專利名稱：用于生化分析、診斷和治療的具有可變物理結構的熱敏聚合物載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及熱敏聚合物，該熱敏聚合物可以通過封裝的磁性和/或金屬膠體的磁感應被加熱，從而產生其物理結構或形狀改變。其中伴隨加熱的形狀改變用以生產可控藥物庫(drug depot)、NMR診斷的對比強化介質、可操縱的微型工具，作為阻塞血管的裝置和作為薄膜生產過程中的可控的生孔物質。
本發明涉及各種幾何形狀和顆粒尺寸的聚合物載體，其中磁性和/或金屬物質或含有膠體的磁性和/或金屬核心聚合物被聚合，該聚合物載體可通過引入熱量或在高頻、交變磁場下被選擇性地加熱，導致聚合物載體的物理結構和/或形狀的改變，使得所述聚合物載體能夠在體內應用。本發明還涉及聚合物載體的生產和用途。
背景技術：
可通過感應加熱的磁性聚合物顆粒在各種出版物和專利中都有描述。例如，DE-OS 3502998、DE-OS 4201461、DE-OS 4412651和DE-OS19800294描述了用于腫瘤治療、艾滋病治療以及用于分子生物學的可感應加熱的磁性聚合物顆粒。
Jordan等(J.Magnet.Mag.Mat.，Vol.225，118，2001以及Int.J.ofHyperthermia，Vol 9，51，1993)在腫瘤的高溫治療中采用了可被感應加熱的各種的涂覆磁性膠體。Mitsumori等(Int.J.of Hyperthermia，Vol.10，785，1994)和Masuko等(Biol.Pharm.Bull.，Vol.18，1802，1995)以相似的方式采用可通過感應加熱的磁性顆粒和磁性脂質體使腫瘤細胞過熱(高溫)美國專利US 4,735,796和4,662,359描述了同樣用于腫瘤治療方面的高溫處理的磁性顆粒。
此處引用的介質和方法的共有特征是磁感應單獨用于加熱顆粒，以通過過熱處理消滅細胞或生物有機體。已知的載體不能借助于感應實現聚合物載體的物理結構或形狀的改變。
優選用于分析、診斷或醫學目的的磁性微顆粒和納米級顆粒通常通過專利PCT/WO 97/04862、PCT/WO 89/11154、PCT/WO 92/22201、PCT/WO 90/07380、PCT/WO 99/62079和美國專利US6,020,210，5,141,740，4,827,945，4,647,447，3,917,538，4,628,037，4,827,945，4,861,705，4,169,804，4,115,534，4,345,588，4,070,246，3,970,518，4,230,685，4,654,267，4,452,773，4,369,226，4,357,259，4,861,705，4,247,406，4,267,234，3,652,761，4,675,173為人們所知，它們附在本文件中作為參考文獻。葡聚糖、瓊脂糖、糊精、白蛋白、硅膠、聚苯乙烯、明膠、聚戊二醛、瓊脂糖-聚戊二醛復合物、脂質體、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯醛、蛋白質和聚氧化乙烯在前述方法和產品中被用作聚合物基質，在生化-醫學分析和診斷方面中，它們能夠按照親和原理通過耦聯生物配體和/或受體以抗原、抗體、蛋白質、細胞、DNA片斷、病毒或細菌的形式來結合分析物。
涂有不同聚合物的磁性顆粒及其在生物醫學領域中的應用的進一步綜述在“Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers”，Hfeli等，由Plenum Press出版，New York，1997中有記載。
所有前述產品的共同特征是，它們的功能都無一例外地來自于結合到基質的生物配體或受體與要分析的物質的互補作用。因此，它們的應用領域局限于利用親和原理分離和分析生物分子或特定細胞的標記的已知領域。這里作為參考引用的磁性聚合物載體也與根據本發明的介質不同，由于它們的化學結構，它們不是熱敏的，即，它們不能基于外部熱激發而改變它們的物理結構或幾何形狀。而這一特性是將聚合物載體用作可操作或可控的微米或納米級載體和/工具的基本條件。
具有熱敏特性的最常用的聚合物是聚-N-異丙基丙烯酰胺，一種在27℃以上的溫度下發生顯著收縮的凝膠樣聚合物。這一收縮是可逆的，即，如果冷卻到30℃以下，聚合物幾乎恢復其原始形狀。聚-N-異丙基丙烯酰胺的該特殊特性和基于此的有意義的應用，如作為藥物庫、生物傳感器、細胞培養基、細胞封裝基質、促動器或閥門，已久為人知，并在數個出版物和專利中記載。
N-異丙基丙烯酰胺或與如丙烯酸、甲基丙烯酸、聚氧化乙烯或殼聚糖的共聚物的聚合和溶脹特性，及與硅橡膠和聚乙烯醇接枝共聚合作用記載在Park和Hoffman，J.Biomed.Mat.Res.，Vol.24，21，1990，Zhang等，Langmuir，Vol.18，2013，2002，Lee和Chen，J.Appl.PolymerSci.，Vol.82，2478，2001，Zhu和Napper，Langmuir，Vol.16，8543，2000，Li等，Radiat.Phys.Chem.，Vol.55，173，1999，Zhang和Zhuo，Eur.Polym J.，Vol.36，2301，2000，Serizawa等，Macromolecules，Vol.35，10，2002，Kanazawa等，Anal.Sci.，Vol.18，45，2002，Asano等，Polym.Gels &Network，Vol.3，281，1995，Sayil和Okay，Polym.Bull.，Vol.45，175，2000，Xue等，Polymer，Vol.42，3665，2001，Maolin等，Radiat.Phys.Chem.，Vol.57，481，2000，以及Ebara等，J.Appl.Polymer Sci.，Vol.39，335，2001中。作為基礎聚合物的聚-N-異丙基丙烯酰胺的相應納米顆粒(nano-particle)或微顆粒(microparticle)記載在Gan和Lyon，J.Am.Chem.Soc.，Vol.123，7517，2001，Wang等，J.Am.Chem.Soc.，Vol.123，11284，2001，Gilányi等，Langmuir，Vol.17，4764，2001，West和Halas，Curr.Opinion.Biotechn.，Vol.11，215，2000，Matsuoka等，Polym.Gels &Networks，Vol.6，319，1998以及Jones和Lyon，Macromolecules，Vol.33，8301，2000中。
Kondo和Fukuda，J.Ferment.Bioeng.，Vol.84，337，1997的工作的主題是含有磁性納米級顆粒的N-異丙基丙烯酰胺共聚物。然而，其中所描述的過程既沒有提供清楚的磁性顆粒封裝，也沒有提供球形顆粒。Kondo等Appl.Microbiol.Biotechn.，Vol.41，99，1994描述了在與聚-N-異丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸共聚物的費時的兩階段聚合過程中封裝的磁性聚苯乙烯聚合物。這一產品只適于分離的抗體。也是本發明的主題的與其感應控制釋放活性劑有關的活性劑的應用卻不能通過這兩種產品實現。
美國專利US 4,832,466，6,165,389，6,187,599，5,898,004，5,854,078，6,094,273，6,097,530，5,711,884和6,014,246公開了以利用聚-N-異丙基丙烯酰胺納米級顆粒的過濾器或開關等形式的熱敏光學系統。
美國專利US 20020032246，20020031841，20010026946其中描述了基于N-異丙基丙烯酰胺的熱敏水凝膠等，用于大分子分離，用于分析物的比色檢測或作為測定化合物的傳感器。
