Mcp蛋白質的新型拮抗劑的制作方法

專利名稱：Mcp蛋白質的新型拮抗劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過適當誘變MCP蛋白質而產生MCP蛋白質的新型拮抗劑，具體是人MCP-1蛋白質的新型拮抗劑。
背景技術：
趨化因子是小的分泌性促炎癥蛋白質，能介導白細胞從血液定向遷移到損傷部位。根據該蛋白質家族特征性保守半胱氨酸的位置，趨化因子家族可依據其結構分成C、C-C、C-X-C和C-X3-C趨化因子，它們存在著一系列對應的膜受體(BaggioliniM等，1997；Fernandez EJ and Lolis E，2002)。趨化因子通常產生在損傷部位，引起白細胞移行和激活，在炎癥、免疫、體內穩態和血管生成過程中起著基礎作用。這些分子因此提供了治療干預這些過程相關疾病的可能性。具體是通過抑制特異性趨化因子和它們的受體，來預防白細胞的過度募集和激活(Baggiolini M等，2001；Loetscher P and Clark-Lewis I，2001；Godessart N and Kunkel SL，2001)。
單核細胞趨化吸引蛋白1(現稱為MCP-1)是CC趨化因子家族的成員，也知道其有各種名稱，如CCL2、可誘導小細胞因子A2(SCYA2)、單核細胞趨化和活化因子(MCAF)、單核細胞分泌蛋白Je、單核細胞趨化因子和HC11。此趨化因子在各種炎癥疾病、不同類型腫瘤、心臟同種移植、AIDS和結核病中，能促進對損傷和感染信號反應中單核細胞和嗜堿性細胞的募集(Gu L等，1999)。
已鑒定到其結構和功能同源性蛋白質，稱為MCP-2(CCL7)、MCP-3(CCL8)、MCP-4(CCL13)和Eotaxin(CCL11)。C-C趨化因子的該亞族，與可能從共同祖先序列共進化產生的其它C-C趨化因子，如RANTES或MIP-1α/β顯著不同。它們具有相似的受體，結合特定的CCR2(但也結合CCR1、CCR3和CCR5)。因此這些C-C趨化因子的許多免疫和炎癥激動劑和拮抗劑活性是共同的(Hughes ALand Yeager M，1999；Berhkout TA等，1997；Luster AD and Rothenberg ME，1997；Proost P等，1996)。
已通過轉基因動物和其它動物模型廣泛研究了MCP-1相關的生理活性，證明MCP-1在許多感染性、炎癥性和自身免疫性疾病中，以及與T輔助細胞應答相關的細胞因子表達中，控制著單核細胞和其它類型細胞(如星狀細胞)的募集。表現出來由MCP-1誘導的其它疾病是血管性疾病(冠脈介入手術后的再狹窄、動脈硬化、動脈粥樣硬化、局部缺血梗塞、中風)和癌癥相關的新血管生成(Ikeda Y等，2002；Egashira K等，2002；Gu L等，2000；Salcedo R等，2000；Gosling J等，1999；Lu B等，1998；Rutledge BJ等，1995)。
由于認為以MCP-1為靶子可作為一些疾病的潛在治療方法，文獻中已有不同類型MCP-1拮抗劑的報導，它們對MCP-1誘導的病理活動獲得了或多或少的抑制作用(Dawson J，2003)。MCP-1拮抗劑的例子有N-端缺失的MCP-1突變體、天然或合成的缺失N-端2-10個氨基酸的MCP-1(Egashira K等，2000；Zhang Y andRollins BJ，1995；McQuibban GA等，2002)、抗MCP-1單克隆抗體(Ajuebor MN等，1998；Eghtesad M等，2001)、RNA aptamers(Rhodes A等，2001)、按MCP-1內部序列設計的肽(Reckless J and Grainger DJ，1999)、MCP-1拮抗肽模擬物(Kaji M等，2001)、反義寡核苷酸(WO 94/09128)、小分子(Mirzadegan T等，2000)、聚合物修飾的MCP-1(WO 02/04015)、或病毒性誘騙受體(Alexander JM等，2002；Beck CG等，2001)。
結構上，MCP蛋白質具有一個N-端環和C-端三個β折迭，上有一α螺旋(HandelTM等，1996；Lubkowski J等，1997；Blaszczyk J等，2000)。文獻提供了許多結構-活性研究的例子(Gong JH and Clark-Lewis I.，1995；Zhang等，1996；Beall CJ等，1996；Steitz SA等，1998；Gu L等，1999；Hemmerich S等，1999；Seet BT等，2001)，其中通過表達N-端截短物(如在許多其它趨化因子中那樣)，或殘基3、8、10、13、15、18、19、24、28、30、37、38和39(按成熟的人MCP-1編號)的單個突變物，已獲得了對受體或其它結合蛋白質活性和/或親和力降低的MCP-1突變體。對Eotaxin也獲得了類似結果(Mayer MR and Stone MJ，2001)。
趨化因子與蛋白聚糖(PGs)和氨醛聚糖(GAGs)的相互反應，是許多細胞信號傳遞可溶性分子(白介素，生長因子)的共同特征。蛋白聚糖是陰電荷蛋白質，其經過翻譯后修飾在絲氨酸殘基上加有氨醛聚糖側鏈。堿性殘基(主要是精氨酸和賴氨酸)的簇集使該蛋白能與GAGs相互反應，而GAGs是二糖重復單位如肝素、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和透明質酸的共同特征。PGs和GAGs可以作為可溶性分子存在膜表面上，可保護該分子免受胞外環境的蛋白水解。也已提出GAGs可能有助于將細胞信號分子正確呈遞給它們的特異性受體，因而也可調節靶細胞的激活。就趨化因子而言，其在炎癥部位以固定梯度濃集，隨之與細胞受體的相互反應和細胞的激活狀態似乎受特異性GAG的調節。已清楚證明許多趨化因子，包括MCP-1能與GAGs相互反應并形成這些梯度，測定了它們的相對親和力。因此有人提出，調節這種相互反應可提供治療炎癥疾病的方法(Hoogewerf AJ等，1997；Kuschert G等，1999；Ali S等，2001；Patel D等，2001；WO 02/28419；WO99/50246)。
然而，對GAG/MCP-1相互反應的結構要求和功能作用研究很少。已知GAGs能調節內皮細胞分泌的MCP-1的活性和產生(Douglas MS等，1997)。也有人報告MCP-1的C-端賴氨酸58和組氨酸66用丙氨酸取代后，阻止了與GAG的結合，但不影響其受體結合、Ca2+流入或趨化活性(Chakravarty L等，1998)，但本領域先前并未揭示哪些可能是MCP-1的其它GAG結合位點，哪些可能是它們消除后的體內效果。即使對某些趨化因子進行了廣泛的研究，也不可能根據序列同源性預測哪些殘基經非保守性取代修飾可影響到GAG結合，和可獲得哪些效果，因為趨化因子的GAG結合區域具有顯著的結構多樣性(Lortat-Jacob H等，2002)。
發明概述已發現人MCP-1的N-端雙堿基位點(精氨酸18，賴氨酸19)負責MCP-1與GAGs的相互反應。用非保守性取代(如用丙氨酸)消除此位點能產生MCP-1突變體，其不僅與GAG相互反應力降低，而且令人驚奇地在體內對MCP-1具有劑量相關的拮抗活性。可利用此現象來開發MCP-1和其它MCP蛋白的突變體，用作相應MCP蛋白質的拮抗劑。本發明制備的化合物可用于抑制表達MCP受體的白細胞的遷移和活化，從而為治療白細胞遷移過度或失控相關的疾病，如炎癥和自身免疫性疾病，提供了有用的治療組合物。本發明的其它特征和優點將從以下詳細說明中得以明白。


圖1(A)如實施例中表達并測定的人和突變體MCP-1蛋白的氨基酸序列(下劃線表示突變的氨基酸)。純化過程中用氨基肽酶處理，除去MCP-1WT*和MCP-1WT*2A中N-端甲硫氨酸，以避免此附加殘基對該蛋白質活性的任何干擾。
