腫瘤易感性增加的檢測方法

專利名稱：腫瘤易感性增加的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測腫瘤易感性增加的方法，該方法是通過特異性檢測人的鼠雙微體-2(MDM2)基因外顯子12的354A→G位置的多態性來實現的。所述多態性是代表人類罹患腫瘤風險增加的遺傳性標記物。本發明還涉及利用所述腫瘤易感性標記物來開發體外及體內檢測系統，該系統以特定的方式將所述標記物整合入診斷、預防以及可能的治療方法中。
背景技術：
MDM2基因首先在自發性轉化的3T3DM小鼠細胞系的雙微染色體中被鑒定。已知該基因產物MDM2能夠轉化小鼠纖維原細胞，從而導致不受控制的、誘發腫瘤的生長。人類的MDM2基因位于12q13-14的染色體片段上，當發現其為腫瘤抑制基因p53的重要的拮抗劑時，其得到了重視。二基因之間的相互調控是通過一個反饋環發生的，即，p53基因活化MDM2基因的轉錄，而所形成的MDM2基因反過來使得p53蛋白降解。MDM2蛋白對p53顯示出泛素連接酶的活性，后者為蛋白體降解的標記。結果達到了對p53蛋白表達的精細調節，而這種調節對胚胎形成是必須的。因此，MDM2基因敲除的小鼠是必死的，但是如果它們不攜帶有功能性活化的p53基因時，則能夠存活。已知MDM2除了與p53腫瘤抑制劑相互作用外，還會影響其它的腫瘤抑制代謝途徑，即，Rb-E2F-p16INK4A/p19ARF代謝途徑。因此，MDM2可與Rb蛋白結合，阻止Rb介導的G1細胞周期停止，或者直接與轉錄因子E2F1/DP相互作用并誘導細胞轉換進入S期。由于MDM2對兩條腫瘤抑制途徑都具有負調節作用，而這兩條途徑對80％的腫瘤都有影響，且許多研究證明，MDM2蛋白具有致腫瘤性(tumourigenic)，因此該基因已經成為基因治療的一個靶點。
概括說來，MDM2的特異性區域能夠與諸如p53，CBP/p300，pRb，p73，E2F1，DP1等多種蛋白、核糖體L5核蛋白顆粒、以及p14ARF和RNA等多種物質相互作用。MDM2對于腫瘤發生、細胞周期、以及凋亡等的特殊功能已經在一些綜述中進行了討論(Freedman et al.，1999，Momand et al.，2000，Juven-Gershon and Oren，1999)。
特別研究了MDM2在肉瘤(即，來源于間葉細胞的惡性腫瘤)中的作用。在惡性腫瘤中，肉瘤具有對MDM2最高的擴增比率-20～30％。MDM2在轉基因小鼠中的過度表達導致了38％的肉瘤發生(與p53的數據無關)。通過multivariate Cox回歸分析可以看出，肉瘤患者中MDM2的過度表達使得相關病人的生存率顯著降低(Würl et al.，1997)。
總的來說，對于MDM2 mRNA或者MDM2蛋白所影響的正常或者腫瘤特異性代謝途徑還所知甚少。對基因的功能進行研究的一個途徑是分析遺傳變異的結果。但是，迄今為止，對于MDM2基因的遺傳變異，即，突變或者多態性等，只僅僅進行了很少的研究。對文獻的廣泛搜索發現，這一主題僅有4篇相關出版物。其中包括對人原發性腫瘤的陰性發現(沒有發現基因變化)(Silva et al.，2000)、在MDM2的鋅指區域很少發生點突變和插入突變(Schlott et al.，1997)、在5’-未翻譯區域的一種多態性(Heighway et al.，1994)、以及在鋅指區域外顯子10的多態性(Taubert et al.，2000)。這一多態性被確定為專門針對軟組織肉瘤(與健康對照受試者的多態性等位基因頻率相比較)。該多態性與存活率降低的趨勢相關(有多態性的患者的存活率38個月；無多態性的患者的存活率57個月)。
本發明的目的在于鑒別與腫瘤相關的人MDM2基因的突變或多態性，并確定其與易患病體質(predispositions)的相關性。從這些相關性出發，欲開發出針對這些易患病體質的分子遺傳學診斷方法。其目的在于建立一個模型，從而可在外科手術以及藥物上都能進行預防以及緩解治療。
