專利名稱：用于結構易變的試劑的無副作用微囊包封技術及水相-水相乳劑的應用的制作方法
技術領域：
該發明揭示了一套制備新型玻璃體顆粒體系的獨特方法。這樣一個 顆粒體系能夠有效地在制備、儲存以及應用過程中保存蛋白質、多肽、 DNA、脂質體和病毒顆粒等的結構和活性。
背景技術：
由于吸收性能差、體內半衰期短，大部分的蛋白質藥物需要通過頻 繁的注射給藥。為了降低這種注射的頻率，1970年代以來[l],這類藥物 的緩釋劑型的研發吸引了本領域科學家的大量關注，至今仍是尚在攻關 的課題。然而，大量的科研投入并沒有取得預期的結果[2]。到目前為止， 只產生了一個緩釋蛋白藥物劑型一重組的人類生長激素(而且還由于一 系列技術問題與2004年6月被生產廠家撤出了市場)。技術久攻不破主 要的障礙在于蛋白質在制劑過程和體內釋放過程中的穩定性問題[3， 4]以 及體內的突釋和不完全釋放。
在過去的幾十年里，文獻中見到過各種關于提高蛋白質在微囊包過 程中的穩定性的方法的報道[3， 5， 6]。但是，這些方法只能解決一個或 一部分問題，而對于其他問題不能兼顧，甚至引發出新的問題。也有些 方法只適用于特定的一種蛋白質。還有一些報導也由于研究者自身所關注的研究領域不同而顯得互相矛盾。舉個例子說明，對于市場上唯一同
類產品--緩釋重組人類成長激素(rhGH)來說，其穩定性是靠和鋅形成 絡合物來實現的[7]。而與鋅形成絡合物是rhGH在體內的自然形態[8]。 當這種鋅絡合制備方法用于另一種蛋白，如促紅細胞生成素(EPO)，蛋 白分子發生聚集的比率可以高達40%[9],引起導致免疫原性的顧慮。為 避免蛋白在微囊包過程中因解除有機溶劑而變性失活，科學家預先將蛋 白分子與糖類、無機鹽或者其他保護劑制為固體顆粒狀，從而采取一種 固體分散在油相，再進一步分散在水相(即油包固體一水包油，S-O-W) 的方法微囊包蛋白藥物[7， 9， 10]。這些蛋白穩定化輔料常常由于其高溶 解度而產生強滲透壓，引起突釋[ll， 12]。比如，當溶解度高的硫酸鹽用 于提高EPO在微囊包過程中的素穩定性時，突釋高達總劑量的55%[9]。
Cleland和Jones研究了在W-O-W 〔油包水-水包油)和S-O-W微囊 化過程中各種輔料對重組人類生長激素和干擾素的保護作用，發現甘露 醇和海藻糖能夠在防止蛋白在微膠囊過程中聚集這個方面起到最好的作 用[6]。 Sanchez核查了類似的賦形劑對于另一種蛋白—破傷風類酶素的保 護作用，結果發現在Cldand和Jones的報告中被認定為對復原重組人類 生長激素和干擾素不起有效作用的葡聚糖能在水合條件下的釋放階段對 蛋白質起到最好保護功能[IO]。這樣的實驗似乎說明了單糖在干燥過程中 對蛋白能起到更好的保護作用，而多糖則在釋放階段起到更好效果[13]。 不過，Sanchez的葡聚糖-PLGA復合微球緩釋劑型的釋放曲線顯示60% 的載藥量發生了突釋。這種突釋放也許是由于直接凍干法制備的蛋白-輔 料顆粒尺寸過大引起的[14， 15]。
在S-O-W過程中，預制備的蛋白顆粒的大小十分重要。Morita發現 當固體蛋白質顆粒的直徑從5微米增大到20微米時，不僅初期的釋放速 率翻倍，其微囊包封率從80%下降到20%[15]。 Cleland討論了在S-O-W 過程前縮小蛋白質微粒體積大小的方法[6]。進一步粉碎蛋白質凍干粉不 能得到直徑小于10微米的微粒，而把這些粉末研磨成更小的尺寸的方法 卻受阻于研磨熱引起的蛋白質性變。噴霧干燥法或許可以提供足夠小的 蛋白顆粒，但是噴嘴附近的高剪切力和液體與空氣間的界面張力會使蛋 白變性[6， 16]。更不妙的是，噴霧干燥或噴霧式冷凍干燥中須使用表面
活性劑，而表面活性劑又促成了蛋白質在下一步制劑程序中與溶劑互相
作用[6]。 Maa等報道了在噴霧干燥之前預先將重組人類生長激素和鋅絡 合的方法防止蛋白質成分的聚集[16]。不過鋅絡合會導致生長激素以外的 蛋白性變[9]。 Motita等用PEG沉淀蛋白質的方法制備了蛋白超微顆粒 [15， 17]。但是，在微囊包過程中這些微粒還是直接處于有機溶劑的作用 下。由于蛋白質對于聚合物基質的內部表面的吸附作用，未受任何保護 的蛋白質和PLGA的直接接觸會引起不完全的釋放[18]。為了避免親水-疏水分界面，科學家曾用親水性雙相體系制備多糖微粒[19， 20]。然而， 在乳化階段必須靠共價或離子同步交聯作用來固化顆粒，從而使蛋白質 暴露在活性反應物中。
結構脆弱的蛋白大分子藥物的緩釋劑型的開發需要一個能夠全面解 決上述所有問題的技術方案。這一方案至今沒有誕生的事實說明對于一 系列技術難題，常規的方法已經無能為力。我們需要新的關于蛋白微囊 化的概念技術。
在與本專利申請相關的前一項專利申請中，我們已經提出了一套獨
特的微囊包方法運用穩定的高分子水相-水相乳劑(這一在我們之前尚 未見到報道的體系)。這一乳液體系和傳統乳劑不同，其分散相和連續相 均為水相。這一體系也不同于所謂的親水兩相體系(aqueous two-phase system)。后者只要停止攪拌會立即形成兩個連續相(two block phases)。 而這一新型乳液體系則可不需化學交聯固化(離子作用或共價作用)、在 不發生分散相溶合的前提下存在至少一周以上。鑒于這些獨特性，蛋白 質、脂質體、病毒顆粒等穩定性差的治療物質可以避免有機溶劑、濃縮 鹽、極端PH值、交聯劑、強剪切力、高溫和高界面張力等因素影響，而 被包封到這種乳劑微滴當中。通過冷凍干燥或者其他干燥方法處理之后， 乳劑的分散相形成粒徑分布均一的、緊密的玻璃體微粒，(可用于蛋白藥 物吸入或者緩釋輸送)。我們先前的工作從概念上證實了這一基于穩定的 水相-水相乳液的蛋白質微囊化方案可以全面系統地解決制劑、存放和藥 物釋放過程中的一系列穩定性問題[3]。此外，制劑過程中所使用的輔料 都是人體可以注射的。