(B)成熟形式的人MCP-1(CCL2；SWISSPROT Acc.No P13500)、MCP-2(CCL7；SWISSPROT Acc.N°P80075)、MCP-3(CCL8；SWISSPROT Acc.No P80098)、MCP-4(CCL8；SWISSPROT Acc.No Q99616)和Eotaxin(CCL11，SWISSPROT Acc.NoP51671)。本專利申請中，MCP-1內相同的堿性殘基包括括弧內能與GAGs(殘基18和19)結合及其它有更多的同源性人蛋白質中相應的保守殘基。所有人MCP蛋白中其它堿性的保守殘基用下劃線表示。
圖2此圖提供用[3H]-肝素和作為趨化因子的MCP-1*WT(○)或MCP-1WT*2A(●)進行肝素結合試驗的結果。
圖3此圖提供了平衡性競爭受體結合試驗的結果，通過監測加入hMCP-1(□)、MCP-1WT*(○)或MCP-1WT*2A(●)作為趨化因子，取代表達CCR2的CHO(細胞膜)的[125I]-MCP-1后的效果。
圖4此圖提供用THP-1細胞和作為趨化因子的重組人MCP-1(□)、MCP-1WT*(○)或MCP-1WT*2A(●)，進行轉移孔趨化因子試驗(transwell chemotaxis assay)的結果。
圖5此圖小結了用MCP-1WT*和/或MCP-1WT*2A在小鼠中進行腹膜細胞募集試驗的結果。圖中用*號表示對MCP-1WT*募集的細胞數抑制活性具有統計學意義的MCP-1WT*2A濃度。
圖6此圖小結了遲發性接觸超敏試驗的結果。小鼠用0.5mg/kg MCP-1WT*2A(■)或只用運載體(□)處理。以處理期間每天耳腫脹程度評定其效果。
圖7此圖小結了對服用博來霉素誘導肺纖維化小鼠體重的影響。將對照鼠(□)的平均體重與接受處理的鼠(腹腔內注射0.25mg/kg MCP-1WT*2A(●))或只注射PBS(○)小鼠的平均體重作比較。所示體重是各組小鼠的平均體重值。
圖8此圖比較了未處理和用博來霉素處理，外加腹腔內只注射PBS或0.25mg/kg MCP-1WT*2A的小鼠中的纖維化水平。纖維化水平用實施例中所述分光光度法(上)或組織學方法(下)測定。
圖9此圖比較了實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動物模型只用PBS(組1)、1μgMCP-1WT*2A/小鼠(組2)、或10μg MCP-1WT*2A/小鼠(組3)處理所測得的臨床評分。
圖10此圖比較了膠原誘導的關節炎(CIA)動物模型只用PBS、或1μgMCP-1WT*2A/小鼠處理所測得的臨床評分。
圖11此圖比較了從只用PBS(組1)處理和攻擊、用PBS處理和用卵白蛋白攻擊(組2)、或用10μg/小鼠MCP-1WT*2A處理和用卵白蛋白攻擊(組3)動物模型氣管分離所得的細胞量。
發明的具體描述鑒于上述文獻所述，尚不清楚人MCP-1的N-端特異性雙堿性(氨基酸)位點是否界定了的GAG的結合位點，而此位點殘基的非保守性取代可導致產生對MCP-1具有拮抗活性的分子。然而，鑒于此雙堿性(氨基酸)位點在已知MCP蛋白中的保守性，以及其它堿性氨基酸和/或已知參與GAG結合的殘基的保守性，可推斷通過非保守性取代相應的人MCP-1中功能特征性的殘基，可獲得MCP蛋白的拮抗劑。
本發明的主要目的是提供由MCP蛋白突變體組成的MCP蛋白質的新穎拮抗劑，這些突變體是將人成熟的MCP-1序列中以下編號的殘基組合被替代為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺a)18和19；b)18和/或19，加上58；c)18和/或19，加上66；d)18和/或19，加上58和66；e)18和/或19，加上以下24、44、49、75中的一個或多個。
本專利申請提供上述組合的具體實施例，即精氨酸18和賴氨酸19用丙酸取代的新穎重組MCP-1突變體獲得的令人吃驚的體內和體外數據。這些結果，與其它高度保守MCP蛋白的序列和結構知識相結合，提示此雙堿性(氨基酸)位點不僅在MCP蛋白質生物活性中起著主要作用，而且可在這些同源性蛋白質中進行相應的修飾以獲得拮抗分子。
為獲得具有拮抗性能的分子，以非保守性方式突變MCP蛋白質中的堿性殘基必須是18和19位的二個殘基、至少18和19位堿性殘基之一加上已知參與GAG結合的殘基如58和66(Chakravarty L等，1999)中至少一個、或至少18和19位堿性殘基之一加上在所有的人MCP蛋白中保守的其它堿性殘基(圖1B；berhkoutTA等，1997)中至少一個。取代該堿性殘基的氨基酸宜為非極性小氨基酸，如丙氨酸或甘氨酸，但其它氨基酸也適合，只要它們帶有電荷，而且大小幾乎不會干擾該蛋白質的結構，同時與GAG結合不相容，如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺。
因此，本發明的主要目的是提供含有上述突變組合，和可作為MCP蛋白拮抗劑的MCP蛋白質突變體。
術語“MCP蛋白的拮抗劑”指可作為相應的成熟性全長天然產生的(野生型)MCP蛋白質的拮抗劑的任何份子。本領域的技術人員知道MCP-1拮抗劑包含有(序列)修飾。
本申請的含義中，術語MCP蛋白質包括人MCP-1、人MCP-2、人MCP-3、人MCP-4和人Eotaxin(圖1B；此圖顯示了相應的SWISSPROT登錄號)，以及具有與人成熟的MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、或Eotaxin至少70％，優選80％和更優選90％同源性，并在所有上述位置中含有堿性陽電荷的氨基酸(精氨酸、賴氨酸或組氨酸)的任何其它蛋白質。
本發明的另一主題是選自以下的MCP蛋白質的拮抗劑a)上述MCP蛋白質突變體中有一個或多個加入、缺失或取代的氨基酸殘基而不干擾其拮抗活性的活性突變體；b)根據(a)所述多肽或肽的序列和/或結構所設計的肽模擬物；c)多肽或肽，其含有(a)或(b)所述氨基酸序列和屬于相應MCP蛋白質以外的某一蛋白質序列的氨基酸序列；d)上述(a)、(b)或(c)的活性組分、前體、鹽或衍生物。
上述MCP突變體的拮抗性質，在本專利申請中以MCP-1WT*2A為例作為MCP-1的拮抗劑，可以活性突變體(形式)保持或甚至加強。該分子的類型包括所述序列的天然或人造同類物，其中有一個或多個氨基酸殘基的加入、缺失或取代，只要它們用本領域已知的和下述實施例說明的方法測定時能顯示本發明特征性的同樣生物活性，水平相當或更高。
例如，可接受的取代應針對于不參與GAG結合的殘基，如實施例中所示，用異亮氨酸取代64位的甲硫氨酸(MCP-1WT*2A；SEQ ID NO3)可改進純化而不會改變人MCP-1的基本性能。本發明的另一目的因此是具有MCP-1WT*2A相應序列(SEQ ID NO3)的MCP-1拮抗劑。或者，除了取代針對參與GAG結合的該殘基外，MCP-1拮抗劑可如已知的MCP-1 N-端缺失突變體(Egashira K等，2000；Zhang Y and Rollins BJ，1995；McQuibban GA等，2002)那樣，短少2-10個N-端氨基酸，而可能獲得改進的拮抗性能。
天然同類物，指人或其它生物中認定的MCP蛋白質的相應序列，如小鼠MCP-1(SWISSPROT Acc.No P10148)。人造同類物，指用已知的化學合成和/或定點誘變技術或任何其他已知的合適技術制備的肽，它們提供了本領域普通技術人員可用本領域先前報導的和本專利申請實施例中提供的方法，能常規地獲得并測定的一組有限數量的基本上相對應的突變或截短的肽，或多肽。
根據本發明，這些活性突變中優選的變化是眾所周知的“保守性”或“安全性”取代，涉及非堿性殘基。保守性氨基酸取代是用具有充分相似化學性能的氨基酸的取代，以保存該分子的結構和生物功能。已知可在上述序列中進行氨基酸插入和缺失而不會改變它們的功能，特別是如果這種插入或缺失僅涉及少數氨基酸，如10個以下，優選3個以下，并且不去除或置換蛋白質或肽功能構象的關鍵性氨基酸。