美國專利US 5,674,521，5,441,732，5,252,318，5,599,534，5,618,800和5,840,338中提到了其中選自例如N-異丙基丙烯酰胺、羥烷基纖維素、聚環氧乙烷、聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、烷基纖維素、聚氧化乙烯嵌段共聚物、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、乙二胺熱敏和pH值敏感的聚合物凝膠，例如作為用于生物活性物質的載體。
美國專利US 5,939,485的主題為互相滲透的聚合物網絡的溫度和pH值敏感的聚合物，其中包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、尿烷或甲基丙烯酸酯和聚氧化乙烯或聚氧化丙烯的嵌段共聚物。
美國專利US 5,998,588描述了用于化驗或分離的對光、溫度和pH值敏感的聚-N-異丙基丙烯酰胺的交互刺激-反應分子共軛物。
美國專利US 5,753,261，5,226,902和5,053,228中也公開了作為藥物庫的pH值、光和溫度敏感的脂質覆蓋微粒及N-取代的聚丙烯酰胺的微粒和脂質體。
美國專利US 5,013,669中公開了人造纖維、紙、聚丙烯酰胺和球蛋白質(agarose bead)等多孔載體介質作為檢測分析物的固相載體。
美國專利US 4,783,409的主題是固定于具有可逆溶解性的丙烯酸酯載體的酶類。
美國專利US 4,780,409公開了使用聚-N-異丙基丙烯酰胺共聚物的熱誘導的相分離免疫測定法以檢測藥物、激素、維生素類、蛋白質、代謝物、細胞、病毒、微生物和抗體。
美國專利US 4,752,638和4,609,707公開了在免疫測定方面以及用于分析目的基于N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯的抗體-聚合物共軛物的合成和應用。
美國專利US 4,912,032的主題是其中能夠釋放活性劑的含有受體、抗體、蛋白質、藥物或核酸的溫度敏感聚-N-異丙基丙烯酰胺或聚-N-異丙基丙烯酰胺共聚物。
美國專利US 5,451,411描述了藻酸鹽顆粒作為口服藥物庫。
美國專利US 6,160,084的主題是可生物降解的形狀記憶聚合物，由硬聚合物片段和軟聚合物片段組成并且其原始形狀可通過加熱到玻璃化溫度以上而被恢復。
這里列出的作為參考的所有介質具有一共同點，即，在有非磁性聚合物載體的情況下，物理結構或形狀的改變僅可通過從外部直接施加的熱而觸發，而在磁性載體的情況下，它們的結構不能通過外部激發也不能通過外部施加能量以任何方式改變。而且，對于本領域的技術人員公知的“刺激-反應”載體要么是不規則的納米級顆粒，要么是較大體積質量的聚合物，不適于作活性劑(藥物)的載體，作為在NMR診斷(磁共振斷層掃描)中的對比介質，作為分子分離的介質或作為在體內應用的可控微型工具。
發明內容
本發明的目的是提供以納米級或微粒狀及其它幾何形狀的聚合物基質和/或聚合物載體，其可通過一種例如磁感應形式的能量供給被選擇性地激發，進而基于由此引起的溫度升高，引發聚合物基質的物理結構發生相應的、確定的變化。
“物理結構的改變”的定義在這里被理解為聚合物載體的幾何形狀、體積或顆粒尺寸的改變。體積的改變可出現在具有聚合物孔徑尺寸相應改變或聚合物外形(幾何形狀)改變的如收縮或溶脹過程中。物理結構的改變也可意指聚合物恢復到原始形狀，該原始形狀通過加熱和冷卻方法(凍結法)暫時改變(“形狀-記憶-聚合物”)。
由于這些聚合物的相轉化溫度(也就是“臨界溶解溫度”)在27-38℃范圍內，也就是在體溫(37℃)范圍內，這些載體仍不能用在體內，因為收縮過程已在該溫度下出現和/或該載體不能再被加熱。為了使基于聚-N-異丙基丙烯酰胺或N-取代丙烯酰胺的載體可作為治療、分析和診斷類型活性劑的載體用于體內應用，本發明的進一步目的是將活性劑封裝在聚合物載體中，然后在相應的體內給藥之后，借助于磁感應選擇性地、可控制地應用這些活性劑。
將磁場感應加熱與載體物理結構和/或幾何形狀的相應改變結合應當創造出遠遠超出以前的聚合載體系統的性能范圍。
本發明的目的通過磁感應，也就是通過外部施加的高頻交變磁場，加熱某些聚合物來解決通過將磁性和/或金屬物質封裝在聚合物基質中以便可吸收來自磁場的能量并可相應地加熱聚合物載體。
根據本發明，此目的也可通過合成基于通過物理結構的改變對熱刺激起作用的聚-N-異丙基丙烯酰胺和N-取代的丙烯酰胺的特別的聚合物和共聚物來解決。
生產熱敏聚合物載體的最初產品是以鐵磁、亞鐵磁或超順磁性納米級或微粒形式的磁性膠體，該磁性膠體顯示出高磁化強度并可在交變磁場中感應加熱。用于該目的的優選物質是磁鐵礦(Fe3O4)或γ-Fe2O3。這些化合物的生產對于本領域的技術人員來說是公知的Shinkai等，Biocatalysis，Vol.5，61，1991，Kondo等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，Vol.41，99，1994，Khalafalla and Reimers，IEEE Trans.Magn.，Vol.16，178，1980，Lee等，IEEE Trans.Magn.，Vol.28，3180，1992，Buske等，Colloids & Surfaces，Vol.12，195，1984。
未使用任何穩定劑的磁鐵礦或γ-Fe2O3膠態分散體已由Kang等公開在Chem.Mater.，Vol.8，2209，l996上。
相似的主要包括磁鐵礦(Fe3O4)、氧化鐵(Fe2O3)或羥基氧化鐵(FeOOH)，并具有5-100nm顆粒尺寸及在NMR診斷中用作造影劑、作為信息存儲介質、封裝劑或抑制劑或用于細胞標記的磁性膠體可在下面的專利中找到，在這里附上作為參考美國專利US 5,492,814，5,221,322，4,647,447，4,827,945，4,329,241，3,215,572，3,917,538，DE-OS 350 8000，DE-OS 39 33 210，DE-OS 39 33 210，EP 0 275 285，PCT/IL99/00275，EP 0 586 052。
具有上述特性并因而適合在聚合物基質中封裝的其它物質包括，如具有通式MOFe2O3的鐵素體，其中M是二價金屬離子或二價金屬離子的混合物或金屬鎳或鈷。
具有各種摩爾比(2∶1，0.5∶1至4∶1)的鐵(III)和鐵(II)鹽溶液形成生產磁鐵礦或γ-Fe2O3的基礎，然后通過加入堿或加熱轉化成相應的膠態磁性分散體(“磁性膠體”)。為了阻止由于范德華力而引起的細磁性顆粒的凝聚，可加入表面活性劑，公知的名稱為“表面活性劑”，“乳化劑”或“穩定劑”，以實際阻止在水性分散中膠體的沉淀。這些穩定化膠態分散體已知為“鐵磁流體”(參見Kaiser and Miskolczy，J.Appl.Phys.，413，1064，1970)。它們也是商業上可得到的(Ferrofluidics Corp.，USA；Advanced Magnetics，USA；Taibo Co，Japan；Liquids Research Ltd.，Wales；Schering AG，Gemany)。
使用的穩定劑是陽離子、陰離子或者非離子物質。適合的化合物包括如烷芳基聚醚硫酸鹽、月桂基磺酸酯、烷芳基聚醚磺酸鹽、磷酸酯、醇醚硫酸鹽、檸檬酸鹽、油酸、烷基萘磺酸鹽、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸或石油磺酸鹽作為陰離子物質，十二烷基三甲基氯化銨作為陽離子表面活性劑，及壬基苯氧基聚縮水甘油、聚乙烯醇、煤油、烷芳基氧化聚乙氧基乙醇、壬酚或聚乙二醇作為非離子物質。公知(見引用的參考文件)由上述制備方法生產的磁性膠體的顆粒尺寸取決于如鐵鹽比例、堿的濃度、pH值和溫度的各種試驗參數。
適于本發明介質的磁性膠體均具有5-1000nm的顆粒尺寸，優選10-500nm。這保證磁性膠體在隨后的封裝在聚合物基質中的過程中以良好分散形式存在。通過選擇性、定量加入相應量的適當膠體，該聚合物載體的磁性特性和類似地加熱特性可被特別地控制。
在單體配方中該磁性膠體濃度通常為10-30體積％，由此該磁性物質相對于單體相的固體含量一般為5-40重量％，優選10-30重量％。