本發明是基于這樣一種認識，即發生在MDM2基因外顯子12密碼子354上的多態性A→G(GAA→GAG)(NM_002392序列的核苷酸1373)并不局限于軟組織肉瘤，而是與多種惡性腫瘤的發病傾向相關，并且，令人驚奇的，該多態性具有遺傳特性，即，其保存于胚芽系中。
已經發現該多態性與某些上皮來源的實體瘤(前列腺實體瘤)具有相關性的傾向，但其并不局限于這些，它還對更多的實體瘤以及血液腫瘤的易感性具有關鍵性的作用。
本發明是按照權利要求書來實現的。本發明涉及一種檢測腫瘤易感性的方法，該方法的特征在于受試個體的核酸被分離，在外顯子12的354位的堿基變換A→G(GAA→GAG)的幫助下，人MDM2基因序列被確定基因型(genotyped)，并且可通過高通量過程對該多態性基因座(在純合體和雜合體間有區別)的等位基因數據進行高特異性的、且非常敏感的有效確定。
可通過測序或其它適宜檢測點突變的方法來檢測基因分型。這些方法包括PCR所支持的基因分型方法，例如，等位基因特異性的PCR；使用寡核苷酸的其它基因分型方法(例如，點印跡或者寡核苷酸連接試驗(OLA))；使用限制性酶的方法以及通過基質輔助的激光離子化脫附游離質譜(MALDI)進行的單核苷酸多態性(SNP)分析；以及理論上用于變異性檢測的任意方法，其中包括任意技術方案的基因芯片技術。
基于上述研究，本發明的方法適于檢測廣譜的易患不同疾病的體質。在本發明的一個實施方案中，該方法通過檢測354位的多態性A→G的純合性或雜合性來作為具有潛在腫瘤易感性的遺傳傾向性的標準，尤其適用于患者及其后代的罹患腫瘤的遺傳傾向性的標準。
在一個優選的突變株中，通過檢測多態性的純合性或雜合性，該方法被用作對上皮組織實體瘤，例如前列腺癌(PCa)、乳腺癌、宮頸癌和/或卵巢癌等的腫瘤易感性的遺傳傾向性的標準。該方法尤其適用于檢測對前列腺癌的腫瘤易感性。
由此為分子生物學診斷專家提供了一個通用的遺傳性腫瘤標記物。
根據本發明，通過檢測某一單模標本的純合性或者雜合性，可以為其遺傳傾向提供有價值的陳述。由此可根據分子遺傳學提供遺傳學建議。
此外，該多態性的鑒定可能作為治療的診斷基礎。
可利用分離的核苷酸進行檢測，也可使用DNA或者RNA。可利用本領域公知的手段將分離的RNA轉錄為mRNA或者cDNA。此后，對DNA進行測序。
根據上述知識，通過使用突變的核苷DNA序列，可以根據本發明開發出新的治療劑，該治療劑通過調節轉錄、翻譯以及影響其效率而影響MDM2基因的通路并攻擊MDM2基因(或與之相關的基因)，優選采用調節表達的方式。
影響MDM2基因的一些基因通路是已知的。例如，它們包括·P53-p14·Rb-p161NK4A/p19ARF-E2F·Mdr-1。
優選開發出作用于人MDM2基因，并攻擊該基因外顯子12的354位A→G的治療劑。
此外，本發明還開發了體外和體內檢測系統。這些檢測系統表達外顯子12的354位A→G突變的人MDM2基因序列，可將該序列用于檢測與MDM2相關的疾病，并且可開發檢測個體特異性治療劑。
對本領域技術人員來說，這些檢測系統是公知的，它們可以是細胞系、異種移植物、以及其它動物模型等。
下面采用對前列腺癌(PCa)的腫瘤易感性的檢測為例，對本發明進行詳細說明，但下述說明并非為了對本發明做出限制。
對從泌尿道腫瘤患者手術前所選取的血液DNA樣品進行分析，其中與德國正常人群相比，被診斷患有原發性前列腺癌、具有家族性既往病史(未表明該家族中的前列腺癌)、且已進行相應的治療(主要為治療處理的目的對局部前列腺癌進行前列腺切除；對個別激素難控制的前列腺癌患者采用化療)的病人MDM2的354位(外顯子12)SNP A→G的雜合性要更高。