此次申請進一步證明了穩定的高分子水相-水相乳液用于蛋白藥物輸
送技術的有效性。蛋白藥物通過在水相-水相乳液分散相和連續相分配平 衡而被包封于分散相中，通過緩慢冷凍干燥形成緊密的玻璃體微粒，整 個制劑工藝過程避免了任何物理、化學因素帶來的損失，蛋白分子一經 制成緊密的玻璃體微粒，便具有了超穩定性，即使在有機溶劑、生理條 件下仍舊可以長期保持固有的生物活性，進而用生物可降解高分子進行 微囊包，釋放過程中沒有突釋及不完全釋放。載于多糖玻璃體微粒(擬
命名為AqueSphere)的蛋白質顯示了對于有機溶劑的耐受力和在37攝氏 度的水合條件下的持續的活性。
發明內容
本發明的目標之一是提供一種蛋白質藥物微球的制備方法。這個方 法是我們在前一項專利申請中描述過的穩定的高分子水相-水相乳液以及 "AqueSphere"(通過水相-水相乳化制備的多糖玻璃體微球)的運用 [24]。這個新的方法包括1)把蛋白質載進穩定的水相-水相乳液的分散 相中；2)將載有蛋白分子的乳液分散相制備成直徑在1-5微米之間的 AqueSphere (這一粒徑剛好是吸入劑的最佳尺寸)；3)把AqueSphere微 囊包在可用于緩釋注射的PLGA或其他可降解聚合物微球中；4)將蛋白 以外的其他敏感的治療試劑(如脂質體或活病毒等)擔載于AqueSphere 中，用于吸入給藥療法。
蛋白大分子藥物緩釋劑型或非注射劑型研發中的一個主要難點是蛋 白大分子在制劑過程中變形失活。為防止這樣的性變，制劑過程中應使 蛋白藥物避免接觸(或在有保護的條件下接觸)以上所提及到的物理和 化學的不利條件。在選擇保護蛋白藥物的方案時，必須保證最終產品的 性質，比如微球大小和形狀、釋放曲線、包封率、以及長效作等不打折 扣。此外，具有這些優良性質的劑型的制備方法應簡便、易于質量控制、 而且不造成環境污染。
此發明揭示了一個可以達到上述所有目標的簡便可行的技術方案。
首先，像蛋白質這樣結構脆弱的生物物質能夠通過穩定的水相-水相 乳液[24]在不受任何物理、化學因素影響的條件下制備成多糖玻璃體微 粒。由于水相-水相乳液的界面張力很低(其基本性質)，制備過程所需的
剪切力亦不高，多糖微粒的粒徑分布均勻。而且，這種系統可以被冷凍
干燥成直徑在1-5微米范圍的玻璃體微粒。 一旦被擔載于這些玻璃體微
粒，被裝載物質的結構將得到有效的保護。由于其親水性和高玻璃態轉 化溫度，該體系具有對有機溶劑的和周圍溫度與濕度的強耐受性(有利
于保持蛋白活性)。載有生物治療物質的AqueSphere可直接用于吸入劑， 或通過進一步微囊包在可降解聚合物體系中實現緩釋的目的。
制備緩釋微球時，AqueSphe可以通過常規的S-O-W或者S-0-0微 囊化方法被載進PLGA或其他可降解的聚合物微球中。我們在實驗中將 PLGA微球重新溶解將AqueSpher從中回收，觀察到AqueSphere保持著 微囊包前的的大小和形狀(見實例4)。
經過細胞增殖實驗，我們證實了載于AqueSphere的蛋白質的生物活 性在和有溶劑互相作用與微膠囊化過程后依舊得到有效的保存(見實例 5， 6， 7)，說明蛋白大分子的構象在多糖玻璃體基質中得到很好保護。 除此之外，AqueSphere在微囊化并回收后的活性保持實驗(見實例7) 說明蛋白質藥物微囊化的包封率很高。
蛋白大分子緩釋劑型研發中最大的挑戰是如何在體溫度及水合條件 下長時間地保證蛋白質的活性PI]。潮濕和高溫增加了蛋白分子的可動性 同時降低了其水解、聚合以及構象改變的能量勢壘。利用這個技術，載 于AqueSphere中的蛋白質能夠在37攝氏度的水合狀態下保持持久的活 性(見實例8)。比如，重組的人類促紅細胞生成素(EPO)的體內半衰 期為8.5小時，載于AqueSpher的EPO在水化和37度下的半衰期長達一 周。吸水溶解的AqueSpher在蛋白質周圍形成高黏度的基質，降低了蛋 白大分子的可動性，制約了蛋白分子之間以及蛋白分子與其他物質(可 降解聚合物基質或體內的酶)的接觸的機會。
突釋，即相當劑量的擔載藥物在用藥初期快速釋出，是蛋白大分子 緩釋技術研發的又一難題。盡管原因可能不同，但是這種效應在植入劑 型和注射微球中都存在。另外還有不完全釋放，即一部分蛋白質由于和 聚合物基質的吸附作甩而不被釋放出來。通過將蛋白質先載于AqueSpher 再微囊包在可降解聚合物微球中的方法可以同時解決突釋和不完全釋放 的問題(見實例9)。
此外，AqueSphere還可以起到降低由于聚合物降解引起的微球內部
局部酸性的作用。這種局部酸性被認為是引起釋放階段中蛋白質性變的 另一原因。水化條件下，AqueSphere在可降解聚合物基質中形成互相聯 系的擴散通道，其高黏度基質一方面限制蛋白大分子的擴散，同時卻對 小分子緩沖劑暢通無阻。這種自然屬性使得局部酸性在緩釋過程中得到 緩沖。除此之外，表面活性分子(鈉藻酸鹽)本身也具有緩沖效應。
這項發明提供了一種簡便且有效的方案，使蛋白大分子緩釋微球劑 型的研發過程中長期存在的技術難題[3， 5]迎刃而解。
圖1:載有肌紅蛋白的穩定的水相-水相乳液。該圖拍攝于樣本制備 好一個星期之后。
(1) 分散相lml,含5w/w。/。的肌紅蛋白和20w/w。/。的葡聚糖；連續相 5ml，含1 w/w。/。鈉藻酸鹽和20w/w%PEG
(2) 分散相lml，含5w/w。/。的肌紅蛋白和20w/w。/。的葡聚糖；連續相 10 ml,含1 w/wn/。鈉藻酸鹽和20w/w%PEG.