除磁性膠體之外，作為一種方案，金屬膠體也可以被封裝在聚合物基質中。在高頻交變場中可被感應加熱的膠態或良好分散形式的所有金屬物質原則上都是合適的。由于根據本發明介質的生理學應用代表現了本發明的一方面，優選使用在生理學上無害的和/或在化學-物理上惰性的那些可被感應加熱的金屬膠體，包括第8族至第11族的金屬(1986年IUPAC定義)，因此由于生物相容性優選使用金、銀、鈀和鉑膠體或相應的粉末。根據本發明用于介質的金屬膠體通常具有5-300nm的顆粒尺寸。由于其在可見光區中的特別吸收特性，這些膠體長期在生物分析中用于測定蛋白質和核酸，這些膠體，尤其是金膠體的生產對于本領域的技術人員來說是公知的Ackerman等，J.Histochem.Cytochem.，Vol.31，433，1983，Geoghagen等，J.Histochem.Cytochem.，Vol.24，1187，1977，Wang等，Histochem.，Vol.83，109，1985，Birell等，J.Histochem.Cytochem.，Vol.35，843，1987，Khler等，Sensors &Actuators B，Vol.76，166，2001，Moeremans等，Anal.Biochem.，Vol.145，315，1985，Englebienne，Analyst，Vol.123，1599，1998，and美國專利US6,361,944。如本領域的技術人員所知，它們都是通過相應金屬鹽的還原或通過金屬噴霧方法而生產的。大量的金屬膠體或粉末也可從商業得到(Sigma，Aldrich，Fluka)。
金屬膠體和相應粉末兩者都可用于根據本發明的介質和方法中，在聚合前，這些物質以想要的濃度混和到單體配方中。在聚合物和/或顆粒中金屬通常占5-40重量％。
在加入膠體后，使用超聲探頭或超聲浴將膠體-單體混合物短暫地暴露在超聲波下以確保膠體的良好分散是有利的。膠體的均勻分布使得熱量在聚合物基質中有一相應的更好消散，隨之又保證封裝的活性劑連續地釋放。
N-異丙基丙烯酰胺和/或N-取代的丙烯酰胺，如N-環丙基丙烯酰胺、N-環丙基甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-n-丙基甲基丙烯酰胺、N-異甲基丙烯酰胺、N，N’-乙基甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、丙基甲基丙烯酰胺以及N-丙烯酰基吡咯烷酮或N-丙烯酰基哌啶被用作聚合物基質和納米級或微粒載體的熱敏單體。正如所知道的(參見參考文件)，聚-N-異丙基丙烯酰胺由于其特別的化學結構具有27和38/40℃之間的相轉化溫度，在超過這一溫度時在凝膠體中導致一個清楚的收縮過程。為了生產通常用作5-30％溶液的熱敏聚合物，依據聚合物載體的形式和預定的用途而使用兩種基本的方法a)在溶液中的自由基聚合；b)在分散狀態下的自由基聚合。
后者包括常見的方法如使成珠聚合法、懸浮聚合法、乳液聚合法、噴霧聚合法和沉淀聚合法以生產良好分散的聚合物顆粒。已證明在分散或懸浮聚合中生產根據本發明介質特別有利，其中單體混合物通過與相應膠體一起攪拌而懸浮在不能與水混合的有機相中，并由此進行自由基聚合(“逆向懸浮聚合”)。
在懸浮聚合中使用的這些有機相的例子是公知的Johansson andMosbach，Biochem.Biophys.Acta，Vol.370，339，1974。在這里主要使用如甲苯或苯的芳香烴、氯化烴、脂族烴或礦物和植物油。
令人驚奇的是，具有5-10(cal/cm3)1/2的極性溶解參數的烴被證明特別適于根據本發明的介質和方法，因而被K.L.Hoy引用的溶解參數(″Tables of Solubility Parameters″，Union Carbide Corporation，SouthCharleston，1969)被用作本發明的依據。在本發明使用的例子為1，2-二氯丙烷、1，1，2-三氯乙烷、三氯乙烯、溴三氯甲烷、四氯甲烷、1，1，1，2-四氯乙烷、氯仿、2，3-二氯丙醇、1，2，3-三氯丙烷。
除使用相應的有機溶劑之外，加入一定的表面活性劑物質促進了聚合物顆粒涉及分散性的質量，其例子包括聚氧化乙烯加成物的衍生物、烷基磺基丁二酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酯、聚氧化乙烯丙烯嵌段共聚物、烷基苯氧聚乙氧基乙醇、脂肪醇乙二醇醚磷酸酯、脫水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖硬脂酸棕櫚酸酯、脂肪醇聚乙二醇酯、聚甘油酯、聚氧乙撐醇、聚氧化乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯和聚氧化乙烯酸，本發明不限于此。為了將由懸浮過程生產的聚合物滴尺寸減小到小于1μm，0.3-15重量％，優選0.5-5重量％的一種或多種表面活性劑通常被加入到分散相中。
這些顆粒尺寸首先是適于在體內的生物醫學應用。具有20-200nm大小的顆粒優選作為在DNA診斷中的反差劑，和作為在薄膜中產生可調節的孔的寬度的生孔物質，100-500nm的顆粒特別作為藥物庫，用于選擇性應用活性劑，例如治療劑、診斷劑或預防劑形式的活性劑。這些顆粒尺寸在體內應用中持久地維持穿透組織的能力。如果以聚-N-異丙基丙烯酰胺顆粒為媒介來設定膜中的確定的孔寬度，則類似的情形也是適用的。通過在無規塑料基質中插入聚N-異丙基丙烯酰胺納米顆粒，可產生通過感應加熱和隨后的冷卻尺寸在10％-80％之間減小及放大的孔。
分散過程通常使用常規的KPG攪拌機或分散機進行。具有600-1500rmp攪拌速度的常規螺旋槳式攪拌器對于10-500μm的顆粒尺寸是足夠的。小于10μm的顆粒尺寸通常通過大于1500rmp的攪拌速度實現。另一方面，對于小于1μm的顆粒尺寸僅需要具有大于2000rmp的混合速度的分散機。所有按照轉子-定子原理工作的攪拌器都可用于此目的。在這些高速混合速度下，實驗優選在氬或氮氣環境或真空下進行，以在很大程度上排除可能永久影響分散質量的空氣的介入。
對于特別在生物醫學領域的應用，可證明聚-N-異丙基丙烯酰胺均聚物不能單獨地用于體內應用。這涉及聚-N-異丙基丙烯酰胺的相轉化溫度，由于制造原因該溫度通常在27-38℃之間。由于該溫度已低于正常體溫，這意味著已發生了聚合物凝膠物理結構的預期和應用相關的改變。為了使這些特別的特性仍然用于體內應用，令人驚奇地顯示出相轉化溫度可通過N-異丙基丙烯酰胺與含有羧基基團的共聚單體的的共聚合而升高，以致使根據本發明介質的功能可結合感應熱被完全地利用。
因此，共聚單體含量在0.02-3mol％之間的納米和微粒的丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物在高于40℃溫度下顯示出最大收縮。作為加入部分帶電的羧基的結果是該聚合物凝膠的基本的溶脹，以便通常引起凝膠體收縮的疏水相互作用力在升高的溫度大大降低。在中性pH條件下38℃放置4分鐘后，具有平均顆粒尺寸3.4μm和丙烯酸含量為1mol％的微粒凝膠體顯示出的流體動力學顆粒直徑與室溫(20℃)下的值相比有18％的減小，另一方面，相同的載體其它條件相同在大于45℃下顯示出大于40％的收縮率。
除了收縮度外，高溫也加速收縮運動。因此，在45℃下的收縮過程通常比在35℃下的收縮快1.5到3倍。
聚合物凝膠體由于含有羧基的共聚合單體的溶脹現象也可被用于優化凝膠的對于各自的封裝任務的孔尺寸和孔結構。具有大于500kDa分子質量的高分子生物分子，如IgM抗體和半乳糖苷酶通常在合理長的時間(幾分鐘)內不能從N-異丙基丙烯酰胺均聚體中擴散出來。在這種情況下孔通道太小。由于與所述的具有羧基基團的共聚單體的共聚合，該孔也可擴大以使這種生物分子也能擴散。共聚單體的含量為0.01-2mol％足以導致必要的結構和特性藥征。
