專利名稱：：治療腸梗阻的方法
技術領域：
：本發明涉及治療胃腸道疾病。
背景技術：
：一氧化碳(CO)氣體在高濃度時是有毒的。然而，現在認識到它是一種重要的信號分子(Verma等，Science259381-384，1993)。已有提示表明一氧化碳作為腦內的神經元信使分子(Id.)和下丘腦內的神經內分泌調節因子起作用(Pozzoli等.，Endocrinology7352314-2317，1994)。和一氧化氮(NO)一樣，一氧化碳是平滑肌的松弛劑(Utz等，BiochemPharmacol.47195-201，1991；Christodoulides等，Circulation972306-9，1995)并且抑制血小板的聚集(Mansouri等，ThrombHaemost.48286-8，1982)。在一些模型中，吸入低水平的一氧化碳顯示具有抗炎效果。腸梗阻(ileus)是一種特征為缺乏腸運動性的疾病，并且是腸阻塞(obstruction)的一種更常見的形式(見，例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。通常，腸梗阻見于整個腸道(例如大腸和小腸)，但有時只涉及腸道的一個或多個節段。腹部手術過程中的腸操作經常導致腸梗阻。已經提出了多種治療腸梗阻的藥物方法(見例如，美國專利5,362,756(非多托嗪(fedotozine))；5,929,035(神經肽)；6,214,843(pyrazolopyridine)；和5,958,407(例如拮抗型蛋白酶活化的受體-2))。
發明內容本發明部分基于這樣的發現給藥CO可減輕腸梗阻。相應地，一方面本發明涉及治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有或可能患腸梗阻的患者，以及給藥該患者包含有效量或濃度的一氧化碳的藥物組合物。腸梗阻可以是胃腸道任何部分的腸梗阻，例如胃，小腸和/或結腸。腸梗阻可以由任何導致腸梗阻的因素引起，例如腹部手術如移植手術(例如小腸移植(SITx))或除移植手術以外的腹部手術(即涉及剖腹術和不涉及剖腹術的腹部手術，例如腹腔鏡手術)，矯形手術(例如髖部手術)；分娩；腸缺血；腹膜后血腫，腹腔內膿毒癥；腹膜內炎癥，例如急性闌尾炎，膽囊炎(choecystitis)，胰腺炎；脊柱骨折；輸尿管絞痛；胸部損傷；基底肺炎(basalpneumonia)；肋骨骨折；心肌梗死；代謝障礙；或者這些疾病的任何組合。藥物組合物可通過本領域已知的任何將氣體，液體和/或固體給藥患者的方法給藥患者，例如通過吸入，吹入，輸注，注射，和/或攝取。例如，在本發明的一個實施方案中，所述藥物組合物通過吸入給藥患者。在另一實施方案中，所述藥物組合物通過口服給藥患者。在另一實施方案中，將所述藥物組合物直接給藥患者的腹腔。所述方法還可包括給藥所述患者除CO以外的以下治療中的至少一種在患者體內誘導HO-1或鐵蛋白；在患者體內表達重組HO-1或鐵蛋白；以及將包含HO-1，膽紅素，膽綠素，鐵蛋白，去鐵敏(desferoxamine)，鐵葡聚糖，或去鐵鐵蛋白的藥物組合物給藥該患者。本發明另一方面涉及治療患者的手術后腸梗阻的方法。所述方法包括鑒定患有術后腸梗阻的患者，并將包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥該患者。所述腸梗阻可以是胃腸道的任何一部分，例如，胃，小腸，和/或大腸(例如結腸)的腸梗阻。所述藥物組合物可通過本文所述的任何途徑給藥患者，例如通過吸入(氣體組合物)；口服；和/或直接給藥至患者的腹腔。本發明還涉及治療患者的腸梗阻的方法，所述患者患有或可能患不是由腹部手術造成的腸梗阻，例如由本文所述的除腹部手術以外的任何因素造成的腸梗阻。該方法包括鑒定患有或可能患不是由腹部手術造成的腸梗阻的患者，以及給藥該患者包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物。本發明另一方面涉及治療患者的腸梗阻的方法，其包括以下步驟提供包含含有一氧化碳氣體的加壓氣體的容器，鑒定患有或可能患腸梗阻的患者，將加壓氣體從所述容器中釋放出來以形成包含一氧化碳氣體的環境，以及將所述患者暴露于該環境，所述環境中一氧化碳的量足以治療患者的腸梗阻。本發明另一方面涉及對患者進行手術的方法。所述方法包括鑒定需要手術的患者，并且在進行手術之前，期間和/或以后使患者吸入足以治療患者腸梗阻的量的一氧化碳氣體。所述手術可以是任何導致和/或使患者可能患腸梗阻的手術。例如，所述手術可涉及對例如胃和/或腸，例如小腸或大腸(例如結腸)的胃腸道的操作(例如，接觸(直接或間接))，還可以是涉及剖腹術或不涉及剖腹術(例如涉及腹腔鏡的手術)的手術。在特定的實施方案中，所述手術可以是移植手術或非移植手術，例如涉及腹部的任何器官或組織的手術，例如泌尿生殖系統(例如腎，輸尿管，和/或膀胱；和生殖器官(例如子宮，卵巢，和/或輸卵管))；消化系統(例如，胃，小腸，大腸(例如結腸)，闌尾，膀胱，肝，脾，和/或胰腺)；淋巴系統；呼吸系統(例如肺)；膈；治療腹腔內任何器官或組織的癌癥的手術；子宮內膜手術；和矯形手術，例如髖部手術。另一方面，本發明提供了包含醫用級壓縮CO氣體的容器。所述容器帶有表明該氣體可用來治療腸梗阻的標簽，例如患者(例如人類患者)體內的手術造成的腸梗阻(例如涉及腸操作的手術)。CO氣體可以與氮氣混合，與一氧化氮和氮氣混合，或者與含氧的氣體混合。CO氣體在混合物中的濃度可以是至少約0.025％，例如至少約0.05％，0.10％，0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。本發明另一方面提供了治療患者的腸梗阻的方法，該方法包括鑒定患有或可能患腸梗阻的患者，以及給予所述患者以下治療中的任何一種和CO治療的聯合治療誘導患者體內的HO-1或鐵蛋白；在患者體內表達重組HO-1或鐵蛋白；以及將包含HO-1，膽紅素，膽綠素，鐵蛋白或去鐵鐵蛋白的藥物組合物給藥所述患者。還涉及CO以及以上列出的任何一種藥劑在制備治療或預防腸梗阻的藥物中的用途。本發明還涉及CO在制備治療或預防本文所述的疾病例如腸梗阻的藥物中的用途。所述藥物也可用在治療患者的腸梗阻和/或治療移植手術中的供體，器官，和/或受體的方法中。所述藥物可以是本文所述的任何形式，例如液體或氣體CO組合物。除非另有限定，本文的所有技術和科學術語具有的含義和本發明所屬領域的熟練技術人員通常所理解的一樣。適宜的方法和材料在下文中描述，但與其類似或對等的方法和材料也可用于本發明的實踐和檢測中。所有公開出版物，專利申請，專利，和其它本文提到的參考文件的全文內容都包含在本文中作為參考。如果有沖突，以本說明書，包括其中的定義在內為準。所述材料，方法和實施例只作為舉例，而不是意圖作為限制。本發明的一個或多個實施方案的細節在附圖和以下說明中詳述。本發明的其它特征，目的，和優點從說明書和附圖，以及權利要求書中明顯可見。圖1是線圖，顯示了小腸移植(SITx)以及CO處理對自發的和氨甲酰甲膽堿刺激的小腸環肌的收縮性的影響。▲＝對照；◇＝對照+CO；X＝SITx；■＝SITx+CO。圖2A是柱圖，其顯示CO對對照動物(未接受SITx的動物)的腸轉運(intestinaltransit)的影響。實心柱＝對照；條紋柱＝對照+CO(250ppm)；stom＝胃；sb＝小腸。圖2B是柱圖，顯示CO對經過SITx的動物的腸轉運的影響。實心柱＝對照；條紋柱＝對照+CO(250ppm)；stom＝胃；sb＝小腸；和col＝結腸。圖2C是柱圖，顯示了CO顯著改善經過SITx的大鼠中的腸轉運。該圖總結了算出的轉運幾何中心的大小(calculatedtransitgeometriccentermeasurement)。對照＝暴露于空氣的對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；SITx＝接受SITx并暴露于空氣的動物；SITx+CO＝接受SITx并暴露于CO的動物。圖3是柱圖，顯示SITx之后，CO對白細胞募集到腸肌層的影響。對照＝暴露于空氣的對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；SbTx＝接受SITx并暴露于空氣的動物；SbTx+CO＝接受SITx并暴露于CO的動物。圖4A是線圖，顯示SITx之后的各時間點粘膜和肌層中IL-6mRNA的表達，所述表達是通過RNase保護實驗測定的。■＝肌肉；○＝粘膜。圖4B是線圖，顯示SITx之后的各時間點粘膜和肌層中IL-1βmRNA的表達，所述表達是通過RNase保護實驗測定的。■＝肌肉；○＝粘膜。圖5是一組柱圖，顯示CO對再灌注后四小時的腸移植物肌外層中一氧化氮合酶(iNOS)，IL-6，IL-1β和IL-10的表達的作用，其是通過實時RT-PCR分析測定的。正常＝暴露于空氣的對照動物；正常+CO＝暴露于CO的對照動物；SITx＝接受SITx并暴露于空氣的動物；SITx+CO＝接受SITx并暴露于CO的動物。圖6是一組柱圖，顯示再灌注后一小時(SITx+CO(1hr)和四小時(SITx+CO(4hr))，CO對經受SITx的動物的血清中IL-6和硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度的影響。正常＝暴露于空氣的對照動物；正常+CO＝暴露于CO的對照動物；SITx(1hr)和SITx(4hr)＝分別是再灌注后一小時和四小時測定的、經受SITx的動物。圖7A是柱圖，顯示使用實時兩步RT-PCR分析測定的腸操作(IM)對肌層提取物中的HO-1表達的影響。在剖腹術后3小時(IM3h)，6小時(IM6h)，12小時(IM12h)，和24小時(IM24h)分析樣品。術后3-6小時出現了峰值HO-1表達。數據代表相對于對照±SEM的平均倍數增長，n＝6。*P＝0.001；**P＝0.0001。圖7B是肌層整體封裝(musculariswholemount)的圖，顯示IM以后浸潤肌層的多形核白細胞中的HO-1樣免疫反應性。圖7C是肌層整體封裝的圖，顯示IM以后浸潤肌層的巨噬細胞樣細胞中的HO-1樣免疫反應性。圖7D是肌層整體封裝的圖，顯示IM以后浸潤肌層的含顆粒細胞中的HO-1樣免疫反應性。圖像下半部分的模糊的免疫熒光位點是焦點平面以下的細胞。圖7E是肌層整體封裝的圖，顯示對照動物的肌層中HO-1樣免疫反應性的缺乏。圖8A是柱圖，顯示吸入的CO(暴露24小時)對沒有接受IM的小鼠的腸轉運的影響。stom＝胃；sb＝小腸；和col＝結腸。實心柱＝沒有暴露于CO的動物；條紋柱＝暴露于CO的動物。大多數熒光信號位于盲腸和近段結腸中。圖8B是柱圖，顯示吸入的CO(暴露24小時)對接受IM的小鼠的腸轉運的影響。stom＝胃；sb＝小腸；和col＝結腸。實心柱＝沒有暴露于CO的動物；條紋柱＝暴露于CO的動物。IM以后，轉運被明顯延遲。吸入CO導致標記的葡聚糖的更遠側的分布(IM-CO)。圖8C是柱圖，顯示幾何中心(GeometricCenter)(GC)計算的結果。數字越高對應標記葡聚糖的更遠側的分布。對照＝對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；IM＝接受IM的動物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動物。與對照相比，*IM組中的GC顯著降低，P＜0.0001；n＝6。+吸入CO(IM+CO)導致與IM相比，GC明顯升高，P＝0.001；n＝6。圖9A是代表性的圖形(trace)，顯示CO對自發收縮活動的影響。對照未接受手術的小鼠的節律性收縮。對照+CO對照小鼠吸入一氧化碳(CO)24小時，對自發收縮性沒有影響。IM對小腸進行手術操作后，節律性收縮性消失。IM+CO接受操作的動物經CO處理后，節律性恢復。圖9B是線圖(劑量-反應曲線)，顯示CO對沒有接受IM的動物的環形平滑肌帶(strip)的強直性收縮的強度的影響。所述收縮是通過將所述肌帶暴露于濃度漸增的氨甲酰甲膽堿(0.1-300μmol/L)誘導的。對照動物吸入CO對氨甲酰甲膽堿誘導的收縮活性沒有影響。■＝對照；▲＝對照+CO。圖9C是線圖(劑量-反應曲線)，顯示CO對接受IM的動物的環肌帶(strip)的強直性收縮的強度的影響。所述收縮是通過將所述肌帶暴露于濃度漸增的氨甲酰甲膽堿(0.1-300μmol/L)誘導的。環肌對氨甲酰甲膽堿反應而收縮的能力在IM后明顯被削弱。CO的吸入將收縮活性恢復到對照水平(IM+CO)。■＝IM；▲＝IM+CO。圖10是柱圖，顯示CO的吸入對浸潤對照小鼠和腸操作(IM)之后的小鼠的腸肌層的髓過氧化物酶(MPO)陽性白細胞的數目的影響。