文獻中提供了關于以天然蛋白質序列和/或結構的統計學和理化研究為基礎，進行保守性氨基酸取代選擇的許多模型(Rogov SI and Nekrasov AN，2001)。蛋白質設計實驗已證明，采用特異性的氨基酸亞組可產生可折迭的活性蛋白質，有助于蛋白質結構中可能更易容納的氨基酸“同義”取代的分類，該氨基酸“同義”取代可被用于檢測功能和結構同類物和共生同源物(Murphy LR等，2000)。同義氨基酸分組和更優選的同義組見表1。
基于這些技術進行取代而產生的活性突變體，以及消除或增加一個或多個氨基酸產生的活性突變體，均在本發明的目的之內，即新穎的MCP蛋白突變體與GAG結合能力差，對相應的MCP蛋白的拮抗活性與最初選出的突變體相當，或如可能甚至更好。
上述替代化合物，指包括上述MCP蛋白質突變體的序列有所改變但不影響本專利申請所述基本特征，特別是所關注的它的作為拮抗劑的活性能力。類似的化合物可得自常規誘變編碼DNA的技術，編碼DNA序列水平上的組合技術(如DNA改組、噬菌體展示/選擇)，或計算機輔助設計研究，然后如本領域先前所述和下述實施例所示進行所需活性的驗證。
可獲得上述MCP突變體的肽模擬物(也稱為模擬肽)形式的特異性拮抗劑，其中所述肽或多肽的性質已在氨基酸側鏈水平上、氨基酸手性和/或肽骨架水平上作了化學修飾。這些替代物目的是提供具有類似的或改進的治療、診斷和/或藥物學動力性能的MCP拮抗劑。
例如，當所述肽對肽酶的切割敏感時，將其注入患者可產生問題；用不可切割的肽模擬物代替特別敏感的肽鍵可提供更穩定因而治療上更有用的肽。與此相似，取代L-氨基酸殘基是賦予肽對蛋白酶水解不敏感的標準方法，最終的產物更類似于有機化合物而不是肽。其它有用的是氨基未端封閉基團，如叔丁氧基羰基、乙基、乙酰基、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、環庚基、己二酰基、壬二酰基、1-二甲胺基萘-5-磺酰基、芐氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基-壬二酰基、甲氧基己二酰基、甲氧基環庚基和2，4，-二硝基苯基。其它許多修飾可提供的效能提高，活性延長，純化容易和/或半衰期增長，這已為本領域所知(WO 02/10195；Villain M等，2001)。肽模擬物中所含的優選替代“同義性”氨基酸分組見表2中所述的那些。
合成和開發肽模擬物及非肽模擬物的技術是本領域熟知的(Sawyer TK，1997；Hruby VJ and Balse PM，2000；Golebiowski A等，2001)。采用體內和體外翻譯系統在蛋白質中摻入非天然氨基酸，以探索和/或改進蛋白質結構和功能的各種方法文獻中也有說明(Dougherty DA，2000)。文獻中報告的MCP-1拮抗性肽模擬物與MCP-1無高度同源性(Kaji M等，2001)。
本專利申請公開了具有MCP拮抗性的多肽或肽，其含有上述氨基酸序列，和屬于相應MCP蛋白質以外的某一蛋白質序列的氨基酸序列的多肽或肽。后一異源性序列應可提供額外的性能但不明顯損傷其拮抗活性，或提供GAG結合性能。這些額外的性能的例子是較易純化過程，在體液中半衰期持續更長，或可胞外定位。這后一特性對上述定義所包括的融合或嵌合性蛋白質的特異性基團是特別重要的，因為它能將作為本專利申請的MCP拮抗劑的分子，定位在不僅有利于這些肽的分離和純化，而且有利于MCP蛋白與它們的天然受體相互反應的部位。
可用于產生(c)中所述多肽或肽的其它蛋白質序列，是膜結合蛋白的胞外結構域、免疫球蛋白的恒定區、多聚化功能域、胞外蛋白質、含信號肽的蛋白質、含輸出信號的蛋白質。選擇一個或多個這些序列，與MCP蛋白的突變體融合，對所述制劑的具體應用也起著功能作用。作為一個通用方法，這些融合蛋白可用常規基因工程技術產生編碼它們的核酸區段，將其克隆入可復制性病毒載體或質粒中，采用游離體形式或非同源性/同源性整合載體，以及轉化、傳染或轉染為基礎的技術，用于修飾原核或真核宿主細胞。這些載體應能在它們自己的轉錄起始/終止調節序列(選擇它們是因其在所述細胞中有組成性活性或可誘導活性)控制下，在原核或真核宿主細胞中表達含有MCP拮抗劑的融合蛋白。然后可分離實質上富含此類細胞的細胞系來提供穩定的細胞系。
當該加入的蛋白質序列，如果是胞外蛋白質、含輸出信號的蛋白質或含信號肽的蛋白質的序列時，可使MCP拮抗劑分泌到胞外間隙中，因而更易從培養的細胞中收集和純化所述物質用于進一步加工，或者，可直接采用或給予所述細胞。
本發明的多肽或肽可采取其它替代形式，根據所希望的應用和/或生產方法優化，例如活性組分、前體、鹽、衍生物、偶聯物或復合物形式。
術語“活性”指應能保持本發明MCP突變體的功能特征，并為藥學上可接受和使用的那些替代化合物。
術語“組分”指所述化合物本身的多肽鏈的任一片段，單獨或與其結合的相關分子或殘基，例如糖殘基或磷酸基的聯合，或最初的多肽或肽的凝聚物。這類分子也可產生自通常不會改變一級序列的其它修飾，如體內或體外的肽化學衍生(乙酰化或羰基化)，通過在肽合成和加工過程中或進一步加工步驟中，修飾其磷酸化(導入磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基)或糖基化(使肽接觸能影響糖基化的酶，如哺乳動物糖基化酶或脫糖基化酶)模式。
“前體”是在給予細胞或機體前或后，通過代謝和酶加工可轉變成本發明化合物的化合物。
術語“鹽”本文指本發明的肽、多肽或其同類物的羧基鹽和氨基的酸加成鹽。可通過本領域已知的方法形成羧基鹽，包括無機鹽，如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽等，含有機堿的鹽是例如，含胺基如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等的那些鹽。酸加成鹽包括，例如，含無機酸如鹽酸或硫酸的鹽，含有機酸如乙酸或草酸的鹽。任何一種這類鹽應具有與本發明的肽或多肽或它們的同類物基本相似的活性。
術語“衍生物”本文用于指可按照已知方法從氨基酸組成的兩側鏈上的功能基團，或N-/C-末端基團制備的衍生物。這類衍生物包含有，例如酯或羧基的脂肪簇酰胺，和游離氨基的N-酰基衍生物，或游離羥基與酰基如醇酰基或芳酰基形成的O-酰基衍生物。
本發明MCP拮抗劑的有用的偶聯物或復合物可用本領域已知的分子和方法，與受體或其它蛋白質(放射活性標記或熒光標記、生物素)相互反應而產生，為改進其治療效果(細胞毒性劑)，或改進制劑的藥物輸送效果，可采用例如聚乙二醇和其它天然或或合成的聚合物(Pillai O and Panchagnula R，2001)。
本發明的化合物可用本領域熟知的方法制備，包括上述重組DNA相關技術，和化學合成技術。
本發明另一主題是含有編碼本發明MCP突變體DNA序列的DNA分子，它們含有基本上相同的核苷酸序列。“基本上相同的核苷酸序列”包括借助于遺傳密碼子的簡并性編碼上述給定氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本發明還包括含有上述DNA的表達載體、用此類載體轉化的宿主細胞，和通過在適當的培養基中培養所述轉化細胞并收集表達的蛋白質制備本發明MCP拮抗劑的方法。
可將編碼本發明蛋白質的DNA序列插入和連接入適當的質粒中。一旦形成表達載體，可將其導入適當的宿主細胞，表達該載體來產生所需的蛋白質。
采用適當的表達載體，上述本發明的任何重組蛋白質可在真核細胞(如酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核細胞中有效表達。可采用本領域已知的任何方法。
