專利名稱：10－氧－對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷的護肝活性的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種環烯醚萜苷的護肝活性，即從黃荊(Vitex negundo)中分離的式1的10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷(穗花牡荊苷)，其分離方法為用極性溶劑如95％的乙醇，甲醇，含水乙醇或水提取氣生部分/整個植物，用溶劑如氯乙烯，二氯甲烷，氯仿或乙酸乙酯研磨提取物以除去脂類非極性成分而得到一級分，通過柱色譜法從該級分中分離出穗花牡荊苷。通過評價穗花牡荊苷對CCl和半乳糖胺誘導的肝損傷模型的保護作用證實了穗花牡荊苷的護肝活性。
背景和現有技術參考文獻黃荊(馬鞭草科(Verbenaceae))在印度廣泛地用在本土的醫藥系統中。該植物的葉和根有多種醫療性能。葉子是有香味的，滋補的和驅蟲的；根用作除痰劑，退燒藥和滋補藥(Chopra，R.N.，Nayar，S.L.和Chopra，I.C.，Glossary of Indian Medicinal Plants，CSIR，NewDelhi，1956，p.256；Wealth of IndiaRaw Material，CSIR，New Delhi，1976，Vol.X.p.522)。從這種植物的多個部分已經分離出許多化合物。從葉子中，Ghosh和Krishna分離出多種化合物，即葡糖諾尼醇(glucononitol)，對羥基苯甲酸，5-羥基間苯二酸和3，4-二羥基苯甲酸以及兩種葡糖苷和一種非晶態生物堿[Ghosh，T.P.和Krishna，S.，7.Indian Chem.Soc.1936，13，634]。Masilungan報道，這種葉子的精油中存在著萜烯，oc-蒎烯，莰烯，檸檬醛和β-石竹烯[Masilungan，V.A.Philip.J.Sci.1955，84，275]。從葉子和嫩枝中還分離出大量的類黃酮。它們是紫花牡荊素，葒草素，異葒草素，四羥黃酮，四羥黃酮-7-氧-葡糖苷，紫堇黃酮，梔子黃素A和B，3-氧-去甲蒿亭，5-氧-去甲川皮苷，3’，4’，5，5’，6，7，8-七甲氧基-黃酮，3’，5-二羥基-4’，7，8-三甲氧基黃烷酮和3’，5-二羥基-4’，6，7-三甲氧基黃烷酮[Sirait.L.M.，Rimpler，H.和Haensal，R.，Experientia 1962，18，72；Haensal，R.等人Phytochemistry 1965，4，19；Banerji A.等人Phytochemistry 1969，8，511；Ferdous，A.J.等人Bangladesh Acad.Sci.1984，8，23；Dayrit，F.M..等人Philipp.J.Sci.1987，116，403；Banerji，J.等人Indian J.Chem.1988；27B，597；Achari，B.等人Phytochemistry.1984，23，703]。莖皮中發現五種新的黃酮糖苷以及四羥黃酮和槭皂苷元(acerosin)。這些新的黃酮糖苷是6β-吡喃葡糖基-7-羥基-3’，4’，5’，8-四甲氧基黃酮-5-氧-α-L-吡喃鼠李糖苷，3’，7-二羥基-4’，6，8-三甲氧基黃酮-5-氧(6”-氧-乙酰基-對-D-吡喃葡糖苷)，3，3’，4’，6，7-五甲氧基黃酮，5’-氧-(4”-氧-β-D-吡喃葡糖基-α-吡喃鼠李糖苷，4’，5，7-三羥基黃酮-8-(2”-咖啡酰基-α-吡喃葡糖苷)和3’，5，5’，7-四羥基-4-甲氧基黃酮-3’-氧-(4”-氧-α-D-吡喃半乳糖基)吡喃半乳糖苷[Rao，V.K.等人Indian J.Pharm.1977，39，41；Subramamian，P.M.和Misra，G..S.Indian J.Chem.1978，16B，615；Subramaniam，P.M.和Misra，G.S.J.Nat.Prod.1979，42，540]。從種子中已分離出一種雙萜，5β-氫-8，11，13-松香基-三烯-6α-醇，和三種三萜，2α，3α-二羥齊墩果基-5，12-二烯-28-酸，2α，3α-二乙酰氧齊墩果基-5，12-二烯-28-酸，2，3cc-二乙酰氧基-18-羥齊墩果基-5，12-二烯-28-酸。這些化合物顯示出消炎活性[Chawla，A.S.Sharma，A.K.，Handa，S.S.和Dhar，K.L.Indian J.Chem.1991，30B，773和J.Nat.Prod.1992，55，163]。然而，葉子中沒有任何三萜，但從根里卻已分離出乙酰齊墩果酸[Vishnol，S.P.，Shoeb，A.，Kapil，R.S.和Popli，S.P.Phytochemistry 1983，22，597]。