除了共聚合外，作為支持收縮動力的參數，在聚合前加入到單體混合物中的某些物質可令人驚奇地有助于收縮過程中的孔擴大和加速。通常以2-30重量％，優選2-20重量％存在的該類型物質為例如可根據Stber等，J.Colloid Interface Sci.，Vol.26，62，1968的方法而被制造的納米級二氧化硅顆粒，以及聚乙二醇或聚氧化乙烯，在各種情況下具有200-5000的分子質量，還有具有500-10,000分子質量的多糖或改性的多糖。因此，5-15體積％(相對于單體溶液)的含有聚乙二醇(分子質量為400)的聚-N-異丙基丙烯酰胺顆粒(平均顆粒尺寸18μm)當加熱到大于45℃時在3分鐘內一般損失5-20％的水，然而具有大于30％聚乙二醇含量的相同顆粒在其它條件相同的情況下在3分鐘內損失50-80％的水。這種伴隨著聚乙二醇含量的增加的水損失增加也伴隨著收縮動力的相應增加，這對于封裝在聚合物載體中活性劑的釋放動力學具有直接影響。因此，活性劑的釋放通常可通過加入這種生孔物質而被加速1.5-5倍。
生產納米級和微粒聚合物載體的進一步方法是在聚合過程中接枝N-異丙基丙烯酰胺到預先合成的、球形的、磁性聚合物內核上或用N-異丙基丙烯酰胺包圍和封裝該聚合物。這意味著除上面描述的懸浮聚合外，例如沉淀聚合和乳液聚合的其他不同的聚合可被用于生產根據本發明的介質。這也開辟了獲得例如特別通過乳液聚合生產的理想球形和單分散的載體的可能性。新產品的特性也可借助于該過程和顯著地擴展該新產品應用范圍的產品結合而實現。例如，剛性核心聚合物如聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚縮水甘油基甲基丙烯酸酯、硅膠、聚酰胺和聚酯有助于改善聚合物載體的機械特性，以致于這些物質可被用作柱色譜法的載體介質。
通過柱分離物質的感應加熱，聚合物改變了其物理特性，從原來非常親水到相對疏水。該改變對載體介質的分離和洗脫性能具有相當大的影響。作為親水-疏水相轉化的結果，比在相轉化之前多高達60％的蛋白質如白蛋白、纖連蛋白、纖維原蛋白和IgG-抗體通常保留在分離柱上。另外，分離介質的分離性質通過接通磁場在通過期間可被顯著地改變，從而用于使很難分離的物質有更好的分離質量。這里的例子包括僅具有微小分子量差異的蛋白質、低聚核苷酸的分離，以及類固醇的分離，其在相變溫度以上的保留時間一般增加達70％。
適合于生產熱敏聚合物載體的其它磁性核心聚合物是可生物降解的或具有高生物相容性的基質。這意味著載體基質特別在體內的應用可被顯著地改善。這些基質的例子為右旋糖苷、明膠、聚交酯、聚乙交酯、硅膠、淀粉、殼聚糖、白蛋白、聚氰基丙烯酸鹽、藻朊酸鹽、聚乙烯醇、瓊脂糖、聚乙二醇和聚氧化乙烯。這些磁性基本聚合物的生產在上述的參考文件中作了說明。
磁性核心聚合物以兩種不同的方式引入到基質中a)通過N-異丙基丙烯酰胺的自由基引發接枝聚合或輻射引發的接枝聚合，及b)通過在合成過程中核心聚合物的簡單聚合。
通過輻射引發和在鈰(IV)鹽存在下的自由基接枝方式的聚合物基質的被覆是本領域的技術人員公知的，通常使用輻射劑量0.2-1Mrad(2to 10kGy)或存在0.05-0.4摩爾的鈰(IV)鹽溶液中與10-30％的N-異丙基丙烯酰胺水溶液進行。相應的方法可在DE-OS 4129901，DE-OS3811042，Müller-Schulte and Horster，Polymer Bull.，Vol.7，77，1982，Müller-Schulte and Thomas，Radiat.Phys.Chem.，Vol.35，93，1990，Müller-Schulte，Radiat.Phys.Chem.，Vol.42，891，1993，Tripathy等，J.Appl.Polymer Sci.，Vol.81，3296，2001，Gupta等，Biomacromolecules，Vol.2，239，2001，Matsuoka等，Polym.Gels & Networks，Vol.6，319，1998，和Li等，Radiat.Phys.Chem.，Vol.55，173，1999中找到，以便它們可被本領域的技術人員在任何時候使用。
類似于使用反向懸浮聚合的聚合物載體的生產，令人驚奇的發現在與N-異丙基丙烯酰胺接枝的過程中，與含有羧基的單體，如丙烯酸或甲基丙烯酸的共接枝也是特別有利的，因為羧基的引入導致與純接枝聚合物相比急劇地改善了收縮的動力學。因而，當由30℃加熱至45℃時，不能在水中溶脹的接枝度大于40％且丙烯酸占1-5％摩爾的N-異丙基丙烯酰胺接枝的核心聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯，通常具有50％-75％的收縮度；而當丙烯酸含量小于1％摩爾時，收縮度均低于50％。另外，如果接枝配方中N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸的摩爾比不變，則收縮度隨著總的接枝度的增加而增加。
通過已知的乳液、懸浮或沉淀聚合或通過懸浮交聯方法生產核心聚合物，懸浮交聯方法描述在下面的出版物中Li等，J.Microencapsulation，Vol.15，163，1998，Quellec等，J.Biomed.Mat.Res.Vol.42，45，1998，Hua等，J.Mater.Sci.Vol.36，731，2001，Kriwet等，J.Contr.Release，Vol.56，149，1998，Chu等，Polym.Bull.，Vol.44，337，2000，“Methods in Enzymology”，Vol.112，Part A，Widder and Greeneditors，Academic Press，Inc.，Orlando，1985。
核心聚合物的顆粒尺寸可根據需要設定在50-1000nm之間。
本發明的關鍵特征為通過原始混合物的組成對聚合物載體目標特性的確定，例如磁性特性、功能性或多孔性。對于封裝的活性劑釋放行為具有重要影響的變量-多孔性，主要通過在單體配方中的交聯劑濃度來確定。單體配方通常包括0.1-10％的交聯劑(相對于總單體含量)，優選0.5-5％。小于1％濃度的交聯劑通常用于生產高多孔性的載體(孔寬大于50nm)。一般地，與單體混合物形成穩定共聚物的二-或三官能團單體可被用作交聯劑。這種二-或三官能團單體的例子包括N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1，1，1，-三-(羥甲基)丙烷三丙烯酸酯、3-(丙烯酰氧)-2-羥丙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸烯丙酯和丙烯酸乙烯基酯。
公知的自由基試劑被用于引發聚合。聚合可通過結合加入N，N，N’，N‘-四甲基乙烯二胺(TEMED)和過硫酸銨(APS)而大大加速。TEMED和APS相對于單體相的濃度(通常是10-40％水性溶液)，TEMED為2-8體積％，APS為2-10體積％，由此TEMED和APS濃度的增加通常伴隨著聚合速度的成比例的增加。這樣，聚合和因而聚合物顆粒的形成可在大約幾分鐘內完成，根據現有技術該過程通常需要24小時。
對于生物醫學的應用，已證明與具有適于耦聯的基團的那些功能乙烯基單體共聚合的聚-N-異丙基丙烯酰胺是有利的。適用于本發明的共聚單體是可以與N-異丙基丙烯酰胺聚合，并且具有適于以氨基、羧基、環氧基、羥基、異硫氰酸酯、異氰酸酯或醛官能團的形式偶聯的基團的共聚單體。不限制本發明的這些共聚單體的例子包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、2-羥乙基甲基丙烯酸酯、2-異氰酰乙基甲基丙烯酸酯、丙烯醛、羥丙基甲基丙烯酸酯、2-羧基異丙基丙烯酰胺。
該類型共聚合開辟了耦聯例如抗體、細胞受體、抗細胞受體抗體、核酸、低聚糖、凝集素和抗原的生物親合配體到聚合物載體的可能性，由此該熱敏載體可指向特定的目標物質如細胞、生物分子、病毒、細菌或組織間隙和/或根據親和力原理選擇性地附著在這些目標器官上。該聚合物載體因而可通過耦聯直接對抗細胞表面的結構，如CD2，CD3，CD4，CD8，CD19，CD14，CD15，CD34和CD45(“分化群”)的抗體而特異性地附著在T-細胞，B-淋巴細胞，單核細胞，粒細胞，母細胞和白細胞上。