(3) 分散相0.5ml，含5w/w。/。的肌紅蛋白和20w/w。/。的葡聚糖；連續 相10ml,含1 w/w。/。鈉藻酸鹽和20w/w%PEG.
(4) 分散相lml,含5w/w。/。的肌紅蛋白和20w/w。/。的葡聚糖；連續相 5ml,含20w/w%PEG.
(5) 分散相lml,含5w/w。/。的肌紅蛋白和20w/w。/。的葡聚糖；連續相 5ml，含lw/w。/。鈉藻酸鹽，20w/w。/。PEG和lOmMNaCL.
(6) 分散相lml,含5w/w。/。的肌紅蛋白和20w/w。/。的葡聚糖；連續相 5ml，含lw/w。/。鈉藻酸鹽，20w/w。/oPEG和lOOmMNaCL.
樣本4和6中所示的棕色分散相，(肌紅蛋白/葡聚糖)制備后立即發 生聚集， 一夜后在容器底部形成一個分層。樣本1， 2， 3和5中的在顯 微鏡觀察下沒發現任何的變化。
圖2:穩定的水相-水相乳液和多糖玻璃體微粒的顯微鏡圖像；
2A)在圖表1-1中所示的穩定的水相-水相乳液的顯微鏡圖像；
2B)將(2A)冷凍干燥并用二氯甲垸洗去其表面上所附的干燥PEG
成分后的多糖玻璃體微粒的顯微鏡圖像。
圖3: S-O-W法制備PLGA微球的過程
3A) S-O-W法制備過程中AqueSpheres載于PLGA-有機溶劑乳珠的 顯微鏡圖像；
3B)固化后的含有AqueSpheres的PLGA微球。
圖4:從PLGA微球體(圖3B所示)中回收后的AquSphere的顯微
鏡圖像。
回收的AqueSpheres的大小和形狀與微囊包在PLGA微球之前沒有 明顯變化(見圖2B)。
圖5:使用水相-水相乳液和AqueSphere技術進行緩釋微球制備的每 一步驟后中的B-半乳糖酐酶的催化作用的比較分析。
比起載于新鮮的水相-水相乳液中的& -半乳糖酐酶，經過一系列制劑 過程后，其對o-nitrophenyl-b-D-galactopyrannoside (ONPG)的降解反應 的催化活性只是稍微的降低了一些。
圖6:經歷了各個制備步驟之后的rhEPO對TF1細胞增殖的生物活性。
同樣單位的rhEPO在經歷了乳化、冷凍干燥、二氯甲烷洗滌之后對 TF1細胞增殖的生物活性。細胞增殖活性通過在顯微鏡下統計每個培養 皿中細胞的平均個數進行評價。
圖7:經歷了各個制備步驟之后的rhGM-CSF對TF1細胞增殖的生 物活性。
同樣量的rhGM-CSF在經歷了乳化、冷凍干燥、二氯甲垸洗滌之后 對TF1細胞增殖的生物活性。細胞增殖活性通過在顯微鏡下統計每個培 養皿中細胞的平均個數進行評價。
圖8:加水并在37攝氏度放置后的rfiEPO對TF1細胞增殖的生物活性。
樣品分析對含有rhEPO的AqueSphere添加相當于其質量兩倍的水， 在37度下放置不同時間，取出測試對TF1細胞的增殖活性；對照分析 把同等量的rhEPO置于TF1細胞培養液在37度下放置與樣品分析相當 的時間，測試對TF1細胞的增殖活性。圖9:加水并在37攝氏度放置后的rhGM-CSF對TF1細胞增殖的生 物活性。
樣品分析對含有rhGM-CSF的AqueSphere添加相當于其質量兩倍 的水，在37度下放置不同時間，取出測試對TF1細胞的增殖活性；對照 分析把同等量的rhEPO置于TF1細胞培養液在37度下放置與樣品分 析相當的時間，測試對TF1細胞的增殖活性。
圖10:加水并在37攝氏度放置后的/3-半乳糖酐酶之催化活性。
樣品分析對含有0 -半乳糖酐酶的AqueSphere添加相當于其質量兩 倍的水，在37度下放置不同時間，取出并測試對ONPG的降解反應的催 化活性；對照分析把同等量的e-半乳糖酐酶置于海澡糖溶液在37度下 放置與樣品分析相當的時間，測試對ONPG的降解反應的催化活性。海 藻糖溶液的濃度為30w/w%.
