上皮細(xì)胞、和中胚層-來源細(xì)胞的細(xì)胞群。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞群。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括成纖維細(xì)胞群。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述移植構(gòu)造物還包括肝素酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述移植構(gòu)造物還包括選自血管內(nèi)皮細(xì)胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉(zhuǎn)化生長因子β、和血清生長因子的生長因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括在所述基質(zhì)組分上培養(yǎng)所述內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠在將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中之前體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。
21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)或近乎同時(shí)接種基質(zhì)組分。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)接種基質(zhì)組分。
25.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，其中在植入移植構(gòu)造物前，內(nèi)皮細(xì)胞或附加的預(yù)選的細(xì)胞群均沒有擴(kuò)增。
26.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠使內(nèi)皮細(xì)胞在沒有體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)的情況下擴(kuò)增，并在基質(zhì)組分上培養(yǎng)附加的預(yù)選的細(xì)胞群一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠在將移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中之前，使附加的預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增。
27.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在基質(zhì)組分上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠使內(nèi)皮細(xì)胞在沒有體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)的情況下擴(kuò)增。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述附加的預(yù)選的細(xì)胞群在植入移植構(gòu)造物前沒有擴(kuò)增。
29.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在基質(zhì)組分上培養(yǎng)附加的預(yù)選的細(xì)胞群一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠在植入移植構(gòu)造物前，使預(yù)選的細(xì)胞群擴(kuò)增。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞在植入移植構(gòu)造物前沒有擴(kuò)增。
31.根據(jù)權(quán)利要求22、23或24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述附加的預(yù)選的細(xì)胞群在植入移植構(gòu)造物前擴(kuò)增。
32.根據(jù)權(quán)利要求22、23或24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述附加的預(yù)選的細(xì)胞群在植入移植構(gòu)造物前沒有擴(kuò)增。
33.一種制備用于修復(fù)患病或受損組織的具有血管樣結(jié)構(gòu)的組織移植構(gòu)造物的方法，所述方法包括用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分的步驟，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述血管樣結(jié)構(gòu)在所述移植構(gòu)造物中形成的開始。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包括在將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中之前，在所述基質(zhì)組分上培養(yǎng)所述內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間的步驟，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)。
35.一種用于增強(qiáng)移植構(gòu)造物的體內(nèi)血管化的方法，所述方法包括下列步驟用內(nèi)皮細(xì)胞群和至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群體外接種選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述移植構(gòu)造物血管化的開始；在所述基質(zhì)組分上體外培養(yǎng)所述內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠誘導(dǎo)血管或血管樣結(jié)構(gòu)的形成；并將所述移植構(gòu)造物植入到脊椎動(dòng)物中需要修復(fù)的部位。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括選自角化上皮細(xì)胞、未角化上皮細(xì)胞、和中胚層-衍生細(xì)胞的細(xì)胞群。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞群。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細(xì)胞群包括平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞群。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分后，再用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用附加的預(yù)選的細(xì)胞群接種基質(zhì)組分后，再用內(nèi)皮細(xì)胞接種基質(zhì)組分。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用內(nèi)皮細(xì)胞和附加的預(yù)選的細(xì)胞群同時(shí)接種基質(zhì)組分。
42.一種用于修復(fù)患病或受損組織的血管化組織移植構(gòu)造物，所述組織移植構(gòu)造物包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)在所述基質(zhì)組分上培養(yǎng)過一段時(shí)間，這段時(shí)間足夠體外形成血管或血管樣結(jié)構(gòu)，且其中所述附加的細(xì)胞群可增強(qiáng)所述移植構(gòu)造物血管化的開始。
43.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或42任何一項(xiàng)所述的移植構(gòu)造物，其中所述基質(zhì)組分包括肝基底膜。
44.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或42任何一項(xiàng)所述的移植構(gòu)造物，其中所述基質(zhì)組分包括源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原。
45.一種治療患者中患病或受損組織的方法，包括使用權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或42任何一項(xiàng)所述的組織移植構(gòu)造物修復(fù)患病或受損組織。
全文摘要
提供一種用于修復(fù)患病或受損組織的組織移植構(gòu)造物。所述組織移植構(gòu)造物包括選自肝基底膜及其提取物和水解產(chǎn)物、和源于脊椎動(dòng)物非粘膜下層來源的已加工膠原的基質(zhì)組分，加入的內(nèi)皮細(xì)胞，以及可增強(qiáng)血管樣結(jié)構(gòu)在移植物中形成開始的至少一種附加的預(yù)選的外源性細(xì)胞群。預(yù)選的細(xì)胞群可以是未－角化或角化的上皮細(xì)胞群或選自成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、多－潛能祖細(xì)胞、周細(xì)胞、成骨細(xì)胞、和任何其它適宜細(xì)胞類型的中胚層來源的細(xì)胞群，優(yōu)選以所修復(fù)組織為基礎(chǔ)選擇的細(xì)胞群。還提供了用于增強(qiáng)這些組織移植構(gòu)造物的體內(nèi)血管化和用于制備這些移植構(gòu)造物的方法。
文檔編號A61K35/34GK1665527SQ03815572
公開日2005年9月7日 申請日期2003年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月2日
發(fā)明者S·F·巴戴拉克 申請人:普渡研究基金會