結合可外部控制結構改變的根據本發明的聚合物載體的特別應用令人驚奇地開辟了開發新的整體活性結合的可能性。其中包括使用聚合物顆粒在NMR診斷方面作為新型對比強化介質，并與此相應地作為活性劑可控制應用的基礎。從現有技術已知(DE-OS 3508000，美國專利US 5,492,814和4,647,447)超順磁性、鐵磁性或順磁性物質導致在NMR診斷(例如磁共振斷層掃描，MRT)方面成像期間對比度的顯著增強，隨之又使通過病理過程(例如在早期腫瘤和微轉移的檢測)良好的定位和分類而得到更精確的診斷。
結合生物親和配體與聚合物基質的耦聯，使得在被分析的(細胞)組織中聚合物顆粒特別富集，根據本發明的介質令人驚奇地幾乎可同時被用作治療的活性劑的載體和高靈敏的診斷指示劑。
與定向抗腫瘤細胞抗原的那些抗體或抗體片段耦聯最初產生選擇性集中聚合物載體在腫瘤組織中并附著聚合物載體到腫瘤細胞的前提。這些腫瘤標記物和/或抗體的例子，但本發明并不限于此，包括腫瘤-相關移植抗原(TATA)、瘤胎抗原、腫瘤-特異性移植抗原(TSTA)、p53-蛋白質、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤抗原(MAGE-1，MAGE-B2，DAM-6，DAM-10)、粘蛋白(MUC1)、人表皮受體(HER-2)、甲胎蛋白(AFP)、螺旋抗原(HAGE)、人乳頭瘤病毒(HPV-E7)、caspase-8(CASP-8)、CD3、CD10、CD20、CD28、CD30、CD25、CD64、白細胞介素-2、白細胞介素-9、乳房-CA抗原、前列腺-特異性抗原(PSA)、GD2抗原、黑色素皮質素受體(MCIR)、138H11抗原。相應的抗體可隨意地使用單克隆或多克隆抗體、抗體片段(Fab，F(ab‘)2)、單鏈分子(scFv)、“微型雙功能抗體(diabodies)”、“微型三功能抗體(triabodies)”、“微抗體(minibodies)”或雙特異性抗體。
對于腫瘤的并聯治療，癌癥治療所用的腫瘤藥物和細胞生長抑制劑被封裝在聚合物顆粒中。其例子包括氨甲葉酸、順鉑、環磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、氟尿嘧啶、阿霉素、呋氟尿嘧啶或這些物質與蛋白質、肽、抗體或抗體片段的結合。該類型的結合對于本領域的技術人員來說是公知的“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology，Reisfeld and Sell，Editors，Alan R.Riss，Inc.，New York，1985。
耦聯生物活性物質如蛋白質、肽、低聚糖或核酸到固體載體的公知方法被用于將生物和親和配體或受體共價結合到聚合物載體(參見“Methods in Enzymology”，Mosbach，editor，Vol 135，Part B，AcademicPress，1987)。在這里使用的耦聯劑包括，例如tresyl chloride、甲苯磺酰氯化物、氰溴化物、二亞胺碳、表氯醇、二異氰酸酯、二異硫氰酸鹽、2-氟-1-甲基-吡啶-甲苯-4-磺酸鹽、1，4-丁二醇-二環氧甘油醚、N-羥基丁二酰亞胺、氯碳酸鹽、異腈、酰肼、戊二醛、1，1′，-羰基-二咪唑。而且，生物配體也可與起反應的異雙官能團化合物耦聯，該異雙官能團化合物可進入到具有基質官能團(羧基、羥基、巰基、氨基基團)和生物配位體的化學鍵。本發明意義上的例子為丁二酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基-甲基)-環己烷-1-羧酸酯、4-丁二酰亞胺基氧羰基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯、丁二酰亞胺基-4-(p-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯、N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基丁二酰亞胺、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼、磺基琥珀酰亞胺基-2-(p-疊氮基水楊基氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。本領域的技術人員根據“Ullmanns Encyclopdie der TechnischenChemie”，4th Edition，Vol.10，or G.T.Hermanson，“BioconjugateTechniques”，Academic Press，San Diego，1996”的信息可在任何時候使用這些耦聯劑。
該聚合物顆粒的磁性特性通過在分散到單體相之前直接混合合適的磁性膠體或金屬膠體或相應的顆粒而獲得。通過精確地混合膠體，該聚合物顆粒的加熱行為可選擇性地改變或調整。因此，具有10重量％含量的磁性膠體的水性分散體可以用30kA/m磁場幅度及0.8MHz頻率在30秒鐘內從室溫加熱到大約45℃。加熱值隨著磁性膠體含量相應升高而相應地增加。這些測定涉及在分散體中宏觀記錄的加熱率。在聚合物顆粒中產生的實際熱量因而相當高。對于根據本發明介質的應用，這意味著僅有幾秒鐘的非常短的一段感應時間對于引起通過加熱而觸發的刺激是足夠的。聚-N-異丙基丙烯酰胺凝膠在大于27℃下根據凝膠的成分已顯示出相對于原始體積的高達85％的顯著收縮。這里的收縮度取決于共聚單體的含量和共聚單體的類型，如上所述，還有交聯度。因此，具有小于1Mol％交聯度的凝膠通常具有60％-85％的收縮度，然而具有大于1Mol％交聯度的凝膠體的收縮度低于60％。
為了加熱上述磁性和金屬物質及化合物到相應于分析、治療和診斷應用的溫度，需要對磁場進行涉及磁場強度和磁場頻率的特殊設計。通常使用由高頻發電機饋電的載流線圈。該類型的線圈系統和高頻發電機是現有技術并且是商業可得的。線圈尺寸取決于各自樣品的尺寸；線圈尺寸一般為直徑5-30cm及長度5-30cm。高頻發電機的必要輸出通常為0.5-1.5kW。原理上可使用兩種發電設置以加熱磁性樣品a)具有100-500A/m低磁場強度的5-20MHz高頻，或b)與1-45kA/m高磁場強度結合的0.2-0.8MHz低頻。原理上兩個場參數的結合保證在短應用時間(小于1分鐘)內充足的熱量輸出。還可以利用較大的線圈(直徑30-40cm)，通過相應提高輻射較大體積區域的磁場強度至大于15kA/m，為加熱載體提供足夠的能量，例如，在將活性藥劑應用于人體特定部位的情形中。
由于產品和方法的特殊結合，根據本發明的聚合物載體可特別地作為用于活性劑的封裝的基質并作為阻塞血管的介質。
通過使用感應加熱，活性劑定量給藥和應用的系統可被產生以用于醫藥領域或分析，其特征在于非接觸的控制能力。一種活性劑可理解為一種以一種方式或其它方式觸發化學、生化或生理學反應的物質，因此產生治療、診斷和/或預防疾病的效果，或可完成分析的功能。例子包括生物學活性蛋白質或肽、酶、抗體、抗原、核酸、糖蛋白、外源凝集素、低聚糖、荷爾蒙、脂類、生長因子、白細胞介素、細胞因子、類固醇、疫苗、抗凝血劑、細胞抑制劑、免疫調節劑或抗生素。
為此，將活性劑封裝在聚合物顆粒中。此過程通過在單體混合物中直接混合相應的活性劑或通過以加熱與預先收縮的聚合物載體一起孵育活性劑來進行。由收縮過程產生的聚合物凝膠的濃度梯度引起活性劑在凝膠體內擴散。
第一封裝變型的問題是如蛋白質、抗體或荷爾蒙的部分非常敏感的活性劑在某些聚合條件下被損壞或失活。為了與該問題斗爭，令人驚奇地發現加入聚醇、糖、血清白蛋白和明膠是有用的，由于這些物質可永久地穩定活性劑而對抗聚合的影響。這些物質的例子中為肌醇、聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、醛醇(aldonite)、赤蘚醇、蔗糖、甘油、木糖醇、果糖、葡萄糖、半乳糖或麥芽糖，在單體配方中這些物質的濃度通常為0.1-5重量％。
以這種方式生產的載有相應活性劑的載體可借助如注射、植入、滲透、擴散、流動(streaming)或活組織檢查的已知給藥方法應用于想要的生理學或生物分析作用部位。磁性顆粒的局部應用可通過使用從外部放置在反應區或作用部位上的電或強永磁鐵將顆粒準確地定位在想要的位置以進一步強化。一旦聚合物顆粒達到它們的作用部位，它們可通過使用位于聚合物載體的實際作用和/或反應部位以外的高頻交變磁場被加熱到相應的相轉化溫度。產生的熱量誘導聚合物凝膠的收縮過程，該過程觸發封裝的活性劑從基質中快速釋放。