圖表11:肌紅蛋白從PLGA微球體中的釋放曲線。該釋放過程的研 究是采用讓50mg微球體懸浮在2ml的0.1MBPS緩沖液中來進行的。我 們使用BCA方法對所釋放的肌紅蛋白進行定量。將肌紅蛋白顆粒直 接微囊包于PLGA微球的釋放曲線；PLGA中的L/G為50/50，分子量為 6K。 將肌紅蛋白-葡聚糖微粒載于PLGA微球后的釋放曲線；PLGA 的參數同上。
圖12:肌紅蛋白從不同分子量及L/G的PLGA微球體中的釋放曲線。 〇. PLGA的L/G比為50/50，分子量為12K; PLGA的L/G比為65/35， 分子量為12K; PLGA的L/G比為75/25，分子量為12K; PLGA 的L/G比為65/35,分子量為20K。
具體實施例方式
本發明闡述了運用穩定的高分子水相-水相乳液[24]制備蛋白藥物及 其他生物分子的緩釋微給藥體系的制備方法。當生物分子被溶于多糖溶 液，經(水相-水相)乳化、冷凍干燥處理，其結構在將會"固化"在親 水性玻璃體微球中。這樣的玻璃體微球(AqueSphere)具有以往報導過 的體系所不具有的一系列優點。
在S-O-W或者S-0-0微囊包過程中，預制備的蛋白質-多糖的細小
而均勻的玻璃體顆粒對于防止突釋以及提高包封率非常重要[6, 13]。本
發明提供了將蛋白質擔載于的細小均勻的多糖玻璃體微粒的新方法(1-3 um，見實例1， 2)，使蛋白大分子的構象不再受有機溶劑、強界面張力、 高溫、大量表面活劑、(共價或離子的)交聯劑等各種不利因素的影響。 關于這些因素在緩釋劑型制備的不同步驟中造成蛋白分子變性失活已有 報道[3, 6， 21]。如我們上面所提及，目前為止還沒有一種方法(無論是 W/0乳化、噴霧干燥、噴霧冷凍干燥、冷凍干燥、研磨、化學交聯等) 能夠在滿足上述所有條件下用于制備蛋白大分子緩釋微球。
此外，利用噴霧干燥和噴霧冷凍干燥法只能將小分子量的糖或鹽類 穩定劑的制成微粒。多糖溶液因其高黏度而不易噴霧。本發明中的穩定 乳化方法可以很容易地將高黏度的多糖溶液制成微粒。在稍后的論述中， 我們將進一步證明多糖作為蛋白穩定劑在提高蛋白穩定性和改善蛋白釋 放動力學中具有一系列優點。
一旦被載進多糖微粒中，蛋白質便在微囊包過程中得到有效的保護， 具有了對有機溶劑的耐受性。實驗中，我們將e-半乳糖酐酶、rhEPO和 rhGM-CSF載進AqueSphere中、并用二氯甲垸(DCM)洗滌或者用二氯甲 烷當溶劑將其微囊包在PLGA微球中。這些蛋白分子的生物活性在上述 制備過程的每一個階段都得到很好保護(見實例5， 6， 7)。 一般來說， 蛋白質和有機溶劑的接觸是制備可降解聚合物緩釋微球時的一個有害因 素[3]。
除了對有機溶劑的耐受性外，AqueSphere還可以保護蛋白質使其不 會在37攝氏度水化條件下發生聚集和構象變化。在如此條件下保護蛋白 質是蛋白緩釋技術研發中最大的技術障礙[21]。我們將載于AqueSphere 中的rhEPO、 rhGM-CSF和e-半乳糖酐酶在水化條件，37攝氏度下培養， 發現蛋白質的活性還是可以得到較好的保存(見實例8)。對于rhEPO來 說，它在溶解狀的AqueSphere中的半衰期是在細胞培養液中的態水球體 中的7倍(見圖8和實例8)。對于rhGM-CSF來說，即使在37度、水化 條件下經過9天的培養，它的生物活性也沒有明顯的下降(圖9和實例8)。 在同等條件下我們對在于/3 -多乳糖酐酶Aquesphere和海藻糖溶液(一種 常用的蛋白質穩定劑)中的活性做了比較。水化條件、37度下培養一周
的結果證明AqueSphere保護下的蛋白活性是在海藻糖之中的5倍(見圖 9及實例8)。
AqueSphere載于可降解聚合物微球中可帶來理想的線性釋放，克服 突釋和不完全釋放的問題。 一般來說，基于PLGA微球的蛋白大分子緩 釋常顯示三個階段[22]:由于吸附在微球表面[25]或內部大孔徑擴散通道 [14]分子的初期擴散；其后的滯后階段，以及由于聚合物的大范圍降解引 起的加速釋放階段。對于一些臨床治療來說，第一天50%藥量的突釋可 能是相當危險的。由于顆粒小而均勻，AqueSphere可以均勻分布在可降 解聚合物基質中(見實例3)，從而降低蛋白質在微球表層的分布。同時， 小分子量的蛋白質穩定劑在聚合物基質中快速溶解(造成高滲透壓[ll]) 和擴散，AqueSphere吸水后則形成高黏度膠質，充滿擴散通道。由于多 糖分子自己從聚合物基質中擴散出來的速率很慢，這一高黏度穩定劑存 在制約了蛋白質的突釋(見實例9)。而且，這種緩慢擴散可以和稍后的 降解過程重疊，改善三段式的釋放模式(見實例9)。
蛋白質和可降解聚合物的互相作用是引起不完全釋放及不溶解的蛋 白質聚集物的重要原因[18]。用目前這種新方法，在整個釋放過程中，蛋 白質分子都被高黏度的多糖所環繞[23]，從而降低了蛋白質與聚合物的接 觸吸附。在圖表11 (實例9)中，我們比較了以純蛋白顆粒的形式直接 微囊包在PLGA微球和通過AqueSphere微囊包在PLGA微球的肌紅蛋白 釋放曲線。直接微囊包的肌紅蛋白，在45天時間里只有少于20%的裝載 蛋白質釋放出來；而后一種情況在同樣時間里卻釋放了 70%的裝載物。
PLGA基質中的局部酸性是引起蛋白質性變的另一原因[3]。聚合物 降解時產生的降解物(乳酸和乙二醇酸及它們的低聚物)可能滯留在聚 合物基質內部從而使局部的pH值下降。本發明的體系里，AqueSphere 吸水溶解后在PLGA基質中形成高黏度的膠狀態充滿擴散通道。這一結 構一方面滯緩大分子蛋白質通過，另一方面對小分子緩沖劑通透性很好， 從而使局部酸性得以緩沖。此外，被作為乳化劑的海藻酸鈉(見實例1) 具有一定緩沖作用。在一個滴定測試中，當100ul的0.IN HC1加到0.9ml 150mM (以單體計算)的海藻酸鈉溶液中時，pH值保持在5左右。而同 樣體積的水的話，那么加入lOul同樣的酸則會使PH值下降到1。
14
本發明針對于蛋白大分子藥物緩釋輸送體系的一系列技術挑戰，第 一次提供了一種簡便且全面的技術方案。這一方案，不僅使蛋白大分子 藥物在緩釋劑型的制備過程和釋放過程中得到很好的保護，而且能夠制 約突釋和不完全釋放，獲得理想的釋放曲線。這一技術在類似蛋白的結 構敏感的治療物質的輸送體系的研發中當有著廣泛的應用。