例如，可用本領域熟知技術，將上述任一方法獲得的編碼所述蛋白質的DNA分子插入到適當構成的表達載體中。用同聚物尾接或限制性連接將雙鏈cDNA連接于質粒載體，涉及采用合成的DNA接頭或平端連接技術利用DNA連接酶連接該DNA分子，并用堿性磷酸酶處理來避免不需要的連接。
為了能表達所需蛋白質，表達載體還應含有特定的核苷酸序列，此序列含有與編碼所需蛋白質DNA相連接的轉錄和翻譯調控信息，以此種方式可使基因表達和產生所述蛋白質。為了轉錄該基因，必須先由RNA聚合酶鑒定啟動子，RNA聚合酶結合啟動子后啟動轉錄過程。有各種各樣的此類啟動子可用，它們的工作效率不同(強和弱啟動子)。
對于真核細胞宿主，可采用不同的轉錄和翻譯調控序列，取決于該宿主的性質。它們可來源于病毒，如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等，其中調控信號與具有高表達水平的特定基因相連。例子是皰疹病毒的TK啟動子、SV40的早期啟動子、酵母菌的gal4基因啟動子等。可選擇轉錄啟動調控信號以便抑制和活化，從而調節該基因的表達。
將含有編碼本發明蛋白質的核酸序列的DNA分子插入已操作性連接于轉錄和翻譯調控信號，因而能將所需基因序列整合入宿主細胞的載體中。
也可通過導入能夠選擇含有表達載體的宿主細胞的一種或多種標志，以選擇受該導入的DNA穩定轉化的細胞。這類標志還可向營養缺陷性宿主提供光營養、抗微生物抗性，如抗生素或重金屬如銅等的抗性。可將該選擇性標志基因直接連接于待表達的DNA基因序列，或通過共轉染導入同一細胞中。
也可采用該載體的附加元件來獲得本發明蛋白質的最佳產量，特別是用于選擇含有質粒或病毒載體的特定細胞；借助該元件可易于識別含有該載體的受體細胞并從不含該載體的受體細胞中選出它們；在特定宿主中產生該載體所需的拷貝數；以及是否需要能使該質粒“穿梭”于不同種宿主細胞之間。
一旦制備好用于表達的含所述構建物的載體或DNA序列后，可用各種合適的方法轉化、轉染、偶聯、原生質融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等中的任一種，將該DNA構建物導入合適的宿主細胞中。
宿主細胞可以是原核或真核細胞。優選為真核宿主，例如哺乳動物細胞諸如人、猴、小鼠和中國侖鼠卵巢(CHO)細胞，因它們能向蛋白質分子提供翻譯后修飾，包括正確折迭或在正確位點糖基化。酵母菌也能進行翻譯后肽的修飾包括糖基化。已有許多利用強啟動子序列和高拷貝數質粒的重組DNA策略，可用于在酵母菌中生產所需蛋白質。酵母菌可識別克隆的哺乳動物基因產物上的前導序列，并分泌帶有前導序列的肽(即前肽)。
導入所述載體后，在選擇性培養基上培養宿主細胞，該培養基的選擇是能使含有載體的細胞生長。克隆基因序列的表達導致產生所需的蛋白質。
本發明的這些目的可通過將本專利申請所提供的的關于MCP蛋白質拮抗劑的內容，與常用的分子生物學技術知識相結合而實現。許多綜述(Makrides SC，1999)和書籍提供了怎樣采用載體和原核或真核宿主細胞來克隆和產生重組蛋白質的技術，如以下系列化書籍的一些題目“A Practical Approach”牛津大學出版社出版(“DNA Cloning2Expression Systems”，1995；“DNA Cloning 4MammalianSystems”，1996；“Protein Expression”，1999；“Protein Purification Techniques”，2001)。
化學合成技術的例子是固相合成和液相合成。當固相合成時，例如，將待合成的肽的C-末端相應氨基酸固定在一種有機溶劑不溶的支持物上，通過交替重復反應，將含氨基和受相應保護基團保護的側鏈功能基團的氨基酸，從C-末端一個接一個地縮合連接至N-末端，并使該肽結合于樹脂的氨基酸或氨基的保護基團釋放，以此種方式延伸肽鏈。固相合成方法主要分成tBoc法和Fmoc法，取決于所用的保護基團類型。通常采用的氨基保護基團包括tBoc(叔丁氧基羰基)，Cl-Z(2-氯芐氧羰基)，Br-Z(2-溴芐氧羰基)，Bzl(芐基)，Fmoc(9-芴基甲氧羰基)，Mbh(4，4’-二甲氧基二苯甲基)，Mtr(4-甲氧基2，3，6-三甲基苯磺酰基)，Trt(三苯甲基)，Tos(甲苯磺酰基)，Z(芐氧基羰基)和Cl2-Bzl(2，6-二氯芐基)；胍基保護基團為NO2(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯丙二氫吡喃-6-磺酰基)；羥基保護基團為tBu(叔丁基)。合成所需肽后，使其經歷脫保護反應從固相支持物上切下。這種肽切除反應對Boc法可用氟化氫或硫酸三氟甲烷進行，對Fmoc法用TFA進行。全合成性MCP蛋白質見文獻(BrownA等，1996)。
本發明的天然、合成或重組的MCP拮抗物的純化，可采用用于此目的的任何一種已知方法進行，即任何常規方法包括抽提、沉淀、層析、電泳等。可用于優先純化本發明蛋白質的另一種純化方法是親和層析法，該方法使用單克隆抗體或親和基團，其能結合靶蛋白并生產和固定在柱中所含凝膠基質上。使含有所述蛋白的不純制品通過此柱。所述蛋白質通過肝素或特異性抗體結合于該柱上，雜質則流穿而過。洗滌后，通過改變pH或離子強度從凝膠上洗脫所述蛋白質。或者，可采用HPLC(高效液相層析)。可采用常用于蛋白質純化的水乙腈溶劑進行洗脫。本發明包括本發明化合物的純化制品。本文所用的純化制品指含有本發明化合物干重至少1％，優選至少5％的制品。
本發明另一目的是將上述MCP拮抗劑用作藥物，特別是用作藥物組合物中的活性成分(與藥學上可接受的運載體、賦形劑、穩定劑或稀釋劑組合配制)，以治療或預防因MCP蛋白質不良活性致使表達其受體的白細胞過度遷移和激活所致的相關疾病，如自身免疫病和炎癥疾病及細菌和病毒感染。這些疾病的非限制性例子有以下關節炎、類風濕關節炎(RA)、牛皮癬關節炎、牛皮癬、骨關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、全身性硬化癥、硬皮病、多肌炎、腎小球腎炎、纖維化、肺纖維化、變態性或過敏性疾病、皮炎、IV型過敏也稱為遲發性過敏反應或DTH、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎癥性腸病(IBD)、Crohn’s病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化癥、敗血性休克、HIV感染、移植、移植物抗宿主疾病(GVHD)、子宮內膜移位癥、胰腺炎、甲狀腺炎、腦病。
回顧關于本主題的文獻，MCP蛋白質拮抗劑可作為藥物組合物的活性成分，用于治療或預防MCP蛋白不良活性相關的其它疾病，如血管疾病(冠脈介入手術后再狹窄、動脈硬化、動脈粥樣硬化、局部缺血、中風)或癌癥。
因此，本發明的另一主題是治療或預防上述疾病的方法，該方法包括給予有效量的本發明MCP蛋白拮抗劑。
所述藥物組合物除MCP拮抗劑外，可含適當的藥學上可接受的運載體、生物相容性運載體和適合給予動物的添加劑(如生理鹽水)，甚至可含有促進該活性化合物加工成為藥學上可用的制品的輔助劑(如賦形劑、穩定劑或稀釋劑)。這類組合物實際上可與具有協同作用的其它治療組合物合用，或與本發明MCP突變體以協同方式合用。例如，已證明CC-趨化因子拮抗劑與環胞菌素合用有類似的協同性能(WO 00/16796)。另外，可采用其它已知具有治療作用的組合物來治療特定的疾病(如IFN-β治療多發性硬化癥，可溶性腫瘤壞死因子(TNF)受體治療類風濕關節炎)。
可按符合給藥方式需要的可接受方法配制藥物組合物。例如，文獻中已報導了采用生物材料和其它聚合物遞送藥物，及不同的技術和方法驗證給藥的具體方式(Luo B and Prestwich GD，2001；Cleland JL等，2001)。