已經報道從黃荊的葉子中分離出五種環烯醚萜苷。它們是桃葉珊瑚苷，穗花牡荊苷(Hansal等人Phytochemistry 4，1965，9-槭苷(negundoside)6’-對-羥基苯甲酰mussaenosidic acid(Sehgal等人Phytochemistry，21，1982，363)和牡荊苷(nishindaside)(Datta等人Tetrahedron 39，1983，3067)。
在我們研究植物來源的護肝藥劑時，用含水乙醇提取黃荊，從中分離的一種級分顯示有強免疫刺激的護肝活性。已經發展了一種從黃荊葉中分離免疫刺激劑的方法，關于此的一項專利已授權給RegionalResearch Laboratory，Jammu[Suri，J.L.等人Indian Patent No.78388 dt.19-03.97]。Regional Research Laboratory，Jammu已經提交了另一個專利申請，其為一種分離具有護肝和免疫刺激活性的生物活性組合物的方法(申請號16/DEL98 dt.16.1.98)。由于庫洛胡黃連(Picrorhiza Kurroa)中的環烯醚萜苷具有強護肝活性(Ansari，R.A.等人Indian J.Med.Research，1988，87，401)，因此想要評價黃荊中的環烯醚萜苷的護肝活性。從黃荊中分離一種環烯醚萜苷的穗花牡荊苷，并將其與該植物的含水酒精提取物一起評價其護肝活性。含水酒精提取物(編號033)和穗花牡荊苷(編號033(1))在用CCl4和半乳糖胺(GalN)對大鼠進行誘導性肝損傷實驗中都顯示有明顯的護肝活性。通過與已知的護肝劑水飛薊素比較顯示，關于它們對血清和肝臟勻漿物參數的升高水平的影響，033和033(1)在大多數參數上顯示更高的護肝潛力(表1和2)。
本發明的描述因而本發明的主要目的是提供從黃荊的葉子中分離出來的特定活性生物分子的護肝活性，即如附在本說明書中的圖所示的式1的穗花牡荊苷。
因此，本發明提供附在本說明書中的式1的化合物的護肝活性，其包括(a)用已知方法將該植物材料磨成粉狀，(b)通過滲濾作用制備含水醇萃取物，(c)用常規方法濃縮醇萃取物，(d)用溶劑如氯乙烯，二氯甲烷，氯仿或者乙酸乙酯來研磨該萃取物，以除去脂類非極性成分，(e)用硅膠吸附剩余萃取物，(f)用柱色譜法從吸附的萃取物中分離穗花牡荊苷以及(g)評價護肝活性在步驟(b)起萃取作用的試劑是乙醇，含水乙醇，甲醇，含水甲醇或水。
化合物的護肝活性以大鼠口服劑量50mg/kg-1進行表示，可推斷對人(70kg)每日劑量為300-400mg，可以一次或分次給藥。
穗花牡荊苷1的特性得到晶體化合物1，mp 148-50℃ IvT-466，UV-232nm，IR(KBr)光譜顯示在3400，1700，1642和1618cm-1有吸收。1H NMR(200MHz，CD3OD)56.35{(dd，J2，6，H-3) 5.12(dd，J，4，6，H-4)2.70(m-H-5)4.48(m，H-6)5.82(s，H-7)2.94(m，H-9)5.05(s，H-10)4.69(d，J8，H-1’)3.65(m，H-2’)7.92(dd，/2，7，H-2“6”)6.84(dd，7，2，7，H-3”)13CNMR δ97.92(C-1)，141.50(C-3)，105.35(C-4)，46.04(C-5)82.58(C-6)132.09(C-7)，142.55(C-8)，46.04(C-9)63.46(C-10)，100.07(C-1’)74.56(C-2’)，77.61(C-3’)71.01(C-4’)，77.82(C-5’)62.49(C-6’)121.81(C-1”)132.73(C-2”，C-6”)，16.08(C-3”，5”)，163.50(C-4”)，167.70(CO)本發明的詳細描述因此，本發明提供一種在包括人類在內的哺乳動物中治療和/或預防肝病狀態的方法，所述方法包括的步驟有給予哺乳動物有效劑量的式1的10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷化合物，其也稱為穗花牡荊苷，該化合物可選地單獨或者聯合一種或多種藥物上可接受的添加劑使用。