以下的實例為更好地理解這一發明提供了參考；但本領域的專家應 能夠理解這些例子只是為了更好地演示技術原理，而絕不會限定本發 明的應用范圍。
實例
實例h聚合物水相-水相乳劑的穩定性。
我們通過在顯微鏡下觀察水相-水相乳液的分散相的聚集和直接觀察
帶顏色分散相是否沉積為一斷層(block phase)。這個分散相是由葡聚糖 溶液來形成的。用溶度分別為5， 20， 40w/w。/。的葡聚糖溶液迸行實驗表 明結果沒有明顯的不同，不管是用哪一種溶度的溶液，都會形成穩定的 水狀乳劑。實驗中，平均分子量為IO，OOO、 67,000和500,000的葡聚糖， 結果也是大約一致。分別用溶度為5， 20， 40w/w^的PEG作為連續相進 行試驗，也都可以形成穩定的水相-水相乳液。變換PEG的平均分子量， 取8000和22,000，均獲得穩定的乳液。作為乳化劑，我們測試了海藻酸 鈉、甲基羧基葡聚糖和甲基羧基纖維素。所有都可起到在穩定水相-水相 乳液的作用。因為海藻酸鈉資源十分豐富，所以在大部分的實驗中予以 采用。實驗中海藻酸鈉的溶度分別取了 0.2， 1， 1.5w/w%。乳液穩定劑海
藻酸鈉被分別置于分散相和連續相進行實驗，沒有發現對乳液穩定性產 生影響。為了便于觀察，我們可在分散相中加入有色分子、如蘭色的葡 聚糖(分子量為50,000和1,000,000)或者肌紅蛋白作為指示劑。
我們還變換葡聚糖和PEG溶液的比例(1: 5妾lj 1: 20之間)，以及 添加氯化鈉進行了實驗，將制備的水相-水相乳液滴放于顯微鏡下觀察并 將圖象拍攝下來。最后將試驗所用的這些樣本放于瓶子里以待繼續觀察。
圖1顯示了攪拌停止并被儲存于室溫環境里一個星期之后的聚合水 狀乳液的圖象。我們用肌紅蛋白作為被裝載在擴散層的蛋白質樣本，結 果肌紅蛋白顯現出褐色。在所有的六個樣本中，只有樣本四是在沒有使
用海藻酸鈉的情況下配制的。樣本六和樣本一的不同之處在于后者中添
加了 100mM的氯化鈉。在四和六這兩個樣本中，攪拌一停止，分散相便 開始聚集，很快在幾個小時里面形成兩個斷層。再看看圖1中的另外四 個樣本(1、 2、 3、 5):分散相粒徑一周后仍保持在3-7微米這樣一個范 圍(圖2A)。這個結果正好支持了我們的下述理論帶電荷的海藻酸鈉 分子會吸附在分散相表面形成擴散雙電層，阻斷了分散相粒珠的聚集和 融合。隨著氯化鈉濃度的增加，鈉離子屏蔽了海藻酸鈉形成的擴散雙電 層，分散相便得以聚集。將葡聚糖和PEG溶液的比例降低到1: 15就將 保持乳液長達兩個星期的穩定性。
在這個實驗里，肌紅蛋白在連續相和分散相間的分配系數為1: 50，
這也意味著大部分的肌紅蛋白都存在于葡聚糖層中。除了肌紅蛋白以外，
rhGM-CSF和攜帶AmB分子的脂質體也都裝載在這個系統里并形成和在 圖2B里一樣的玻璃體微粒。經過活性試驗(詳見后面分析)或UV吸收 測試，大約93。/。的rh-CSF和95%的AmB/脂質體存在于分散相中(UV 吸收波長為408nm)。圖2A顯示了不含氯化鈉的聚合物水相-水相乳液的 顯微鏡圖像。我們得到了直徑在3-8微米之間的分散相液珠。 實例2: AqueSphere的制備
AqueSphere將上述穩定水相-水相乳液進行冷凍干燥而制備。在冷凍 干燥后，葡聚糖液滴就會轉變成固體微粒。然而，大部分的葡聚糖微粒 卻還是都分散在由PEG連續相所形成的固體基質上。PEG可用二氯甲烷 或者乙腈沖洗除去。這些溶劑既不溶解(dissolve)也不溶脹(swell)干 燥的葡聚糖微粒。圖2A和2B顯示的是在不同制備階段的葡聚糖微粒的 顯微鏡圖像乳化、冷凍干燥后用二氯甲垸沖洗(以除去、PEG)，以及從 PLGA微球中回收。冷凍干燥后，分散相粒徑從3-7微米下降到l-3微米。 這是由于水分丟失而引起的體積縮小(見圖表2B)。這些圖象也說明在 凍干過程中不會發生任何的溶液微滴溶合。這樣的直徑范圍大小正好很 適合于吸入性使用治療藥劑的傳輸，同時也十分適合于通過雙乳化法 (S-O-W)制備微球。
實例3: AqueSphere在PLGA微球的微囊包。
通過S-O-W乳化過程，AqueSphere可以進一步被微囊包在、PPLGA
基質或其他可生物降解的微球中。在這個研究實驗中，我們使用的PLGA 的L/G比分別為50: 50和75: 25。實例2中所制備的AqueSphere先被 懸浮在PLGA的二氯甲烷溶液中；AqueSphere與PLGA的比例在1: 2 和1: 20之間。然后將這一懸濁液進一步分散到含有0.1-10%氯化鈉和 0.1-4%聚乙烯乙醇或者PEG、 PVP的水溶液中。這兩相的體積比例在1: 2到1: IO之間。在乳液形成之后，將其倒進體積大的多的冷水(體積為 乳液的10倍以上)中并緩慢攪拌，這樣就可以把有機溶劑提取出來。圖 表3A和3B顯示的分別是在有機溶劑提取之前的PLGA微滴和其后的 PLGA微粒。在溶劑提取前，PLGA微滴是透明的，且AqueSphere分布 在其中；之后，因為溶劑的提取而硬化，失去透明度。 實例4: AqueSphere從PLGA微粒中的回收
AuqeSphere可以從實例3所描述的PLGA微球中回收回來。將載有 AqueSphere的PLGA微球在二氯甲烷或乙腈中重新溶解后離心，去掉上 清液，如此反復4至6次，AqueSphere得以回收。圖4顯示了從PLGA 微球中回收后的AqueSphere。回收后的AqueSphere的大小與形狀和被微 囊包進PLGA微球之前一樣。該結果說明了在微囊化處理過程中 AqueSphere的水化作用不明顯。
為了評價包封率，我們測量了回收后的AqueSphere的重量。PLGA 微囊包前后的葡聚糖AqueSphere的重量基本一致，分別為1: 19和1.06: 19…說明了本發明中的微球制備方法有很高的包封率。這個結論和微囊 包前、后對蛋白質活性試驗的結果是一致的。
實例5:使用有機溶液的制備過程中，AqueSphere對P-半糖乳糖酐 酶的保護作用