對照＝對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；IM＝接受IM的動物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動物。數據表示為平均值±SEM。*P＜0.0001；n＝4。圖11A是柱圖，顯示手術麻醉和IM對IL-6mRNA表達的時間過程的影響，用實時兩步RT-PCR進行分析的結果。在3小時(IM3h)，6小時(IM6h)，12小時(IM12h)，和24小時(IM24h)分析樣品。表達在術后3和6小時達到峰值。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P＜0.0001。圖11B是柱圖，顯示CO吸入對術后3小時(IM+CO3hr)和6小時(IM+CO6hr)的IL-6mRNA的表達的影響。IM3hr和IM6hr＝3小時和6小時的IM對照動物。數據表示為平均值±SEM。圖11C是柱圖，顯示CO吸入對IL-6蛋白從術后24小時采集的肌層提取物中的釋放的影響。IL-6蛋白的釋放被CO吸入明顯降低。對照＝對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；IM＝接受IM的動物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動物。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P＜0.0001，且相對于IM+P＝0.001；n＝6。圖12A是柱圖，顯示手術麻醉和IM對IL-1βmRNA表達的時間過程的影響，用實時兩步RT-PCR進行分析的結果。在3小時(IM3h)，6小時(IM6h)，12小時(IM12h)，和24小時(IM24h)分析樣品。表達在術后6小時達到峰值。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。圖12B是柱圖，顯示CO吸入對術后3小時(IM+CO3hr)和6小時(IM+CO6hr)的IL-1βmRNA的表達的影響。CO顯著抑制峰值IL-1βmRNA表達。IM3hr和IM6hr＝3小時和6小時的IM對照動物。數據表示為平均值±SEM。*P＝0.001對IM小時，n＝6。圖12C是柱圖，顯示CO吸入對IL-1β蛋白從術后24小時采集的肌層提取物中的釋放的影響。IL-1β蛋白釋放由于CO吸入明顯降低。對照＝對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；IM＝接受IM的動物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動物。數據表示為平均值±SEM。ND＝未檢測到。*相對于對照P＝0.0001，相對于IM+P＝0.001；n＝6。圖13A是柱圖，顯示手術麻醉和IM對iNOSmRNA表達的時間過程的影響，用實時兩步RT-PCR進行分析的結果。在3小時(IM3h)，6小時(IM6h)，12小時(IM12h)，和24小時(IM24h)分析樣品。術后6小時出現峰值表達。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。圖13B是柱圖，顯示CO吸入對術后3小時(IM+CO3hr)和6小時(IM+CO6hr)的iNOSmRNA的表達的影響。IM3hr和IM6hr＝3小時和6小時的IM對照動物。數據表示為平均值±SEM。+P＝0.001對IM6小時，n＝6。圖13C是柱圖，顯示CO吸入對總亞硝酸鹽從術后24小時采集的肌層提取物中的釋放的影響。總亞硝酸鹽的釋放被認為是iNOS活性的標志。吸入CO明顯抑制手術誘導的亞硝酸鹽從被操作肌層中的釋放的增加。亞硝酸鹽的類似降低也可通過在存在選擇性iNOS抑制物L-Nil(30μM；IM+L-Nil)的條件下，通過保溫肌層提取物實現。對照＝對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；IM＝接受IM的動物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動物。*相對于對照P＝0.0001，相對于IM+P＝0.001；n＝6。數據表示為平均值±SEM。圖14A是柱圖，顯示手術麻醉和IM對COX-2mRNA表達的時間過程的影響，用實時兩步RT-PCR進行分析的結果。在3小時(IM3h)，6小時(IM6h)，12小時(IM12h)，和24小時(IM24h)分析樣品。術后3-12小時出現峰值表達。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。圖14B是柱圖，顯示CO吸入對術后3小時(IM+CO3hr)和6小時(IM+CO6hr)的COX-2mRNA的表達的影響。IM3hr和IM6hr＝3小時和6小時的IM對照動物。數據表示為平均值±SEM。圖14C是柱圖，顯示對照動物吸入CO顯著增加處理后3小時(CO3hr)的COX-2mRNA的表達。CO6hr＝處理后6小時的表達。數據表示為平均值±SEM。*P＝0.01。圖14D是柱圖，顯示CO吸入對PGE2蛋白從術后24小時采集的肌層提取物中的釋放的影響。PGE2蛋白的釋放被認為是COX-2活性的標志。吸入CO明顯增加蛋白從對照肌層中的釋放，但對手術誘導的PGE2從操作的肌層中的釋放增加沒有影響。對照＝對照動物；對照+CO＝暴露于CO的對照動物；IM＝接受IM的動物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動物。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P＝0.01且**P＝0.0001；n＝6。圖15A是柱圖，顯示手術麻醉和IM對IL-10mRNA表達的時間過程的影響，用實時兩步RT-PCR進行分析的結果。在3(IM3h)，6(IM6h)，12(IM12h)，和24(IM24h)小時分析樣品。術后3-6小時出現峰值表達。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P≤0.001，n＝6。圖15B是柱圖，顯示CO吸入對術后3小時(IM+CO3hr)和6小時(IM+CO6hr)的IL-10mRNA的表達的影響。吸入CO增加手術后3小時的IL-10信息(message)，但不增加手術后6小時的IL-10信息。IM3hr和IM6hr＝3小時和6小時的IM對照動物。數據表示為平均值±SEM。+p＝0.001相對于IM3小時；n＝6。圖15C是柱圖，顯示對照動物吸入CO明顯增加處理后3小時(CO3hr)和6小時(CO6h)的IL-10mRNA的表達。數據表示為平均值±SEM。*相對于對照P≤0.001，n＝6。圖16A是柱圖，顯示在手術(IM)后3小時和6小時，對手術麻醉和IM對HO-1mRNA表達的時間過程的影響進行實時兩步RT-PCR分析的結果。吸入CO明顯增加術后3小時(IM+CO3hr)的HO-1mRNA的表達，但不增加術后6(IM+CO6hr)小時的HO-1mRNA的表達。IM3hr和IM6hr＝3小時和6小時的IM對照動物。數據表示為平均值±SEM。+p＜0.001對IM3hr；n＝6。圖16B是柱圖，顯示對照動物吸入CO對處理后3小時(CO3hr)和6小時(CO6h)的HO-1mRNA的表達的影響。對照動物吸入CO增加處理后6小時的HO-1mRNA的表達。*相對于對照P＜0.05，n＝6。發明詳述本文術語“一氧化碳”(或“CO”)描述了氣態的，加壓成液態的，或者溶解于水溶液中的分子一氧化碳。本文術語“一氧化碳組合物″或“包含一氧化碳的藥物組合物”用于描述可給藥患者和/或器官例如小腸的、含有一氧化碳的氣體或液體組合物。熟練醫師知道在具體應用中，優選何種形式的藥物組合物，例如氣體，液體，或氣體和液體的形式。本文術語“有效量”和“有效地治療”指一段時間內(包括急性或慢性給藥以及定期的或連續的給藥)給藥一定量或濃度的一氧化碳，所述量或濃度在其給藥用來產生目的效果或生理結果的背景下是有效的。本發明所用有效量的一氧化碳包括例如防止或減輕諸如小腸移植等手術后的腸梗阻的量。在氣體的情況下，有效量的CO通常在約0.0000001％到約0.3％重量之間，例如0.0001％到約0.25％重量，優選CO重量至少約0.001％，例如至少約0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％。在CO溶液的情況下，有效量通常在約0.0001到約0.0044gCO/100g溶液，例如至少約0.0001，0.0002，0.0004，0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020.0.0021，0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或0.0042gCO/100g水溶液。優選的范圍包括，例如約0.0010到約0.0030gCO/100g液體，約0.0015到約0.0026gCO/100g液體，或者約0.0018到約0.0024gCO/100g液體。熟練的醫師應理解根據應用的情況可使用這些范圍外的量。本文術語“患者”描述根據本發明提供的方法對其進行治療的動物，人或非人。本發明明確涉及獸醫學應用。該術語包括但不限于哺乳動物，例如人，其它靈長類，豬，嚙齒類例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，倉鼠，牛，馬，貓，狗，綿羊和山羊。本文術語“治療”是指延緩病情的發生，抑制，預防或緩解疾病的影響，所述疾病例如腸梗阻。術語“供體”或“供體患者”用于文中指患者(人或非人)，從該患者可以獲得器官或組織用于移植到受體患者。術語“受體”或“受體患者”指器官或組織被轉移至其中的患者(人或非人)。本文術語“腸梗阻”通常指胃腸道的部分或完全麻痹或運動障礙。腸梗阻可以出現在整個胃腸道，或者可以只涉及胃腸道的一個或幾個部分，例如，胃，小腸或結腸。熟練的醫師將理解腸梗阻可以由很多因素造成，包括，例如手術(例如任何涉及剖腹術的手術)，例如小腸移植(SITx)；或者任何涉及腹腔鏡的手術)；腸缺血；腹膜后血腫；腹腔內膿毒癥；腹膜內炎癥；急性闌尾炎；膽囊炎；胰腺炎；輸尿管絞痛；胸部損傷；基底肺炎；心肌梗死；代謝障礙，例如導致鉀的水平降低的代謝障礙；藥物，例如長期使用鴉片制劑；和外傷，例如脊柱和肋骨骨折(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。該術語還包括產后腸梗阻，其是產后期婦女的常見疾病，例如陰道分娩(“自然分娩”)或手術輔助的分娩以后。本文術語“手術后腸梗阻”指任何手術例如腹部手術以后患者經歷的腸梗阻。術語“非手術介入”指不涉及手術的醫學治療。術語“不涉及手術的病情導致的腸梗阻”指由除手術以外的因素例如本文所述的因素導致的腸梗阻。認為可能出現腸梗阻的個體尤其可從本發明受益，主要是因為在出現任何腸梗阻的證據以前，就可以開始預防性治療。“可能患”的個體包括，例如需要腹部手術(醫學上必要的或可選的)的患者，和/或患有前一段落所述的任何病情或損傷的個體。熟練的醫師應理解通過本領域已知的任何方法，可確定患者可能患腸梗阻，例如通過醫師的診斷。本文所用術語“移植”是總稱，用于描述將器官或組織(例如小腸)轉移到患者體內的過程。術語“移植”在本領域定義為將活體組織或細胞從供體轉移到受體，并保持被轉移的組織或細胞在受體中的功能完整性(見例如TheMerkManual，Berkow，FletcherandBeers，Eds.，MerckResearchLaboratories，Rahway，N.J.，1992)。該術語包括本領域已知的所有種類的移植。移植通過部位以及供體和受體之間的遺傳關聯分類。該術語包括例如自體移植(autotransplantation)(將病人身體的一個位置的細胞或組織取出并轉移到同一病人身體的相同或另一位置)，同種異體移植(allotransplantation)(相同物種成員間的移植)，和異種移植(xenotransplantation)(不同物種成員間的移植)。制備氣體組合物CO組合物可以是氣體一氧化碳組合物。可用于本發明的方法中的壓縮氣體(compressedgas)或加壓氣體(pressurizedgas)，可自任何商業來源獲得，并可位于任何類型的適合保存壓縮氣體的容器(vessel)中。例如，壓縮或加壓氣體可以自任何提供醫用壓縮氣體例如氧氣的來源獲得。本文術語“醫用級”氣體，指適合給藥本文所定義的患者的氣體。提供用于本發明的方法的加壓氣體包括一氧化碳時，可使得所需的最終組合物中的所有氣體(例如，CO，He，NO，CO2，O2，N2)在同一容器內，除NO和O2不能保存在一起的情況。