原理上活性劑從凝膠體擴散所需的時間取決于凝膠體的尺寸、活性劑的摩爾量、凝膠體的溫度和載體交聯度。一般地說，低交聯凝膠體(0.1-1％交聯度)及納米級顆粒和微粒使活性劑快速擴散，比高交聯的聚合物(大于1％交聯度)或宏觀凝膠體快。于是，當加熱至大于40℃時，80％的小分子激素，如加壓素、胰島素、睪丸素、可的松及抗生素、細胞生長抑制劑(分子量小于kDa)在1分鐘內，從平均粒徑為430nm的1％交聯納米級顆粒中擴散出來；而相同活性劑在大約5μm的凝膠中卻需要5～10分鐘左右。高分子活性劑如白蛋白、IgG-抗體、纖維原蛋白、乳酸脫氫酶在類似的條件下需要相應更長的時間大于10分鐘。為了改變活性劑的釋放率，根據本發明的介質如上所述提供了大量可調節和可改變的參數，如顆粒尺寸、共聚單體含量、共聚單體類型、加熱和/或交聯度，可改變載體介質的特性以使根據各自的任務作出最佳的調節。
關于磁感應，第一次創造了開發聚合物載體結構特性的改變的基礎以得到非接觸、可控制活性劑的應用。
根據本發明的介質和方法也允許反向應用該載體溶脹行為，其通過從通過預先加熱已被大大收縮的載體開始，然后通過低于相轉化溫度的冷卻過程而恢復到其原始溶脹的形態和/或幾何形狀。該現象可應用在治療抗腫瘤措施的方面中。在腫瘤生長期間致命的病理進程之一是血管生成。一般認為是在腫瘤組織中血管形成的大量散布。到目前為止主要使用藥物治療(或通過手術)的該病理過程現在可借助于本發明的介質令人驚奇地抑制或大大地推遲。預先已通過感應被加熱到高于45℃并且因而達到其最大收縮度的顆粒，優選是具有0.3-5μm顆粒尺寸的顆粒被引入到腫瘤組織中。作為隨后適應于體溫的結果，顆粒開始溶脹并在幾分鐘之后達到平衡的溶脹狀態。在該溶脹狀態下，聚合物載體具有栓塞(embolising)功能，即它們可阻塞血管并因而與腫瘤的生長作斗爭。
該特殊功能特別通過這些相變溫度已經通過例如共聚而提高的聚合物顆粒展現出來。特別適合的載體是那些如上所述的具有含羧基的共聚單體的載體。具有共聚單體含量為0.05-1mol％并且最大收縮溫度為高于40℃的載體在該情況下是優選。具有特別寬范圍尺寸的顆粒適合于在實踐中與血管生成作斗爭，因為它們使所有寬度的血管立刻被阻塞。
具體實施例方式
基于下面的實施例將對本發明進行更詳細地描述。
實施例110ml 0.1M的Na-磷酸鹽緩沖液，pH值7.2，含有從n-己烷、5％丙烯酰胺和0.6％N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺中重結晶的15％N-異丙基丙烯酰胺，及含有根據Shinkai等，Biocatalysis，Vol.5，61，1991的說明生產的2.2mM Fe/ml(平均顆粒尺寸為26nm)的2.5ml水磁膠體，一起混合并在超聲波浴(250W)中暴露于超聲波下5分鐘，同時用冰冷卻。然后，氮被引入到混合物中15分鐘以除去過量的氧。由0.1mg抗-p53-抗體(Roche Molecular Biochemicals)、0.05％人血清白蛋白，2％肌醇和0.5％明膠組成的水性溶液加入到該混合物中。它在超聲波下再暴露30秒鐘，同時用冰冷卻。然后，在氮氣存在下，于4℃的熱受控的分散容器(Ultra-Turrax LR 1000，IKA Werke)中，一邊攪拌(15,000rpm)一邊將水相與2毫升包含0.5％的Igepal 720的30％過硫酸銨溶液(APS)混合，接著使之懸浮于150毫升預先用氮氣通氣20分鐘并包含1.5％由80％Span 85和20％Tween 20組成的混合物的三氯乙烯中。10秒鐘后加入1ml N，N，N’，N’-四甲基乙烯二胺(TEMED)。懸浮過程在持續提供氮和冰冷卻下持續5分鐘。該分散體無需攪拌再靜置20分鐘以進行聚合。然后將分散液放置在裝有稠密鋼絲絨的玻璃柱中(裝填體積大約10ml；內徑0.5cm)，四周環繞著長5厘米的環形釹-硼-鐵磁體，并使混合物通過玻璃柱緩慢地滴下(0.5ml/min.)。之后，用含有10％乙醇、2％肌醇和1.5％聚乙烯醇(分子量Mw5000)的約20ml Na-磷酸鹽緩沖液洗滌10次。接下來用蒸餾水洗滌5次，然后以pH值為7.2、0.05M Na-磷酸鹽/1％肌醇緩沖液洗滌3次。在除去磁體之后，然后用5ml pH為7.2的0.1M Na-磷酸鹽緩沖液洗脫玻璃柱上的磁性聚合物餾分。以這種方式獲得的洗脫物然后冷凍干燥。在再分散于pH值為7.5、2ml的0.05M Na-磷酸鹽/0.1％人血清白蛋白(HSA)/0.1％聚乙二醇(PEG，Mw1000)緩沖液后，獲得平均顆粒尺寸為170nm的磁性聚合物顆粒。所獲得的該顆粒在交變磁場(磁場30kA/m；0.6MHz，線圈直徑5.5cm，8個圈)處理后2分鐘內其尺寸減小了43％。
以這種方式獲得的顆粒可用作在NMR診斷方面的對比強化介質并用于腫瘤治療。
實施例2鈷-鐵氧體納米顆粒(CoFe2O4)根據Sato et al.，J.Magn.Magn.Mat.，Vol.65，252，1987的說明從CoCl2和FeCl3生產，并借助于高功率超聲探頭(由Dr.Hielscher制造，80％振幅)在0.75％聚丙烯酸(Mw5.500)存在下30秒鐘分散在水中，5ml具有21nm顆粒尺寸的含有1.9mMFe/ml的膠體與20ml已溶解了15％N-異丙基丙烯酰胺、6％丙烯酰胺、1％丙烯酸、0.5％Igepal 520和0.8％N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的高純和脫氣的水混合。該混合物再一次暴露在使用超聲探頭的超聲波下1分鐘，同時用冰冷卻，然后在超聲波浴下30分鐘。加入2ml 40％APS后，在引入氮氣和在冰冷卻下的熱受控的分散容器(Ultra-Turrax LR 1000，IKA Werke)中，該混合物在冰冷卻和引入氮氣的情況下借助分散機(Ultra-Turrax，IKAWerke，100000rpm)分散于300ml包含6％由Tween80和Span 85(72％28％)組成的混合物的1，1，1-三氯乙烷中。1mlTEMED在10秒鐘后加入。該分散過程持續5分鐘。該反應混合物然后在10℃下靜置20分鐘以完成反應。然后，該產物類似于實施例1被分離和洗滌。在用5ml pH值為7.4的0.1M Na-磷酸鹽緩沖液洗脫后，用5L pH值為7.4的0.01M Na-磷酸鹽緩沖液滲析3天。獲得具有平均顆粒尺寸245nm的磁性顆粒。2ml獲得的磁性顆粒餾分放在磁性分離柱中(參見實施例1)，然后用0.01M HCl溶液洗滌3次，并用高純水洗滌5次。在除去磁體后，加入2ml pH值為4.2的0.1M 2-嗎啉基-乙烷磺酸(MES)/0.5％PEG(Mw1000)緩沖液以洗脫在柱上的磁性顆粒。其中溶解了0.2mM N-環己基-N′-(2-嗎啉代乙基)-碳二亞胺-甲基-p-甲苯磺酸酯的0.5ml pH值為4.2的0.1M MES緩沖液被加入洗脫。該混合物在室溫下輕微振蕩30分鐘。隨后的通過填充有鋼絲棉的分離柱的流過分離任何過量的N-環己基-N′-(2-嗎啉乙基)-碳二亞胺-甲基-p-甲苯磺酸，然后保留的磁性顆粒餾分在各種情況下用15ml的冰水洗滌5次。在除去磁體后，用1.5ml pH值為5.5的0.05M MES緩沖液洗脫。洗出液與0.5ml的相同MES緩沖液混合，其中1.25×10-4mM抗-CD30-Fab-片段被溶解并與抗體片段在4℃耦聯超過12小時。該結合物在填充鋼絲棉的柱上被分離，然后在各種情況下用10ml冰冷的pH值為7.2的0.05M Na-磷酸鹽/1％肌糖/0.1％HAS緩沖液洗滌10次。接下來用pH值為10.5的0.05M甘氨酸緩沖液洗滌5次，然后用蒸餾水洗滌2次。在除去手持磁鐵(hand magnet)后，磁性餾分用2ml pH值為8.5的0.1M三氨基甲烷鹽酸緩沖液(Tris/HCl)洗脫5次。該洗出液用3ml pH值為8.5的含有1M甘氨酸的Tris緩沖液在室溫下孵育12小時以鈍化任何殘余的碳二亞胺。然后，該磁性餾分通過磁性柱分離出來，并用pH值為7.5的0.05M磷酸鹽緩沖液/0.05％HSA洗滌10次。在用2ml pH值為7.5的0.05M磷酸鹽緩沖液/0.05％HAS成功洗脫磁性結合物后，磁性顆粒可按照已知的應用方法使用，作為在NMR方面診斷的對比強化介質以診斷Hodgkin′s淋巴瘤。