本發明的另一個實施例，其中所述的組合物減少血清中升高的谷丙轉氨酶(GPT)水平大約70％。
而在本發明的另一個實施例中，其中所述的組合物降低了血清中升高的谷草轉氨酶(GOT)水平大約60％。
在本發明的另一個實施例中，其中所述的組合物降低了血清中升高的堿性磷酸酶(ALP)水平的大約62％。
在本發明的另一個實施例中，其中所述的組合物降低了血清中升高的甘油三酯的水平的大約70％。
在本發明的另一個實施例中，其中所述的組合物降低升高的膽紅素水平的大約72％。
本發明的還有另一個實施例中，其中的化合物穗花牡荊苷是從整個植物中得到的。
在本發明的還有另一個實施例中，其中的10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷的濃度范圍在每kg體重大約20到200mg之間。
在本發明的還有另一個實施例中，其中10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷的濃度為每kg體重大約50mg。
在本發明的還有另一個實施例中，其中的病理狀態是從肝病中選擇的。
在本發明的還有另一個實施例中，從哺乳動物和動物中選擇受試者，優選為人。
在本發明的還有另一個實施例中所述的組合物是單獨使用或者聯合藥物上可接受的載體一起使用。
在本發明的還有另一個實施例中，所述組合物與藥物上可接受的添加劑、載體、稀釋劑、溶劑、濾劑(filter)、潤滑劑、賦形劑、粘合劑或者穩定劑聯合施用給受試者。
在本發明的還有另一個實施例中，對于預防和治療的特性給予想要的劑量。
在本發明的還有另一個實施例中，是以口服或者任何臨床/醫學上接受的方法給予所述的組合物。
在本發明的還有另一個實施例中，對于人的優選劑量大約為5mg/kg體重。
在本發明的還有另一個實施例中，所述組合物可以采用多種物理形態如粉末，片劑，膠囊，糖漿，顆粒，乳劑，氣霧劑，或者小珠。
在本發明的還有另一個實施例中，可用于肝硬化，半乳糖血癥，Hemoanigoma，血色病，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，戊型肝炎，庚型肝炎，酒精性肝病，自免疫肝炎，肝癌，膽道閉鎖，糖原過多癥1，α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥，肝動脈畸形綜合征(Alagillesyndrome)，Byler病，先天性肝內膽管擴張，脂肪肝，肝臟瘙癢癥，原發性膽汁性肝硬化，硬化性膽管炎或者紅細胞肝性原卟啉癥。
本發明的另一個實施例中，一種分離式1的10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷化合物(也稱為穗花牡荊苷)的方法，所述化合物從氣生部分/整個植物中分離，包括以下步驟(a)用已知方法將該植物材料磨成粉狀，(b)通過滲濾作用制備含水醇萃取物，(c)用常規方法濃縮醇萃取物，(d)用溶劑如氯乙烯，二氯甲烷，氯仿或者乙酸乙酯來研磨該萃取物，以除去脂類非極性成分，(e)用硅膠吸附剩余萃取物，(f)用柱色譜法從吸附的萃取物中分離出2’-對羥基苯甲酰mussaenosidic酸附圖的簡要說明
圖1是式1的化合物10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷(穗花牡荊苷)。
圖2是分離10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷(穗花牡荊苷)的流程圖。
通過下面給出的實施例詳細地描述本發明，其不能解釋為對本發明范圍的限制。