可選的，本發明的方法可使用多個含有單一氣體的容器進行。例如，可提供含或不含其它氣體的含一氧化碳的單個容器，其含有的氣體可選地與室內空氣或其它容器中含有的氣體混合，所述其它容器例如含有氧氣，氮氣，二氧化碳，壓縮空氣，或任何其它適合的氣體或其混合物的容器。根據本發明給藥患者的氣體組合物通常含有0％-約79％重量的氮氣，約21％-約100％重量的氧氣和約0.0000001％-約0.3％重量(相當于約1ppb或0.001ppm-約3,000ppm)的CO。優選氣體組合物中氮氣量是約79％重量，氧氣量是約21％重量且CO量是約0.0001％-約0.25％重量。CO的量優選是至少約0.001％，例如，至少約0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。CO的優選范圍包括約0.005％-約0.24％，約0.01％-約0.22％，約0.015％-約0.20％，和約0.025％-約0.1％重量。注意到根據應用情況，具有大于0.3％(例如1％或更高)的CO濃度的氣體CO組合物可短期使用(例如一次或數次呼吸)。可用氣體CO組合物產生包含CO氣體的環境(atmosphere)。包含適當水平的CO氣體的環境可通過例如以下方式產生提供含有包含CO氣體的加壓空氣的容器，并將所述加壓氣體從容器中釋放到室或空間內，在該室或空間內形成包括CO氣體的環境。可選地，所述氣體可被釋放到使氣體在呼吸面罩或呼吸管內達到最高濃度的一種儀器中，從而在呼吸面罩或呼吸管中創造出包含CO氣體的環境，使得患者成為該室內唯一暴露于明顯水平的CO的人。環境中CO的水平可通過本領域已知的任何方法檢測或監測。這種方法包括電化學檢測，氣相色譜，放射性同位素計數，紅外吸收，比色法，和基于選擇性膜的電化學方法(見例如Sunderman等，Clin.Chem.282026-2032，1982；Ingi等，Neuron16835-842，1996)。亞百萬分數級(sub-partspermillion)CO水平可通過例如，氣相色譜和放射性同位素計數檢測。此外，本領域已知亞-ppm范圍內的CO水平可通過中紅外氣體傳感器(midinfraredgassensor)在生物組織中檢測(見例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol280H482-H488，2001)。CO傳感器和氣體檢測儀可自多種商業來源獲得。制備液體組合物包含CO的藥物組合物也可以是液體組合物。液體可通過本領域已知的任何使氣體溶于液體的方法制成CO組合物。例如，所述液體可以置于所謂的“CO2溫育箱”中并暴露于持續的CO氣流，優選由二氧化碳平衡，直到液體中CO達到所需的濃度。另一實施例中，CO氣體可直接″吹入(bubbled)″液體中，直到液體中CO達到所需的濃度。溶解于給定水溶液中的CO量隨溫度的降低而增加。在另一實施例中，適宜的液體可流經允許氣體進行擴散的管道系統(tubing)，該管道系統在包含CO的環境(例如利用如體外膜氧合器(extracorporealmembraneoxygenator)的儀器)中運行。CO擴散進入液體產生液體CO組合物。很可能地，這種用于引入活動物體內的液體組合物，當其被引入動物體內時，溫度是或約37℃。液體可以是本領域熟練技術人員已知的任何適合給藥患者，或保存和/或洗滌和/或灌注目的器官的液體(參見，例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。通常，所述液體是水溶液。適合的溶液的實例包括磷酸鹽緩沖的鹽水溶液(PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，檸檬酸鹽溶液，和威斯康星大學(UniversityofWisconsin)(UW)溶液(OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。在本發明的一個實施方案中，液體是林格氏液(Ringer′ssolution)，例如，乳酸鹽林格氏溶液，或任何可輸注入患者體內的其它液體。在另一實施方案中，液體包括血液，例如全血。任何適合的液體可通過氣體擴散器飽和到給定的CO濃度。可選地，可用經質量控制含有給定水平的CO的預制溶液。可通過使用帶有與CO分析儀連接的透氣但不透液的膜的儀器對劑量進行精確控制。可將溶液飽和到所需有效濃度并保持在這些水平。用CO組合物治療患者可用本領域已知的任何將氣體和/或液體給藥患者的方法使用一氧化碳組合物治療患者。一氧化碳組合物可給藥診斷為，或者確定可能患腸梗阻的患者，例如手術患者，包括接受了SITx的患者。本發明還涉及將液體或氣體一氧化碳系統地給藥患者(例如通過吸入和/或攝取)，以及將所述組合物局部地給藥患者的胃腸道(例如通過攝取，吹入，和/或導入腹腔)。系統地遞送氣體CO氣體CO組合物可系統地遞送給患者，例如手術患者或者小腸移植供體和/或受體。氣體CO組合物通常通過嘴或鼻道吸入肺內給藥，在肺內CO直接顯示其作用或者很容易地被吸收到患者的血流內。治療性氣體組合物中所用活性化合物(CO)的濃度有賴于CO的吸收，分布，滅活和排出(通常通過呼吸)速率以及本領域熟練技術人員已知的其它因素。還應理解，對于任何具體受試者而言，具體的劑量方案應根據個體需要和實施或監督組合物給藥的人員的職業判斷隨時間進行調整，而且前述的濃度范圍只是示例性的，而不是為限制所要求的組合物的范圍或實踐。本發明還涉及CO的急性，亞急性和慢性給藥，所述給藥方式有賴于例如患者腸梗阻的嚴重性或持續性。CO可在足以治療病情并顯示預期藥理學或生物學效應的一段時間內(包括不定時地給藥)遞送給患者。以下是一些可用于對患者給藥氣體CO組合物的方法和器械的實例。呼吸機(ventilator)可購買醫用級CO(可有多種濃度)，所述CO與空氣或其它含有氧氣的氣體混合于加壓氣體標準罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述氣體為非反應活性(non-reactive)的，而本發明方法所需濃度遠遠低于可燃范圍(空氣中10％)。在醫院中，推定要將氣體遞送到床邊，在那里使之與氧氣或室內空氣在混合器(blender)內混合，達到所需的ppm濃度。患者通過呼吸機吸入氣體混合物，呼吸機的流率根據患者的舒適程度和需要設定。通過肺圖(即呼吸速率，潮氣量等)可確定該流率。可將防止患者不必要地接受超過所需量的一氧化碳的自動防故障機制(fail-safemechamism)設計在遞送系統中。患者的CO水平可通過研究以下指標進行監測(1)靜脈血中可測的碳氧血紅蛋白(COHb)，和，(2)從呼吸機側部收集的呼出CO。可根據患者的健康狀況和標志物調節CO暴露。如果有必要，還可通過吸入100％的氧氣洗出CO。CO是不被代謝的，因此除很小一部分被轉化成CO2，無論吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治療性遞送CO而不導致隨后的低氧狀況。面罩和幕(Tent)含有CO的氣體混合物如上述方法制備，從而允許患者通過面罩或幕被動吸入。吸入濃度可改變，并通過簡單地換成吸入100％的O2進行洗滌。可用自動防故障機制在面罩或幕或在其附近監測CO水平，所述自動防故障機制可防止吸入過高濃度的CO。便攜式吸入器(Portableinhaler)加壓CO可被包裝入便攜式吸入器并吸入經過計量的劑量，例如使得不住院的受體接受間歇性治療。可將不同濃度的CO包裝到容器中。該儀器可簡單到只是帶有開-關閥和管子的含有稀釋CO的小儲罐(例如低于5kg)，從所述管子中，患者可根據標準方案或需要吸入CO。靜脈內人工肺(IntravenouSArtificialLung)設計為遞送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中氣體交換的導管器械)可用于CO遞送。該導管植入后，定位于一根大靜脈中并可系統性遞送所需濃度的CO或將其遞送到局部位點。所述遞送可以是短時間內遞送高濃度CO到手術位點例如鄰近小腸的局部遞送(所述高濃度在血流中迅速稀釋)，或者相對較長的時間內暴露于較低濃度的CO(見例如，Hattler等，Artif.Organs18(11)806-812(1994)；和Golob等，ASAIOJ.，47(5)432-437(2001))。正常氣壓小室(Normobaricchamber)在某些情況下，需要將患者整體暴露于CO。患者須位于充滿CO的密閉艙中，其中CO的水平不會對患者造成危險，或者該水平造成可接受的危險但不會使旁觀者處于被暴露的危險。完成暴露后，用空氣(例如，21％O2，79％N2)充滿該艙，并使用CO分析儀分析樣品，以保證在允許患者離開暴露系統前沒有任何CO存留。系統性遞送液體CO組合物本發明還涉及，可產生用于系統地遞送給患者的液體CO組合物，例如輸注到患者體內。例如，液體CO組合物，如CO飽和的林格氏溶液，可以在外科手術之前，期間和/或以后輸注給患者。可選或此外，被CO部分或完全飽和的全(或部分)血可輸注入患者。本發明還涉及能夠遞送可用的CO氣體或液體劑型的試劑(例如CO釋放性膠，乳膏，軟膏劑或膜片)。使用一氧化碳對胃腸道進行局部治療可選或此外，一氧化碳組合物還可直接給藥胃腸道，例如整個胃腸道的內部和/或外部，或者其任何部分。氣體組合物可通過本領域已知的將氣體吹入患者的方法，直接給藥患者的胃腸道，所述患者例如手術患者或者小腸移植供者或受者。例如，在內窺鏡和腹腔鏡操作中，氣體如二氧化碳通常被分別吸入患者的胃腸道和腹腔從而輔助檢查(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。熟練醫師將理解類似的方法可以用于將一氧化碳組合物直接給藥患者的胃腸道。認為本發明可用來輔助預防腹腔鏡和內窺鏡檢查例如結腸鏡和食管胃十二指腸鏡檢查導致的腸梗阻。液體CO組合物也可局部給藥患者的胃腸道。液體CO組合物可通過本領域已知的任何將液體給藥患者的方法給藥。和氣體組合物一樣，液體CO組合物可直接給藥患者胃腸道的內部和/或外部。例如，液體形式可經口服給藥，例如通過使病人攝取液體一氧化碳組合物的膠囊化或非膠囊化劑型。另一實例中，液體，例如含有溶解的CO的鹽水溶液，可以分別在內窺鏡和腹腔鏡手術中注入患者的胃腸道和腹腔。SITx時，原位暴露可以通過本領域已知的任何方法進行，例如從供者體內取出器官之前，使用液體一氧化碳組合物在原位沖洗該器官(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。活體外小腸移植器官的保存(preservation)一氧化碳組合物可用來治療接受胃腸道的任何部分的移植，例如小腸移植(SITx)的患者。在移植手術的情況下，一氧化碳組合物可用來在器官采集，保存，和移植過程的任何步驟處理供體，受體和/或器官本身。胃腸器官可以從供體采集，根據本發明使用一氧化碳組合物在活體外(exvivo)處理該器官，并將其移植到受體內。可選地或此外，該器官可以在原位處理，即還在供體內時處理。可選地，一氧化碳組合物可以在手術之前，期間，和/或以后，例如使用受體的血液灌注該器官以后給藥該受體。所述一氧化碳組合物可以在從供體采集器官以前或采集過程中給藥供體。小腸(或其一部分)在活體外暴露給一氧化碳可以通過將小腸暴露于含有一氧化碳氣體的環境，和/或暴露于液體一氧化碳組合物，例如其中溶有一氧化碳的灌注液，保存液或洗滌液實現。將小腸暴露于氣體一氧化碳組合物可在任何適合產生包含適當水平的CO氣體的環境的小室(chamber)或區域中進行。這樣的小室包括，例如孵箱，和用于將器官保存在保存液中的小室。適宜的小室是其內部環境只有加入該小室的氣體的小室，使得一氧化碳的濃度可建立并保持給定的濃度和純度，例如密封小室。例如，CO2溫育箱可用來將器官暴露于一氧化碳組合物，其中的一氧化碳氣體從含有該氣體的容器中以連續氣流的方式供給。將器官在活體外暴露于液體一氧化碳組合物可通過本領域已知的任何方法進行。例如所述暴露可在任何小室或空間中在活體外進行，只要該小室或空間具有足以使該器官完全或部分浸沒在一氧化碳組合物中的容積。另一實例中，也可以通過將所述器官置于任何適宜的容器中而暴露給一氧化碳組合物，并使液體一氧化碳組合物“洗過”所述器官，使得所述器官暴露于一氧化碳組合物的連續流。另一實施例中，所述器官可用一氧化碳組合物灌注。術語“灌注”是本領域已知的術語，并且和液體例如一氧化碳組合物流經該器官的血管相關。就胃腸道而言，該術語包括使用一氧化碳組合物沖洗腸腔。在活體外和原位灌注器官的方法是本領域已知的。可通過例如連續低溫自動灌注(continuoushypothermicmachineperfusion)在活體外使用一氧化碳組合物灌注該器官(見OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。