實施例37.5ml pH值為7.2的0.1M磷酸鹽緩沖液，在其中溶解了20％N-異丙基丙烯酰胺、4％丙烯酰胺、1％N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺和2.4％2-羥基-甲基丙烯酸酯，用氮氣洗滌20分鐘，然后與2.5ml磁鐵礦-鐵磁流體(EMG 507，FerroTec，USA)混合。該混合物在超聲波浴中暴露于超聲波5分鐘，同時用冰冷卻。然后加入2ml 1％明膠和含有0.1％HSA(InsumanBasal，100IU/ml)的胰島素溶液。加入1.2ml 35％APS溶液到水相后，在攪拌(1200rpm)和恒定的冰冷卻及連續的氮氣流下，分散在130ml三氯乙烯中，該三氯乙烯含有2.5％Span 60和1％吐溫80。20秒鐘后，加入0.5mlTEMED，并在10℃下攪拌該混合物8分鐘。該反應混合物然后在15℃下靜置20分鐘以完成反應。然后，該磁性相類似于實施例1被分離且保留的產品被純化。在冷凍干燥和重復分散在2ml pH值為7.2的Na-磷酸鹽緩沖液/0.1％HSA/0.5％PEG(Mw1000)中后，獲得具有平均顆粒尺寸23μm的磁性顆粒。該顆粒暴露在磁場中(15kA/m；0.6MHz，線圈直徑5.5cm，8個圈)導致在3分鐘內55％的收縮，由此58％原始加入的胰島素被釋放。聚合物載體可用作糖尿病治療中的胰島素庫。
實施例4根據Müller-Schulte and Brunner，J.Chromatogr.A 711，Vol.711，53，1995的說明被生產的含有40重量％磁鐵礦的1g聚乙烯醇(平均顆粒尺寸為25μm)與4ml 20％水性N-異丙基丙烯酰胺溶液、0.5ml N-乙烯基吡硌烷酮、3ml丙酮和5ml甲醇混合。然后，該混合物用氬氣洗滌20分鐘，接下來用來自Cs137源(Gammacell 40)γ射線輻射45小時(總劑量3.4kGy)。然后，該接枝物質用乙醇提取20小時，接下來用水提取10小時。干燥到恒重后，產生出67重量％的接枝產量(相對于原始聚合物)。感應加熱到40℃導致62％的收縮度。以這種方式獲得的載體可用在柱色譜法中以分離蛋白質。
權利要求
1.一種含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，其物理結構可通過磁感應或供能被改變。
2.根據權利要求1所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物包括聚-N-異丙基丙烯酰胺，聚-N-取代的丙烯酰胺，聚-N-取代的甲基丙烯酰胺，選自包含N-異丙基丙烯酰胺、N-取代的丙烯酰胺和N-取代的甲基丙烯酰胺的組的單體的共聚物，或上述聚合物和/或共聚物的混合物。
3.根據權利要求2所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物含有一種或多種共聚物或嵌段共聚物，除所提到的單體之外，該共聚物或嵌段共聚物含有一種或多種共聚單體，優選選自含有羧基的單體的組，如丙烯酸、甲基丙烯酸，或選自丙烯酸酯、丙烯酸酯衍生物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物、丙烯醛、丙烯酰胺、N-取代的丙烯酰胺和醋酸乙烯酯。
4.根據權利要求2或3所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物含有一種或多種共聚物或嵌段共聚物，選自包含聚丙烯酸、聚丙烯醛、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、N-取代的聚丙烯酰胺及其混合物的組。
5.根據權利要求1-4任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物為納米級顆粒或微粒。
6.根據權利要求1所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，磁感應包括高頻、交變磁場。
7.根據權利要求1所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該物理結構的改變包括聚合物幾何形狀的改變。
8.根據權利要求7所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該幾何形狀的改變包括恢復到通過加熱引起形狀改變之前的聚合物所顯示的原始形狀(“形狀記憶聚合物”)。
9.根據權利要求1所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該物理結構的改變包括聚合物顆粒尺寸的增大和縮小。
10.根據權利要求1-9任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該磁性膠體包括具有小于1μm的顆粒大小的鐵磁顆粒、超順磁顆粒、亞鐵磁顆粒、低溫鐵素體或鐵磁流體。
11.根據權利要求10所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，低溫鐵素體具有30℃-100℃范圍的居里溫度。
12.根據權利要求1-11任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該金屬膠體包括第8、9、10或11族的元素(族分類IUPAC1986的新提議)。
13.根據權利要求1-12任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該磁性和/或金屬膠體以它們被包裹的核心聚合物的形式存在。
14.根據權利要求13所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該核心聚合物具有50-1000nm的顆粒尺寸。
15.根據權利要求13或14所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，封裝在該核心聚合物中的該磁性和/或金屬膠體以分散膠體的形式存在。
16.根據權利要求13-15任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該封裝核心聚合物選自殼聚糖、右旋糖苷、淀粉、聚丙烯酸、多糖、硅膠、硅酮衍生物、纖維素、蛋白質、白蛋白、聚丙烯酸類、瓊脂糖、藻朊酸鹽、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸鹽、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酯、聚氨基酸、透明質酸、聚交酯、聚乙交酯、聚丙烯醛及其共聚物的組。
17.根據權利要求1-16任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物含有0.1-30重量％的生孔物質。
18.根據權利要求17所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該生孔物質選自硅膠、蛋白質、核酸、聚乙二醇、聚氧化乙烯和多糖的組。
19.根據權利要求1-18任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物與二或三官能團的交聯劑交聯。
20.根據權利要求19所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該交聯劑相對于總單體含量具有0.1％-10％的濃度。
21.根據權利要求1-20任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物具有結合生物分子的反應基團。