在進一步的研究中，在229個受檢測DNA樣品中，清楚地檢測到31個樣品具有多態性(13.5％)。由該數字可以清楚地看出，MDM2的多態性比率要比正常人群高1倍(假設在對照個體中檢測了雜合性比率，對照個體為健康年輕的正常人群，也包括具有非傾向性可確定的前列腺癌風險的男性個體)。這一結果表示對偶發性前列腺癌患者來說，雜合子基因座是可能的腫瘤易感性因子。
有趣的是，還發現，在晚期PCa患者的兩個DNA樣品中，得到了純合子等位基因的結果(兩個等位基因都為354位(外顯子12)的多態性A→G)。
當在分子篩選中使用HTS來檢測待研究MDM2基因座的個體特異性等位基因數據時，可能解決現存的問題。確定待研究的MDM2的多態性，是通過與病人DNA中所存在的純合或者雜合子的高靈敏性以及確切類型相聯系。選定的方法學操作簡單快速，具有高度的可重復性以及穩定性。
由上可知，該方法可高度綜合地與有核血細胞的全自動化DNA提取相關，并且可能用于全自動分離或者用于分子樣品的制備。優選的檢測方法是基于DNA ELISA，以及接下來的在96孔格式中對雜交結果的間接酶學檢測。但是，這一優選的DNA ELISA實施方案不應被限制在對待研究的MDM2基因座的分子篩選方法中。在優選的實施方案(DNA ELISA)中，利用從待研究患者的血液樣品中預先分離的基因組DNA來生成雙鏈DNA片段，將該片段采用PCR技術與待測MDM2基因座的側邊相聯(flank)。用于PCR的初始對含有一引物，該引物在5’位置被生物素化。由此所生成的PCR片段在擴增后也被生物素化。接著將該PCR片段轉移至鏈霉抗生素(streptavidin)包被的96孔微檢測板中，通過生物素化與板的表面共價連接。通過加入NaOH溶液使與板面結合的雙鏈DNA片段變性，通過洗滌去除未結合的DNA單鏈。接下來共價結合的DNA單鏈作為MDM2的基因型堿基互補雜交反應的靶序列。然后用兩個FITC-標記的寡核苷酸探針/擴增樣品在各種情況下進行雜交，寡核苷酸探針/擴增樣品在所研究的MDM2基因座兩種可能的MDM2等位基因突變體都具有堿基互補性。該雜交反應通過與酶偶聯的抗-FITC抗體反應以及接下來的底物轉化而被間接酶學檢測。所存在的等位基因情況通過反應完成后對相應孔的顏色變化或者亮度的檢測進行鑒別。以顏色為基礎，可能清楚地鑒別具有純合子或者雜合子特性的存在。該方法可能用一個96孔板同時研究48個患者的DNA。已經通過大量研究的樣品以及一系列空白對照的研究證實了該方法的可重復性以及穩定性。在附加的DNA序列的幫助下，已經對一系列樣品的DNA ELISA生成的結果進行了清楚的驗證。
對所有顯著性的樣品以及典型數量的非顯著性樣品的檢測結果進行重新評價，采用不同的識別檢測系統(直接PCR DNA測序，ALF Express，PharmaciaBiotech)得到了100％的確認。
此外，在進一步的空白實驗中，通過相關以及非相關實驗系列確定了同一檢測個體的多個DNA等分以及陰性對照。該研究還得到了定性結果的完全匹配，該定性結果強調了所選用的檢測方法的靈敏性。進一步的研究目前正在進行中，該項研究對400多位可檢測的偶發性前列腺癌患者進行了確定的數理統計分析。
對于其它類型腫瘤的實驗證實了該基因多態性的發生與上皮細胞實體瘤發生率的升高的關系。例如，在32個所研究的患有乳腺癌、宮頸癌或者卵巢癌的血液DNA樣品中，其中有5例(15.6％)證實具有雜合MDM2等位基因的情況。
為了證實所述PCR-ELISA檢測結果的特異性，對于在多態性MDM2基因座具有已知等位基因情況的分組人口個體進行了重新評價。此外，通過增加對照組來確定正常人群中的精確的雜合體頻率(在該方案中描述的所有DNA樣品來自健康對照個體以及Saxony和Saxony-Anhalt在1996-2001的腫瘤患者，并且樣品的獲得都得到了患者的書面同意，且制備的DNA樣品為匿名保存)。DNA樣品完全從經過嚴格納入標準選擇的供血者中獲得(在供血時以及供血之前沒有腫瘤疾患的癥狀，無已知的家族性疾病，且不論在工作地點或者在家都未暴露于輻射或者其它致突變/致癌性物質)。