實施例1用80％的乙醇(4×3L)通過滲濾對避光干燥和成粉末的黃荊葉子(1kg)進行萃取。在降低的壓力下，于低于50℃將合并的萃取物濃縮成1升的水濃縮液。用乙酸乙酯(3×500ml)對水濃縮液進行洗滌，進一步濃縮成400ml。這種糖漿似的剩余物用硅膠(400g)吸附，在室溫下干燥。將漿放入硅膠柱，用氯仿-甲醇(19∶1)的混合物進行洗脫，獲得1(2.1g)。(編號033(1)實施例2精細研磨的黃荊葉子(200g)用石油醚(60-80°)萃取三次(第一次萃取用1升，后兩次萃取每次用600ml)。在室溫下使該藥中沒有溶劑。然后用乙醇萃取(第一次萃取用1升，后三次每次分別用600ml相同的溶劑。)在一個旋轉薄膜蒸發器中蒸發乙醇，產生30g的萃取物(編號實施例3用033和033(1)對實驗動物進行抗CCU引起的肝損傷的治療，這降低了血清中的GPT，GOT，ALP，膽紅素，TG和肝脂質過氧化作用的升高水平，同時升高了GSH的水平。關于它們對CCU導致的上述參數的升高水平的作用，與已知的護肝劑水飛薊素相比顯示出，033和033(1)在大多數參數上顯示更高的護肝活性。使用033和033(1)所觀察的護肝活性分別為血清中的GPT-67.52和59.52，GOT-58.91和57.42，ALP-58.26和60.17，膽紅素-60.00和71.79，TG-46.47和38.53，以及肝臟勻漿中的LP-55.71和41.48及GSH-61.42和38.12％。而用水飛薊素時相同的參數分別為58.44，51.63，52.26，57.50，41.30，62.05和60.15(表-1)。
實施例4對動物進行抗半乳糖胺(GaIN)引起的肝損傷的治療也降低了血清中的GPT，GOT，ALP，膽紅素，TG和肝脂質過氧化作用的升高水平，以及升高了GSH的水平。使用033和033(1)所觀察到的護肝活性為血清中GPT，GOT，膽紅素，ALP，和TG的百分比分別是59.58和44.97，56.62和44.05，54.28和47.66，57.71和66.66，57.89和49.33，以及肝脂質性過氧化作用(LP)和GSH的百分比分別為67.51和48.34，66.56和55.13。而用水飛薊素時相同的參數分別是57.38，55.40，60.00，53.54，46.17，69.59，67.18(百分比)(表-2)。
與以現在所用的以植物為基礎的護肝劑相比，本發明的優點在于1.穗花牡荊苷比商購可得的草藥護肝劑水飛薊素更有效。
2.水飛薊素是一個三種成分的混合物，它們之間的相對比例會因批次不同而不同，而穗花牡荊苷則是一種純化合物。
表1在用CCU(1ml/kg，p.o.)對大鼠進行誘導性肝損傷之前48小時、24小時、2小時，以及在用CCU(1ml/kg，p.o.)對大鼠進行誘導性肝損傷6小時之后給予033，033(1)以及水飛薊素的護肝活性(體內)。
a數值表示每組中6個動物的護肝活性的平均百分比。
H以{1-(T-V/C·V)}×100計算的護肝活性‘T’表示藥和CCU的平均值，“C”表示CCU單獨的平均值，“V”表示用賦形劑處理動物的平均值。
單位每個單位是(摩爾 丙酸酮/分鐘/L。
b是形成的11摩爾的對硝基苯酚/mini Uc是n摩爾的MDA/g肝，d是n摩爾的GSH/g肝表2在用GalN(300mg/kg，s.c.)對大鼠進行誘導性肝損傷之前48小時、24小時、2小時，以及在用GalN(300mg/kg，s.c.)對大鼠進行誘導性肝損傷6小時之后給予033，033(1)以及水飛薊素的護肝活性(體內)。
a數值表示每組中6個動物的護肝活性的平均百分比H以{I-(T-V/C-V))×100計算的護肝活性“T”是藥和GalN的平均值，“C”是GalN單獨的平均值，“V”表示用賦形劑處理動物的平均值。
單位每個單位是pinole丙酸酮/分鐘/L。
b是M，形成的對硝基苯酚的摩爾數/分鐘/L，c是n摩爾的MDA/g肝.，d是p摩爾的GSH/g肝.，
權利要求
1.一種在包括人類在內的哺乳動物中治療和/或預防肝病狀態的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效劑量的式1的10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷化合物的步驟，所述10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷也稱為穗花牡荊苷，該化合物可選地單獨使用或者聯合一種或多種藥物上可接受的添加劑一起使用。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物降低血清中升高的谷丙轉氨酶(GPT)水平的大約70％。