22.根據權利要求21所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該結合基團與親合配體、肽、蛋白質、抗體、抗原、酶類、細胞受體抗體、抗腫瘤標記物抗體、抗體片段、人造抗體、改性抗體、抗體結合物、低聚糖、糖蛋白、血凝素、核酸、抗生物素蛋白鏈菌素或生物素反應。
23.根據權利要求1-22任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該聚合物含有封裝的活性劑。
24.根據權利要求23所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，其特征在于，該封裝的活性劑選自荷爾蒙、細胞生長抑制劑、抗體、抗體衍生物、抗體片段、細胞因子、免疫調節劑、抗原、蛋白質、肽、血凝素、糖蛋白、核酸、反義核酸、低聚糖、抗生素或普通試劑。
25.根據權利要求1-24任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，分散磁性和/或金屬膠體的單體溶液通過加入多官能團的交聯劑和自由基引發劑被自由基聚合成固體。
26.根據權利要求1-24任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，將磁性和/或金屬膠體分散于其中的水性單體溶液在加入多官能團交聯劑和自由基引發劑之后通過機械粉碎懸浮在不與水混溶的有機相中，并自由基聚合成納米顆粒或微粒。
27.根據權利要求1-24任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，將磁性和/或金屬膠體分散于其中的水性單體溶液在加入多官能團交聯劑之后通過機械粉碎懸浮在不與水混溶的有機相中，并在懸浮過程中，通過加入自由基引發劑而自由基聚合成納米顆粒或微粒。
28.根據權利要求25-27任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，N-異丙基丙烯酰胺、N-取代的丙烯酰胺、N-取代的甲基丙烯酰胺或其混合物被用作單體。
29.根據權利要求25-28任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，0.05-30mol％的共聚單體加入到單體溶液中。
30.根據權利要求29所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該共聚單體為丙烯酸酯衍生物、甲基丙烯酸酯衍生物、丙烯酸、丙烯醛、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、醋酸乙烯酯或其混合物。
31.根據權利要求25-30任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，具有小于1μm的顆粒尺寸的鐵磁、超順磁或亞鐵磁物質、或低溫鐵素體或鐵磁流體被加入到該單體溶液中。
32.根據權利要求25-31任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該鐵磁、超順磁或亞鐵磁物質、或低溫鐵素體以膠體或粉末形式存在。
33.根據權利要求26或27所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，分散封裝磁性和/或金屬膠體的納米顆粒或微粒核心聚合物被加入到該單體溶液中。
34.根據權利要求33所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該核心聚合物由殼聚糖、右旋糖苷、淀粉、聚丙烯酸、多糖、硅膠、硅酮衍生物、纖維素、蛋白質、白蛋白、聚丙烯酸、瓊脂糖、藻朊酸鹽、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸鹽、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚氨基酸、透明質酸、聚交酯、聚乙交酯、聚丙烯醛或其共聚物形成。
35.根據權利要求26和27所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，作為該有機相的溶劑具有5-10(cal/cm3)1/2的極性溶解度參數。
36.根據權利要求26和27所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，將0.05-15重量％的一種或多種表面活性物質加入到該有機相中。
37.根據權利要求36所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該表面活性物質選自烷基磺基丁二酸鹽、聚氧化乙烯芳基醚、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯山梨聚糖酯、聚氧化乙烯加合物、聚氧化乙烯丙烯嵌段共聚物、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇、脂肪醇聚乙二醇酯、聚甘油脂、聚氧乙撐醇、聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧化乙烯酸及其混合物的組。
38.根據權利要求26所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該單體溶液在分散于有機相中之前被預聚合5-120秒。
39.根據權利要求25-38任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，親合配位體、肽、蛋白質、抗體、抗原、酶類、細胞受體抗體、抗腫瘤標記物抗體、抗腫瘤抗原抗體、抗體片段、人造抗體、改性抗體、抗體結合物、低聚糖、糖蛋白、血凝素、核酸、抗生物素蛋白鏈菌素或生物素被結合到聚合物。
40.根據權利要求25-39任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該活性劑被封裝到聚合物中。
41.根據權利要求40所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該活性劑選自荷爾蒙、細胞生長抑制劑、抗體、細胞因子、免疫調節劑、抗原、蛋白質、肽、血凝素、糖蛋白、核酸、反義核酸、低聚糖、抗生素或普通試劑的組。
42.根據權利要求40或41所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，0.1-20重量％的多元醇、聚乙烯醇、明膠或碳水化合物加入到該活性劑中。
43.根據權利要求42所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該多元醇或碳水化合物選自肌醇、甘露糖醇、山梨醇、醛醇、赤蘚醇、蔗糖、甘油、木糖醇、果糖、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖的組。
44.根據權利要求40-43任一項所述的熱敏聚合物的制備方法，其特征在于，該封裝的活性劑因為磁感應或供能而被釋放。
45.根據權利要求1-24任一項所述的含有磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物的用途，其作為在NMR診斷中的對比強化介質，作為醫學治療和診斷中活性劑的載體，作為反應物的可控制的載體，作為控制微觀流體過程的介質，作為柱色譜法的分離介質，作為調節和調整膜孔尺寸的介質，作為阻塞血管的介質，作為人工細胞的載體，作為核酸、細胞、蛋白質、類固醇、病毒或細菌的分離介質。
全文摘要
本發明涉及一種包含磁性和/或金屬膠體的熱敏聚合物，該熱敏聚合物的物理結構可通過磁感應或通過使用動力而被改變，還涉及其制備方法，及該熱敏聚合物用于診斷和治療目的用途。
文檔編號A61K47/42GK1658902SQ03812675
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月28日 優先權日2002年6月1日
發明者德特勒夫·P·米勒－舒爾特 申請人:麥格納麥迪克斯有限公司