對于正常個體的108例血液DNA樣品，Taubert et al.(2000)已經通過測序和限制性消化等手段對其中的一定比例樣品獨立進行了MDM2多態性的研究，所有當時檢測為雜合DNA的樣品已經通過PCR-ELISA進行了清楚的證實。此外，對已有研究的WTS組織的31個DNA樣品進行研究已經證實了100％的特異性。另外，在這些WTS患者中的一些(n＝6)，腫瘤組織DNA顯示出MDM2的多態性，對其相應的DNA血液樣品進行分析，也發現其為陽性。由此可以看出，WTS患者組織DNA樣品的多態性檢測高度可能為遺傳性的，即，該多態性在生殖細胞系中是保守的。
在歐洲中部男性經常罹患的癌癥疾病中，前列腺癌(PCa)排名第二，并且由于近年增加迅速，因此引起了重視。在美國，其已經成為最常檢測出的腫瘤類型，并且為肺癌之后的腫瘤相關病死率最高的實體瘤。在80％的情況下，該疾病在65歲以上的男人中診斷出。盡管局部的前列腺癌可以通過切除前列腺治愈，但是對于在局部發展且伴有轉移的腫瘤則幾乎不可能得到治療。對于腫瘤轉移病人的三年存活率僅為40％。對于前列腺癌，轉移通過血流和淋巴管進行傳播。淋巴轉移的最初侵襲位置為骨盆淋巴結。血液微轉移主要影響骨骼系統，最主要的為骨盆、脊骨、以及肝和肺等個體器官。對于有轉移的前列腺癌，手術和藥物治療的目的在于抑制睪丸激素的形成和作用，該睪丸激素是前列腺以及前列腺癌細胞增殖的主要原因。因此，對于腫瘤階段的正確確定，即，該腫瘤是局部的還是已經發展為擴散性，對確定接下來的治療形式是絕對必要的。在前列腺癌的最初診斷中，目前使用的檢測方法為直腸指診、血清中腫瘤標記物PSA(前列腺特異性抗原)的檢測、對取出的或組織切片進行組織病理學檢查、個別情況下對骨盆的淋巴結摘除進行檢查、并可選擇性進行MRT及CT或者骨閃爍掃描法。但是，直到現在，還無法檢測血液中或者淋巴結中最初轉移的生成(血液中擴散的前列腺癌細胞、區域性淋巴結的低入侵)，而對淋巴結僅可能在術后通過組織病理學檢查。可用于術前檢測的影像學技術(CT，MRT)靈敏性很低，僅為22-26％，且僅能檢測廣泛轉移的病例。由于轉移的發展明顯依賴于腫瘤所處的階段、腫瘤的體積以及腫瘤等級，因此除了組織學區別(Gleason評分)，上述這些也是確定患者預后情況的重要因素。
除了直腸指診，腫瘤標記物PSA(前列腺特異性抗原)的檢測也是前列腺癌早期診斷所用的一種高選擇性和靈敏的標準方法。但是，前列腺特異性抗原并非是前列腺的癌癥特異性標記物，而僅為組織特異性的標記物。PSA血清值的增加暗示了PCa的存在。通過PSA來區分BPH和腫瘤，在2-10ng/ml范圍內是非常難于區分的，這是由于隨著年齡的增長BPH發作更頻繁，隨著年齡的增加，由于前列腺的自然增大使PSA值也會增加。PSA的表達受到睪丸激素和二氫睪酮(DHT)的調節。在對患者給予激素(抑制睪丸激素和二氫睪酮的作用)時，血清中PSA水平降低。
PCa對于健康保健具有重要作用(尤其對于西方工業化國家)，因此，由于缺少腫瘤特異性標記物以及已知的腫瘤生物學和腫瘤細胞異種性，需要對PCa進行深入的臨床研究，該研究集中于鑒別偶發性以及遺傳性PCa的遺傳性以及外成性輔助因子。尤其在美國，對PCa發生率增加的家族進行了表征，將人類基因學研究(家族相關性的)深入到PCa。
本發明公開了一種普遍適用的遺傳性腫瘤標記物，該標記物在MDM2外顯子12的354位具有A→G(GAA→GAG)的多態性，該標記物尤其適用于前列腺癌。研究已經表明該多態性與PCa具有精確的相關性。通過檢測該多態性，可能對PCa的遺傳傾向進行更清楚地描述，并可能用于臨床。
參考文獻·Freedman D.A.，Wu L.，Levine A.J.(1999)，Functions of the MDM2 oncopro-tein.Cell Mol.Life Sci.5596-107.