“有效量”指所述活性成分的給藥量足以影響疾病進程和嚴重程度，導致病理過程減輕或緩和。有效量取決于給藥途徑和病人狀況。
“藥學上可接受的”指包含不會干擾所述活性成分生物活性作用，并對給予的宿主無毒性的任何運載體。例如，腸胃道外給藥時，上述活性成分以單位劑量形式配制在運載體，如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液中，供注射用。
為建立所述活性成分理想的血液水平，本領域技術人員可利用并確定給藥的可接受方式。例如，可通過各種腸胃道外途徑給藥，如皮下、靜脈內、皮內、肌肉內、腹腔內、鼻內、透皮、直腸內、口服或口頰途徑。腸胃道外給藥可以是藥團注射或長時間逐步灌輸。非腸胃道給藥的制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液，可含有本領域已知的輔助劑或賦形劑，可按常規方法制備。此外，所述活性化合物的懸浮液可作為適當的油性注射懸液給予。合適的親脂性溶劑或運載體包括脂肪油類，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油。水性注射用懸浮液可含有能增加懸液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任選地，該懸浮液也可含穩定劑。藥物組合物包含適合注射給藥的溶液，含有約0.01-99％，宜含約20-75％的活性化合物和賦形劑。可以直腸給藥的組合物包括栓劑。
可理解，給藥劑量取決于接受者的年齡、姓別、健康狀況和體重、同時也取決于并行治療(如果有的話)、治療的頻率和所需效果的性質。劑量應視各個對象而定，這是該領域技術人員知道和可確定的。對于每一治療所需的總劑量可以是按分次劑量方式或以一次劑量方式給予。本發明的藥物組合物可單獨給藥或與其它針對該疾病或針對該病其它癥狀的治療劑聯合給藥。通常活性成分的每日劑量在每公斤體重0.01-100毫克。通常每天每公斤1-40毫克分成幾次給予或以緩釋形式給予，有效地獲得所需結果。再次或后續給藥的劑量可與初次或原先給予個體的劑量相同、較少或較高。
本發明通過參考具體實施例進行描述，但描述的內容包括本領域技術人員可執行的所有修飾和替代，這些均不超出本文權利要求所述的內容和目的。
現在本發明將通過以下實施例進行描述，這些實施例不以任何方式構成對本發明的限制。實施例將參考附圖進行以下說明。
具體實施例方式
實施例1非肝素結合MCP-1突變體MCP-1WT*2A的體外特征材料和方法MCP-1突變體MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的表達MCP-1突變體通過體外PCR誘變編碼人MCP-1(hMCP-1；圖1；SEQ ID NO1)，特別是成熟形式的人MCP-1的DNA序列而產生，其相應于該前體分子的24--99區段(SWISSPROT Acc No P135OO)。
首先產生編碼稱為MCP-1WT*的活性突變體MCP-1蛋白的質粒。其中在編碼人MCP-1序列的N-端(24-99)加上一個甲硫氨酸起始密碼子，一個內部甲硫氨酸(前體蛋白的87位氨基酸和成熟蛋白的64位氨基酸)用異亮氨酸替代。當該質粒用于在大腸桿菌中表達時，此種替代可避免形成含甲硫氨酸亞砜的不良MCP-1種類，而不影響MCP-1的典型性能(Paavola CD等，1998)。將得到的序列，稱為MCP-1WT*，通過采用以pET3質粒為基礎的質粒克隆入大腸桿菌中并在其中表達(Paavola CD等，1998)，產生含77個殘基的蛋白質(圖1A；SEQ ID NO2)。
然而該表達MPC-1WT*的質粒進一步由一PCR片段的克隆所誘變，所述PCR片段編碼在人MCP前體中41和42位(在成熟蛋白的18和19位)上取代精氨酸和賴氨酸的2個丙氨酸，此種誘變產生與MCP-1WT*有相同長度和純化性能的MCP-1突變體MCP-1WT*2A(圖1，SEQ ID NO.3)。
獲得的所有構建物用標準分子生物學技術控制(PCR誘變和擴增、DNA測序、限制性酶消化)，克隆過程維持在大腸桿菌DH5α菌株中進行。選擇的編碼序列具有可用于在大腸桿菌中表達的最適密碼子(Kane JF，1995)。
將編碼MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的pTE3質粒轉移到大腸桿菌BL21(pLYs)衍生菌株TAP302中，所得菌株用于上述MCP-1突變體的重組表達(Paavola CD等，1998)。此方案包括采用氨基肽酶去除N-端甲硫氨酸，如此獲得的重組MCP-1突變體具有與天然成熟形式相同的長度(76個氨基酸；圖1B)。通過質譜驗證此重組蛋白的同一性。
MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的層析法試驗將MCP-1WT*和MCP-1WT*2A加載到肝素Sepharose柱上或SP Sepharose陽離子交換柱上。兩柱均用10mM磷酸鉀(PH7.5)平衡，用同一緩沖液配的0到1MNaCl以線性梯度洗脫該蛋白質。
MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的肝素結合試驗將包括0.02-30μM范圍的MCP-1WT*突變體以磷酸緩沖鹽水(PBS)配成系列稀釋液，與170nM的[3H]-肝素37℃培育1小時。將每份樣品20微升一式三份轉移到配有硝酸纖維濾膜的96孔P81 Unifilter板(Whatman Inc)中。用200微升PBS，真空泵洗滌該板三次去除未結合的標記肝素。各孔加入閃爍液(50微升)，在β計數儀上計數放射活性(每孔一分鐘)。用Prism程序分析數據(GraphPad Software)。
平衡競爭受體結合試驗此試驗在穩定表達MCP-1受體(CCR2)的中國倉鼠卵巢細胞的膜上進行，采用閃爍親近測定法(SPA)，以[125I]-MCP-1作為示蹤劑。按[125I]供應商(Amersham)說明書，從重組的成熟MCP-1產生放射標記的趨化因子(比活性2200mCi/mole)。用結合緩沖液(50mM HEPES pH7.2，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.15M NaCl0.5％BSA)配制未標記MCP-1突變體的系列稀釋液(范圍10-6～10-12M)制備競爭劑。
在PBS中重懸麥胚SPA珠(Amersham)至50mg/ml，以結合緩沖液稀釋至10mg/ml，此試驗的最終濃度為0.25mg/孔。將表達CCR2的細胞膜-80℃保存，以結合緩沖液稀釋至80μg/ml。最終的膜濃度為2μg/孔，[125I]-MCP-1為0.1nM。室溫震搖培育此板4小時。在β計數儀上計數放射活性(每孔一分鐘)。用Grafit程序分析一式三份樣品(Erithacus Software)。
結果文獻顯示測定MCP-1的肝素/GAG結合性能有不同方法(Hoogewerf AJ等，1997；Kuschert G等，1999；Ali S等，2001；Patel D等，2001；Chakravarty L等，1998)。
在大腸桿菌中表達兩種MCP-1突變體，其序列基于成熟形式的人MCP-1(圖1)。第一種為MCP-1WT*，對應于成熟的人MCP-1前體，具有已知能消除甲硫氨酸氧化可能性而不會干擾MCP-1經典的結合性能和活性的突變(Paavola CD等，1998)。第二種突變體為MCP-1WT*2A，基于此“活性”突變體的序列表達，其中N-端雙堿性氨基酸位點已用丙氨酸殘基取代。
先通過肝素層析測定了后一取代對MCP-1性能的影響。加載在此層析柱上后，此二突變體的洗脫圖形顯著不同，這是因為洗脫MCP-1WT*所需的NaCl濃度為0.54M NaCl，而MCP-1 WT*2A使用的洗脫液為0.24M NaCl。在SP Sepharose柱上利用陽離子交換層析測得的差異較小(0.55M NaCl對0.27M NaCl)。