為了驗證有機溶液存在條件下AqueSphere對結構易變的蛋白大分子 的保護作用，我們把e-半糖乳糖酐酶(一個具有四級結構、分子量為 434KD的酶)載進AqueSphere進行了測試。先將蛋白質以10-100單位/ml 的比例溶于葡聚糖溶液(MW= 10 - 500KD，濃度=5-25%)，然后將其 加入實例1所描述的PEG溶液中乳化。冷凍干燥后，像實例4那樣用二 氯甲垸反復洗滌幾遍除去PEG。接下來的步驟中，將所回收的載著蛋白 質的AqueSphere在緩沖液中重新溶解，加入o-nitrophenyl- P -D- galactopyranoside (ONPG)，測試對底物一ONPG的水解催化活性。如圖 5中所示，酶的催化作用在經歷了從實例1到實例2所描述的操作過程(包 括乳化、冷凍干燥以及二氯甲烷洗滌)后，只是下降了不到10%。此10% 的活性下降還包括了由于在乳化過程中被分配在PEG相的部分蛋白以及 冷凍干燥過程中損失的蛋白活性。也就是說，在與微囊包過程所用的有 機溶液一二氯甲烷的接觸中，AqueSphere有效地保存了蛋白酶的活性。
實例6:水相-水相乳液中，rhEPO和rhGM-CSF在分散相和連續相 中的分配
首先，按照實例1的方法和條件制備含有rh-EPO和rhGM-CSF的穩 定的水相-水相乳液。然后將乳液離心，分離其分散相和連續相。將分離 的兩相分別溶解稀釋，加入TF1細胞培養皿中測試其對細胞增殖的活性。 蛋白質的活性可以通過在顯微鏡下計量細胞的數目來衡量。實驗結果發 現大約93°/。的rhEPO和93%的rhGM-CSF分配于葡聚糖相中。
實例7:使用有機溶液的制備過程中，AqueSphere對rhEPO和 rhGM-CSF的保護作用
接下來我們考察了 AqueSphere對提高rhEPO和rhGM-CSF對有機溶 劑的耐受性的作用。首先將蛋白質按照實例5中的方法載進AqueSphere。 其生物活性的測試通過細胞增殖法進行(如實例6)。將用二氯二甲烷洗 過的AqueSphere重新溶解，加入同樣的細胞懸浮液中培養。圖6顯示了 rhEPO細胞增殖活性。冷凍干燥之后，85%的活性仍然保存下來一細胞數 目從冷凍干燥前的27800減少到冷凍干燥后的23700。將凍干后的樣品置 于二氯甲烷洗滌，導致細胞增殖數目減少到22600，相當于95%的蛋白質 活性被保存下來。由于重量測試顯示有機溶液洗滌后有大約94%的蛋白 質分配在葡聚糖相(實例6)，可以認為存在于AqueSphere中的蛋白質的 活性基本上不受有機溶劑影響。
圖7顯示了 rhGM-CSF在經歷了每個制備步驟后的活性測試結果。 將含有蛋白質的水相-水相乳液冷凍干燥，每個容器中細胞的平均數由 130900下降到122600，相當于蛋白活性保存了 94%。繼續用二氯甲烷清 洗凍干粉以除去殘余的PEG后，細胞增殖數目下降到111100，即活性減 少了大約9%，。減少的這9%和乳化時分配在PEG連續相中的rhGM-CSF
部分相當(大約為rhGM-CSF總數的7%，見實例6)。將含有蛋白質成 分的葡聚糖微粒(AqueSphere)載進PLGA微球體中沒有再引起蛋白質 活性的下降，每個容器中平均的細胞增殖數量此時為118900。這種蛋白 活性保存率也反應出較好的包封率，這點與重量測試的結果是一致的(實 例4)。
實例8:生理溫度、水化條件下AqueSphere對rhEPO， rhGM-CSF 和P -半乳糖酐酶活性的保護作用
在生理溫度、水溶液存在的條件下能否保證蛋白質藥物在漫長的緩 釋周期中保持生物活性是蛋白緩釋劑型研發中所面臨的最嚴峻的技術挑 戰。緩釋過程中，可降解聚合物微球會吸收水分溶脹，而其中的蛋白質 分子會處在體溫和水化狀態中。水化和溫度的升高將增加蛋白質分子的 可動度(mobility),從而使得蛋白質產生物理和化學變化的機會增加。 為了測試蛋白質在體溫下的穩定性，我們將水加入裝載有rhEPO或者 rhGM-CSF的葡聚糖微粒(AqueSphere)中然后在37攝氏度下放置，然 后在不同時間取出蛋白樣品，加入FT1細胞培養皿中培養，觀察細胞增 殖情況。結果顯示在圖8和圖9中。
對于rhEPO來說，載于AqueSphere的，其活性在一個星期里下降到 50% (圖表8)，而直接用細胞培養液稀釋的rhEPO， 一天里面其活性就 會下降相同的幅度。由于酶的催化作用，rhEPO在人體里的存活時間為8.5 小時。很明顯，水化作用而形成的高黏度的多糖相(水化的AqueSphere 基質)可大大延長rhEPO在生理條件下蛋白質的活性。
同樣的結果出現在對rhGM-CSF (圖9)的測試中。那些受到 AqueSphere保護的rhGM-CSF，其10天放置后活性的存留程度為85%; 而直接置于細胞培養液的蛋白樣品，其活性就下降到56%。
我們對多糖對e -半乳糖酐酶在水化狀態下所起的穩定化作用與海藻 糖在這方面的功能進行了對比。活性測試采用了實例5中的方法。在37 攝氏度條件下放置7天，處于多糖穩定劑(水化AqueSphere)的樣品活 性保持了原來的89%，而海藻糖溶液中的樣品活性只有原來的17%。如 果延長放置時間到兩個星期，那么水化AqueSphere的活性將進一步下降 到48%，但是相比之下，用海藻糖溶液中的樣品下降到0 (圖IO)。
實例9:無明顯突釋和不完全釋放的蛋白質從PLGA微球中釋放曲
線
突釋和不完全釋放是蛋白藥物緩釋劑型研發中的另一個常見難題。