·Juven-Gershon T.，Oren M.(1999)，MDM2The ups and downs.Mol.Med.571-83.
·Momand J.，Wu H.H.，Dasgupta G.(2000)，MDM2-master regulator of thep53 tumour suppressor protein.Gene 24215-29·Würl P.，Meye A.，Berger D.，Bache M.，Lautenschlger C.，Schmidt H.(1997)，Prognostic relevance of C-terminal MDM2 detection is enhanced by positivityin soft tissue sarcomas.Diagn.Mol.Pathol.6249-54.
權利要求
1.一種檢測對腫瘤具有易感性的方法，其特征在于分離受試個體的核酸，對人MDM2基因，采用外顯子12中354位的堿基交換A→G(GAA→GAG)進行基因分型，用該方法來確定該多態性基因座的等位基因情況。
2.權利要求1的方法，其特征在于，將純合或雜合多態性(突變)的檢測用作腫瘤易感性的遺傳傾向性的充分標準。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于將純合或雜合多態性(突變)的檢測用作受試者及其后代罹患腫瘤風險的遺傳傾向性的充分標準。
4.權利要求1至3任意一項所述的方法，其特征在于將純合或雜合多態性(突變)的檢測用作前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌和/或卵巢癌的腫瘤易感性的充分標準。
5.權利要求1至4任意一項所述的方法，其特征在于通過對DNA進行測序或者通過其它適于檢測點突變的方法來進行基因分型。
6.權利要求1至5任意一項所述的方法，其特征在于通過多個高特異性的擴增引物以及標記的雜交探針的DNA-ELISA來進行基因分型。
7.一種治療劑，該治療劑通過調節轉錄、翻譯以及影響其效率，優選通過調節表達來影響MDM2基因的通路和/或攻擊MDM2基因外顯子12中354位的多態性A→G(GAA→GAG)、或與之相關的基因。
8.一種治療劑，該治療劑通過調節轉錄、翻譯以及影響其效率，優選通過調節表達，作用于人MDM2基因并攻擊MDM2基因外顯子12中354位A→G(GAA→GAG)的位點變化。
9.一種體外及體內檢測系統，該檢測系統表達人MDM2基因，該MDM2基因在外顯子12的354位具有A→G(GAA→GAG)突變(多態性)，所述檢測系統用于研究與MDM2相關的疾病以及用于開發檢測個體特異性治療劑。
全文摘要
本發明涉及一種檢測腫瘤易感性增加的方法，該方法是通過特異性檢測人的鼠雙微體－2(MDM2)基因外顯子12的354 A→G位置的多態性來實現的。所述多態性是代表人類罹患腫瘤風險增加的遺傳性標記物。本發明還涉及利用所述腫瘤易感性標記物來開發體外及體內檢測系統，該系統以特定的方式將所述標記物整合入診斷、預防以及可能的治療方法中。
文檔編號A61P13/08GK1662661SQ03814029
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月16日 優先權日2002年6月18日
發明者阿克塞爾·梅耶, 黑爾格·陶貝特, 蒂莫·希勒布蘭德, 彼得·本扎科, 卡塔琳娜·克呂格爾, 馬蒂亞斯·卡普勒, 曼弗雷德·維爾特 申請人:英維泰克生物技術和生物設計有限公司