該層析介質上的洗脫圖形比較，提供了因堿性氨基酸的非特異性靜電作用對肝素結合性能的貢獻的定量指標(ProudfootA等，2001)。陽離子交換層析獲得的NaCl濃度之差，是減去從肝素層析獲得的濃度而得到的。按照此方法，當所得數字為正時(此例為0.02M)，可得到的結論是鑒定到的與肝素的特異性相互反應與MCP-1WT*2A中的雙堿性氨基酸位點突變相關。
然后用氚化肝素和表達MCP-1突變體的大腸桿菌系列稀釋液，直接測定與肝素的結合(圖2)。將該稀釋液加到硝酸纖維濾膜上分離得到蛋白質-肝素復合物。硝酸纖維支持物能有效保留蛋白質，因而能評價結合于該蛋白質的放射標記的肝素量。此方法證實與MCP-1WT*相比，MCP-1WT*2A的肝素結合性能顯著降低。
最后，進行平衡競爭受體結合試驗以證明MCP-1WT*2A的肝素結合性能降低對特異性受體CCR2結合的影響(圖3)。將含有放射標記的MCP-1樣品與兩種突變體之一或MCP-1的系列稀釋液混合，與由穩定表達CCR2的CHO細胞制備的膜一起培育。雖然MCP-1WT*和MCP-1蛋白顯示了幾乎相同的結合圖形，但MCP-1WT*2A突變體顯示對CCR2的親和力降低20倍，因為它的IC50為1.73±0.6nM，相比較其它兩種測試蛋白為0.08±0.045nM，顯示該肝素結合缺陷性MCP-1突變體維持了高親和力。
實施例2非肝素結合性MCP-1突變體在細胞募集模型中的特征分析材料和方法趨化作用試驗此試驗在配有5μm孔徑膜(Neuroprobe)的24孔transwell趨化小室(Costar)中用人前單核細胞系(THP-1)進行。重組MCP-1蛋白質用600微升含5％滅活胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和25mM HEPES(Ph7.2)的RPMI培養液進行系列稀釋(范圍10-6-10-12M)，這些樣品放在孔下部，而將TPH-1細胞(以同一培養液配成10×106細胞/ml的細胞懸液100微升)置于插片中。在5％CO2下37℃培育小室3小時。然后取出樣品轉移到1.5ml試管，200g離心5分鐘。將沉淀細胞重懸于100ml PBS中并用Coulter計數儀(Beckman)計數。用Prism程序分析數據(GraphPad Software)。
腹膜細胞募集試驗給8-12周齡雌性BALB/c小鼠腹膜內注射10微克/0.2ml用無菌無脂多糖的PBS稀釋的重組MCP-1WT*或MCP-1WT*2A蛋白質以誘導細胞募集。當測定MCP-1WT*2A的拮抗性能時，在給予激動劑(MCP-1WT*)前30分鐘，給予用0.2ml相同無菌液稀釋的所示量的該蛋白質。給予激動劑后16小時吸入CO2處死小鼠，用5毫升PBS進行腹腔灌洗三次。合并灌洗液，600g離心10分鐘，重懸沉淀細胞至最終體積1ml，用血球計數儀計數誘引出的白細胞總數。
結果已采用細胞募集試驗對與MCP-1相關的不同的蛋白質的性能作特征鑒定(Ajuebor MN等，1998；Reckless J and Grainger DJ，1999；Kaji M等，2001)。
在人單核細胞(THP-1細胞系)趨化試驗中，MCP-1WT*2A獲得的結果與實施例1所述受體-結合試驗獲得的結果極其相符。MCP-1WT*2A能誘導THP-1趨化的強應答(超過基線6倍)，雖然最大活性見于10nM，而與之相比，1nM野生型蛋白誘導了超過基線9倍的增加(圖4)。
也用腹膜細胞募集試驗評價了作為MCP-1拮抗劑或激動劑的MCP-1WT*2A的活性(圖5)。當給予MCP-1WT*和MCP-1WT*2A時，該肝素結合缺陷性突變體在MCP-1WT*能引起大量募集的劑量(10μg/小鼠)時，不能誘導細胞募集到腹腔中。另外，如果在給予MCP-1WT*前30分鐘給予MCP-1WT*2A，MCP-1WT*誘導的細胞募集以劑量依賴方式受到顯著拮抗。因此，廢除MCP-1中的GAG結合位點可產生能在體內抑制MCP-1誘導的細胞募集的MCP-1拮抗劑。
實施例3；非肝素結合性MCP-1突變體在動物模型中的特征鑒定材料和方法遲發性接觸過敏模型如前人所述進行了小鼠耳腫脹試驗以測定接觸性過敏反應(Garrigue JL等，1994)。簡言之，在小鼠剃毛的腹部皮膚局部施加25微升丙酮/橄欖油(4∶1)中含有0.5％的2，4-二硝基氟苯(DNFB；Sigma Chemical Co)的溶液到使其預致敏。五天后在右耳施加20微升用同一載體配的0.2％DNFB，左耳只施加該載體。從第5天到第9天每日腹腔給予0.5mg/kg(10μg/小鼠)的MCP-1WT*治療小鼠，或對照組只給PBS。在DNFB攻擊前1小時給予第一次治療。用可調厚度儀(MitutoyoCorp)測量耳朵的厚度，從攻擊后的值減去攻擊前值，再減去單用載體攻擊的對側耳朵測得的腫脹值，估計耳朵腫脹。
博來霉素誘導的肺纖維化模型第0天氣管內給予C57BL/6雌性小鼠博來霉素(3.75U/kg，在25微升PBS中)。吸入博來霉素1小時后，測試動物腹腔內給予0.2ml PBS中的0.25mg/kg的MCP-1WT*2A；或只給予0.2ml PBS。每日給予這種治療，持續10天。每日記錄體重減輕情況和死亡百分數。第10天所有小鼠用CO2窒息處死，將4個肺葉置于-80℃測定羥脯氨酸水平，作為膠原沉積的指標，并加工1個肺葉作肺纖維化的組織學測定。通過分析羥脯氨酸確定肺膠原總水平。簡言之，用組織撕裂器和Tris-HCl(pH7.6)將肺葉做成勻槳，然后與琥石樹脂115℃培育過夜。將檸檬酸/醋酸緩沖液、異丙醇、氯胺-T和DAB溶液加入樣品中，60℃放置30分鐘。樣品冷卻至室溫，保持10分鐘，在分光光度計上讀取560nm的值。還將右肺葉固定在10％福爾馬林中，然后石蠟包埋、切片和用Masson’s三色溶液染色，以組織學方法測定肺纖維化。在光顯微鏡下測定組織學變化。采用半定量評分法，計算纖維化面積百分率，進行博來霉素誘導的肺炎癥和纖維化的形態學評價。
實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型第0天注射0.2ml含MOG35-55肽(200μg)和結核分枝桿菌(500μg)的弗氏完全佐劑(CFA；Difco Lab)乳液，左腹側皮下免疫雌性小鼠(8周齡；C57BL/6NCrIBR品系；體重18-22克)。立即腹腔內給予百日咳毒素(400微升含0.5MNaCl，15mM Tris(pH7.5)，0.017％ Triton X-100的緩沖液中含500納克毒素)。第二天給動物第二次腹腔內注射含百日咳毒素的相同溶液。第7天小鼠右側腹部皮下注射給予第二劑含MOG35-55肽(200μg)的CFA。此程序導致在大約第18-20天時發病，呈現進行性麻痹，從尾部開始進行性上升到前肢。
實驗第7天(大約在通常發生疾病前的1-3天)開始每只動物的治療持續連續21天。從第7天開始，通過臨床評分檢查各個小鼠是否存在麻痹，評分如下0＝無疾病癥狀0.5＝尾部分麻痹1＝尾麻痹1.5＝尾麻痹+單側后肢部分麻痹2＝尾麻痹+后肢力弱或后肢部分麻痹2.5＝尾麻痹+后肢部分麻痹(骨盆以下)3＝尾麻痹+后肢完全麻痹3.5＝尾麻痹+后肢完全麻痹+失禁4＝尾麻痹+后肢麻痹+前肢力弱或部分麻痹5＝垂死或死亡如下所示用三組動物，每組10只進行實驗。組1用PBS治療作為陽性對照。組2每日用腹腔注射0.05mg/kg的MCP-1WT*2A治療。組3每日用腹腔注射0.5mg/kg的MCP-1WT*2A治療。將MCP-1WT*2A突變體蛋白溶于無菌水中，然后以無菌PBS稀釋(200微升/小鼠)獲得所需濃度。
膠原誘導的關節炎(CIA)模型第0天在雄性小鼠(8-12周齡；DBA/1品系；18-22克體重)的尾根部皮內注射0.2ml含牛II型膠原(100微克；Morwell Diagnostics)和結核分枝桿菌(400μg)的弗氏完全佐劑(CFA；Difco Lab)乳液使其免疫。