可選地，在原位或活體外灌注中，使用一氧化碳組合物灌注所述器官之前，可以用洗滌液，例如不含一氧化碳的UW溶液灌注該器官，以從該器官中去除供體的血液。進行該過程可以避免供體血紅蛋白競爭一氧化碳。此外，洗滌液還可以是一氧化碳組合物。在另一實例中，所述器官可以被置于，例如浸沒在不包含一氧化碳的介質或溶液中，并將其置于小室內，使得所述介質或溶液可通過暴露于本文所述的含有一氧化碳的環境而制成一氧化碳組合物。另一實例中，所述器官可以浸沒在不含有一氧化碳的液體中，而一氧化碳可以被“吹入”該液體中。小腸可以通過本領域熟練技術人員已知的任何方法從供體中采集并移植(見例如，OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。本領域熟練技術人員已知移植和/或采集器官用于移植的方法隨具體情況而不同，例如供體/受體的年齡。本發明所述的將器官暴露于液體一氧化碳組合物的上述方法之一或全部，例如洗滌，浸沒，或灌注，可被用于給定的手術，例如單SITx手術。血紅素加氧酶-1和其它化合物的應用本文還涉及隨同一氧化碳的給藥而誘導或表達血紅素加氧酶-1(HO-1)。在SITx的情況下，HO-1可隨一氧化碳的給藥而在器官內，器官供體體內，受體或所有三者中誘導。例如，HO-1可以在供體內(例如去除該器官以前或該過程中)，在所述離體器官中，和/或在受體內在移植前，移植過程中，或移植后誘導。在其它(即非移植相關的)很可能造成腸梗阻的介入治療的情況下，HO-1在介入治療前不久，期間或之后不久被誘導。本文術語“誘導”指使用細胞本身編碼蛋白的基因例如，HO-1的內源性(例如非重組的)基因，造成分離的細胞或組織，器官或動物的細胞中上述蛋白的生成增加。HO-1可通過本領域任何已知的方法在患者體內誘導。例如HO-1的產生可通過氯高鐵血紅素(hemin)，鐵原卟啉，或鈷原卟啉誘導。各種非血紅素(non-heme)制劑包括重金屬，細胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，內毒素和熱休克也強烈誘導HO-l表達(Otterbein等，Am.J.Physiol.LungCellMol.Physiol.279L1029-L1037，2000；Choi等，Am.J.Respir.CellMol.Biol.159-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharma一氧化碳1.Toxi一氧化碳1.37517-554，1997；和Tenhunen等，J.Lab.Clin.Med.75410-421，1970)。多種導致氧化物應激的制劑和條件可高度誘導HO-1，所述制劑和條件包括過氧化氫，谷胱甘肽耗竭物，UV輻射和氧過多(Choi等，Am.J.Respir.CellMol.Biol.159-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharma一氧化碳1.Toxi一氧化碳1.37517-554，1997；andKeyse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8699-103，1989)。“包含HO-1誘導物的藥物組合物”指包括任何能夠在患者體內誘導HO-1的試劑的藥物組合物，例如任何上述的試劑，例如氯高鐵血紅素，鐵原卟啉，和/或鈷原卟啉。通過基因轉移可增加細胞中HO-1的表達。本文術語“表達”指通過外源給藥基因(例如重組基因)造成分離的細胞或組織，器官或動物的細胞中的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或鐵蛋白。HO-1或鐵蛋白優選是與受體的同一物種的(例如人，小鼠，大鼠等)，從而最小化任何免疫反應。可通過組成型啟動子(例如巨細胞病毒啟動子)或組織特異的啟動子(例如用于哺乳動物細胞的乳清蛋白啟動子或用于肝細胞的白蛋白啟動子)驅動表達。編碼HO-1或鐵蛋白的適宜基因治療載體(例如逆轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(AAV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，小鼠極小病毒，乙型肝炎病毒，流感病毒，單純皰疹病毒-1型，和慢病毒)可通過口服，吸入或注入，在誘導腸梗阻的手術以前，期間和/或以后的任何時間(例如誘發腸梗阻的操作前24小時或即刻)給藥至腸壁，腸腔，或腹腔。類似的，編碼HO-1或去鐵鐵蛋白的質粒可作為例如裸露的DNA的形式，位于脂質體中的形式，或位于微顆粒中的形式給藥。此外，外源性HO-1蛋白可通過本領域已知的任何方法直接給藥患者。外源性HO-1可直接給藥，作為上述在患者體內誘導或表達HO-1的方法的補充或替換，。所述HO-1蛋白可在脂質體內，和/或作為融合蛋白例如TAT融合蛋白(見例如，Becker-Hapak等，Methods24247-256，2001)的形式給藥患者。可選或此外，HO-1的任何代謝產物例如膽紅素，膽綠素，鐵，和/或鐵蛋白可與一氧化碳聯合給藥，以防止或治療腸梗阻。此外，本發明涉及將除鐵蛋白以外的鐵結合分子，例如去鐵敏(desferoxamine，DFO)，鐵右旋糖苷(irondextran)，和/或去鐵鐵蛋白，給藥患者。本發明還涉及可抑制催化任何這些產物降解的酶(例如膽綠素還原酶)以創造/增強所需的效果。上述任何物質均可給藥，例如經口服，靜脈內，腹膜內，或直接給藥腸內或腸外。本發明的方法中也可以使用在給藥化合物后，將CO釋放到機體的化合物(例如釋放CO釋放的化合物，如光可激活的的釋放CO的化合物)，例如二錳十羰基，三羰基二氯釕(II)二聚體，和二氯甲烷(例如，在400-600mg/kg之間的劑量，例如，約500mg/kg)，也可以使用碳氧血紅蛋白以及供給CO的血紅蛋白替代物。可以以任何方式給藥患者上述任何物質，例如通過口服，靜脈內，或動脈內給藥。上述任何化合物可局部和/或系統地給藥患者，并且可以聯合給藥。本發明還涉及通過將CO給藥患者治療腸梗阻與對患者的腸道進行功能性刺激聯合，所述對腸道的刺激例如通過給藥患者糞便軟化劑，輕瀉劑，和/或潤滑劑；和/或通過靜脈內水合作用(intravenoushydration)和/或鼻胃減壓(nasogastricdecompression)。CO可以和任何其它已知的治療腸梗阻的方法或化合物聯合給藥。以下實施例說明了本發明的一部分，所述實施例不應理解為從任何方面限制本發明。實施例1一氧化碳對移植誘導的腸梗阻的保護作用動物近親交配的雄性LEW(RT1)大鼠體重200-300克，購自HarlanSpragueDawley，Inc.(Indianapolis，IN)，并保存在UniversityofPittsburgh的層流動物設備。使用標準飲食隨意地喂養動物。小腸移植為確定CO是否抗御小腸移植相關的腸梗阻，在同基因Lewis大鼠中進行同位SITx。具有腔靜脈引流的SITx是使用前述方法進行的。整個供體小腸從Treitz韌帶到回盲瓣在血管蒂上分離，所述血管蒂由門靜脈和帶有主動脈的一個節段的腸系膜上動脈組成。使用5m1冷的林格氏(Ringer’s)乳酸溶液通過該主動脈節段灌注該移植物，并用含有0.5％新霉素-硫酸鹽(Sigma，St.Louis，MO)的20ml冷鹽水溶液灌注腸腔。使用10-0NovafilTM縫線進行移植物主動脈和受體的腎下主動脈之間，以及移植物門靜脈和受體腔靜脈之間的端-側吻合。冷缺血時間(coldischemictime)為1小時。整個受體的腸被去除，并通過近端和遠端端-端腸吻合恢復整個連續性。術后3天給予受體動物20mg/天預防性的頭孢羥唑酯鈉。手術后3小時給予移植受體喂水，在術后24小時喂食。實驗分組四組動物在本研究中被檢查，其中兩組接受了SITx。第一組由未接受手術的正常大鼠組成。第二組動物暴露于CO且沒有接受手術。第三組中，進行了同基因SITx，并將受體置于室溫。第四組由SITx受體組成，其在手術前被置于CO小室中1小時，隨后在手術以后立刻暴露于CO直到處死。在第三組和第四組中，正常LEW大鼠作為供體。CO暴露所述動物暴露于250ppm濃度的CO。簡言之，空氣中1％的CO和空氣(21％氧氣)在不銹鋼混合柱(cylinder)中混合，然后以12L/min的流速導入3.70ft3玻璃暴露小室中。使用CO分析儀(Interscan，Chatsworth，CA)，連續測定小室中CO的水平。CO濃度一直保持在250ppm。在暴露的過程中給所述動物提供食物和水。功能研究CO治療對于被移植的移植物的腸運動障礙的作用在體內和體外評價。手術后24小時或48小時采集組織，這個時間顯示是移植誘導的運動障礙出現高峰的時間點。在體內，環肌機械活性如前述測定(Eskandari等.，Am.J.Physiol.273(3Pt1)G727-34(1997))。大鼠被麻醉并在術后24小時通過放血被殺死。中空腸的一個節段被釘在SygaardTM覆蓋的解剖盤上，所述解剖盤含有預先氧處理的Krebs-Ringer-重碳酸鹽緩沖液(KRB；137.4mMNa+，5.9mMK+，2.5mMCa2+，1.2mMMg2+，134mMCl-，15.5mMHCO3-，1.2mMH2PO4-，和11.5mM葡萄糖)，所述緩沖液使用97％O2/3％CO2平衡。沿腸系膜邊緣打開小腸，并使用細剪(fineforceps)去除粘膜。沿與環肌層平行的方向剪下全層肌肉帶(1×6mm)。肌肉帶置于連續澆蓋了預先氧處理的KRB并保持在37℃的小室(standardhorizontalmechanicalorganchamber)中。每個肌肉帶的一個末端和固定的柱(post)結扎在一起，另一端和等大的力量傳感器(WPI，Sarasota，FL)連接。使肌肉帶平衡1小時，隨后其逐漸伸長直到最大自發收縮出現(L0)。第二次平衡30分鐘以后，收縮性-反應曲線通過將組織暴露于濃度漸增的毒蕈堿激動劑氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)10分鐘產生，然后洗滌10分鐘。收縮活性通過總和曲線下的面積而計算，通過將肌肉帶的重量和長度轉化成組織的平方毫米(1.03mg/mm2)而標準化，然后報道為g/s/mm2。術后48小時，在對照和操作的動物中，通過評估熒光標記的葡聚糖(MolecularProbes)的腸分布測定腸轉運(intestinaltransit)。通過吸入異氟醚使動物稍鎮定，并口服標記的葡聚糖(200μl，濃度為6mg/ml，溶解在鹽水中)。給藥后兩小時，將該動物處死，并收集從胃到遠端結腸的整個腸道。打開胃，小腸(分成等長的10個節段)，盲腸，和結腸(3個節段，近段，中段和遠段)的內容(contents)，置于2ml的鹽水中，并強力渦旋以釋放各節段中存在的葡聚糖。沉淀腸組織和乳糜后，等分量的上清在讀板儀上讀數兩次(CytoFluorII；激發波長530nm，發射波長590nm)，來定量每個腸節段的熒光信號。隨后，繪制熒光信號的中值柱形圖，以顯示實驗組之間標記的葡聚糖的分布的改變。通過計算幾何中心(GC)進行統計分析測定腸轉運。形態學研究小腸移植物在10％的緩沖福爾馬林中固定，并在石蠟中包埋。制作4μm的切片并使用蘇木精和伊紅染色。髓過氧化物酶組織化學肌肉全層包埋物是從術后24小時采集的中段小腸制備的。腸段浸在SylgaardTM覆蓋的玻璃盤的KRB中，并沿腸系膜邊緣在不拉伸的情況下固定。該節段的長度和寬度使用游標卡尺測定。隨后沿腸系膜邊緣打開結腸，并拉伸到長度的150％和寬度的250％。使用精細鑷(fineforceps)去除粘膜和粘膜下層，余下的組織在100％的變性乙醇中固定30分鐘。使用PBS洗滌數次后，使用Hanker-Yates試劑來檢測顯示髓過氧化物酶(MPO)活性的多形核嗜中性粒細胞(PMN’s)(Sheibani等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)367-70(1981))。使用Gel/MountTM(BiomediaCorp.，FosterCity，CA)在載玻片上制作組織的標本，加上蓋玻片并通過光學顯微鏡(NikonFXA，Fryer，Huntley，IL)以200×的放大率進行檢查。浸潤肌外層的MPO陽性PMN的數目通過腸系膜和腸系膜游離緣(anti-mesentericborder)之間集中的五到六個相鄰視野的平均計數確定。分子生物研究RNase保護實驗(RPA)為研究細胞因子mRNA在粘膜和肌層中表達的序列(sequential)分析，根據生產說明使用RiboquantTM試劑盒(Pharmingen)進行RNase保護實驗。