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物降低血清中升高的谷草轉氨酶(GOT)水平的大約60％。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物降低血清中升高的堿性磷酸酶(ALP)水平的大約62％。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物降低血清中升高的甘油三酯水平的大約70％。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物降低血清中升高的膽紅素水平的大約72％。
7.根據權利要求1所述的方法，其中的化合物穗花牡荊苷是從整個植株中獲得的。
8.根據權利要求1所述的方法，其中10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷的濃度范圍在每千克體重大約20到200毫克之間。
9.根據權利要求1所述的方法，其中10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷的濃度大約是每千克體重50毫克。
10.根據權利要求1所述的方法，其中的病理狀態選自肝病。
11.根據權利要求1所述的方法，其中受試者選自哺乳動物和動物，優選為人類。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物單獨使用或者與藥物上可接受的載體聯合使用。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物與藥物上可接受的添加劑，載體，稀釋劑，溶劑，濾劑，潤滑劑，賦形劑，粘合劑或者穩定劑聯合施用給受試者。
14.根據權利要求1所述的方法，其中給予想要的劑量用于預防和治療特性。
15.根據權利要求1所述的方法，其中以口服或者任何臨床/醫學上接受的方法給予所述的組合物。
16.根據權利要求1所述的方法，其中用于人體的優選劑量是每千克體重大約5毫克。
17.聲明所述組合物可利用的多種物理形式，如粉末，片劑，膠囊，糖漿，顆粒，乳劑，氣霧劑，或者珠狀物。
18.根據權利要求1所述的方法，對肝硬化，半乳糖血癥，Hemoanigoma，血色病，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，戊型肝炎，庚型肝炎，酒精性肝病，自免疫肝炎，肝癌，膽道閉鎖，糖原過多癥1，α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥，肝動脈畸形綜合征，Byler病，先天性肝內膽管擴張，脂肪肝，肝臟瘙癢癥，原發性膽汁性肝硬化，硬化性膽管炎或者紅細胞肝性原卟啉癥是有效的。
19.分離也稱為穗花牡荊苷的式1的化合物10-氧-對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷的方法，所述化合物從氣生部分/整個植株中分離，包括以下步驟1.用已知方法將該植物材料磨成粉狀，2.通過滲濾作用制備含水醇萃取物，3.用常規方法濃縮醇萃取物，4.用溶劑如氯乙烯，二氯甲烷，氯仿或者乙酸乙酯來研磨該萃取物，以除去脂類非極性成分，5.用硅膠吸附剩余萃取物，6.用柱色譜法從吸附的萃取物中分離出2’-對羥基苯甲酰mussaenosidic酸。
全文摘要
一種在包括人類在內的哺乳動物中治療和/或預防肝病狀態的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效劑量的式1的10－氧－對羥基苯甲酰桃葉珊瑚苷化合物的步驟，其也稱為穗花牡荊苷，該化合物可選地單獨使用或者與一種或多種藥物上可用的添加劑聯合使用。
文檔編號A61P1/16GK1658865SQ03813500
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月9日 優先權日2002年5月10日
發明者A·普拉巴卡, B·D·古普塔, K·A·蘇里, N·K·薩蒂, S·馬爾霍特拉, R·K·約里, B·S·賈吉, B·K·錢丹, A·K·沙爾馬, D·K·古普塔, B·K·卡帕尼, K·L·貝迪, O·P·蘇里, G·N·卡奇 申請人:科學與工業研究會