大約從第16-20天開始出現炎癥癥狀，影響一個或多個肢體。根據觀察到的前爪和后爪的指(趾)存在的炎癥作臨床評分，給動物疾病的嚴重程度分等級如下0＝無疾病癥狀0.5＝1-5個指/趾有炎癥癥狀1＝6-10個指/趾有炎癥癥狀1.5＝11-15個指/趾有炎癥癥狀2＝16-20個指/趾有炎癥癥狀臨床總評分＞0.5的二組(n＝10小鼠)每日治療連續7天，腹腔注射PBS(對照組)或0.05mg/kg的MCP-1WT*2A。末次治療后24小時處死所有動物。
卵白蛋白誘導的肺炎癥(OVA)模型研究使用雌性小鼠(8-10周齡；Balb/c品系)。腹腔內注射在總體積200微升中以2毫克2％氫氧化鋁(Serva)沉淀的10微克卵白蛋白(Sigma)致敏小鼠。在725微升無LPS的0.9％NaCl中混合25微升卵白蛋白(2mg/ml)、250微升氫氧化鋁，4℃沉淀3-4小時，制備氫氧化鋁2％/卵白蛋白溶液。致敏后15天，治療和攻擊小鼠，每組6只，分組如下組1用無LPS的0.9％NaCl攻擊并用PBS治療(基線)組2用卵白蛋白攻擊并用PBS治療(陰性對照)組3用卵白蛋白攻擊并用0.5mg/kg的MCP-1WT*2A治療在連續5天每次攻擊前30分鐘腹腔內注射(200微升)給予PBS或MCP-1WT*2A。在用異氟烷吸入麻醉下，用卵白蛋白(15微克沉淀的卵白蛋白重懸在50微升無LPS的0.9％NaCl中)鼻內攻擊小鼠。攻擊后72小時，致死性腹腔注射300微升以0.9％NaCl配的14％烏拉坦(v∶v)處死小鼠。修剪除去氣管的結締組織，制造一小切口，將直徑75mm的導管插入氣管中。用一縫線栓住導管使其附著于1毫升針筒。原位用0.4ml PBS充滿肺。輕輕按摩脫落細胞，抽出肺中的液體，收集到置于冰上的塑料試管中。重復此過程4次，將每只動物收集的細胞懸液在冰上合并得到最終體積約1.4ml。用血細胞計數器對2倍倍比稀釋的細胞懸液臺盼蘭染色計數細胞。
結果在許多文章中，特別是采用轉基因小鼠的文章中，已特征分析了MCP-1的體內特性(Lu B等，1998；Rutledge BJ等，1995)。采用人類炎癥和疾病的動物模型測定MCP-1WT*2A，證實了用腹腔細胞募集模型獲得的此MCP-1肝素結合缺陷性突變體的拮抗活性。
遲發性接觸過敏反應是一種動物模型，其中T細胞介導的半抗原-特異性皮膚炎癥可用耳朵腫脹試驗測定。已在能組成性產生高水平血清MCP-1的轉基因小鼠中顯示了增強的接觸性過敏反應(Mizumoto N等，2001)。采用接觸致敏劑2，4-二硝基氟苯(DNFB)作半抗原攻擊正常小鼠的耳朵皮膚。整個治療期限間，當與只用運載體治療的小鼠所觀察到的效果相比，腹腔給予MCP-1WT*2A(在用DNFB攻擊時開始治療)治療的小鼠耳朵持續腫脹顯著較低(圖6)。
在肺部炎癥/纖維化模型中測定了MCP-1WT*2A的性能，因為已知MCP-1在肺或皮膚炎癥過程中誘導了前膠原的沉積(Hogaboam CM等，1999)。
小鼠氣管內灌注博來霉素后分別在7-10天導致肺炎癥和纖維化、膠原在肺中顯著積累及體重快速下降(Chen ES等，2001)。記錄小鼠腹腔給予MCP-1WT*2A或只給予PBS治療1小時后再接觸博來霉素后整10天中的體重，進一步與不用博來霉素處理的對照組比較。如清楚顯示的那樣，從第二天起，PBS治療的對照小鼠與MCP-1WT*2A治療小鼠相比，體重損失量高得多(圖7)。第10天用二種不同方法處死小鼠后評價了肺纖維化和炎癥。已知博來霉素能提高肺羥脯氨酸的合成(此合成與膠原合成和纖維化成比例)(Madtes DK等，1999)。只用PBS治療小鼠測到的羥脯氨酸水平顯著高于接受腹腔注射MCP-1WT*2A的小鼠組測到的水平。確實，后一組的水平相當于非博來霉素處理小鼠。另一半定量組織學評估證實，MCP-1WT*2A治療組與對照組相比纖維化總水平顯著降低(圖8)。
抗MCP-1抗體和缺乏功能性MCP-1基因的轉基因小鼠證明，MCP-1對例如與單純皰疹病毒誘導的腦脊髓炎(HSM)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、多發性硬皮病動物模型中相關的中樞神經系統的巨噬細胞募集和炎癥起著關鍵作用(Nakajima H等，2001；Huang DR等；2001)。給予MCP-1WT*2A后，兩種測試劑量都顯著提高了EAE動物模型的臨床評分(圖9)。
如上所述，MCP-1具有很強的纖維化作用。在膠原誘導關節炎(CIA)模型中測定了MCP-1WT*2A拮抗此MCP-1活性的能力。此時MCP-1WT*2A也顯著改進了治療小鼠的臨床評分(圖10)。
由于肺中不同白細胞亞組的積累和激活而產生了哮喘特征性的肺過敏性炎癥和支氣管過敏反應(BHR)。用抗體阻斷MCP-1，顯著減輕了BHR和炎癥(GonzaloJA等，1998)。在卵白蛋白誘導的肺炎癥(OVA)模型中，就減少細胞募集而言，MCP-1WT*2A獲得了顯著的改進(圖11)。
鑒于本發明實施例中的雙堿性氨基酸位點的突變，加上已知參與MCP-1和GAG結合的其它殘基，如組氨酸66和賴氨酸58(Chakravarty L等，1999)，在所有MCP中都是保守的(圖1B)，可根據本專利申請的發現設計出具有拮抗活性的其它MCP突變體。
具體說，MCP拮抗劑可以是人成熟的MCP-1(SEQ ID NO4)、MCP-2(SEQID NO5)、MCP-3(SEQ ID NO6)、MCP-4(SEQ ID NO；7)或Eotaxin(SEQID NO8)的位點18和19、18和58(或66)、19和58(或66)的雙突變體，以及位點18、19和58(或66；此序號對應于人成熟的MCP-1的序號)的三突變體。除位點18和19外其它可突變的殘基是經鑒定在所有人MCP蛋白質中高度保守的其它堿性殘基(殘基24、44、49、75；圖1B)。
這些替代分子的性能可用上述任一方法及本領域已知的其它驗證方法測定。許多其它有用的趨化因子相關技術(重組表達、體外試驗、轉基因動物)可見文獻綜述(“Chemokine Protocols”，Methods in Molecular Biology vol.138，HumanaPress，2000；”Chemokine Receptors”，Methods in Enzymology vol.288，AcademicPress，1997)。
表1

表2

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序列表<110>應用研究系統ARS控股(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)<120>MCP蛋白質的新型拮抗劑<130>WO512<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>99<212>PRT<213>智人<400>1Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr1 5 10 15Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val20 25 30Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu35 40 45Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val50 55 60Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln65 70 75 80
Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr85 90 95Pro Lys Thr<210>2<211>77<212>PRT<213>合成性構建物<400>2Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe1 5 10 15Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile20 25 30Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val35 40 45Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser50 55 60Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>3<211>77<212>PRT<213>合成性構建物<400>3
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe1 5 10 15Thr Asn Ala Ala Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile20 25 30Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val35 40 45Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser50 55 60Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>4<211>76<212>PRT<213>智人<400>4Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>5<211>76<212>PRT<213>智人<400>5Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr20 25 30Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly35 40 45Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met50 55 60Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70 75<210>6<211>76<212>PRT<213>智人<400>6
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75<210>7<211>75<212>PRT<213>智人<400>7Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser1 5 10 15Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr20 25 30Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys35 40 45Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys50 55 60
His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu Lys Thr65 70 75<210>8<211>74<212>PRT<213>智人<400>8Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Glu35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70
權利要求
1.由MCP蛋白的突變體組成的MCP蛋白質的拮抗劑，其特征在于，其中人類成熟的MCP-1序列中以下編號的殘基組合被替代為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺a)18和19；b)18和/或19，加上58；c)18和/或19，加上66；d)18和/或19，加上58和66；e)18和/或19，加上以下24、44、49、75的一個或多個。
2.如權利要求1所述的拮抗劑，其中殘基18和19被丙氨酸所替代。
3.如權利要求1或2所述的拮抗劑，其中MCP蛋白是人MCP-1、人MCP-2、人MCP-3、人MCP-4或人Eotaxin。
4.如權利要求1或2所述的拮抗劑，其中MCP蛋白是與人類成熟MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4或Eotaxin具有至少70％同源性的蛋白質。
5.MCP蛋白質拮抗劑選自a)如權利要求1至5所述MCP蛋白質拮抗劑的活性突變體，其中已加入、缺失、或替代了一個或多個氨基酸殘基而不干擾其拮抗活性；b)根據(a)所述多肽或肽的序列和/或結構設計的肽模擬物；c)多肽或肽，其含有(a)或(b)所述氨基酸序列和屬于相應MCP蛋白質以外的某一蛋白質序列序列的氨基酸序列；d)上述(a)、(b)、或(c)的活性組分、前體、鹽或衍生物。
6.如權利要求5所述的MCP拮抗劑，其中(a)所述的多肽或肽具有SEQ IDNO3相應的序列。
7.如權利要求5所述的MCP拮抗劑，其中(c)所述的多肽或肽含有屬于一個或多個以下這些蛋白質序列膜結合蛋白質的胞外結構域，免疫球蛋白恒定區，多聚體結構域，胞外蛋白質，含信號肽的蛋白質，含輸出信號的蛋白質，的氨基酸序列。
8.如權利要求5或7所述的MCP拮抗劑，其中所述的拮抗劑是與選自放射活性標記、生物素、熒光標記、細胞毒性劑、藥物輸送劑的分子相偶聯或復合的活性形式。
9.含有編碼如權利要求1至7所述MCP拮抗劑的DNA序列的DNA分子，其特征在于，該DNA分子包含基本上相同的核苷酸序列。
10.含有如權利要求9所述DNA分子的表達載體。
11.用權利要求10所述載體轉化的宿主細胞。
12.如權利要1至8所述的MCP拮抗劑的制備方法，該方法包括培養權利要求11所述的轉化細胞并收集表達的蛋白質。
13.如權利要求1至8所述MCP拮抗劑的純化制品。
14.所述MCP拮抗劑作為藥物的用途。
15.如權利要求1至8所述MCP拮抗劑用作治療或預防白細胞過度遷移和活化相關疾病的藥物組合物中活性成分的用途。
16.如權利要求15所述的用途，其中所述疾病是炎癥性疾病、自身免疫性疾病或感染。
17.如權利要求1至8所述MCP拮抗劑用作治療或預防血管性疾病或癌癥的藥物組合物中活性成分的用途。
18.含有如權利要求1至8所述MCP拮抗劑作為活性成分的藥物組合物。
19.白細胞過度遷移和活化相關疾病的治療或預防方法，其特征在于，該方法包括給予有效量的權利要求1至8所述的MCP拮抗劑。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述疾病是炎癥性疾病、自身免疫性疾病或感染。
21.血管性疾病或癌癥的治療或預防方法，其特征在于，該方法包括給予有效量的權利要求1至8所述的MCP拮抗劑。
全文摘要
通過在MGP蛋白質N－末端進行非保守性取代消除其GAG結合位點制造MCP突變，可獲得MCP蛋白，特別是MCP－1蛋白質的新型拮抗劑。本發明制備的化合物可用于治療或預防MCP蛋白不良活性相關疾病，如炎癥疾病、自身免疫性疾病、血管性疾病和癌癥。
文檔編號A61K38/19GK1665839SQ03813007
公開日2005年9月7日 申請日期2003年4月9日 優先權日2002年4月10日
發明者A·普羅德富特, M·科斯科-維爾博伊斯, T·亨德爾 申請人:應用研究系統Ars股份公司