放射標記的反義RNA多探針是使用體外轉錄試劑盒和大鼠細胞因子多重探針模板組(multi-probetemplateset)(rCK-1)合成的，該多探針包括細胞因子(白介素(IL)-1a，IL-1β3，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，TNF-a，TNF-β和IFN-γ)以及管家基因(L32和GAPDH)。32P標記的探針(8.0×105cpm)和樣品RNA(5μg)在56℃雜交12-16小時，而且包括反義RNA探針在內的單鏈RNA通過使用RPA試劑盒(Pharmingen)消化。被保護的探針加樣在40％的聚丙烯酰胺凝膠上。使用PhosphorImagerTM系統(MolecularDynamics，Krefeld，Germany)進行放射自顯影。使用NIHImage進行mRNA帶的放射活性的定量，根據GAPDH標準化，并表達為細胞因子/GAPDH的比值(n＝3-4)。SYBRgreen實時RT-PCR吸入CO對移植誘導的促炎基因和抗炎基因的表達的影響通過RT-PCR在肌肉提取物中測定。從正常腸和移植后4小時的移植物中采集肌外層，并在液氮中急速冷凍。該時間點落在最大炎癥介導物表達的的范圍內，即腹部切開后3-6小時之間。使用前述的硫氰酸胍酚-氯仿提取法(Eskandari等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)367-370(1997))進行總RNA提取。RNA碎片(pellet)重懸于RNA-安全的(secure)重懸液(AmbionInc.，Austin，TX)中，然后通過使用DNaseI(DNA-Free試劑盒，AmbionInc.，Austin，TX)處理去除可能存在的污染的DNA。每個樣品的等分量(5μg)的總RNA通過分光光度法(波長250nm)定量，且以40ng/μl的濃度進行等分。峰值mRNA表達通過SYBRGreen兩步，實時RT-PCR定量兩次。GAPDH被用作內源參照物。使用隨機六聚物(PEappliedBiosystems，FosterCity，CA)和SuperScriptIITM(LifeTechnologies，Rockville，MD)，對等分量的RNA進行第一鏈(first-strand)互補DNA(cDNA)合成。引物序列根據文獻獲得或者根據公開的序列設計(表1)。使用SYBRGreenPCR核心反應試劑(CoreReagents)(PEAppliedBiosystems)制備PCR反應混合物。每種樣品都使用產品說明推薦的條件估測兩次。所述反應在50℃保溫2分鐘，以活化尿嘧啶N’-糖基化酶，隨后在95℃保溫12分鐘，以活化AmplitaqGoldTM聚合酶，然后在ABIPRISM7700序列檢測系統(PEAppliedBiosystems，FosterCity，CA)上，以95℃，15秒和60℃，1分鐘進行循環，共40次。實時PCR的數據被繪制成ΔRn熒光信號對循環數的圖。給logΔRn循環圖的中段-線性部分(mid-linearportion)設定任意的閾值。閾值循環(CT)被限定為ΔRn與該閾值交叉時的循環數。mRNA表達的定量可根據GAPDH標準化，并使用比較CT法(Schmittgen等.，J.Biochem.Biophys.Methods46(1-2)69-8(2000))相對于對照進行計算。為了排除對污染基因組DNA的PCR擴增，RT陰性對照(含有未被逆轉錄的RNA的樣品)包括在每次的PCR反應中。對每次反應進行熔解曲線分析，以保證對特定產物進行擴增。此外，還對所述引物進行凝膠電泳以確定不存在非特異條帶，以及確定擴增子大小正確。檢測靶cDNA的PCR擴增的效率以測定稀釋的共線性(colinearity)。對cDNA的連續3倍稀釋，平行三份重復進行。通過用CT值對相對輸入拷貝數作圖產生標準曲線。標準曲線的斜率為-3.2±0.3，校正系數為0.99被認為是可接受的，其相應的效率是100±10％。表1引物總結HO-1的Northern印跡如上述進行Northern印跡(Camhi等.，Am.J.Respir.CellMol.Biol.13387-398(1995))。簡言之，如上述從組織中提取10μg總RNA，并在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后通過毛細作用轉移到尼龍膜上。隨后在65℃，將所述尼龍膜在雜交緩沖液中(1％牛血清白蛋白(BSA)，7％SDS，0.5MPO4緩沖液，pH7.0，和1mMEDTA)預雜交2小時，然后使用32P標記的大鼠HO-1cDNA，32P標記的大鼠L-鐵蛋白，或32P標記的大鼠H-鐵蛋白寡核苷酸探針在65℃雜交24小時。隨后在65℃在緩沖液A(0.5％BSA，5％SDS，40mMPO4緩沖液，pH7.0，和1mMEDTA)中洗滌兩次，每次15分鐘，然后在65℃在緩沖液B(1％SDS，40mMPO4緩沖液，pH7.0和1mMEDTA)中洗滌三次，每次15分鐘。HO-1cDNA探針全長大鼠cDNA(pHO1)由Tohoku大學(Sendai，Japan)的S.Shibahara博士提供。pHO1被克隆到pBluescript載體中，并用HindIII進行消化以將0.9kbHO-1cDNA插入物從pBluescript載體中分離出來。為了控制不同樣品中RNA量的差異或加樣誤差，印跡和相應于18SrRNA的寡核苷酸探針雜交。與18SrRNA互補的24個堿基對的寡核苷酸(5’-ACGGTATCTGATCGTCTTCGAACC-3′；SEQIDNO17)是通過使用DNA合成儀(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)合成的。使用購自BoehringerMannheim(Mannheim，Germany)的隨機引物試劑盒用[32P]CTP標記HO-1cDNA。所有寡核苷酸探針都用末端去氧核苷酰轉移酶(BethesdaResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)在3’端用[32P]ATP進行標記。將放射自顯影信號和得自同一印跡的18SrRNA進行比較。血清細胞因子水平的確定灌注后1，4和24小時順序取得血清樣品，并保存在-80℃直到進行評估。血清細胞因子(包括IL-6，IL-10，和TNFα)的濃度是通過使用酶聯免疫測定(ELISA)試劑盒(R&D，Cambridge，MA)如產品說明所述測定的。血清亞硝酸鹽/硝酸鹽水平的測定為了監測NO代謝的穩定終產物，使用可購得的檢驗試劑盒(R&D，Cambridge，MI)測定1，4和24小時的血清亞硝酸鹽/硝酸鹽水平，并根據產品說明進行定量。在該試驗系統中，使用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，且樣品中亞硝酸鹽的濃度隨后使用Griess反應測定。肌肉細胞培養術后24小時，對照大鼠和移植后大鼠的小腸被取出(在無菌條件下)。結腸保留在原位。將小腸轉移到含有Hank’s平衡鹽溶液(Sigma，St.Louis，MO)和200U/ml的青霉素G和200μg/ml的鏈霉素(HBSS)的無菌碎裂機(breaker)中。如上述分離肌層，并在無菌紗布上點樣。測定樣品的濕重，等分組織，每份150-200毫克。在HBSS中洗滌該組織兩次。如上述將各等分試樣轉移到35毫米的有孔培養板中，該板含有3ml含有青霉素/鏈霉素的無血清DMEM，并在5％的CO2孵箱中在37℃保溫24小時。保溫一段時間后，在液氮中冷凍1ml的上清等分試樣，并保存在-80℃。細胞因子蛋白水平通過ELISA測定，并根據組織濕重標準化。根據產品說明使用可購得的ELISA試劑盒。數據分析結果表示為平均值加或減平均值的標準誤(SEM)。在適合的條件下，使用s檢驗(student’stest)或方差分析(ANOVA)進行統計學分析。概率水平p≤0.05被認為是統計學上顯著的。CO抑制與SITx相關的腸功能障礙的發生在體外器官浴(organbath)試驗中研究SITx和使用CO治療對于自發和氨甲酰甲膽堿刺激的小腸環肌收縮的作用。再灌注移植后的腸移植物后24小時采集組織。對照小腸的肌肉帶(strip)出現有規律的收縮(數據未顯示)。使用CO處理24小時對未接受手術的對照大鼠的自發收縮沒有影響(數據未顯示)。SITx以后，自發收縮活性消失(數據未顯示)。CO治療恢復了移植后大鼠的自發收縮活性(數據未顯示)。將氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)加入水浴澆注液中引發了濃度依賴的強直性收縮。圖1顯示了對氨甲酰甲膽堿劑量遞增產生反應的整合后的收縮反應對獲得的組織面積進行標準化。在對照動物中，收縮力在10-300μM的氨甲酰甲膽堿的范圍內是濃度依賴的，其峰值力量為對100μM的氨甲酰甲膽堿起反應而產生的3.5±0.7g/mm2/s。使用CO處理對未接受手術的動物的收縮力沒有影響(峰值收縮力量3.2±0.5g/mm2/s)。與對照相比，SITx導致整個劑量反應曲線的收縮力量降低，并在氨甲酰甲膽堿的濃度大于10μM時具有統計學顯著性。在氨甲酰甲膽堿的濃度為100μM時，峰值收縮力量降低了49％，為1.7±0.4g/mm2/s。使用CO處理防止了SITx對整個劑量-反應曲線的抑制作用，使峰值收縮力量恢復到對照的水平(3.6±0.7g/mm2/s)。術后48小時，通過評估口服的，熒光素標記的葡聚糖的腸分布測定對照動物和移植后動物的腸轉運。圖2A-2B是轉運柱圖，顯示口服2小時后，不可吸收的FITC標記的葡聚糖沿胃腸道(從胃到結腸)的分布。經口喂養2小時后，來自未接受手術的對照大鼠和使用CO處理的對照大鼠的每個腸節段中熒光的中值柱圖在圖2中繪制。在這兩組中，大多數熒光標記位于小腸節段9和10，以及盲腸中。這和移植后的大鼠中觀察到的分布模式相反(圖2B)，其中的熒光標記主要見于胃，一些標記進入了近端小腸。在使用CO處理的移植動物中，標記的分布更遠，總體來說主要在小腸節段6，7和8中。幾何中心計算結果的統計分析在表2C中總結，顯示了吸入CO顯著提高接受了小腸移植的大鼠的腸轉運。白細胞募集小腸肌層中的細胞炎性事件通常出現在SITx后24小時。通過Hanker-Yates組織化學測定的髓過氧化物酶(MPO)活性，用來定量來自對照動物和移植動物，經過和沒有經過CO處理的組織中的白細胞浸潤。在未經手術的對照大鼠和CO處理的對照大鼠中，MPO陽性細胞很少見(數據未顯示)。SITx導致白細胞明顯被募集到腸肌層(數據未顯示)。每200×視野的細胞計數在圖3中總結，其顯示了CO處理降低了MPO陽性細胞的平均數目；然而，所述降低沒有統計學顯著性(p＝0.08，n＝6)。粘膜和肌層中細胞因子的序列分析RNase保護實驗顯示，SITx導致IL-6和IL-1βmRNA的明顯上調，其峰值在移植后的移植物中持續3-6小時(圖4A和4B)。相應地，再灌注后4小時分析炎癥介質mRNA水平。分子炎性反應圖5是一組柱圖，其顯示了再灌注四小時后，腸移植物的肌外層中CO對一氧化氮合酶(iNOS)，IL-6，IL-1β，和IL-10的表達的影響。實時PCR分析顯示腸移植物的肌外層中，促炎細胞因子mRNA表達明顯增加，(IL-6(3400倍))和IL-1β(38倍))。TNFα也明顯上調，但程度較低(3倍)。ICAM-1的基因表達增加了14倍，其中ICAM-1是在循環炎性細胞的募集中起重要作用的粘附分子。在使用CO處理的受體大鼠中，平均相對IL-6和IL-1β的表達降低(分別降低40％和50％)，而TNFα和ICAM-1的表達不變。由于移植組間的大的標準偏差，CO處理的大鼠中IL-6mRNA的表達的降低不具有統計學顯著性(p＝0.046，n＝6)，而IL-1β的表達明顯降低(p＝0.084，n＝6)。移植后移植物的肌層中，可誘導形式的環加氧酶(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的基因表達也明顯上調(分別為5倍和48倍)。這兩種酶的平均相對mRNA表達在CO處理的大鼠中降低大約50％。iNOS表達的降低仍不十分顯著(p＝0.060，n＝6)，而COX-2的表達的降低非常顯著(p＝0.26，n＝6)。單獨吸入CO對于任何一種所研究的介質的表達沒有影響。圖6是一組柱圖，顯示了再灌注后1和4小時，接受腸移植物的動物中，CO對血清IL-6和硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度的影響。為了產生這些數據，在移植后的各時間點采集血清樣品，并保存在-80℃直到對其進行評估時。血清IL-6濃度使用大鼠酶聯免疫測定(ELISA)試劑盒(R&D，Cambridge，MA)。