由于突釋效應，30%-70%但載蛋白藥可能在用藥初期立即釋放。不完全 釋放指的是20-40%的蛋白質成為不溶殘渣不再釋放出來。這類問題可以 通過將蛋白質預載進AqueShere中的方法避免。先通過水相-水相乳化， 將蛋白藥物載于AqueSphere(0.1-20。/。)，然后用S-O-W法將含有蛋白質的 AqueSphere微囊包在PLGA微球中。在PLGA中的肌紅蛋白的裝載容量 為0.25-5%。微囊包時，PVA， PEG和PVP則作為表面活劑加在水相中。 圖11所顯示的分別通過AqueSphere保護或直接微囊包在(端頭甲基化 的)PLGA微球中的肌紅蛋白的釋放曲線。當純肌紅蛋白顆粒直接微囊 包進PLGA微球時，45天里面只有17%的蛋白質釋放出來。對于預載進 AqueSphere然后微囊包的肌紅蛋白，75%的蛋白質擔載量在45天時間釋 放，而且在開始階段不出現突釋。我們也用端頭非甲基化的PLGA制備 了微球，實驗中觀察到了同樣的無突釋的肌紅蛋白的線性釋放(圖12)。 圖12顯示的是肌紅蛋白從分別由L/G比為50: 50， 65: 35和75: 25的PLGA (MW=12K)制備的微球中釋放出來動力學曲線。所有這些 PLGA微球都先將肌紅蛋白預制備在AqueSphere后通過S-O-W法制備 的，其第一天的釋放量大約為載藥量的7%-12%，隨后釋放亦為線性的。 對于PLGA的L/G比分別為50/50和65/35分子量為12K的微球，釋放卯％ 的載藥量需50天時間。PLGA的L/G比增加到75/25時，同樣的時間里 只有80%的載藥量得到釋放。如PLAG的分子量增加到20K，也引起了 釋放速率的降低。對于L/G比例為65/35的PLAG來講，在50天釋放了 65%載藥量。不管是上述情況中的哪一種，肌紅蛋白的釋放曲線都幾乎是 線性的。根據對微球制備后的上清液中蛋白質的含量進行的分析，肌紅 蛋白在上述PLGA微球中的包封率大概為90%。
實例10:從PLGA微球中釋放的GM-CSF的生物活性 含有rhGM-CSF裝載進PLGA微球通過實例1 ， 2和3中所描述的方 法制備。蛋白質與葡聚糖的比例為1: 500，而AqueSphere與PLGA的比 例則為1: 5。載有rhGM-CSF的PLGA微球懸浮在緩沖液中并在37攝
氏度條件下緩慢搖動。每天都將上清液收集起來并代之以新鮮的緩沖液。
將收集的上清液稀釋20倍，并采用實例7中的方法進行測試。在不同的 日期所測試出來的活性的水平標記在圖13中。蛋白質的活性在施放實驗 開始后的第24天前基本保持在相同水平，其后逐漸下降至第32天活性 降至零。
緩釋過程中聚合物的降解在PLGA微球中產生的局部酸性也是造成 蛋白質性變的重要原因[26]。為了考察酸性對rhGM-CSF活性的影響，我 們將蛋白質置于pH值分別為1， 2， 3， 4， 5，和6的葡聚糖溶液中在37C 下搖動一天。相對于在pH值為6的溶液，rhGM-CSF在pH值為4的溶 液中的活性下降到了原來的75%。當pH值小于2時，活性下降到45%。 但是對于蛋白質從PLGA微球中釋放的情況來說，卻不會觀察到這種類 似的情況發生。這個結果表明局部酸性不會在PLGA微球中形成。這可 能是由于AqueSphere在水合狀態下形成了具有膠狀擴散通道所致。雖然 這種充滿多糖分子的通道滯緩蛋白大分子的滲透，卻對小分子暢通無阻。 因此在蛋白質緩釋過程中由PLGA的降解產生的酸性得到緩沖。
引用文獻
1) R. Langer, Folkman， J" Atowre 263， 793-800 (1976).
2) CAS， "Search on Chemical Abstracts resulted in 962 research articles and patents on the subject of sustauned release of proteins based on degmdable polymers." (2002).
3) M. V. Weert, Hennink， W. E., Jiskoot, W.，i 仏17， 11591167 (2000).
4) R. T. Bartus， Tracy, M.A" Emerich, D.F.， Zale， S.E.， 《SWe"ce 281， 1161-1162(1998).
5) P. A. Burke, Z/awt/6ooA: o/ cow加〃ed re/ease fec/wo/ogy Marcel Dekker, 661 -692 (2000).
6) J. L. Cleland, Jones J.S.,尸/wr肌13， 1464-1475 (1996).
7) O. L. Johson，泡mwr固rica/i e層rc/z 14， 730-735 (1997).
8) B. C. Cunningham, Mulkerrin， M. G" Wells, J. A., 253， 545-化系(可溶化系)、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系等任意的劑型。 實施例1
下文舉出本發明的實施例進4亍更詳細的i兌明，^f旦是本發明不被這些實施例所限定。下述實施例中，有時將丙烯酸簡稱AA、將二曱基二烯 丙基氯化銨簡稱DMDAAC、將丙烯酰胺簡稱AM。
首先，對本發明的兩性三元共聚物的合成方法進行說明。兩性三元共聚物1
將二甲基二烯丙基氯化銨(陽離子性單體)20g(123mmol)和丙烯酰胺 (非離子性單體)70g(986mmol)加入具有攪拌器的玻璃反應器內。然后，一邊充分攪拌混合一邊加入用純化水稀釋丙烯酸(陰離子性單 體)10g(139mmol)而得到的水溶液，直至溶液中的全部單體的濃度為 14~20%。用氫氧化鈉稀釋水溶液將混合的單體的pH調節為6.0-6.5 后，加熱至55。C,加入氮，換氣(八。一^ )30分鐘。聚合通過加入560ppm 過硫酸鈉引發。到達放熱峰后，進一步加入稀釋水，加入硫酸氫鈉除去 殘留單體，得到目的的丙烯酸/二曱基二烯丙基氯化銨/丙烯酰胺 (10/20/70)三元共聚物。
兩性三元共聚物的配合本發明人首先對配合有根據上述制備例制備的兩性三元共聚物1的 洗臉劑和以往的配合有陽離子聚合物的洗臉劑進行比較。評價基準如下
合組成r ;價結果一并示于表1。下i中，各種聚合物的單體^成以構 成單體總量中的AA、 DMDAAC、 AM各種單體的質量比(％)表示。此外， 各種聚合物的配合量都以純成分(純分)換算表示。 (l)洗滌時的泡質對于各實施例和比較例的洗臉劑洗滌時的泡質，通過專業評價人員 IO名實施實際使用試驗。評價基準如下所述。 5分為乳油狀。 4分稍有乳油狀。 3分普通。 2分稍無乳油狀。 l分非乳油狀。
22) ^V. R. Liu, Langer， R., Klibanov， A. M.， 5zo&c/2. 5z'oe"g. 37， 177-184 (簡).