血清亞硝酸鹽/硝酸鹽水平，NO代謝的穩定終末產物，使用可購得的檢驗試劑盒(Cayman，AnnArbor，MI)測定。在該實驗系統中，使用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并隨后使用Griess反應測定樣品的亞硝酸鹽濃度。接受SITx并使用空氣處理的動物中的血清IL-6和亞硝酸鹽/硝酸鹽水平隨時間增加。接受SITx并使用CO處理的動物(SITx+CO)顯示血清IL-6以及亞硝酸鹽/硝酸鹽的水平明顯降低。顯示CO防止移植誘導的腸功能障礙的數據列在下表1中。SITx后早期(＜48小時)，腸移植物的腸轉運明顯延緩，肌肉收縮力明顯降低，且出現大量炎性浸潤。這些改變在用CO處理的受體中下降。與沒有用CO處理的SITx動物相比，用CO處理的SITx動物中的血清IL-6濃度(再灌注后4小時)明顯降低。CO通過下調促炎細胞因子IL-6和IL-1，防止腸移植炎癥和與SITx相關的I/R損傷。表2CO抑制與SITx相關的腸功能障礙實施例2CO抑制與小腸的手術操作相關的腸梗阻的發生動物C57B16野生型雄性小鼠(20-25g)得自Harlan(Indianapolis，IN)。小鼠圈養在無病原體的裝置中，保持12小時的晝/夜循環，并隨意地用可購得的嚙齒動物食物和自來水喂養。實驗分組和操作步驟年齡相當的小鼠被分成四個實驗組自然對照組(對照)；使用CO處理的對照組(對照+CO)；接受小腸手術操作(IM)的小鼠；和接受手術操作并使用CO處理的小鼠(IM+CO)。手術操作通過吸入異氟醚麻醉小鼠，并從腹中線剖開腹部。將小腸從腹腔拉出，并使用濕潤的無菌棉敷料沿其全長輕壓。這一過程是為了刺激腸的“蠕動”，通常在臨床腹腔手術中進行。將腸重新放回腹腔，并使用雙層連續縫合關閉切口。手術的時間為大約15分鐘，且所述動物在麻醉解除后20分鐘內在其籠子周圍自由移動。CO吸入治療圈養籠子里的小鼠被置于持續通空氣或者含有CO(250ppm)的空氣的樹脂玻璃小室中。提供取樣口以持續監測小室內的一氧化碳濃度。動物可隨意在任何時間吃食和喝水。剖腹術前1小時將小鼠暴露于CO或空氣，轉移出小室進行手術操作，然后返回小室24小時。沒有接受手術的小鼠從小室中轉移出相似長度的時間，然后返回小室中24小時。形態學研究MPO組織化學肌肉全層包埋物是從術后24小時采集的中段小腸制備的。腸段浸在SylgaardTM覆蓋的玻璃盤的KRB中，并沿腸系膜邊緣在不拉伸的情況下固定。該節段的長度和寬度使用游標卡尺測定。隨后沿腸系膜邊緣打開結腸，并拉伸到長度的150％和寬度的250％。使用精細鑷(fineforceps)去除粘膜和粘膜下層，余下的組織在100％的變性乙醇中固定30分鐘。使用PBS洗滌數次后，使用Hanker-Yates試劑來處理組織以檢測顯示髓過氧化物酶(MPO)活性的多形核嗜中性粒細胞(PMN’s)(Sheibani等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)367-70(1981))。使用Gel/MountTM(BiomediaCorp.，FosterCity，CA)在載玻片上制作組織的標本，加上蓋玻片并通過光學顯微鏡(NikonFXA，Fryer，Huntley，IL)以200×的放大倍數進行檢查。計數腸系膜邊緣和腸系膜游離部邊緣之間集中的五到六個相鄰視野中的MPO陽性PMN的數目。HO-1免疫組化如上述制備的肌肉全層包埋物在Zamboni’s固定劑中固定1小時，使用DMSO清洗。使用PBS洗滌數次后，使用含有10％的正常驢血清和0.1％的Triton-X的PBS處理所述組織。隨后肌肉全層包埋物和兔抗大鼠HO-1抗體(1∶500，Stressgen，Vancouver，Canada)一同溫育過夜，經洗滌后和驢抗兔IgG-Cy3偶聯物(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.，WestGrove，PA)一同保溫2小時。如上述使用Gel/MountTM包埋組織，并通過熒光顯微鏡進行檢測(NikonMicrophot-FXA，Huntley，IL)。功能研究小鼠被麻醉，并在使用CO或室內空氣24小時小室處理的最后，通過放血處死小鼠。體外環肌的機械活性如上Eskandari等(Am.J.Physiol.273G727-G734(1997))所述測定。簡言之，中段小腸的一個節段被釘在SygaardTM覆蓋的解剖盤上，所述解剖盤含有預先氧處理(preoxygenate)的Krebs-Ringer-重碳酸鹽緩沖液(KRB；137.4mMNa+，5.9mMK+，2.5mMCa2+，1.2mMMg2+，134mMCl-，15.5mMHCO3-，1.2mMH2PO4-，和11.5mM葡萄糖)，并通入97％O2/3％CO2使pH為7.4。沿腸系膜邊緣打開小腸，并使用精密剪(fineforceps)去除粘膜。沿與環肌層平行的方向剪下的全層肌肉帶(1×6mm)置于標準水平機械器官小室(standardhorizontalmechanicalorganchamber)中，并連續傾注保持在37℃的預先氧處理的KRB。每個肌肉帶的一個末端和固定的柱(post)結扎在一起，另一端和等大的力量傳感器(WPI，Sarasota，FL)連接。使肌肉帶平衡1小時，隨后其逐漸伸長到L0(出現最大自發收縮的長度)。基線出現30分鐘后，收縮性-反應曲線通過將組織暴露于濃度漸增的毒蕈堿激動劑氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)10分鐘產生，然后洗滌10分鐘。收縮活性通過總和曲線下的面積計算。通過將肌肉帶的重量和長度轉化成組織的平方毫米(1.03mg/mm2)而使應答標準化，然后報告為g/s/mm2。術后24小時，在對照和操作的動物中，通過評估不可吸收的熒光標記的葡聚糖(分子量70,000)的腸分布測定腸轉運。通過吸入異氟醚使動物稍鎮定，并口服標記的葡聚糖(100μl，25mg/mlCO儲存液)。給藥后九十分鐘，將該動物處死，并收集從胃到遠端結腸的整個腸道。胃，小腸(分成等長的10個節段)，盲腸，和結腸(3個節段等長)在1ml的鹽水中切碎，并強力混合以釋放各節段中存在的葡聚糖。沉淀腸組織和乳糜后，等分量的澄清上清在讀板儀上讀數兩次(CytoFluorII；激發波長530nm，發射波長590nm)，來定量每個腸節段的熒光信號。通過計算幾何中心(GC＝∑(每個節段的總熒光信號百分比×節段數))測定信號在胃腸道中的分布，以進行實驗組之間的定量統計比較。SYBRgreen實時RT-PCR促炎基因和抗炎基因的表達通過實時RT-PCR測定。小腸肌外層在術后四個時間點采集(3，6，12，和24小時)，并在液氮中急速冷凍。使用Eskandari等(Id)所述的硫氰酸胍酚-氯仿提取法進行總RNA提取。RNA沉淀物重懸于RNA-安全(secure)的重懸液(AmbionInc.，Austin，TX)，然后通過使用DNaseI(DNA-FreeKit，AmbionInc.，Austin，TX)處理去除可能存在的污染DNA。每個樣品的等分量(5μg)的總RNA通過分光光度法(波長250nm)定量。峰值mRNA表達通過SYBRGreen兩步，實時RT-PCR定量兩次。β-肌動蛋白被用作內源參照物。使用隨機六聚物(PEappliedBiosystems，FosterCity，CA)和SuperScriptIITM(LifeTechnologies，Rockville，MD)，對等分量的RNA(40ng)進行第一鏈(first-strand)互補DNA(cDNA)合成。引物序列根據文獻獲得或者根據公開的序列設計(表3)。使用SYBRGreenPCR核心反應試劑(CoreReagents)(PEAppliedBiosystems)制備PCR反應混合物。每種樣品都使用產品說明推薦的條件估測兩次。實時PCR的數據被繪制成ΔRn熒光信號對循環數的圖。給logΔRn圖中段-線性部分設定任意的閾值。閾值循環(CT)被限定為ΔRn與閾值交叉時的循環數。mRNA表達的定量可根據β-肌動蛋白標準化，并使用比較CT法(Schmittgen等.，J.Biochem.Biophys.Methods46(1-2)69-8(2000))相對于對照進行計算。表3引物總結為了排除對污染基因組DNA的PCR擴增，RT陰性對照(含有未被逆轉錄的RNA的樣品)包括在每次的PCR反應中。對每次反應進行熔解曲線分析，以保證對特定產物進行擴增。此外，還對所述引物進行凝膠電泳以確定不存在非特異帶，以及確定擴增子大小正確。檢測靶cDNA的PCR擴增的效率以測定連續稀釋物的共線性(colinearity)。對cDNA的逐級3倍稀釋重復三次。通過用CT值對相對輸入拷貝數作圖產生標準曲線以驗證引物。標準曲線的斜率為-3.2±0.3，校正系數為0.99被認為是可接受的，其相應的效率是100±10％。從腸肌層釋放的介質的分析蛋白和一氧化氮測定術后4或24小時，對照小鼠和接受腸操作的小鼠的小腸在無菌條件下被取出。結腸保留在原位。將小腸轉移到含有Hank’s液平衡的鹽水溶液(Sigma，St.Louis，MO)和200U/ml的青霉素G和200μg/ml的鏈霉素(HBSS)的碎裂機中，沖洗腸腔，并將組織轉移到含HBSS的第二個碎裂機中。如上述采集肌層，用于實時RT-PCR。整個采集過程中，組織保持在在3-5℃的無菌條件下。將分離的肌層在無菌紗布上點樣，測定樣品的濕重以獲得40-60毫克的等分試樣。在HBSS中洗滌該組織兩次。如上述將各等分試樣轉移到35毫米孔的培養板中，該板含有3ml含有青霉素/鏈霉素的無血清DMEM，并在5％的CO2孵箱中在37℃保溫24小時。加入培養基的藥物試劑在使用前過濾滅菌。保溫一段時間后，在液氮中冷凍等分量的培養基，并保存在-80℃。使用可購得的ELISA試劑盒(R&D，Cambridge，MA)，根據產品說明測定分泌到培養基中的IL-6，IL-1β，PGE2和IL-10蛋白的水平。釋放到培養基中的一氧化氮(NO)通過測定NO代謝的穩定終末產物估計。硝酸鹽/亞硝酸鹽水平使用可購得的檢驗試劑盒(Cayman，AnnArbor，MI)在術后24小時測定，并根據產品說明定量。在該實驗系統中，使用顆粒化的鎘將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并隨后使用Griess反應測定樣品的總亞硝酸鹽濃度。所有測定都根據組織濕重標準化。吸入的CO抑制術后腸梗阻的發生總體觀察所有動物都很快從手術中恢復。沒有與手術或者CO暴露方案相關的死亡或發病。盡管小鼠出現了腸梗阻，術后喂養和日常行為正常，并且麻醉恢復后，幾個小時內就恢復了經口攝取食物和水。HO-1的表達圖7A-7E是柱圖和照片，顯示了鼠小腸的手術操作后，腸肌層中血紅素加氧酶(HO)-1的表達。為研究內源性HO-1產物的潛在抗炎保護作用，通過SYBRgreen實時RT-PCR測定HO-1mRNA表達的改變。圖7A顯示了未接受手術的對照小鼠和操作小鼠在剖腹術后3，6，12和24小時采集的腸肌層中，HO-1mRNA的表達模式。剖腹術后3小時，HO-1mRNA的表達相對于對照明顯增加了35倍，其峰值表達出現在術后6小時，為45倍。盡管表達水平在6小時以后有所降低，直到術后24小時測定的終時間點，表達仍保持升高(22倍)。也研究了HO-1mRNA的增加是否導致手術操作后的腸肌層中蛋白的表達。HO-1的免疫組化對從沒有接受手術的小鼠采集的肌肉全層和從接受小腸操作術后24小時的小鼠采集的中段空腸肌肉全層包埋物進行。在操作的動物中，在大量浸潤的多形核白細胞中觀察到HO-1免疫活性(圖7B)，并在與巨噬細胞形態相似的細胞中觀察到HO-1免疫活性(圖7C)。有時，發現含有多個胞漿顆粒的細胞(粒細胞)也顯示強的HO-1免疫反應性(圖7D)。弱HO-1免疫活性也見于分散在肌肉層中的不典型細胞群中。在未接受操作的對照小鼠的肌肉全層中沒有檢測到HO-1免疫反應性(圖7E)。HO-1的免疫染色的特異性通過最初抗體的缺失確定(未顯示)。功能研究通過評估口服熒光素標記的葡聚糖的胃腸分布，測定術后24小時對照和操作動物中的腸轉運。圖8A-8C是柱圖，顯示了口服給藥1.5小時后，從不可吸收的熒光素標記的葡聚糖的分布測定的轉運研究的結果。自然對照小鼠和CO處理的小鼠的每個腸節段中存在的熒光的中值柱圖繪制在圖8A中。在自然動物中，標記的葡聚糖在攝取葡聚糖90分鐘后，主要分布在末端小腸，盲腸，和遠端結腸中。單獨吸入CO的治療(250ppm)導致轉運的輕微的不明顯的改變，其中所述標記主要分布在盲腸和結腸中。圖8B對比了接受了腸操作，進行或未進行CO處理的小鼠中的熒光信號的分布。小腸操作后，所述熒光信號被限制在胃和小腸的近端3個節段。動物用CO處理時，所述標記在整個胃腸道較遠端分布。幾何中心(GC)的計算結果總結在圖8C中用于統計比較。GC的值越高，熒光信號的分布越靠遠端，并對應于更快的轉運。該圖中的值顯示CO加速未操作的小鼠中的腸轉運，但GC值沒有統計學顯著性。此外，如前所示GC顯示腸操作后轉運顯著減慢，但這種轉運的延長在使用CO吸入處理的小鼠中明顯改善。小腸手術操作后24小時，在體外器官浴試驗中研究了CO對自發的和氨甲酰甲膽堿刺激的小腸環肌收縮的影響，在該時間點腸梗阻顯示已形成。圖9A-9C顯示了這種小腸環形平滑肌帶的機械活性。圖9A是一組代表性的圖形，顯示了小腸環肌的自發收縮。來自自然小鼠小腸的肌肉帶出現有規律的收縮(圖9A；對照)，且使用CO處理沒有作用(圖9A；對照+CO)。IM以后，自發收縮活性被明顯抑制(圖9A；IM)。然而，在使用CO處理的IM小鼠中，節律性明顯改善(圖9A；IM+CO)。將毒蕈堿激動劑氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)加入澆注液激發了濃度依賴的強制性收縮。將收縮曲線下的面積進行總和，并根據肌肉帶表面積進行標準化，以獲得環肌收縮力的測定值。圖9B和9C是線圖，顯示了標準化的收縮力。在對照小鼠中，峰值收縮力(3.5±0.7g/s/mm2)是對100μM的氨甲酰甲膽堿反應產生的(圖9B)。單獨的CO對對照收縮力(3.2±0.7g/s/mm2)沒有作用。手術操作導致與對照相比，整個劑量-反應曲線的收縮力量的降低，當氨甲酰甲膽堿的濃度大于10μM時，具有統計學顯著性(圖9C)。這些小鼠中，100μM的氨甲酰甲膽堿產生的峰值收縮力降低了49％(1.7±0.4g/s/mm2)。吸入CO(250ppm)完全防止了手術操作的抑制效應(3.6±0.7g/s/mm2)。MPO組織化學小腸的手術操作通常導致大量肌層內的細胞炎性反應。使用Hanker-Yates組織化學檢測髓過氧化物酶(MPO+)的活性，用來定量對照的和操作的，進行和未進行CO處理的動物的組織中的白細胞浸潤。圖10是柱圖，總結了該研究所用的四個實驗組中，浸潤腸肌層的MPO+陽性細胞的數據。在200×的放大倍數下進行白細胞計數。在沒有進行手術的對照動物中，MPO+細胞非常少。手術麻醉和腸操作導致在24小時浸潤肌層的MPO+細胞的數目增加了250倍。有趣的是，CO吸入治療對各組中白細胞浸潤的程度沒有影響。促炎細胞因子表達圖11A-11C是柱圖，顯示了吸入CO對IL-6的表達的影響。該圖顯示了小腸操作后IL-6基因表達的時間過程，以及吸入的CO對于IL-6基因和蛋白表達的影響。使用實時RT-PCR進行的時間過程分析顯示了手術后3和6小時，IL-6mRNA相對于自然對照小鼠增加了300倍(圖11A)。12小時后，表達迅速降低，在24小時降低到了相對于對照組的50倍的增加。吸入CO對3和6小時的時間點的操作誘導的基因表達沒有影響(圖11B)。在細胞培養基中保溫后，測定從分離的肌層中釋放的IL-6蛋白(圖11C)。IL-6蛋白在腸操作后24小時大量升高，并且與PCR數據相比，CO處理的小鼠中，蛋白釋放明顯降低了70％。還研究了促炎細胞因子IL-1β。IL-1β基因表達的時間過程如圖12A-12B所示。IL-1β的測定被天然對照小鼠和使用CO處理的對照小鼠中的肌外層中的mRNA水平低于序列分析儀的檢測能力這一觀察復雜化。因此，術后6小時采集的來自操作的小鼠的樣品被連續稀釋，并且將循環閾值(CT)的值根據沒有稀釋的樣品中測定的β-肌動蛋白進行標準化。隨后使用IL-1β的最低濃度計算對照ΔCT值，在該濃度CT降低到線性范圍以內。隨后計算余下的實驗組的基因表達相對于所述對照組的改變，且因此在對其實際倍數增加的估計上是保守的。從這些計算發現，對手術麻醉和腸操作反應的IL-1βmRNA的表達在手術后3小時，相對于對照增加了38倍。最大表達的出現稍晚于較早報道的IL-6較早的表達，在術后6小時和12小時達到170倍和150倍，并在24小時再次降低到40倍(圖12A)。在使用CO處理的動物中，IL-1β在6小時的時間點的表達降低了60％(圖12B)。從術后24小時采集的肌外層中釋放的IL-1β蛋白在細胞培養基中再保溫24小時后測定(圖12C)。與RT-PCR相關，沒有IL-1β蛋白可在任一對照組中檢測出，而100mg提取的組織所產生的蛋白的濃度在腸操作后升高。該反應在使用CO吸入處理的小鼠中明顯降低了60％。環加氧酶-2和可誘導的一氧化氮合酶表達活化的固有(resident)巨噬細胞和浸潤白細胞合成并釋放來自環加氧酶可誘導的同種型的前列腺素，COX-2，以及來自一氧化氮合酶(iNOS)的可誘導形式的一氧化氮(NO)，上述物質對小腸平滑肌收縮器有直接且有效的抑制作用。操作后iNOS表達的時間圖顯示在圖13A-13C中。時間過程分析顯示，基因表達在小腸操作后3和6小時明顯增加(圖13B)。6小時處的峰值表達在CO處理的動物中降低了60％(圖14B)。天然小鼠暴露于CO對iNOS的表達沒有影響(倍數增加對照，1.06±0.18；CO3小時，1.04±0.19；CO6小時；1.26±0.19)。測定從術后24小時采集的肌層提取物中釋放到培養基的總亞硝酸鹽，作為對NO產生的估計(圖13C)。如PCR數據所預測的，亞硝酸鹽的測定值在腸操作后明顯增加，并且用CO處理小鼠使該增加降低了75％。該反應類似的減弱通過將肌層提取物在存在選擇的iNOS抑制物，L-Nil(50μM)，的條件下保溫實現，表明iNOS是手術誘導的NO產生增加的來源。圖14A-14D是柱圖，顯示了吸入CO對COX-2表達的影響。該圖顯示了IM誘導的COX-2表達的時間圖。時間過程分析顯示COX-2基因表達在術后3-6小時增加了8-10倍，并且在24小時內保持升高(圖14A)。CO處理對3或6小時時間點的基因表達無影響(圖14B)。術后3小時，未手術的對照小鼠CO吸入本身導致相對小的(2.5倍)COX-2信號的誘導(圖14C)。PGE2從術后24小時采集的肌層提取物中的釋放作為COX-2活性的標志物被測定(圖14D)。與PCR的數據一致，單獨吸入CO和小腸操作都導致PGE2的釋放明顯增加。尤其是對PGE2而言，用CO處理操作的小鼠對IM誘導的這種前列腺類物質釋放沒有影響。抗炎基因表達IL-10是一種多效細胞因子，在胃腸道中具有重要的保護和抗炎效應。圖15A-15C顯示CO吸入對IL-10表達的影響。該圖顯示了IL-10表達隨時間變化的圖形。術后3和6小時，對腸操作反應的基因表達相對于對照增加了12倍。隨后表達降低，但在24小時內與對照表達相比，仍保持升高大約4倍(圖5A)。在3小時的時間點，在CO處理的操作動物中，IL-10基因表達比對照增加到43倍，比單獨的操作引起的反應高300％(圖15B)。在對照小鼠中，單獨的CO吸入足以誘導IL-10表達的明顯增加(圖15C)。吸入的CO對HO-1基因表達的作用也被評估。圖6A-16B顯示了CO吸入對HO-1表達的影響。圖16A對比了術后3小時和6小時，IM誘導的基因表達(見圖7D)，以及CO處理的操作小鼠中IM誘導基因的表達。吸入CO也使術后3小時的HO-1基因表達比單獨操作增加到300％的水平(圖16B)。在這種情況下，未接受手術的對照小鼠只吸入CO誘導了盡管明顯但小的HO-1基因表達的增加，但只是在6小時的時間點。本實施例提供了吸入低濃度的CO(250ppm)顯著降低術后腸梗阻的特征性腸運動障礙的體內和體外證據。該數據顯示了CO能在基因和蛋白的表達水平起作用，從而選擇性調節促炎和抗炎途徑的具體元件，使得腸功能明顯改善。術后腸梗阻是腹部手術目前實際上不能避免的后果，并且可從短期的張力缺乏到可持續數天的嚴重的麻痹性腸梗阻。麻痹性腸梗阻的特征是腸淤滯，細菌過量生長，和體液電解質紊亂，導致很高的發病率并通常導致死亡。將小鼠通過吸入暴露于CO改善了操作誘導的自發環形平滑肌收縮力的抑制，恢復了該肌肉對膽堿能激動劑產生反應而收縮的能力，并明顯降低了腸轉運的損害。獲得總體收縮功能的改善而不明顯降低炎性細胞的浸潤，表明CO對炎性級聯元件而不是與白細胞募集相關的那些元件起作用。為了評估CO對炎性級聯的影響，通過實時RT-PCR評估促炎和抗炎介質基因的表達。增加的促炎細胞因子IL-6和IL-1水平在人和動物的急性和慢性腸炎癥，包括術后腸梗阻中持續表達。IL-6活化各種細胞類型以誘導化學引誘物和粘附分子的合成，并由此在發動白細胞募集和外滲到腸肌層中起核心作用。在該實施例中，吸入CO不改變術后3和6小時測定的早期手術誘導的IL-6基因表達的增加，這一發現和CO缺乏對炎性細胞浸潤的程度的影響一致。然而，在CO處理的小鼠中，術后24小時測定的IL-6蛋白從分離的腸肌層中的釋放降低了60％，從5000pg/ml到2000pg/ml，表明CO對IL-6表達具有轉錄后效應。該持續的蛋白釋放水平與自然對照(150pg/ml)相比，仍然是顯著升高的，使得很難估計這對IL-6促炎信號有怎樣的影響。然而最近的研究顯示，IL-6可能還具有重要的抗炎性質，表明IL-6的持續表達對于誘導特定保護性途徑是必要的。這些可能包括抑制TNFα，IL-1β和巨噬細胞炎性蛋白-2的能力，以及增加IL-1受體拮抗劑和TNF-可溶的受體在體外的水平。因此，IL-6介導的促炎途徑的抑制，以及在炎癥級聯的后期IL-6介導的抗炎途徑的啟動，可能導致術后24小時所見的腸收縮力的改善。IL-1β在術后腸梗阻中起的作用還沒有很好的定論，但內源性IL-1β顯示抑制大鼠腸平滑肌對膽堿能激動劑以及對電刺激的收縮反應，表明其通過改變神經元通路顯示其抑制效果。此外，IL-1活性的免疫中和作用極大地降低了結腸炎鼠模型中疾病的嚴重性，表明這種細胞因子在腸炎癥中也起重要的啟動作用。在CO處理的操作小鼠中，IL-1β基因表達顯著降低，術后6小時手術誘導的基因表達降低了75％，且術后24小時測定的蛋白表達也相應降低。因此，預期IL-1β的促炎活性，以及其可能的對神經肌肉器的抑制作用將被明顯減弱。總的來看，這些發現表明CO吸入的保護作用至少部分通過靶向IL-6和IL-1β介導的促炎級聯反應中的選擇性元件的機制而出現，所述級聯反應不依賴于白細胞募集，或者在白細胞募集被完全啟動以后出現。盡管浸潤白細胞的數目在CO處理的小鼠中沒有改變，細胞因子的數據表明，存在細胞因子的CO依賴性功能抑制，其中所述細胞因子通常由白細胞產生。因此，研究了對白細胞來源的運動活躍的平滑肌介質NO和PGE2的調節，所述介質可作為CO抑制的其它靶點。已顯示COX-2產生的前列腺類物質和iNOS產生的一氧化氮對腸平滑肌收縮力具有有效的抑制作用，而且對COX-2酶的抑制或來源于白細胞的iNOS基因的選擇性敲除明顯增加了對術后腸梗阻發生的抵抗性。在本實施例中，對iNOS和COX-2基因表達的研究顯示，這兩者在腸操作后顯著升高。手術誘導的iNOS基因表達和NO產生中的增加在CO處理的動物中大約降低了75％，表明CO在基因轉錄的水平起作用以調節iNOS的表達。在體外還顯示，NOS的活性，以及NOS的內皮同種型和神經元同種型，可直接被CO抑制，可能是通過CO與存在于NOS蛋白上的血紅素基團的結合產生的。總的來看，降低的基因表達和/或酶活性造成的NO釋放降低預期明顯地造成CO吸入誘導的腸功能的改善。與iNOS相反，CO吸入對手術誘導的COX-2mRNA表達或PGE2釋放沒有影響，如保溫的肌層(術后24小時采集)的培養基中測定的那樣。有趣的是，天然小鼠吸入CO導致術后3小時COX-2mRNA的表達升高2.5倍，且24小時后PGE2的釋放相應地增加。CO誘導的COX-2以前沒有報道，這一增加的活性的功能后果是未知的。CO處理的對照小鼠沒有顯示功能損害或者促炎介質的升高，表明在這種情況下，COX-2的誘導在促炎能力中不起作用。CO吸入的顯著效果之一是對與抗炎途徑相關的基因IL-10和HO-1的表達。盡管這兩種基因都在腸操作后誘導，在CO處理的操作動物中，表達增加了300％。在術后3小時而不是6小時的時間點觀察到這一增加，表明CO暴露導致這些基因的早期誘導，這一概念由顯示天然動物單獨吸入CO明顯誘導IL-10和HO-1的結果支持。這些介質在術后腸梗阻中的作用以前沒有被描述。然而，IL-10是多效的細胞因子，對淋巴樣細胞和髓樣細胞具有廣泛的生物效應譜。其已知的功能之一就是抑制促炎介質的產生；包括腫瘤壞死因子α(TNFα)，IL-6，IL-1，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，以及活化的單核細胞/巨噬細胞產生的一氧化氮。近來，發現IL-10通過拮抗L-精氨酸的細胞吸收以及iNOS本身的催化活性抑制LPS激活的鼠巨噬細胞的NO產生，從而極大地促使NO對腸平滑肌的抑制作用的減弱。此外，還逐步發現，對HO-1介導的途徑的誘導，在多種急性和慢性炎性條件下具有重要的抗炎作用的細胞保護作用。目前有證據表明，這兩種介質的表達是相關的。公開的發現表明，暴露于CO提高IL-10基因的表達和從LPS-刺激的巨噬細胞中的蛋白釋放。