23) B. Bittner， Morlock， M., Koll， H.， Winter, G" Kissel, T.， J.尸/wmz. B/o/ /2^附.45， 295-305 (1998).
24) J. Hampl, Dittrich， M.， Franz, J.， Reschova, S., Stepanek， J.， /"/em. / 尸/i畫.144， 107-114(1996).
25) H. Takahata, Lavelle, E.C.， Coombes, A.G.A.， Davis, S.S., J Cow/ra〃Wi e/eose 50, 237-246 (1998)
26) G Zhu, S. R. Mallery, S. P. Schwendeman, Nature Biotech., 18, 52-57 (2000)..
權利要求
1、使用有穩定性的水相-水相乳液將化學成分進行微囊包制備微球的方法，其中包括A.選擇多糖作為水相-水相乳液的分散相，選擇親水性聚合物作為其連續相，并選擇水相-水相乳液的穩定劑及其濃度，以制備穩定的高分子水相-水相乳液以及通過這樣的乳液將有用化學成分載于乳液的多糖分散相中；B、包括至少一種有用的化學成分；C.將載有化學成分的多糖分散相的尺寸與形狀控制在適當范圍內；D.干燥水相水相乳液；以及E.干燥后通過有機溶劑的洗滌除去連續相。溶劑不得對載于分散相中的化學成分造成影響。
2、 權利要求1中所用到的材料組合，包括親水性的分散相，親水 性的連續相，以及親水性的表面活性成分等能夠形成穩定的水相-水相乳 液的所有成分。
3、 權利要求2所指的材料組合包括足夠量的、能夠形成水相-水相 乳液分散相并且擔載化學成分的多糖或者多糖衍生物。
4、 權利要求3所指材料組合中的多糖包括葡聚糖、淀粉、纖維素及其衍生物、和瓊脂糖、以及所有具有相似結構的糖的高聚物或多聚物
5、 權利要求4所指材料組合中的多糖的分子量在2,000至2，000，000之間。
6、 權利要求3所指材料組合中的化學成分為有生物活性的物質。
7、 權利要求6所指材料組合中的化學成分包括蛋白質、多肽、 DNA/RNA、脂質體以及活病毒。
8、 權利要求7所指材料組合中的蛋白質和多肽包括EPO、 G-CSF、 GM-CSF、干擾素、生長激素、TPA、 VIII及IX遺傳因子和其他用于治 療的蛋白質或多肽。
9、 權利要求3所指材料組合還包擴作為輔助成分的小分子糖類化合物。這類小分子糖類具有在多糖相中協助保護活性成分不受微囊包過程 破壞的功用。
10、 權利要求9所指材料組合中的小分子糖類包括海藻糖、甘露 醇、蔗糖、乳糖或甘油。
11、 權利要求2所指材料組合中的親水性高分子與多糖溶液不相容 從而能夠作為水相-水相乳液的連續相。
12、 權利要求11所指材料組合中的作為連續相的親水性高分子包括:PEG、 PEO、 PEV或PVA。
13、 權利要求12中的高分子的分子量在2,000和2，000，000之間。
14、 權利要求2所指的材料組合中的表面活性成分為親水性高分子。
15、 權利要求14所指的材料組合中的作為表面活性成分的親水性高 分子包括海藻酸鈉、透明質酸鹽、羧基甲基纖維素、羧基甲基葡聚糖、 硫酸修飾葡聚糖、以及葡聚糖或纖維素的其他衍生物等骨架帶有負電荷 的聚合物鹽類。
16、 權利要求1所指的方法包括將乳液通過凍干、噴霧式干燥或 傳統的干燥方式進行干燥使之固化成為載有化學成分的多糖玻璃體微 粒。
17、 權利要求16的方法所制備的多糖玻璃體微粒的直徑在作為吸入 給藥方法時為l-5微米之間，作為其他用途時為l-50微米之間。
18、 一種將干燥的多糖微粒微囊包進可生物降解的聚合物微球中， 并用于生物活性物質的可控釋放的方法，包括A. 使用S-O-W或S-O-O方法，其中多糖分散相為其中的固相；B. 選擇一種可生物降解的聚合物，將該聚合物溶于有機溶液，之后讓干燥的多糖分散相懸浮在此聚合物溶液中；C. 選擇表面活性的聚合物用來幫助將可降解聚合物溶液分散到含有少量鹽的水溶液中；D. 上述含鹽水溶液的溶度在0.5%-50%之間；E. 采用提取或者蒸發的方式將有機溶劑除去。
19、 權利要求18所指的方法中的可降解聚合物為PLGA、聚偽 (polypseudo)絲氨酸或其他的聚合物。
20、 采用權利要求11所講的方法制備的可降解聚合物的微粒中分布 著干燥的多糖擴散相顆粒。
21、 權利要求20所述的微粒中干燥的多糖分散相和可降解聚合物的 比例在1: 2到1: 40之間。
22、 上述權力要求2-15中任何所指的材料組合均可用于藥物治療。
全文摘要
一種用于結構易變的試劑的無副作用微囊包封技術及水相-水相乳劑的應用，在不接觸有機溶劑和強界面張力的條件下將蛋白大分子、脂質體等不穩定試劑擔載于多糖玻璃體微粒中。由于三級結構被固化以及多糖基質對有機溶劑的不滲透性，載于多糖微粒后，蛋白大分子等試劑具有對有機溶劑和其它物理條件的耐受性，可以進一步微囊包與可降解高分子為基質的緩釋微球中而不受制備條件的影響。尤其是在緩釋條件下，緩釋高分子微球中的多糖微粒吸水溶解形成粘稠的膠狀充滿與微球內的擴散通道。這些膠狀多糖一方面滯緩了蛋白大分子相互之間的接觸和聚集以及在可降解高分子內表面上的吸附，同時選擇性地對小分子緩沖液高度通透，而對蛋白大分子則不然。
文檔編號A61K9/50GK101115468SQ03812857
公開日2008年1月30日 申請日期2003年6月3日 優先權日2002年6月3日
發明者樺 朱, 朱家浩, 拓 金 申請人:拓 金