近期，內源性IL-10被發現可誘導小鼠巨噬細胞中的IL-10，且HO-1的誘導是IL-10對脂多糖誘導的TNFα的產生的抑制效應所需的。HO-1的早期誘導導致增加的內源性CO產出，預期可促成外源性使用氣體的效果。此外，HO-1活性具有細胞保護和抗氧化性質，所述性質是由膽綠素和膽紅素的氧化還原循環過程中的自由基清除造成的。因此，增加的IL-10產生和增強的HO-1活性將協同起作用，通過下調促炎介質表達，增強CO的組織利用度，和提供對自由基應激的保護，在炎性級聯反應的發生早期抑制該反應。總之，本文的數據表明，CO吸入的保護作用通過靶向促炎和抗炎途徑中的選擇性元件發生。CO在基因和蛋白的水平起作用，導致IL-10和HO-1的誘導，IL-1β的下調，和iNOS的抑制。這些效應在一起造成對小腸肌層內手術誘導的炎性反應的調節，導致術后功能的改善。實施例3CO抑制小鼠和豬的小腸手術操作相關的腸梗阻的發生通過對小腸的輕柔操作在小鼠中誘導腸梗阻。作切口暴露小鼠的腹腔，小腸操作是通過輕柔地戳和刺小腸進行的(見例如Schwarz等.，Gastroenterology121(6)1354-1357(2001))。切口隨后被關閉，且24小時后進行分析。小鼠在腸操作前一小時通過吸入暴露于CO(250ppm和500ppm)，并且在整個24小時的恢復期也通過吸入暴露于CO(250ppm和500ppm)。通過測定環形肌帶對氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)反應的收縮在體外測定腸收縮力，并通過從口服熒光素標記的葡聚糖的分布測定腸轉運以及如上述實施例1所述計算幾何中心。HO-1和IL-10mRNA從肌外層提取物的表達是通過SYBRgreen實時RT-PCR測定的，如實施例1所述。平滑肌收縮的有效抑制物一氧化氮(NO)的釋放，通過測定血清總亞硝酸鹽估測，也在上述實施例1中描述。與對照相比(2.2±0.5g/s/mm2)，對氨甲酰甲膽堿(100μM)反應產生的峰值收縮力被IM明顯降低(1.1±0.2g/s/mm2)。IM誘導的收縮抑制在IM+CO小鼠中被阻止(1.9±0.5g/s/mm2)。小腸轉運在CO處理的小鼠中也得到改善(幾何中心；對照＝11.0±0.5，IM＝2.7±0.2，IM+CO＝6.3±0.8)。RT-PCR數據顯示，IM后，相對于對照IM誘導在6小時時的峰值HO-1表達(45倍)，和IL-6(300倍)以及IL-10(13倍)在3小時的表達明顯增加。在IM-CO小鼠中，HO-1表達峰值出現較早，即IM后3小時，相對于對照其表達水平較高(150倍)。IL-10在3小時的表達在IM-CO小鼠中也較高(35倍)。血清亞硝酸鹽在IM后增加(18.3±3.6μM)對對照(2.4±1.0μM)，并在IM-CO后降低(6.0±1.6μM)。因此，CO在體外和體內都減輕手術誘導的腸運動障礙，其機制可能涉及抗炎細胞因子IL-10的誘導和降低的NO產生。HO-1的早期誘導(其表達比單獨IM增加了300％)將增加CO的可利用度，增強其抗炎效果。類似的實驗可在豬模型中進行。通過輕微操作小腸(IM)誘導腸梗阻。IM前將豬暴露于CO(250ppm)或空氣(對照)3小時。通過觀察置于小腸內的鋼性球形物(steelballbearing)的腸轉運，評估體內的胃腸道功能。發現CO可改善腸操作后的腸轉運。實施例4剖腹術前使用低濃度的CO(250-75ppm)預治療3小時，防止術后腸梗阻本實施例顯示了短期釋放的低濃度CO可防止術后腸梗阻的發生。腸梗阻通過對小腸的輕微操作(IM)誘導。剖腹術前，將大鼠暴露于空氣中的濃度遞減的CO(250，125，75，30ppm)1小時或3小時(n＝6)。將結果與使用先前已建立的方案獲得的結果進行對比，所述方案即剖腹術前暴露于250ppm的CO1小時，術后暴露24小時。通過從口服喂養的熒光素標記的葡聚糖在整個胃腸道的分布測定腸轉運，評估體內的胃腸功能。測定標記的葡聚糖的中值分布，用于通過計算幾何中心(GC)進行統計學比較。經過手術操作的大鼠和沒有經過手術的對照相比，其幾何中心明顯降低(GC分別為對照＝9.8±0.4，IM＝5.8±0.4)，表明腸轉運明顯減慢。盡管將未接受手術的大鼠暴露于250ppm24小時導致腸轉運輕微延緩(GC8.8±0.4)，1小時的預治療后，使用250ppm的CO進行24小時的處理，導致接受手術操作的大鼠的腸轉運明顯改善(GC8.2±0.4)。僅在術前使用250ppm對操作的大鼠進行1小時的預處理，在預防手術誘導的轉運抑制中的效果較差(GC7.2±0.3)，而預處理3小時產生的效果和24小時的預處理的效果等同(GC8.6±0.3)。通過使用如125和75ppm這樣低的濃度進行預處理獲得相似的改善(GC分別為8.6±0.4和8.8±0.1)。當CO濃度進一步降低到30ppm，這種保護效應降低(GC7.0±0.2)。本實施例顯示了獲得對術后腸梗阻的完全保護效應無需延長地暴露于CO。將低濃度的CO在術前期摻入麻醉氣體中，可提供侵入性最小的技術，其可協助降低易感患者的腸梗阻，從而加速術后恢復并將縮短住院期。實施例5治療腸梗阻的方案以下實施例顯示了在手術前，其間，和/或以后治療患者的方案，所述手術例如移植(例如SITx)或非移植手術(例如可導致腸梗阻的手術)。所述實施例包括治療腸梗阻的方案，例如由移植和非移植手術造成的腸梗阻，以及使用CO處理移植手術中的供體，其胃腸道或其胃腸道的一部分例如小腸，和受體的其它方案。以下方法中的任何一種或多種都可用于給定的手術方法中。患者的處理對患者進行手術以前，其間和/或以后，或者患者被診斷為腸梗阻(例如由手術造成或由不涉及手術的情況造成的腸梗阻)后，可將一氧化碳系統地或局部地給予患者。患者可吸入的CO的濃度可以從10ppm到1000ppm，例如，約100ppm到約800ppm，約150ppm-約600ppm，或約200ppm-約500ppm。優選的濃度包括，例如，約30ppm，50ppm，75ppm，100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或約1000ppm。例如，可將一氧化碳間斷或連續給藥患者，在手術進行前0-20天開始，例如，至少在手術前約30分鐘開始，例如，手術前約1，2，3，5，7，或10小時，或約1，2，4，6，8，10，12，14，18，或20天，或大于20天開始。可選或此外，可將一氧化碳在手術期間給予患者，例如通過局部和/或通過吸入來給藥。可選或此外，可將一氧化碳在術后給藥患者，例如手術完成后立刻，并在手術完成后持續約1，2，3，5，7，或10小時，或約1，2，5，8，10，20，30，50，或60天，或不定期，直到正常腸運動恢復。移植方法供體的處理收獲器官或其部分前，可使用吸入的一氧化碳(250ppm)處理供體一小時。處理的給藥的劑量可從10ppm-1000ppm，時間從一小時到六小時，或者從開始可能處理腦死亡(尸體)供體到器官被取出的時間的整個階段。對于人類供體，宣布腦死亡后應盡早進行處理。在一些應用中，需要在腦死亡前進行處理。對于非人動物(例如豬)用作異種移植供體的情況，如需要可用相對高水平的吸入的一氧化碳處理活動物，只要由此產生的碳氧血紅蛋白不損害待移植器官的生存力和功能。例如，可使用大于500ppm(例如，1000ppm或更高，甚至達10,000ppm，特別是短時間使用)的濃度。器官的原位處理從供體收獲器官前，可以在該器官仍在供體體內時將該器官內充滿溶液，例如緩沖液或介質。目的是使用用一氧化碳飽和的溶液沖洗該器官，并保持在一氧化碳的環境中，使得一氧化碳的含量保持飽和。沖洗可進行至少10分鐘，例如1小時，幾小時或更長。較理想的是，該溶液將可能的最高濃度的一氧化碳遞送到器官的細胞。器官的活體外(exvivo)處理器官如小腸從供體取出后到移植給受體以前，可保存在包含一氧化碳的介質中。這可通過將器官或組織保存在含有一氧化碳的介質中進行，或者通過灌注這種介質進行。由于這種情況出現在活體外而不是動物體內，可使用非常高濃度的一氧化碳氣體(例如，10,000ppm)使該介質被一氧化碳飽和。受體的處理可用一氧化碳處理受體。可在移植手術當天手術開始前至少30分鐘開始處理。可選地，可以于再灌注受體器官前30分鐘開始。可持續至少30分鐘，例如一小時。可將10ppm到3000ppm的一氧化碳劑量遞送不同時間，例如數分鐘或數小時，并可在移植當天和移植后數天給藥。例如，受體可在三次連續10秒的呼吸中吸入例如3000ppm濃度的一氧化碳。可選地，也可以采用規律呼吸而不是深呼吸(breathholding)的方式間斷或連續地遞送較低濃度的氣體，遞送較長時間。碳氧血紅蛋白濃度可指導對患者適當地給藥一氧化碳。通常，受體的處理不應導致碳氧血紅蛋白水平升高到被認為可能給需要移植的患者造成危險的程度。應理解，雖然發明詳述描述了本發明，前述說明意圖列舉但不是限制所附權利要求限定的范圍。其它方面，優點，和改動也在以下權利要求書的范圍內。權利要求1.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有腸梗阻的患者；和將包含治療患者的腸梗阻的有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥該患者。2.權利要求1的方法，其中所述腸梗阻是小腸的腸梗阻。3.權利要求1的方法，其中所述腸梗阻是結腸的腸梗阻。4.權利要求1的方法，其中所述腸梗阻是胃的腸梗阻。5.權利要求1的方法，其中所述腸梗阻是手術后腸梗阻。6.權利要求1的方法，其中所述腸梗阻是產后腸梗阻。7.權利要求1的方法，其中所述藥物組合物通過吸入給藥患者。8.權利要求1的方法，其中所述藥物組合物是液體形式的，并且通過口服給藥患者。9.權利要求1的方法，其中將所述藥物組合物直接給藥至患者的腹腔。10.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有由于各種腹部手術導致的腸梗阻或者有患該腸梗阻危險的患者，所述腹部手術選自泌尿生殖系統的手術；消化系統的手術；淋巴系統的手術；呼吸系統的手術；膈的手術；治療癌癥的手術；子宮內膜手術；或矯形手術；和將包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥所述患者。11.權利要求10的方法，其中所述腸梗阻是小腸的腸梗阻。12.權利要求10的方法，其中所述的腸梗阻是結腸的腸梗阻。13.權利要求10的方法，其中所述藥物組合物通過吸入給藥患者。14.權利要求10的方法，其中所述藥物組合物是液體形式的，并且通過口服給藥患者。15.權利要求10的方法，其中將所述藥物組合物直接給藥至患者的腹腔。16.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有或者可能患不是由手術造成的腸梗阻的患者；和將包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥所述患者。17.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括(a)提供含有包含一氧化碳氣體的加壓氣體的容器；(b)鑒定患有腸梗阻的患者；(c)從所述容器中釋放加壓氣體，以形成含有一氧化碳氣體的環境；和(d)將所述患者暴露于該環境，其中環境中一氧化碳的量足以治療患者的腸梗阻。18.含有壓縮的醫用級一氧化碳氣體的容器，所述容器帶有表明該氣體可用來治療患者的腸梗阻的標簽。19.權利要求18的容器，其中所述一氧化碳氣體和含氧的氣體混合。20.權利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約0.025％。21權利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約0.05％。22權利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約0.10％。23.權利要求19的容器，其中的混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約1.0％。24.權利要求19的容器，其中的混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約2.0％。全文摘要本發明涉及治療患者的腸梗阻的方法，包括將包含一氧化碳的藥物組合物給藥患者。文檔編號A61K9/72GK1658889SQ03812662公開日2005年8月24日申請日期2003年2月21日優先權日2002年4月15日發明者利奧·E·奧特拜因,奧古斯丁·M·K·喬伊,貝弗利·A·穆爾,安東尼·J·鮑爾申請人:聯邦高等教育系統匹茲堡大學,耶魯大學